Усовершенствование лабораторной диагностики урогенитальной хламидийной инфекции
На правах рукописи
ЗОЕРМАН Вера Михайловна УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ УРОГЕНИТАЛЬНОЙ ХЛАМИДИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ 03.00.07 Микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Пермь – 2007
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Урогенитальные инфекционные заболевания, обусловленные как патогенными, так и условно-патогенными микроорганизмами, наносят значительный экономический и демографический ущерб. Исследования, проведенные в клиниках разных стран, свидетельствуют о том, что нарушения репродуктивной функции человека среди инфицированных лиц в 50-90% случаев вызваны моно - либо смешанной хламидийной инфекцией (Серов и др., 2003). По данным Л.К.
Глазковой (2001), лишь у 32,9% женщин воспалительный процесс гениталий обусловлен только Clаmydia trachomatis, у 67,1% регистрируется смешанная хламидийная инфекция. Чаще всего хламидии сочетаются с уреаплазмами в 12,5%, гарднереллами - 14,8%, одновременно с теми и другими - 13,6%. В то же время статистически достоверные данные о распространенности смешанной хламидийной инфекции среди различных групп населения, составе микробных ассоциаций немногочисленны и зачастую достаточно противоречивы. Факторы, связанные с риском заражения урогенитальными инфекциями, на первый взгляд, очевидны: незащищенные половые контакты, большое количество половых партнеров, представляющих так называемое рискованное половое поведение (Кубанова и др., 2004;
Jepser et al., 2003).
В то же время отмеченные тенденции к дальнейшему повышению уровня заболеваемости урогенитальными инфекциями обусловлены не только прошедшей «сексуальной революцией», но и совершенствованием методов лабораторной диагностики латентных и вялотекущих форм заболеваний урогенитального тракта.
Выраженный полиморфизм клинических проявлений и отсутствие патогномоничных симптомов значительно осложняют клиническую диагностику смешанных хламидийных инфекций. В этих случаях решающее значение при постановке диагноза приобретают лабораторные методы исследования (Козлова и др., 2003;
Lau et al., 2002). Однако, к выбору методов диагностики и интерпретации полученных результатов при выявлении урогенитального хламидиоза, особенно его смешанных форм, нет единого подхода. В настоящее время предложено большое количество лабораторных тестов, обладающих различной чувствительностью и специфичностью. Каждый из них имеет свои преимущества и ограничения.
Разнообразие применяемых методов и тест-систем создают предпосылки для разночтений при интерпретации результатов исследования, а, следовательно, и в постановке диагноза. Это диктует необходимость разработки оптимального для практики алгоритма лабораторного обследования на урогенитальный хламидиоз, и, главным образом, его микстформ, с учетом биологических особенностей патогенов-ассоциантов. Такой метод, как нам представляется, должен быть построен по принципу «от простого и относительно экономичного метода - к более сложному и соответственно более дорогостоящему».
Цель настоящего исследования - оптимизация лабораторной диагностики урогенитальной хламидийной инфекции.
Основные задачи исследования 1. Определить уровень инфицирования возбудителями урогенитальных инфекций населения г. Перми.
2. Оценить результативность диагностических тестов, используемых для выявления различных урогенитальных инфекций у лиц, обратившихся в диагностический центр с клинически выраженными и бессимптомными формами инфекции, а также у беременных женщин.
3. Дать сравнительную оценку диагностической значимости традиционных методов выявления урогенитального хламидиоза в случае моно - и микстинфекции.
4. Разработать алгоритм лабораторного обследования больных моно и смешанной хламидийной инфекцией с учетом биологических особенностей микробных ассоциантов.
Научная новизна. Дана комплексная оценка степени информативности различных методов лабораторной диагностики урогенитального хламидиоза в зависимости от биологических особенностей микробных ассоциантов.
Обосновано, что в качестве скрининг-теста на определение возбудителей урогенитальных инфекций, целесообразно использовать полимеразную цепную реакцию. Установлено, что сочетанное использование полимеразной цепной реакции и иммуноферментного анализа значительно повышает степень эффективности лабораторной диагностики урогенитальных инфекций и практически во всех случаях позволяет выявлять как моно -, так и смешанную хламидийную инфекцию.
В результате анализа большого объема клинического материала с использованием «прямых» и «непрямых» методов лабораторной диагностики выявлен высокий уровень инфицированности возбудителями урогенитальных инфекций различных групп населения. При этом обнаружено, что при сочетанном использовании ПЦР и ИФА обнаружена широкая циркуляция уреа - и микоплазм среди жителей г. Перми. На основании данных комплексного лабораторного обследования установлена высокая частота встречаемости возбудителей урогенитальных инфекций у практически здоровых лиц и беременных женщин.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление об урогенитальной хламидийной инфекции и методах ее диагностики. В практическом плане результаты проведенных исследований позволяют оптимизировать лабораторную диагностику урогенитальных инфекций и свидетельствуют о необходимости проведения комплексного лабораторного обследования с использованием полимеразной цепной реакции и иммуноферментного анализа при подозрении на моно - или смешанную хламидийную инфекцию. Достаточно высокий уровень инфицирования возбудителями урогенитальных инфекций практически здорового населения, обуславливает целесообразность проведения профилактических осмотров у лиц сексуально-активного возраста с использованием скрининг-теста на основе ПЦР.
Обоснована необходимость обследования на урогенитальный хламидиоз беременных женщин для своевременного выявления данной инфекции.
Разработанный алгоритм лабораторного обследования больных смешанной хламидийной инфекцией может быть использован для практического применения в лечебно-профилактических учреждениях венерологического и гинекологического профиля.
Основные положения, выносимые на защиту 1. В результате целенаправленного использования комплекса взаимодополняющих диагностических методов обследования с применением «прямых» и «непрямых» тестов выявляет хламидийной инфекции должна проводиться с учетом биологических особенностей микробных ассоциантов.
Внедрение результатов исследований в практику. Результаты исследований внедрены в работу Пермского областного кожно венерологического диспансера (614000 Пермь, Леонова, 37. Тел: (342) 269548) и лабораторно-диагностического центра ООО «Лабдиагностика» (614000 Пермь, ул. 9-е МАЯ, 18а. Тел: (342) 2298333). Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедрах кожно венерических болезней, микробиологии, вирусологии и иммунологии Пермской государственной медицинской академии.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийской Научно практической конференции «Медицинская микробиология - XXI век», Саратов, 2004;
Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы теоретической и клинической медицины», Пермь, 2005;
Межрегиональной конференции «Иммунология вчера, сегодня, завтра», Пермь, 2005. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.
Связь работы с научными программами.
Работа выполнена в соответствии с общим планом НИР «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера Pосздрава» (номер госрегистрации 01.200502713).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 221 источника, из них 128 отечественных и зарубежных. Работа иллюстрирована 31 таблицей и 7 рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Проведено лабораторное обследование 62 676 человек, обратившихся в медицинский центр по различным причинам, из них 40 739 женщин и 934 мужчин в возрасте от 15 до 45 лет. Все пациенты, в зависимости от причины обращения, разделены на четыре группы (табл. 1). Первую группу (14 720 мужчин, 17 765 женщин) составили пациенты, направленные врачами различных клиник по поводу воспалительных заболеваний урогенитального тракта. Вторую группу (5 598 мужчин, 8 159 женщин) пациенты, не предъявлявшие жалоб, обратившиеся в диагностический центр в связи со случайными половыми контактами. Третью группу - 11 беременных женщин. Четвертую группу (1 616 мужчин, 2 935 женщин) здоровые лица, не имеющие в анамнезе воспалительных заболеваний мочеполовых органов и отрицающие случайные половые контакты.
За период наблюдения исследовано 18 871 образец сывороток крови в иммуноферментном анализе (ИФА), 24 908 мазков в прямой иммунофлюоресценции (ПИФ), выполнено 38 377 анализов в полимеразной цепной реакции (ПЦР).
При диагностировании возбудителей урогенитальных инфекций (УГИ) использовали ПЦР. Методика проведения анализа включала три этапа:
(1) выделение ДНК из клинического образца;
(2) амплификация специфических фрагментов ДНК;
(3) детекция продуктов амплификации, которую проводили по двум схемам: (a) гибридизационная детекция;
(в) горизонтальный электрофорез в агарозном геле.
Таблица 1.
Распределение пациентов по причине обращения Исследовано проб Кол-во Группы человек обследованных ПЦР ПИФ ИФА I 32 485 16 356 16 738 9 II 13 757 8 217 5 540 4 III 11 883 10 152 1 731 2 IV 4 551 3 652 899 3 Всего 62 676 38 377 24 908 18 Регистрацию флуоресцентного сигнала проводили в процессе амплификации с использованием термоциклера «Rotor - Gene 3000» с детекцией в режиме реального времени. С помощью программного обеспечения, прилагаемого к амплификатору, вычисляли концентрацию исходной матрицы ДНК. Реакцию амплификации проводили с помощью тест - систем «АмплиСенс - 100 - FRT Сhlamydia trachomatis», «АмплиСенс Mycoplasma hominis - FRT (RG)», «АмплиСенс - Ureaplasma urealiticum - FRT (RG)» и др. Для индикации антигенов возбудителей УГИ использовали ПИФ. Мазки окрашивали специфическими моноклональными антителами, конъюгированными с флуоресцентным красителем (тест - системы фирмы Галарт «ХламиСлайд», «УреаСлайд», «МикоСлайд», Москва и др.). Результат оценивали при люминесцентной микроскопии (микроскоп «Микрос», Австрия). Для подтверждения морфологии элементарных телец использовали увеличение X 1000. Результат считали положительным, если в препарате обнаруживали более 5 ЭТ в поле зрения. Серодиагностику хламидиоза, уреамикоплазмоза, трихомониаза, гонореи и кандидоза осуществляли с помощью иммуноферментного анализа. Реакцию проводили с использованием тест систем фирмы «МБС», Новосибирск, результаты учитывали на аппарате «Stat Fax 2002». Для оценки микробного пейзажа слизистой уретры у мужчин, цервикального канала и влагалища у женщин использовали бактериоскопический метод, который выполняли традиционным способом.
Препараты окрашивали либо по Романовскому - Гимзе в течение 40 минут, либо метиленовым синим с пятиминутной экспозицией.
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью компьютерных программ Ехсеl 2003 (Мiсгоsоft Iпс., 1999), Statistica for Windows, v.5.0 (StatSoft Inc., 1995). Достоверность различий между средними величинами оценивали с использованием F-критерия Фишера.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В течение 2005-2006 гг. на УГИ выполнено 82 216 различных исследований (ПЦР, ПИФ и ИФА). При этом в 13 637 (16,6%) случаев получены положительные результаты. В ПЦР обследовано 38 пациентов, у 7 928 (20,6%) из них в исследуемом материале были выявлены фрагменты геномов различных микроорганизмов, в ПИФ - 24 908 пациентов, у 1 328 (5,3%) получены положительные результаты. Серологические исследования в ИФА на выявление специфических иммуноглобулинов различных классов к C. trachomatis, M. hominis, U. urealiticum, T. vaginalis и C. аlbicans проведены у 18 871 человека - положительных проб 23,2%.
Результаты ПИФ и ПЦР представлены в таблице 2. Как следует из этих материалов, у обследованных лиц чаще всего выявляли структуры уреаплазм, гарднерелл, вируса папилломы человека и микоплазм, реже - герпеса 1- типов, хламидий, цитомегаловируса, гонореи и т.д. При этом в большинстве случаев регистрировали геном возбудителей в ПЦР. Так ДНК U. urealiticum выявили у 50,8±0,63% обследованных, G. vaginalis - 43,7±2,3%, HPV 31,6±0,52%, M. hominis - 20,8±1,1%. C. trachomatis и HSV 1-2 типов обнаружили у 8,8±0,26% и 8,9±0,51% обследованных соответственно.
Антигены микроорганизмов в исследуемом материале выявляли реже:
уреаплазм в 2,8,±0,19%, цитомегаловирусов в 1,9±0,53%, гарднерелл в 10,9±1,5% и микоплазм 6,2±0,29%, т.е., соответственно в 9,1, в 3,9 и 3,3 раза реже, чем в ПЦР.
Поскольку пациентами диагностических центров становятся по самым разным причинам (от тяжелой клинически выраженной патологии, до простого любопытства), представляло интерес выяснить, среди каких контингентов положительные находки регистрируются чаще, в каких тестах и сочетаниях. Поэтому мы проанализировали результаты обследования пациентов в зависимости от причин обращаемости в медицинский центр.
Всех обследованных лиц условно разделили на четыре группы. В группе пациентов с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта (I), чаще всего выявляли U. urealiticum - 86,8±0,6%, G. vaginalis - 62,1±2,9%, HPV - 44,4±0,8%, M. hominis - 29,1±1,9 и HSV 1-2 типа - 15,1±1,3%, C.
trachomatis обнаружили у 12,5±0,5% обследованных. Сходная картина встречаемости маркеров возбудителей УГИ отмечена в группе пациентов со случайными половыми связями (II). Здесь чаще всего обнаруживали таких патогенов, как: HPV - 30,7±1,6%, U. urealiticum - 24,2±1,0%, M. hominis 25,8±2,8%, G. vaginalis - 15±7,9% и HSV 1-2 типа - 14,0±1,3%, C. trachomatis определяли в 10,8±0,6% случаев, N. gonorrhoeae - 8,9±3,0%.
Таблица 2.
Частота выявления возбудителей УГИ в ПЦР и ПИФ у лиц репродуктивного возраста 2005-2006 гг.
Исследовано проб ПЦР ПИФ Возбудители P** всего кол-во пол. проб всего кол-во пол. проб абс. %±m абс. %±m C. trachomatis 11 617 1 027 8,8 ± 0,26 6 901 196 2,8 ± 0,19 4, U. urealiticum 6 269 3 186 50,8 ± 0,63 8 342 470 5,6 ± 0,25 0, M. hominis 1 321 275 20,8 ± 1,1 7 081 446 6,2 ± 0,29 6, М. genitalium 4 287 283 6,6 ± 0,38 --- --- --- -- 394 9 2,3 ± 0,75 180 6 3,3 ± 1,3 0, T. vaginalis G. vaginalis 444 194 43,7 ± 2,3 583 64 10,9 ± 1,3 3, 315 17 5,4 ± 1,3 150 10 6,7 ± 2,0 0, N. gonorrhoeae HSV 1-2 типа 3 161 281 8,9 ± 0,51 1 018 123 12,0 ± 1,0 0, CMV 2 315 171 7,4±0,54 653 13 1,9 ± 0,53 7, HPV 7 781 2 464 31,6 ± 0,52 --- --- --- -- C. аlbicans 473 21 4,4 ± 0,94 --- --- --- -- 38 377 7 928 20,7 ± 0,21 24 908 1 328 5,3 ± 0,14 3, Всего Примечание. ** Значение числа Р (по Фишеру) между показателями ПЦР и ПИФ по каждому возбудителю УГИ Р0,05 - разница статистически не достоверна, ссим птомным течением. Это в определенной степени объясняет высокий процент выявления у них маркеров таких возбудителей как HPV, U. urealiticum, M.
hominis и т.д. Высокий уровень HPV определяли также среди пациентов, имевших случайные половые контакты, что может быть связано с распространением папилломовирусной инфекции как среди мужчин, так и женщин, живущих активной половой жизнью. Хотя уреамикоплазменная и гарднереллезная инфекции официально и не относятся к ИППП, но фактически они передаются преимущественно половым путем, поэтому высокая сексуальная активность может способствовать инфицированию.
Кроме того, у пациентов данной группы отмечена более высокая инфицированность N. gonorrhoeae - 7,0% и T. vaginalis - 3,4% по сравнению с больными воспалительными заболеваниями урогенитального тракта N.
gonorrhoeae - 2,6%, T. vaginalis - 1,9% (р0,05).
Среди беременных женщин чаще всего выявляли маркеры U. urealiticum 13,8±1,3% и HPV - 13,3±0,6%, затем M. hominis - 11,4±1,8% и G. vaginalis 10,1±2,6%, C. trachomatis регистрировали в 6,6±0,4% случаев. По данным литературы, уреамикоплазменная инфекция среди беременных встречается в 5-30% случаев (Гасанова, 2002), а частота генитального хламидиоза в этой группе составляет 3-14% (Малова, 2004). Различие показателей инфицирования у беременных женщин и обследованных из предыдущих групп, очевидно связано с выявлением возбудителей заболеваний урогенитального тракта еще на стадии планирования беременности с последующим лечением и санацией. У клинически здоровых лиц, обратившихся в медицинское учреждение с профилактической целью, с помощью прямых методов чаще регистрировали структуры HPV - 17,7±0,8%, U. urealiticum - 14,6±1,3%, M. hominis - 4,9±1,6%. У них примерно с одинаковой частотой определяли М. genitalium - 2,7±0,8% и C.trachomatis 2,1±0,3%. Такие возбудители, как C. аlbicans и CMV не выявлены ни у одного из обратившихся.
На наличие T. vaginalis, G. vaginalis и N. gonorrhoeae ни один из пациентов данной группы не обследован. Превалирование ВПЧ-инфекции среди практически здоровых лиц, очевидно, связано с широким распространением HPV среди здорового населения от 2,8% до 36% (Козлова и др., 2003). Что касается результатов обследования в ИФА пациентов I группы, то специфические антитела к C. trachomatis определяли в 38,7±0,59% случаев, к U. urealiticum в 6,9±0,6%, к T. vaginalis - 2,6±2,5% и к M. hominis в 1,4±0,4% случаев. Группа пациентов, обратившаяся по поводу случайных половых связей, характеризовалась высоким процентом выявления специфических иммуноглобулинов к T. vaginalis - 14,9±2,7% и к N. gonorrhoeae - 14,2±2,8%.
Незначительно отличается, по сравнению с I группой, процент лиц, у которых выявлены специфические антитела к C.trachomatis - 34,6±1,0%, к U. urealiticum - 7,9±0,8% и к M. hominis -1,7±0,52%, где p 0,05 во всех случаях.
Среди беременных женщин антитела к C. trachomatis и U. urealiticum выявлены у 27,9±1,3% и 5,8±0,73% соответственно. Обращает на себя внимание уровень выявленных антител к M. hominis - 3,4±0,6% (в два раза выше, чем у предыдущих групп), а также процент специфических иммуноглобулинов G к C. аlbicans - 18,8±2,3%.
В группе практически здоровых лиц антитела к C. trachomatis определены в 25,1±1,4% случаев, к U. urealiticum и M. hominis в 5,2±0,9% и 2,5±0,8% соответственно.
В контексте серьезных демографических проблем, осложнений при реализации репродуктивной функции, особый интерес представляет вопрос о гендерной принадлежности инфицированных и их возрастной структуре.
Интересно отметить, что доли инфицированных мужчин и женщин (табл. 3) существенно не различались - соответственно 3 286 (14,9±0,24%) и 5 (13,1±0,17%) человека (Р0,05). Наибольший процент инфицированных зарегистрирован в группе больных с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта, в том числе женщин - 3 534 (20,6%±0,3), 2 (17,1±0,3%) мужчин. Суммируя положительные результаты в ПЦР и ПИФ у пациентов разного возраста, можно констатировать, что наибольшее число инфицированных выявляли среди лиц в возрасте от 18 до 35 лет, с максимальным значением в группе больных с воспалительными заболеваниями - 21,6±0,26%, во второй, третьей и четвертой группе соответственно 12,4±0,3%, 7,2±0,2%, 4,9±0,4% (табл. 4).
Таблица 3.
Доля инфицированных мужчин и женщин, обратившихся в диагностический центр по различным причинам Группы Мужчины Женщины Всего С пол. %±m Всего С пол. %±m обсл. рез. обсл. рез.
I 14 720 2 520 17,1± 0,3* 17 765 3 534 20,6±0,3* II 5598 690 12,3±0,44* 8 159 836 10,2±0,33* III --- --- --- 11883 860 7,2±0, IV 1 616 76 4,7±0,53 2 935 131 4,5±0, Всего 21 934 3 286 14,9±0,24 40 739 5 361 13,1±0, Примечание. *Достоверные отличия от соответствующих показателей контрольной группы (IV).
В возрастной категории 40 лет и старше наибольшее число инфицированных также зарегистрировано среди лиц первой группы - 7,5±0,3%, у пациентов со случайными половыми контактами - 7,1±0,4%, у практически здоровых лиц 3,4±0,6%.
Учитывая широкую распространенность урогенитального хламидиоза, а также сложность и противоречивость лабораторной диагностики данной инфекции, более детально остановимся на анализе ее результатов.
Всего за период 2005-2006 гг. выполнено 29 502 различных исследований на урогенитальный хламидиоз. В ПЦР обследовано 11 617 пациентов у (8,8%) из них были получены положительные результаты. В ПИФ - 6 человек, антигены хламидий обнаружены у 196 (2,8%). Специфические IgA выявлены у 2 522 человек (17,2%), IgG у 8 462 обследованных (38,9%). При этом на основании проведенного комплексного обследования у 71,1% пациентов диагностирована моно -, у 28,9% - смешанная хламидийная инфекция.
В серии специальных наблюдений, как и ранее, мы проанализировали частоту и структуру смешанной хламидийной инфекции. По данным ПЦР лаборатории нашего центра 733 (71,1%) положительных результатов приходилось на хламидийную моно - и 294 случая (28,9%) - на смешанную инфекцию. При этом в 23,4% случаев из 294 выявляли два возбудителя, а в 7,3% - три. Структура смешанной хламидийной инфекции представлена на рисунке 5. Из двухкомпонентных ассоциаций чаще всего встречали сочетания C. trachomatis и U. urealiticum - 52,1%, C. trachomatis и HPV 19,4%. В случае обнаружения трех возбудителей превалировали сочетания C. trachomatis+U. urealiticum+HPV - 6,5% и C. trachomatis+ М. genitalium+ U. urealiticum - 5,7%. Ассоциацию четырех возбудителей, таких, как C.trachomatis+М. genitalium+U. urealiticum+HPV, регистрировали в 1,6% случаев. Все остальные комбинации (21) составили 6,7%.
Как уже указывалось, при тестировании 6 901 образца исследуемого материала в ПИФ антигены C. trachomatis регистрировали в 196 пробах (2,8%). В 69,9% (137 случаев) это была моно -, а 30,1% (59 случаев) смешанная хламидийная инфекция. В структуре смешанной хламидийной инфекции, регистрируемой с помощью ПИФ, из двухкомпонентных ассоциаций чаще всего встречали сочетания C. trachomatis и U. urealiticum 28,8%, C. trachomatis и ВПГ - 20,3%, C. trachomatis и M. hominis - 18,6%.
Комбинацию из трех возбудителей обнаружили в единственном варианте C. trachomatis+U. urealiticum+ M. hominis, что составило 27,1%.
Сравнительный анализ результатов использования ПЦР для диагностики смешанной УГИ мужчин и женщин показал, что с практически одинаковой частотой, у тех и у других, встречаются такие сочетания как C.
trachomatis+U.urealiticum (22,9±2,5% и 26,8±2,3%, где р0,05), C.
trachomatis+HPV (19±3,8% и 21,1±2,9%, где р0,05), а также C.
trachomatis+М. genitalium+U. urealiticum (2,6±1,8% и 4,0±2,8%, где р0,05) соответственно.
VIII IX VII X VI V IV III I II Рис. 5. Структура смешанной хламидийной инфекции диагностируемой в ПЦР.
I - C. trachomatis+U. urealiticum;
II - C. trachomatis+HPV;
III - C. trachomatis+U. urealiticum+HPV ;
IV - М. genitalium+U. urealiticum;
V - C. trachomatis+ М. genitalium;
VI - C. trachomatis+U. urealiticum+ M. hominis;
VII - C. trachomatis+CMV;
VIII - C. trachomatis+М. genitalium+ U. urealiticum+HPV;
IX - C. trachomatis+М. genitalium+ HPV ;
Х. Остальные случаи.
В то же время, выявленные у женщин ассоциации микроорганизмов: C.
trachomatis+М.genitalium (15,7±4,3%), C. trachomatis+U. urealiticum+M.
hominis (18,7±6,9%), C. trachomatis+CMV (7,7±3,3%) у мужчин не обнаруживали. Значительной была также разница в удельном весе сочетания C. trachomatis +М. genitalium+U. urealiticum+HPV у мужчин (3,9±2,7%), у женщин (7,1±3,9%), где (p0,05).
Результаты обследования в ПИФ как мужчин, так и женщин отличались от таковых в ПЦР. С практически одинаковой частотой в обеих группах выявляли только такие комбинации как: C. trachomatis+U. urealiticum+ M.
hominis (12,2±4,3% и 12,5±3,9%, где р0,05) и C. trachomatis+CMV (2,2±2,2% и 2,9±2,0%, где р0,05) соответственно.
Таким образом, широкий спектр выявленных возбудителей УГИ, сочетающихся с C. trachomatis, различный у мужчин и женщин, ставит вопрос о настороженности врачей урологического и гинекологического профиля при осмотре и необходимости целенаправленного обследования в отношении тех или иных возбудителей УГИ.
Учитывая отсутствие единого стандартного подхода к диагностике урогенитального хламидиоза, противоречивости литературных данных о целесообразности использования тех или иных тестов, в серии специальных наблюдений мы сопоставили информативность ПЦР, ИФА и ПИФ при обследовании 1 522 человек, обратившихся в диагностический центр. Все эти пациенты условно были разделены на три группы. Первую группу составил 731 больной, у которых были зарегистрированы признаки воспалительных заболеваний урогенитального тракта, 304 человека (2-я группа) не предъявляли субъективных жалоб и обратились в клинику в связи со случайными половыми контактами, а 487 практически здоровых лиц, обратившихся с профилактической целью, не имевших в анамнезе воспалительных заболеваний мочеполовых органов и отрицавших случайные половые контакты, составили третью контрольную группу.
В результате комплексного обследования, урогенитальный хламидиоз был диагностирован у 552 человек. В первой группе выявлено 469 случаев инфекции, во второй и третьей - 80 и 3 соответственно (в этом разделе работы мы не дифференцировали моно - и смешанную хламидийную инфекцию). ДНК Chlamydia trachomatis обнаружили у 469 (64,2±1,8%) больных с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта, в то время как антигены в ПИФ выявляли у 119 пациентов (16,3±1,4%). Во второй группе у 80 человек из 304 обследованных получен положительный результат в ПЦР, что составляет 26,3±2,5%, а положительная ПИФ была у больного (10,2±1,7%). У практически здоровых лиц как в ПЦР, так и в ПИФ эти показатели были минимальными - 0,6±0,3% (3 случая) и 0,2±0,2% ( случай) соответственно. Как и следовало ожидать, в ИФА наибольший процент положительных результатов определяли у пациентов первой группы - 521 человек (71,2±1,7%). У лиц, обратившихся по поводу случайных половых связей, этот показатель был значительно ниже - 30,6±2,6% и, наконец, в контрольной группе из 487 обследованных 37 человек в сыворотке крови (7,6±1,2%) имели специфические иммуноглобулины к Chlamydia trachomatis.
Таким образом, во всех группах обследованных ПЦР была наиболее информативным методом диагностики УГХ. При этом обращает на себя внимание достаточно высокий процент обнаружения структур хламидий в группе лиц, обратившихся в диагностический центр по поводу случайных половых контактов, что еще раз свидетельствует о возможности бессимптомного (малосимптомного) течения урогенитального хламидиоза.
Анализируя результаты исследования сывороток пациентов в ИФА, необходимо отметить, что сочетания IgА и IgG в высоких титрах (1:20/1:40), чаще всего обнаруживали у пациентов I группы (14,2±1,3%), что принято считать признаком активной хламидийной инфекции. У пациентов со случайными половыми связями и практически здоровых лиц этот показатель составил 6,6±1,4% и 0,6±0,3% соответственно.
Таблица 4.
Возрастной состав инфицированных возбудителями УГИ, обратившихся в медицинский центр по различным причинам Группы обследованных Возраст I II III IV С пол.рез. С пол.рез. С пол.рез. С пол.рез.
Обсл. Обсл. абс. %±m Обсл. %±m Обсл.
абс. %±m абс. абс. %±m 18-39 25 529 5 531 21,6±0,3* 10 390 1 286 12,4±0,3* 11 883 860 7,2±0,2 3 474 170 4,9±0, лет 40 лет и 6 956 523 7,5±0,3* 3367 240 7,1±0,4 --- --- --- 1 077 37 3,4±0, старше Всего 32 485 6054 18,6±0,2 13 757 1 526 11,1±0,3 11 883 860 7,2±0,2 4 551 207 4,5±0, Примечание.* Достоверные отличия от соответствующих показателей контрольной группы (IV).
Анализ совпадений положительных результатов различных тестов дал возможность сопоставить их диагностическую значимость. У больных I группы чаще всего совпадали результаты ПЦР и ИФА - 70,3%, во II группе ИФА и ПИФ - 8,3%. Следует подчеркнуть, что практически у всех больных с положительным результатом ПИФ были выявлены фрагменты генома хламидий, тогда как при положительной ПЦР в значительном числе случаев ПИФ была отрицательна. Эта закономерность была характерна, как для пациентов I, так и II групп. Следовательно, с помощью ПЦР гораздо чаще, чем в ПИФ, выявляли структуры возбудителя. Результаты серологического обследования и ПЦР - диагностики совпадали в 97% случаев. При этом в сыворотках крови обследованных одновременно обнаруживали специфические IgA и IgG. Известно, что для оценки достоверности результатов серологической диагностики различных форм урогенитального хламидиоза (острая, хроническая или персистирующая), целесообразно исследовать «парные» сыворотки, взятые с интервалом 10-14 дней. В наших условиях, в условиях диагностического центра, не всегда удавалось провести динамическое обследование пациентов, поэтому мы в основном ориентировались на результаты комплексного обследования с обязательным использованием прямых методов диагностики.
В настоящее время не существует единых алгоритмов обследования больных при подозрении на смешанную хламидийную инфекцию, поэтому мы сочли целесообразным проанализировать диагностические возможности различных лабораторных методов выявления урогенитального хламидиоза в группе больных, у которых имелись различные сочетания хламидий с другими инфекционными агентами (вирусы, патогенные, условно патогенные бактерии и простейшие).
Нами обследовано 82 женщины и 67 мужчин репродуктивного возраста с различными вариантами смешанной хламидийной инфекции.
Первую группу составили больные, у которых обнаружили хламидиоз и гонорею, вторую – хламидиоз и трихомониаз, третью - хламидии и вирус простого герпеса, в четвертой группе имели место ассоциации хламидий и микоуреаплазм, в пятой - хламидии и гарднереллы.
Важно подчеркнуть, что сопутствующие хламидиозу инфекции во всех случаях были подтверждены результатами постановки ПЦР. Все эти больные были обследованы на хламидиоз с использованием комплекса взаимодополняющих методов исследования ПЦР, ПИФ, ИФА. Обобщив результаты проведенных исследований по диагностике хламидийной микстинфекции, следует отметить, что во всех случаях, независимо от этиологии сопутствующих заболеваний, использование ПЦР практически у всех больных позволило диагностировать урогенитальный хламидиоз.
Исключение составили лишь больные трихомониазом, однако анализ «комбинированного» исследуемого материала у таких больных дал возможность значительно повысить результативность ПЦР. При этом ПЦР оказалась значительно более чувствительной, чем ПИФ. Что касается данных серологического тестирования, то сочетание хламидиоза с другими ИППП наложило определенный отпечаток на результаты ИФА. Так, на фоне урогенитального хламидиоза и острой гонореи при серологическом обследовании как у женщин, так и мужчин уровни специфических JgA и JgG достигали значимых величин. Это, возможно, связано со стимуляцией гуморального иммунного ответа при остром воспалительном процессе, обусловленном N. gonorrhoeae. В то же время, при ассоциации хламидий с вирусом простого герпеса, выявляли только специфические IgG в низком диагностическом титре (1:5-1:10), что представляется закономерным, так как при персистенции возбудитель слабо инициирует выработку нового поколения протективных антител. Результаты серодиагностики хламидийной инфекции на фоне трихомониаза были неоднозначны. Так, у 9 женщин и мужчин в сыворотке крови определяли только специфические IgG в низких титрах (1:10-1:20). У двух женщин и одного мужчины определяли только IgA в титрах (1:20-1:40). При этом 9 обследованных женщин и 7 мужчин оказались серонегативными. Очевидно, это может быть связано с недоступностью хламидий, находящихся внутри трихомонад, и, как следствие, полным отсутствием или наличием лишь слабовыраженной гуморальной специфической реакции, несмотря на острый воспалительный процесс. Выявление IgA к C. trachomatis у некоторых больных, скорее всего, указывает на более раннее заражение хламидиозом, чем трихомониазом, т.к.
установлено, что на эффективность репродукции каждого вида возбудителя, а, следовательно, и специфического иммунного ответа, существенное влияние оказывает одновременность или последовательность заражения (Козлова, 2003). Следует подчеркнуть, что существенных различий в результативности использованных диагностических методов в зависимости от пола больных не выявлено.
Таким образом, в основе этиологического диагноза смешанной хламидийной инфекции лежит правильный выбор алгоритма лабораторного обследования пациента, с учетом анализа жалоб, результатов гинекологического и урологического обследования. Следует иметь в виду, что смешанная инфекция является качественно новой формой инфекции, а не суммацией составляющих ее моноинфекций, что зависит от количественного соотношения патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, от взаимоотношений между отдельными агентами и от активации некоторых из них в присутствии других. Так при подозрении на смешанную хламидийную инфекцию необходимо учитывать особенности ассоциантов, их локализацию, для определения правильного места забора материала либо биологического субстрата.
ВЫВОДЫ 1. С использованием различных методов лабораторной диагностики (полимеразной цепной реакции, прямой иммунофлюоресценции и иммуноферментного анализа) у жителей города Перми выявлен широкий спектр нозологических форм урогенитальных инфекций, среди возбудителей которых преобладают Ureaplasma urealiticum, вирус папилломы человека (HPV), Clamydia trachomatis и вирус простого герпеса (HSV) 1-2 типов.
2. На основании данных комплексного лабораторного обследования установлена высокая частота встречаемости возбудителей урогенитальных инфекций у практически здоровых лиц и беременных женщин, что свидетельствует о высоком риске нарушения репродуктивного здоровья.
Маркеры различных возбудителей урогенитальных инфекций определяли у мужчин и женщин с практически одинаковой частотой преимущественно в возрасте 18 - 39 лет.
3. Экспериментально обосновано, что в качестве скрининг-теста на определение возбудителей урогенитальных инфекций целесообразно использовать полимеразную цепную реакцию. При обследовании на урогенитальный хламидиоз различных групп пациентов положительные результаты в полимеразной цепной реакции регистрировали в 3,1 раза чаще, чем при использовании метода прямой иммунофлюоресценции.
4. Установлено, что сочетанное использование полимеразной цепной реакции и иммуноферментного анализа значительно повышает степень эффективности лабораторной диагностики урогенитальных инфекций и практически во всех случаях позволяет выявлять как моно -, так и смешанную хламидийную инфекцию. Среди жителей г. Перми у 28,9% больных обнаружена смешанная, у 71,1% - монохламидийная инфекция.
5. Разработан рациональный алгоритм диагностики смешанной урогенитальной хламидийной инфекции с учетом особенностей биологических свойств микроорганизмов-ассоциантов.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Высокая чувствительность и специфичность полимеразной цепной реакции определяет необходимость ее использования как для диагностики практически всех урогенитальных инфекций, так и для контроля эффективности их излеченности.
2. При выявлении в полимеразной цепной реакции генома условно патогенных микроорганизмов целесообразно использовать культуральный метод для количественного определения возбудителей урогенитальных инфекций.
3. В диагностике хламидийной моноинфекции целесообразно комплексное использование полимеразной цепной реакции и иммуноферментного анализа, что позволяет дифференцировать как «свежие», так и хронические случаи заболевания.
4. При сочетании хламидиоза с вирусными урогенитальными инфекциями, вызывающими угнетение иммунологической реактивности, целесообразно использование «прямых» методов диагностики полимеразной цепной реакции и иммунофлюоресцентного анализа. При подозрении на персистирующую хламидийную инфекцию в качестве дополнительного теста целесообразно определение специфических иммуноглобулинов G.
5. При сочетании хламидийной и гонококковой инфекций, особенно острой формы, потенцирующей гуморальный иммунный ответ и манкирующей возбудителя, оправдано комплексное использование полимеразной цепной реакции и иммуноферментного анализа как взаимодополняющих методов.
6. В случаях сочетания хламидиоза и трихомониаза, учитывая способность трихомонад фагоцитировать Clamydia trachomatis и транслоцироваться в верхние отделы урогенитального тракта, необходимо исследование комбинированных проб различного биологического материала (соскобы из уретры и цервикального канала, мочи, спермы) с использованием полимеразной цепной реакции.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Зоерман В.М. Опыт диагностики заболеваний передающихся половым путем в условиях диагностического центра//Матер. Всеросс. науч. конф.
«Медицинская микробиология – XXI век». - Саратов, 2004.- С. 46-47.
2. Зоерман В.М. Выявление Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum при воспалительных процессах урогенитального тракта у мужчин и женщин методом полимеразной цепной реакции//Сб.
научных работ «Естествознание и гуманизм». - Томск, 2005. - Т. 2. - № 4. - С.
66.
3. Зоерман В.М., Федачук И.О., Поспелова С.В. Использование полимеразной цепной реакции для выявления Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum при воспалительных процессах урогенитального тракта у мужчин и женщин//Пермский медицинский журнал. - 2005. - Т. 4. - № 2. - С. 30-31.
4. Зоерман В.М. Использование иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции в лабораторной диагностике урогенитального хламидиоза у женщин//Матер. научной-практ. конф. «Современная вакцинопрофилактика: проблемы и перспективы развития». – Пермь, 2005. С. 173 - 178.
5. Зоерман В.М., Горовиц Э.С. О результативности некоторых лабораторных методов диагностики хламидийной инфекции у больных острой гонореей//Матер. Всеросс. научн. конф. «Актуальные проблемы теоретической и клинической медицины». - Пермь, 2005. - С. 91- 93.
6. Зоерман В.М., Федачук И.О. Выявление заболеваний урогенитального тракта в условиях крупного диагностического центра//Сборник научных работ «Естествознание и гуманизм». - Томск, 2006. - Т. 3.- № 4. - С. 71-72.
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера Росздрава», (Пермь) и лабораторно диагностического центра ООО «Лабдиагностика», (Пермь)
Научный консультант:
доктор медицинских наук, профессор Горовиц Эдуард Семенович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Демаков Виталий Алексеевич доктор медицинских наук, профессор Евструпов Александр Николаевич
Ведущая организация: Омская государственная медицинская академия, Омск
Защита состоится: «25» октября 2007 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13.
Факс: (342) 2446711.
Автореферат диссертации размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН: (http: /www.iegm.ru.)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.
Автореферат разослан « » сентября 2007.
Ученый секретарь диссертационного совета, Ившина Ирина Борисовна Член-корр. РАН Зоерман Вера Михайловна УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ УРОГЕНИТАЛЬНОЙ ХЛАМИДИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ Автореферат