Влияние периодической гипобарической гипоксии на процессы химической модификации белковых компонентов липопротеинов крови у лиц с атерогенными дислипопротеинемиями
На правах рукописи
ГИРИНА ЛЮДМИЛА ВЛАДИМИРОВНА ВЛИЯНИЕ ПЕРИОДИЧЕСКОЙ ГИПОБАРИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ НА ПРОЦЕССЫ ХИМИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВЫХ КОМПОНЕНТОВ ЛИПОПРОТЕИНОВ КРОВИ У ЛИЦ С АТЕРОГЕННЫМИ ДИСЛИПОПРОТЕИНЕМИЯМИ 03.00.04. - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Уфа - 2008
Работа выполнена на кафедре биологической химии ГОУ ВПО Оренбургская Государственная Медицинская Академия Росздрава, и отделении бароадаптации областной клинической больницы №2 г.Оренбурга
Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Никоноров Александр Александрович
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Высокогорский Валерий Евгеньевич доктор биологических наук, профессор Башкатов Сергей Александрович
Ведущая организация: ГОУ ВПО «Челябинская Государственная Медицинская Академия Росздрава»
Защита состоится 30 октября 2008 года в 12.00 часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.131.01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу:
450054, г. Уфа, пр. Октября,
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра по адресу: 450054, г. Уфа, пр. Октября,
Автореферат разослан «29» сентября 2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета к.б.н., ст. научный сотрудник С.М. Бикбулатова Актуальность работы. Известно, что обусловленные атеросклерозом заболевания являются основной причиной высокой смертности не только среди мужчин (46%), но и женщин (старше 55 лет – 65%) [Аронов, 2000;
Оганов, 2002]. Огромный фактический материал, базирующийся на экспериментальных, клинических и эпидемиологических данных, убедительно доказывает, что дислипопротеинемии (ДЛП), по сути, являются основой атерогенеза [Концепция факторов риска, 2002]. При этом в настоящее время, приоритет атерогенеза отдается не столько ДЛП, сколько химической модификации компонентов липопротеинов (ЛП) крови и, прежде всего, аполипопротеинов [Азизова, 2000;
Рагино, 2007].
Модификация ЛП in vivo происходит за счет процессов протеолиза, гликозилирования, десиалирования белковой части, а также за счет окисления липидных и белковых компонентов ЛП, что приводит к их агрегации или образованию иммунных комплексов [Осипов, 1982;
Орлова, 2005]. В результате таких модификаций ЛП становятся атерогенными и токсичными, увеличивается захват этих ЛП макрофагами [Климов, 1999;
Pech, 1992;
Thorne, 1996]. Процессу химической модификации подвергаются все классы ЛП как за счет ферментативных, так и неферментативных процессов. При этом установлено, что некоторые типы модификаций усиливают другие, и оказывают синергическое атерогенное действие [Cohen, 2006].
Аполипопротеинам ЛП отводят важнейшую роль в метаболических превращениях липидных компонентов ЛП, и в обеспечении их последующего транспорта в определенные органы и ткани [Климов, 1999;
Титов, 2006]. При этом все больше данных свидетельствует, что изменение соотношения аполипопротеинов (АпоЛП), их химическая модификация [Азизова, 2000], сопровождающаяся нарушением их физико-химических и функциональных свойств, играют решающую роль в развитии атеросклероза [Орлова, 2005].
Вместе с тем, данных о взаимосвязи степени химической модификации АпоЛП с выраженностью атерогенных ДЛП явно недостаточно.
Известно, что развитию атерогенных ДЛП способствуют факторы риска:
повторяющиеся психоэмоциональные нагрузки, артериальная гипертензия, сахарный диабет, алиментарное ожирение, сниженная физическая активность, курение [Аронов, 2005]. Это требует поиска нефармакологических методик, способных снизить негативный эффект факторов риска атеросклероза, поскольку полностью исключить их из жизнедеятельности человека невозможно. В этом плане, особый интерес представляет периодическая гипобарическая гипоксия (ПГГ), прекрасно зарекомендовавшая себя в лечении и профилактике целого ряда неинфекционных заболеваний, в том числе и атерогенного характера [Меерсон и др., 1989;
Тиньков, 1995;
Прокофьев, 2005].
Все вышеизложенное определило основную цель исследования: изучить влияние ПГГ на качественные и количественные характеристики аполипопротеинового спектра ЛП крови при атерогенных ДЛП, а также обосновать возможность использования продуктов химической модификации АпоЛП как биохимических маркеров для оценки эффективности адаптации к ПГГ при сердечно-сосудистых заболеваниях.
Исходя из цели исследования, были поставлены следующие задачи:
1. Определить концентрации аполипопротеинов А-I (апоА-I), В (апоВ), C-III (апоС-III), Е (апоЕ) в сыворотке крови и установить их взаимосвязь с количественным распределением липидных компонентов в составе ЛП крови при атерогенных ДЛП;
2. Определить концентрации продуктов химической модификации аполипопротеинов и продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в ЛП крови различных классов у обследуемых лиц;
3. Определить количественные изменения аполипопротеинового спектра после адаптации ПГГ и их взаимосвязь с количественным перераспределением липидов в составе ЛП крови;
4. Оценить влияние ПГГ на качественные характеристики белковых компонентов ЛП крови по уровню продуктов химической модификации аполипопротеинов у обследуемых лиц.
Научная новизна исследования определяется его основными результатами:
• показано, что в основе нарушения функциональной активности липид транспортной системы крови лежит химическая модификация динамичных и транспортных АпоЛП;
• впервые показано, что месячный курс ПГГ у лиц с ДЛП приводит к разнонаправленному изменению уровня транспортных АпоЛП и, как следствие, к существенному снижению риска развития атеросклероза.
• показано, что курс ПГГ существенно повышает концентрацию динамичных АпоЛП, что, лежит в основе активации апоВ/апоЕ рецепторного транспорта ЛП в клетки;
впервые показано постадаптационное увеличение концентрации • фосфолипидов в составе ЛВП, что лежит в основе повышения эффективности транспорта ХС из периферических клеток вследствие активации ЛХАТ-реакции.
• впервые показана неравномерность распределения продуктов перекисного окисления липидов в составе различных классов ЛП крови после курса адаптации к ПГГ;
• впервые показан протективный эффект адаптации к действию ПГГ в отношении химической модификации АпоЛП;
Практическая значимость работы Проведенное исследование позволило оценить влияние ПГГ на процессы химической модификации АпоЛП крови, а также функциональную активность различных классов ЛП частиц. Полученные результаты могут быть использованы при определении риска развития атеросклероза и обосновывают применение адаптации к действию ПГГ для профилактики и лечения лиц с атерогенными ДЛП. Определение продуктов химической модификации АпоЛП может быть рекомендовано в качестве биохимических тестов для оценки эффективности курса ПГГ при сердечно-сосудистых заболеваниях. Результаты исследования могут быть использованы в процессе обучения в медицинских Государственных образовательных учреждениях высшего профессионального образования, на курсах повышения квалификации медицинских работников.
Положения, выносимые на защиту 1. При ДЛП наблюдается количественное и качественное изменение АпоЛП спектра липопротеиновых частиц, лежащее в основе нарушения липидного метаболизма;
2. Позитивный эффект адаптации к действию ПГГ в отношении атерогенных дислипопротеинемий связан с нормализацией аполипопротеинового спектра крови и снижением степени их химической модификации.
Апробация работы и публикации Основные положения работы изложены и представлены на заседаниях Региональной конференции молодых ученых и специалистов Оренбургской области (Оренбург, 2006), на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимии» (Киров, 2007), на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), на VI Международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2008).
По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, 3 из которых – в рецензируемых журналах по перечню ВАК РФ.
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы.
Библиографический указатель включает 330 источников: из них отечественных и 201 иностранных авторов. Работа содержит 13 таблиц и рисунков.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования В работе приняли участие 56 мужчин в возрасте 40-45 лет. В основу деления на группы легло соотношение показателей концентрации холестерина атерогенных и антиатерогенных ЛП или интегральный тест, получивший широкую известность под названием холестериновый коэффициент атерогенности (Климов, 1999): КА = ХС ЛНП/ХС ЛВП, что позволяет судить о балансе между липидно-белковыми комплексами двух функционально различных классов, и своевременно выявить формирующуюся атерогенную ДЛП (Камышников, 2003). Опытную группу составили 44 человека с атерогенными ДЛП. Контрольную группу составили 12 человек без нарушений липидного обмена.
Адаптацию ПГГ проводили в отечественной многоместной медицинской вакуумной барокамере «Урал – 1» на базе Оренбургской областной клинической больницы № 2, в соответствии с методическими рекомендациями «Метод адаптации к периодической гипобарической гипоксии в терапии и профилактике», утвержденными МЗ РСФСР в 1989 году. Кровь для биохимических исследований брали в утренние часы натощак из локтевой вены (самотеком) в две пробирки: в первую для получения сыворотки, а во вторую для получения плазмы, в качестве антикоагулянта использовали этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) с концентрацией 1мг/мл. Биохимические исследования проводили до и после окончания курса ПГГ.
При оценке липидного спектра сыворотки крови в течение периода наблюдения пациенты не принимали гипохолестеролемических средств.
Содержание холестерина (ХС), триацилглицеридов (ТГ), ХС липопротеинов высокой плотности (ХС ЛВП) определяли ферментативным способом на биохимическом анализаторе «Cobas integra 400 plus» (Швейцария-Германия).
Уровень ХС, входящего в состав наиболее атерогенных ЛНП, рассчитывали по формуле Friedevald (1972): ХС ЛНП = общий ХС – ТГ/2,2 – ХС ЛВП, ммоль/л.
Контроль качества при выполнении исследований осуществляли с параллельной оценкой двух контрольных сывороток Precinorm U и Precipath U фирмы «Cobas integra» (Швейцария-Германия). Дополнительно в плазме крови определяли концентрацию неэтерифицированных жирных кислот (НЭЖК) по методу W.G.
Duncombe (1964), в модификации И.А. Волчегорского (2000). Определение НЭЖК проводили в ЭДТА-стабилизированной плазме крови. Пробы колориметрировали при 440 нм (оптический слой - 1 см) против контроля на спектрофотометре «APEL - 303» (Япония). Для установления зависимости между оптической плотностью пробы и содержанием в ней НЭЖК строили калибровочный график. На анализаторе «Cobas integra» (Швейцария-Германия) определяли содержание АпоЛП: апоА-I, апоВ, апоС-III и апоЕ по реакции преципитации со специфической антисывороткой турбидиметрическим методом при 340 нм. Контроль качества проводили контрольной антисывороткой Т (овечьей) к человеческому апоА-I, апоВ, апоС-III и апоЕ соответственно. Фракционное разделение ЛП осуществляли с помощью реакции преципитации по классической технологии, в модификации И.А.
Волчегорского (2004). В ЛВП-содержащем супернатанте определяли содержание фосфолипидов (ФЛ) колориметрическим методом с помощью диагностического набора («Chronolab», Швейцария) на спектрофотометре “APEL” PD-303UV (Япония). Для оценки состояния процессов ПОЛ в супернатанте, содержащем ЛВП и осадке, содержащем апоВ-липопротеины (ЛОНП и ЛНП) определяли спектрофотометрически продукты ПОЛ по методу И.А. Волчегорского (2000). Спектрофотометрию каждой фазы липидного экстракта проводили при 220, 232 и 278 нм против соответствующего оптического контроля с расчетом единиц индексов окисления. Окислительную модификацию АпоЛП оценивали по уровню образования динитрофенилгидразонов (ДНФГ) по методу Е.Е. Дубининой (1995), на спектрофотометре “APEL” PD-303UV (Япония). Результаты выражали в единицах оптической плотности на 1 мг апопротеинов ЛВП и апоВ-содержащих ЛП. Для определения концентрации белка в каждой подфракции липопротеиновых частиц использовали общепринятый метод Лоури. Степень окисления АпоЛП в составе ЛП также оценивали по содержанию SH-групп.
Число сульфгидрильных групп определяли с помощью реактива Эллмана (5,5 дитиобис-2-нитробензойная кислота) по реакции тиол-дисульфидного обмена в щелочной среде колориметрическим методом [Северин, 1989]. Расчет концентраций SH-групп рассчитывали по разности оптических плотностей, с экстинкции 14000 М-1 · см-1 (при использованием коэффициента молярной длине волны 412 нм). О степени десиалирования АпоЛП судили по содержанию сиаловых кислот (СК) в подфракциях ЛП. Уровень СК определяли колориметрическим методом с помощью диагностического набора «Сиалотест» (Россия) при длине волны 540 нм. Степень фрагментации модифицированных АпоЛП оценивали по методу S.P. Wolff (1986). В надосадочной жидкости определяли кислоторастворимые пептиды при длинах волн 254, 272 и 280 нм.
Степень фрагментации АпоЛП выражали в единицах оптической плотности.
Данные, полученные в результате исследования, были подвергнуты статистической обработке параметрическим методом вариационной статистики по критерию Фишера-Стьюдента путем подсчета средней арифметической (M), среднего квадратического отклонения (s), средней ошибки средней арифметической (mМ) и средней ошибки средней величины (m%). Достоверность полученных различий между средними величинами определяли при помощи вычисления средней ошибки разности, степень достоверности - по таблице Стьюдента-Фишера. Взаимосвязь между исследуемыми признаками анализировали с использованием программы «корреляционный анализ», при этом достоверность выявленных связей определяли по достижению коэффициентами “r”пороговых величин, соответствующих размерам анализируемой выборки и заданной значимости достоверности.
Результаты исследования и их обсуждение Аполипопротеиновый спектр крови при атерогенных ДЛП Как видно из данных таблицы 1, в опытной группе происходит перераспределение ХС в сторону увеличения атерогенной фракции: 46% повышение в ЛНП и 20% снижение в ЛВП по сравнению с контролем. В итоге КА в опытной группе превышал значение контроля на 87%. Важно отметить 36% повышение ТГ в опытной группе, что может свидетельствовать как о нарушении процессов ассоциации н-ЛОНП с динамичными АпоЛП (апоС-II и апоА-V), так и о снижении активности постгепариновой ЛПЛ. Поскольку основная функция ЛП заключается в транспорте к клеткам ЖК, в виде неполярных транспортных форм в ассоциации либо с ХС (в виде ЭХС), либо с глицерином (в виде ТГ), определение содержания в сыворотке крови ХС и ТГ является основным тестом оценки липид-переносящей системы ЛП [Титов, 2006].
Таблица 1.
Показатели липидного обмена у обследованных лиц (М±m) Опытная группа Контрольная группа р (n = 44) (n = 12) ОХС, ммоль/л 6,27 ± 0,15 5,06 ± 0,30 0, ХС ЛОНП, моль/л 0,86 ± 0,05 0,56 ± 0,08 0, ХС ЛНП, ммол/л 4,22 ± 0,13 3,01 ± 0,24 0, КА 4,52 ± 0,12 2,40 ± 0,13 0, ХС ЛВП, моль/л 1,19 ± 0,035 1,49 ± 0,09 0, ФЛ ЛВП, моль/л 0,88 ± 0,03 1,2 ± 0,08 0, ТГ, моль/л 1,88 ± 0,10 1,21 ± 0,17 0, НЭЖК, мэкв/л 0,47 ± 0,01 0,38 ± 0,02 0, Примечание: n – число обследованных в группе;
р - достоверность различий с контролем.
В связи с этим, высокий уровень ХС ЛНП при ДЛП может свидетельствовать о нарушении транспорта эссенциальных полиненасыщенных ЖК и их возможном дефиците в клетках, а низкий уровень ХС ЛВП, отражающий транспорт ХС от клеток, в виде моно-ЭХС, отражает задержку ХС в клетках и, соответственно, высокую вероятность атерогенеза. При исследовании АпоЛП спектра (табл. 2) в опытной группе было выявлено 25% повышение уровня апоВ по сравнению с контролем при высокой степени его корреляции с уровнями ОХС (r = 0,82) и ХС ЛНП (r = 0,78). При этом наблюдалось практически 60% повышение индекса апоВ/апоА-I, который в настоящее время служит независимым критерием диагностики атерогенных дислипопротеинемий [Северин, 2000].
Таблица 2.
Аполипопротеиновый спектр крови у лиц с атерогенными ДЛП(М±m) Опытная группа Контрольная группа р (n = 44) (n = 12) апоА-I, г/л 1,52 ± 0,036 1,67 ± 0,09 0, апоВ, г/л 1,23 ± 0,028 0,92 ± 0,06 0, апоВ/апоА 0,84 ± 0,026 0,55 ± 0,02 0, апоЕ, мг/дл 3,4 ± 0,14 2,2 ± 0,26 0, апоС-III, мг/дл 9,01 ± 0,17 7,79 ± 0,67 0, Примечание: n – число обследованных в группе;
р - достоверность различий с контролем.
Высокие уровни апоВ и ХС ЛНП при атерогенных ДЛП, по-видимому, связаны с неэффективностью апоВ/апоЕ рецепторного взаимодействия и невозможностью поглощения клетками эссенциальных полиненасыщенных ЖК (ЭПНЖК) для которых ХС ЛНП является своеобразной матрицей, доставляющей их ко всем клеткам организма [Титов, 1999]. Важно отметить у лиц опытной группы 13,5% повышение уровня апоС-III по сравнению с контролем. При этом апоС-III опытной группы положительно коррелировал с высокими значениями ТГ (r = 0,72), что подтверждает его ингибирующее действие на ЛПЛ [Mauger, 2006]. Отмеченное 35% повышение уровня апоЕ в опытной группе, может свидетельствовать о конформационных изменениях АпоЛП при ДЛП, поскольку реализация биологического эффекта этого динамичного АпоЛП (взаимодействие с апоВ/апоЕ рецепторами) может быть осуществлена только в результате взаимодействия с определенным доменом структурных АпоЛП. Таким образом, обнаруженное изменение АпоЛП спектра крови при ДЛП, лежит в основе нарушения транспорта и обмена липидов крови.
Перекисное окисление липидов в ЛП частицах при атерогенных ДЛП.
Увеличение времени циркуляции ЛП в крови, несомненно, повышает вероятность окислительной модификации липидных компонентов в составе ЛП частиц, что дало предпосылку для определения продуктов ПОЛ. Было выявлено повышение относительного содержания ДК (ЕИО 232/220) в гептанофильной фракции апоВ-содержащих ЛП и ЛВП опытной группы относительно значений контроля на 16% и 14%, а в изопропанольной фракции на 55% и 26% соответственно, что свидетельствует об интенсификации процессов свободно-радикального окисления (СРО) жирных кислот, входящих в состав этих частиц. Известно, что высокие уровни вторичных продуктов липопероксидации - КД и СТ рассматриваются в качестве потенциальных маркеров атерогенной опасности [Волчегорский И.А., 2003]. Обнаруженное практически двукратное повышение в опытной группе уровня вторичных продуктов ПОЛ в составе апоВ-содержащих ЛП и ЛВП, в сочетании с их повышенным содержанием в изопропанольной фракции (на 31% и 24,3% соответственно), а также наличие обратной корреляционной зависимости между изопропанол-растворимыми КД, СТ и уровнем ФЛ ЛВП (r = - 0,75;
р 0,05), несомненно, указывает на низкую способность ФЛ выступать в качестве донора ненасыщенных ЖК, участвующих в этерификации свободного ХС ЛВП под действием фермента ЛХАТ.
Химическая модификация аполипопротеинов при атерогенных ДЛП.
Несомненно, СРО могут подвергаться все компоненты ЛП. Из данных, представленных в таблице 3 видно, что у лиц с ДЛП наблюдается окислительная модификация АпоЛП во всех классах ЛП.
Таблица 3.
Содержание продуктов окислительной модификации аполипопротеинов у лиц с атерогенными дислипопротеинемиями (М±m) Опытная группа (n = 44) Контрольная группа (n = 12) АФГ КФГ АФГ КФГ ЛНП+ЛОНП 14,51 ± 0,25 * 3,66 ± 0,11 * 9,26 ± 0,14 2,64 ± 0, ЛВП 6,69 ± 0,11 * 1,75 ± 0,03* 5,62 ± 0,23 1,32 ± 0, Примечание: n – число обследованных в группе;
* - достоверность различий с контролем (р 0,01) Так содержание АФГ апоВ-содержащих ЛП и ЛВП в опытной группе превышало значения контроля на 57% и 20%, а КФГ на 39% и 32,6%, соответственно. Следует отметить, что окислительная модификация АпоЛП более интенсивно протекала во фракции апоВ-содержащих ЛП, что, несомненно, существенно повышало их атерогенный потенциал.
Важно отметить, что корреляционный анализ не выявил зависимости между уровнями продуктов ПОЛ и продуктов окислительной модификации АпоЛП в разных фракциях ЛП частиц, что согласуется с полученными ранее данными, о независимости процесса окислительной модификации АпоЛП от процесса окисления липидного компонента ЛП частиц при СРО [Рагино, 2007]. При этом, даже «минимально» окисленные ЛП не распознаются апоВ/Е рецепторами апоВ-содержащих ЛП, в результате окислительной модификации апоВ-100, ведущей к изменению его конформации, что приводит к активации скэвенджер рецепторов макрофагов, инициирующих возникновение и прогрессирование атеросклероза [Dhaliwal, 1999, Watson, 1997]. Известно, что индикатором структурных изменений белка и его комплексов является уровень сульфгидрильных групп [Соколовский, 1996]. Как видно из представленных данных в табл. 4, в опытной группе происходит снижение концентрации SH групп апоВ-содержащих ЛП на 40%, при этом в ЛВП уровень SH-групп не отличался от контроля, что подтверждает устойчивость ЛВП к окислению и возможности их элиминации из кровотока не зависимо от степени окисленности белкового компонента [Плавинский, С.Л., 1999].
Таблица 4.
Уровень сульфгидрильных групп во фракциях ЛП у лиц с атерогенными дислипопротеинемиями (М±m) показатели Опытная группа Контрольная р (n=44) группа (n=12) SH-группы ЛВП, 0,28 ± 0,03 0,31 ± 0,07 0, ммоль/л SH-группы ЛОНП 0,06 ± 0,005* 0,10 ± 0,02 0, + ЛНП, ммоль/л Примечание: n – число обследованных в группе;
* - достоверность различий с контролем.
В настоящее время перекисная модификация белка рассматривается как сигнал к его последующей деградации [Дубинина, 1993;
Алабовский, 2005]. Если эти процессы протекают во внеклеточном пространстве, то сопровождаются образованием средних и малых молекул, уровень которых рассматривается как один из показателей эндогенной интоксикации организма. Результаты исследования показали, что в опытной группе, содержание общих продуктов протеолиза, регистрируемых при длине волны 254 нм, в составе ЛВП повышено на 10%, а в составе апоВ-содержащих ЛП на 13%, по сравнению с контрольной группой. На протеолиз окислительно модифицированных АпоЛП также указывает 30% и 25% повышение в опытной группе уровня пептидов, содержащих ароматические группировки, определяемых при = 272 нм, в апоВ содержащих ЛП и в ЛВП соответственно.
При исследовании корреляционной зависимости между степенью окисленности АпоЛП и уровнями продуктов протеолиза была установлена положительная корреляция между уровнем ароматических пептидов и уровнем КФГ (r = 0,72;
р 0,05) апоВ-содержащих ЛП. В целом, полученные результаты указывают на активацию протеолитических систем у лиц ДЛП, физиологический смысл которой состоит в деградации «недоокисленных» АпоЛП, что и приводит к образованию низкомолекулярных пептидов.
Важную роль в процессах химической модификации АпоЛП отводят их десиалированию [Белова, 2000;
Мельниченко, 2005]. Из данных, представленных в таблице 5 видно, что в апоВ-содержащих ЛП уровень сиаловых кислот в опытной группе снижен на 35% по сравнению с контрольной группой, при этом в ЛВП достоверных различий не наблюдалось.
Таблица 5.
Уровень сиаловых кислот в подфракциях ЛП частиц у лиц с атерогенными ДЛП (М±m) показатели Опытная группа (n=44) Контрольная группа р (n=12) СК ЛНП, ммоль/л 0,37 ± 0,01* 0,57 ± 0,05 0, СК ЛВП, ммоль/л 0,87 ± 0,03 1,10 ± 0,3 0, Примечание: n – число обследованных в группе;
* - достоверность различий с контролем.
Таким образом, ДЛП сопровождаются целым комплексом химических модификаций АпоЛП, причем преимущественно в апо-В-ЛП, что, с одной стороны можно рассматривать как адаптивный процесс, направленный на удаление эндогенных патогенов из кровотока, а с другой, как процесс, приводящий к конформационным изменениям АпоЛП и, как следствие, к нарушению биологической функции комплексов.
Влияние ПГГ на динамику липидного и аполипопротеинового спектра крови при атерогенных ДЛП При изучении влияния ПГГ на ЛП обмен (рис.1) было выявлено, что у лиц с атерогенными дислипопротеинемиями месячный курс адаптации к гипоксии сопровождается снижением ОХС на 15%, ХС ЛОНП на 24%, ХС ЛНП на 16% и повышением ХС ЛВП на 11%, что отразилось в снижении КА на 32%.
* ОХС, ммоль/л 6, 5, * ИА, у.е.
* 5 4, ХСЛНП 4, 3, 3, * ТГ, ммоль/л * * 1, ХСЛВП, * ФЛ ЛВП, ммоль/л ХСЛОНП, * 1, 1,19 1,33 ммоль/л ммоль/л 0,88 1,19 НЭЖК, 0,86 мэкв/л 0, 0, 0, Рис. 1. Влияние курса ПГГ на липидный спектр крови у лиц с атерогенными дислипопротеинемиями.
Примечание: * - достоверность различий до и после курса ПГГ (р 0,05) Выявленный факт увеличения под действием ПГГ уровня ФЛ в составе ЛВП (на 27%), по-видимому, лежит в основе механизма известной постадаптационной индукции ЛХАТ – реакции [Твердохлиб, 1989]. Об этом свидетельствует и увеличение соотношения ФЛ/ХС на 20% в составе ЛВП после курса ПГГ, поскольку высокое содержание фосфолипидов в этих частицах позволяет служить им эффективным акцептором свободного ХС, в том числе и ХС клеточных мембран, а присутствие динамичных АпоЛП, стимулирует его последующую этерификацию, протекающую при участии ЛХАТ [Томпсон, 1991]. При изучении влияния адаптации к ПГГ на АпоЛП спектр ЛП крови опытной и контрольной групп обращает на себя внимание разнонаправленность изменения уровня транспортных и динамичных апопротеинов (повышение на 20% апоЕ и снижение на 15% апоВ) в опытной группе. При этом наблюдаемое постадаптационное снижение АпоЛП индекса апоВ/апоА-I на 25% (рис. 2) в опытной группе, несомненно, отражает снижение атерогенности ситуации и, по-видимому, связано с увеличением скорости элиминации апоВ-содержащих ЛП из кровотока.
апоА-I, г/л 1, 1, 1, * апоВ, г/л 1, 1, 1, 1, * апоВ/апоА-I, у.е.
0, 0, 0, 0, 0, 0, Рис. 2. Изменение уровня транспортных апопротеинов у лиц с атерогенными дислипопротеинемиями после курса ПГГ.
Примечание: * - достоверность различий до и после курса ПГГ в опытной группе (р 0,05) Данные о влиянии курса ПГГ на уровень динамичных АпоЛП у лиц опытной группы отражены на рисунке 3. Как видно из этого рисунка, курс ПГГ сопровождается увеличением в опытной группе уровня апоС-III на 10%, при этом стоит отметить постадаптационное снижение корреляционной зависимости между уровнями апоС-III и ТГ (с r = 0,72 до r = 0,47;
р 0,05), что, возможно, свидетельствует о снижении ингибирующего эффекта апоС-III на ЛПЛ.
Интересен факт 20% повышения апоЕ у лиц опытной группы после курса адаптации к ПГГ, учитывая, что это происходит на фоне снижения ХС ЛОНП и ХС ЛНП осуществляемого, несомненно, по апоВ/апоЕ-рецепторному пути, что должно привести и к соответствующему снижению в крови и апоЕ, чего не наблюдается. Это позволяет сделать предположение, что в ходе адаптационной активации генетического аппарата клеток [Меерсон, 1973], направленной, по видимому, в том числе и на поддержание функциональной системы липидного транспорта, в основном активируется синтез динамичных АпоЛП, содержащихся, преимущественно, в ЛВП, а механизм повышения апоЕ у лиц с ДЛП, и лиц, прошедших курс ПГГ различен.
* апоСIII, мг/дл 10, 9, * апоЕ, мг/дл 4, 3, Рис. 3. Изменение уровня динамичных апопротеинов у лиц с атерогенными дислипопротеинемиями после курса ПГГ.
Примечание: * - достоверность различий до и после курса ПГГ в опытной группе, р 0, Влияние адаптации к действию ПГГ на состояние процессов СРО липидных компонентов ЛП крови при атерогенных ДЛП При изучении влияния ПГГ на состояние СРО в липидных компонентах ЛП было показано, что месячный курс адаптации к ПГГ приводит к снижению ДК как в апоВ-содержащих ЛП, так и в ЛВП на 22% и 22,5% в гептанрастворимой фракции и на 29% и 20% в изопропанолрастворимой фракции, соответственно (табл. 6). При этом следует отметить, что в опытной группе происходило более существенной снижение уровней ДК по сравнению с контрольной, что еще раз подтверждает наблюдение о преимущественном влиянии адаптации к ПГГ на те величины, которые существенно отклоняются от нормы [Меерсон, 1989]. При исследовании влияния ПГГ на содержание вторичных продуктов ПОЛ в различных подфракциях ЛП, было обнаружено, что уровень КТ и СТ в гептанофильной и изопропанолрастворимой фракциях апоВ-содержащих ЛП и ЛПВ опытной группы после адаптации к ПГГ снижается практически в 2 раза.
Учитывая, что высокие уровни вторичных продуктов ПОЛ, отражают степень окисленности полиеновых ЖК, транспортируемых в структуре ЛП, то данный факт может рассматриваться как положительный момент адаптации, направленный на снижение атерогенности ЛП частиц.
Таблица 6.
Влияние адаптации к ПГГ на активность ПОЛ в ЛП крови (М±m) Опытная группа Контрольная группа (n = 44) (n = 12) До ПГГ После ПГГ До ПГГ После ПГГ ЕИО ЕИО ЕИО ЕИО ЕИО ЕИО ЕИО ЕИО 232/220 278/220 232/220 278/220 232/220 278/220 232/220 278/ апоВ-ЛП 0,78 0,11 0,61 0,06 0,67 0,07 0,64 0,07 ± (гептановая ± 0,01 ± 0,01 ± 0,02 ± 0,01 ± 0,01 ± 0,01 ± 0,01 0, фракция) * * ЛВП 0,71 0,12 0,55 0,07 ± 0,61 ± 0,08 ± 0,50 0, (гептановая ± 0,01 ± 0,01 ± 0,01 0,005 0,003 0,002 ± 0,01 ± 0, фракция) * * апоВ-ЛП 0,75 0,38 0,53 ± 0,20 0,48 0,33 0,46 0, (изопропан. ± 0,01 ± 0,01 0,02 ± 0,01 ± 0,07 ± 0,04 ± 0,03 ± 0, фракция) * * ЛВП 0,64 0,46 0,51 0,22 0,51 0,37 0,42 ± 0,20 ± (изопропан. ± 0,01 ± 0,01 ± 0,01 ± 0,01 ± 0,05 ± 0,04 0,004 0, фракция) * * Примечание: n – число обследованных в группе;
* - достоверность различий до курса ПГГ между опытной и контрольной группами, р 0,05;
достоверность отличий после курса ПГГ в опытной группой, р 0,05;
- достоверность отличий после курса ПГГ между опытной и контрольной группами;
р 0,05;
- достоверность различий в контрольной группе до и после курса ПГГ, р 0, Таким образом, под влиянием адаптации к гипоксии происходит уменьшение окисленных ЛП, в результате чего возрастает элиминация ЛП частиц из кровотока с участием апоЕ рецепторного пути, который, в настоящее время считается, доступным и для ЛВП [Титов, 2006;
Rader, 2006].
Влияние ПГГ на СРО белковых компонентов ЛП частиц крови Поскольку структурная организация ЛП частиц и их функциональная активность определяется, в первую очередь, их Апо-ЛП составом, важно было изучить влияние адаптации к ПГГ на степень окисленности Апо-ЛП при атерогенных ДЛП. Как видно из данных, представленных на рис. 4, в опытной группе, курс ПГГ сопровождается снижением первичных продуктов окислительной модификации апопротеинов (АФГ) в апоВ-содержащих ЛП на 21% и в ЛВП на 30%. Несомненно, снижение содержания АФГ в ЛВП на фоне возросшего в них количества ХС, свидетельствует об оптимизации нативной конформации апоА-I, улучшающей взаимодействие данного транспортного апопротеина с ЛХАТ и с ХС на поверхности насцентных ЛВП.
е.о.п. на 1мг белка * АФГ апоВ-ЛП 14, 11, * АФГ ЛВП 6, 4, Рис. 4. Влияние ПГГ на уровень АФГ в апоВ-содержащих ЛП и ЛВП у лиц опытной группы.
Примечание: * - достоверность различий до и после курса ПГГ в опытной группе (р 0,05) При этом, выявленный факт снижение АФГ, являющихся ранними маркерами окислительного стресса, в ЛП частицах, можно связать и с возросшей мощностью антирадикальной защиты ЛВП, которые не только защищают себя от свободно-радикального окисления, но и, действуя как «ловушки» супероксидного радикала, способны предохранять ЛНП от окисления, оказывая протективное действие [Павлинский, 1999].
Данные о влиянии адаптации к действию ПГГ на устойчивость АпоЛП к окислению представлены на рисунке 5. Как видно, в опытной группе наблюдается постадаптационное снижение уровня КФГ как в апоВ содержащих ЛП (на 34%), так и в ЛВП (на 20,5%). Позитивный эффект адаптации к действию ПГГ нашел свое отражение и в повышении уровня сульфгидрильных групп на 50% в апоВ-содержащих ЛП и на 14% в ЛВП опытной группы.
е.о.п. на 1 мг белка * КФГ апоВ-ЛП 3, 3, 2, * КФГ ЛВП 2, 1, 1, 1, 0, Рис. 5. Изменение уровней КФГ в подфракциях апоВ-содержащих ЛП и ЛВП после адаптации к ПГГ у лиц опытной группы.
Примечание: * - достоверность различий до и после курса ПГГ в опытной группе (р 0,05) Для получения более полной картины, позволяющей оценить изменение степени окислительной деструкции АпоЛП под действием ПГГ, в сыворотке крови лиц как опытной, так и контрольной групп был определен уровень продуктов протеолиза белковых компонентов ЛП частиц, как показатель активности физиологического механизма деградации окислительно модифицированных белков. Как видно из данных, представленных в таблице 8, в опытной группе месячный курс воздействия ПГГ сопровождался снижением общих продуктов протеолиза как в составе апоВ-содержащих ЛП, так и ЛВП.
При этом обращает на себя внимание существенное снижение у лиц с ДЛП в составе апоВ-содержащих ЛП уровня пептидов, содержащих ароматические группировки (на 40%) и пептидов неароматической природы (на 25%), а в составе ЛВП - на 35% и 40% соответственно.
Таблица 8.
Изменение уровней среднемолекулярных пептидов в ЛП частицах под действием адаптации к ПГГ (М±m) Опытная группа Контрольная группа (n=44) (n=12) апоВ-ЛП ЛВП апоВ-ЛП ЛВП До После До После До После До После 254 нм 1,44 1,36 1,55 1,38 ± 1,35 1,27 1,43 1, ± 0,05 ± 0,06 ± 0,01 0,04 ± 0,03 ± 0,03 ± 0,1 ± 0, * * 272 нм 0,17 0,10 ± 0,20 ± 0,13 0,13 0,11 ± 0,15 0, ± 0,03 0,003 0,007 ± 0,03 ± 0,06 0,05 ± 0,06 ± 0, * * 280 нм 0,08 ± 0,06 0,16 0,09 ± 0,06 0,05 0,05 0, 0,003* ± 0,01 ± 0,01* 0,003 ± 0,04 ± 0,03 ± 0,03 ± 0, Примечание: n – число обследованных в группе;
* - достоверность различий до курса ПГГ между опытной и контрольной группами (р 0,05);
достоверность отличий после курса ПГГ в опытной группе (р 0,05);
- достоверность отличий после курса ПГГ между опытной и контрольной группами (р 0,05) Следует отметить, что большинство изучаемых показателей протеолиза АпоЛП у лиц опытной группы после курса ПГГ достоверно не отличались от аналогичных показателей контрольной группы. Таким образом, полученные результаты согласуются с известным положением о взаимосвязи степени окисленности белка с его деградацией протеолитическими системами.
Применительно к данному случаю, постадаптационная стабилизация СР процессов у лиц с ДЛП, привела к существенному снижению оксидативного повреждения АпоЛП различных подфракций ЛП и, соответственно, их протеолиза. В настоящее время не вызывает сомнений, что десиалирование АпоЛП вызывает формирование аномальной структуры белка, запускающий процесс активации системы мононуклеарных фагоцитов, направленный на удаление модифицированных ЛП из кровотока [Аксенов Д.В, 2007]. При изучении влияния ПГГ на процессы десиалирования апопротеинов при атерогенных ДЛП выявлен факт 21% повышения уровня сиаловых кислот в ЛВП и 23% в апоВ-содержащих ЛП опытной группы после курса ПГГ (табл.8).
Таблица 8.
Влияние курса ПГГ на изменение уровня сиаловых кислот в апоВ содержащих ЛП и ЛВП (М ± m) Показатели Опытная группа Контрольная группа (n=44) (n=12) До курса ПГГ После ПГГ До курса ПГГ После ПГГ СК ЛНП, 0,37 ± 0,01 0,48 ± 0,06 0,57 ± 0,05 0,61 ± 0, ммоль/л * СК ЛВП, 0,87 ± 0,03 1,11 ± 0,3 1,10 ± 0,3 1,15 ± 0, ммоль/л * СК лнп/апоВ 0,30 ± 0,09 0,46 ± 0,04 0,62 ± 0,02 0,66 ± 0, * Примечание: n – число обследованных в группе;
* - достоверность различий до курса ПГГ между опытной и контрольной группами, р 0,05;
- достоверность отличий после курса ПГГ в опытной группой, р 0, При этом, повышение индекса СКлнп/апоВ на 35% отражает снижение химической модификации, прежде всего, апоВ, путем его десиалирования, и может рассматриваться как один из механизмов реализации позитивного эффекта адаптации к ПГГ при дислипопротеинемиях. Подтверждением данного факта является наличие корреляционной зависимости между уровнем апоВ и уровнем СК апоВ-содержащих ЛП (r = 0,72;
р 0,05). Высокое содержание сиаловых кислот в ЛВП опытной группы после адаптации к ПГГ, по-видимому, можно связать и с увеличением концентрации апоС-III, т.к. именно он является гликопротеином, несущим остатки сиаловых кислот на конце углеводной цепи [А.Н. Климов, 1999]. Таким образом, повышение концентрации сиаловых кислот в составе АпоЛП после месячного курса воздействия ПГГ указывает на восстановление их структурно-функциональной организации, а, следовательно, и функциональной активности.
Выводы 1. В основе развития атерогенных дислипопротеинемий лежат количественные и качественные изменения АпоЛП спектра крови, отражающие реальную картину перераспределения ХС в липопротеиновых частицах 2. Курс адаптации к ПГГ нормализует функцию липид-переносящей системы организма, что выражается в существенном снижении КА.
3. Постадаптационная нормализация функции липид-переносящей системы организма реализуется как через активацию синтеза динамичных апопротеинов, так и ограничение их химической модификации.
4. Определение продуктов химической модификации АпоЛП может быть рекомендовано в качестве биохимических тестов для оценки эффективности курса ПГГ при сердечно-сосудистых заболеваниях.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Гирина, Л.В. Влияние адаптации к действию периодической гипобарической гипоксии на некоторые характеристики липопротеинового спектра крови у лиц с атерогенными дислипопротеидемиями [Текст] /А.А. Никоноров // Молодежь и наука:
итоги и перспективы. - Материалы межрегиональной научно практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. - Саратов, 2006. – С. 2. Гирина, Л.В. Влияние процессов окислительной модификации липидов и белков липопротеидов крови на показатели гемостаза у лиц с атерогенными дислипопротеидемиями [Текст] /А.А. Никоноров, И.А.
Александрова, Н.А. Овчинникова, И.В. Гончарук //Экология человека. 2006. – Т.4, №2. – С. 213-217.
3. Гирина, Л.В. Влияние периодической гипобарической гипоксии на липидный спектр и уровень апопротеинов крови у лиц с атерогенными дислипопротеидемиями [Текст] /Л.В. Гирина //Вестник ОГУ. – 2006. №12. – С. 220- 4. Гирина, Л.В. Оценка липидного спектра у детей с сахарным диабетом I типа [Текст] /Николаева С.Н., Л.П. Кулагина, Е.Н. Лебедева // Материалы V Всероссийского конгресса эндокринологов «Высокие медицинские технологии в эндокринологии. Биохимические аспекты в эндокринологии. – М., 2006. - С.933.
5. Гирина, Л.В. Влияние периодической гипобарической гипоксии на процессы окислительной модификации липопротеидов крови у лиц с атерогенными дислипопротеидемиями [Текст] /Л.В. Гирина //Материалы II Пироговской студенческой научной медицинской конференции. - М., 2007. - Вестник РГМУ. – 2007 (приложение) – С. 6. Гирина, Л.В. Влияние периодической гипобарической гипоксии на процессы десиалирования апоВ-содержащих липопротеидов крови и их окислительную модификацию у лиц с атерогенными дислипопротеинемиями [Текст] /Л.В. Гирина // Тезисы международной научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы медицины». – Харьков,2007. - Вестник ХНУ. – (приложение) - С.43.
7. Гирина, Л.В. Адаптация к действию периодической гипобарической гипоксии снижает выраженность химической модификации липопротеидов крови у лиц с атерогенными дислипопротеинемиями [Текст] /Л.В. Гирина //Экология человека. – 2007. (приложение). - С. 8. Гирина, Л.В. Химическая модификация липопротеинов крови при атерогенных дислипидемиях [Текст] /А.А. Никоноров //Вятский медицинский вестник. – 2007. - №4. – С. 44-46.
9. Гирина, Л.В. К возможности коррекции химической модификации апопротеинов крови у лиц с дислипопротеинемиями адаптацией к действию периодической гипобарической гипоксии [Текст] /А.А.
Никоноров //Вятский медицинский вестник. – 2007. - №4. – С. 131-133.
10. Гирина, Л.В. Химическая модификация апопротеинов крови у лиц с атерогенными дислипопротеинемиями и ее коррекция периодической гипобарической гипоксией [Текст] /А.А. Никоноров, А.Б. Прокофьев, А.Н. Тиньков //Вестник ОГУ. - 2007. - № 12 – С. 117 – 123.
11. Гирина, Л.В. Роль химической модификации апопротеинов в развитии атерогенных дислипопротеинемий [Текст] / А.А. Никоноров //Сборник материалов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. - Новосибирск: «Арта», 2008. – С. 12. Гирина, Л.В. Периодическая гипобарическая гипоксия снижает степень окислительной и протеолитической деструкции апопротеинов крови при атерогенных дислипопротеинемиях [Текст] / А.А. Никоноров //Сборник материалов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. - Новосибирск: «Арта», 2008. – С. 13. Гирина, Л.В. Влияние периодической гипобарической гипоксии на процессы окислительной модификации белков липопротеинов крови и некоторые показатели системы гемостаза при атерогенных дислипопротеинемиях [Текст] / А.А. Никоноров //Астраханский медицинский журнал (приложение). – 2008. – Т.3 - №3 – С.79-82.