Цитофизиологические аспекты возрастной устойчивости мягкой пшеницы к возбудителю бурой ржавчины puccinia triticina erikss.

На правах рукописи

ШТУБЕЙ Татьяна Юрьевна ЦИТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВОЗРАСТНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ К ВОЗБУДИТЕЛЮ БУРОЙ РЖАВЧИНЫ Puccinia triticina Erikss.

Специальность 03.00.12 – физиология и биохимия растений 03.00.24 – микология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

Работа выполнена на кафедре селекции, генетики и физиологии растений ФГОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет» доктор биологических наук

Научный консультант:

Плотникова Людмила Яковлевна кандидат биологических наук

Официальные оппоненты:

Зайцева Людмила Григорьевна, доктор биологических наук Карпук Василий Васильевич Главный Ботанический сад Ведущая организация – им. Н.В. Цицина РАН

Защита состоится 13 ноября 2009 г. в 15.30. на заседании диссертационного совета Д.501.001.46 при биологическом факультете МГУ им.М. В. Ломоносова по адресу: 119992, ГСП-2, г. Москва, Ленинские горы, дом 1, к. 12, ауд. М-1.

тел / факс (495)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факульте та МГУ им.М. В. Ломоносова Автореферат разослан 9 октября 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета – кандидат биологических наук М. А. Гусаковская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одним из наиболее вредоносных заболеваний мягкой пшеницы Triticum aestivum L. является бурая ржавчина, вызываемая биотрофным грибом Puccinia triticina Erikss. Патоген отличается быстрыми темпами эволюции, в его популяциях появляются и накапливаются новые аг рессивные расы, что приводит к регулярной потере устойчивости сортами.

Ежегодные потери урожая от бурой ржавчины составляют 5-15%, а в годы эпифитотий – 45-70% (Санин, 1995;

Лебедев, 2000). В связи с этим высоко актуальны исследования физиологических механизмов устойчивости пшени цы к бурой ржавчине.

Для стабильной защиты пшеницы от болезни учеными международно го центра СIMMYT была сформулирована концепция неспецифической ус тойчивости по принципу замедления развития болезни – «медленное ржавле ние» (slow rusting) (Caldwell, 1968) или «частичной устойчивости» (Parlevliet, 1979). Генетическую защиту таких сортов составляли гены возрастной ус тойчивости, которые в сочетании с 2–3 генами обеспечивали длительную за щиту растений (Parlevliet, 1979;

Singh et al., 2003).

Несмотря на высокую эффективность сортов с частичной устойчиво стью в защите растений физиологические механизмы возрастной устойчиво сти практически не исследованы. Не известны особенности взаимодействия патогена с растениями, определяющие неспецифическую устойчивость сор тов. Представляет интерес изучение эффективности генов возрастной устой чивости к бурой ржавчине в регионах России, различающихся климатиче скими условиями и составом популяции Р. triticina. Не изучены цитофизио логические проявления действия генов возрастной устойчивости и формиро вание признака в онтогенезе. Представляет интерес изучение проявления ге нов в разных комбинациях. Исследования перечисленных вопросов важны для обеспечения длительной защиты пшеницы от ржавчины.

Диссертационная работа выполнена в ФГОУ ВПО «Омский государст венный аграрный университет» (ОмГАУ) в период с 2005 по 2009 гг. в рам ках темы «Изучение цитофизиологических механизмов длительной и инду цированной устойчивости пшеницы к бурой ржавчине» (№ Гос. регистрации 0120.0 509874).

Цель работы. Определение цитофизиологической основы возрастной устойчивости мягкой пшеницы к бурой ржавчине.

Задачи исследований:

1. Исследовать эффективность генов возрастной устойчивости к бурой ржавчине в условиях континентального климата юга Западной Сибири на на боре изогенных линий сорта мягкой пшеницы Тэтчер.

2. Выявить цитологические особенности взаимодействия P. triticina с растениями, защищенными генами возрастной устойчивости.

3. Изучить формирование признака устойчивости в онтогенезе.

4. Исследовать роль активных форм кислорода в защите линий с гена ми возрастной устойчивости от P. triticina.

5. Изучить роль синтеза каллозы в защите линий с генами возрастной устойчивости от болезни.

6. Выявить значение синтеза фенольных соединений в возрастной ус тойчивости.

7. Исследовать роль индуцированной устойчивости в защите линий от P. triticina.

8. Выявить механизмы устойчивости растений с комбинациями генов возрастной устойчивости и их воздействие на развитие патогена.

Научная новизна исследований. Впервые исследована эффектив ность набора генов возрастной устойчивости к бурой ржавчине на юге За падной Сибири (г. Омск). Установлены характерные черты взаимодействия P. triticina с группой линий, защищенных генами возрастной устойчивости.

Продемонстрировано формирование возрастной устойчивости в онтогенезе.

Выявлены цитофизиологические механизмы устойчивости в форме синтеза активных форм кислорода, каллозы, фенольных соединений, а также подав ление формирования инфекционных структур, связанное с отсутствием сти мулов для их развития. Установлена роль индуцированной устойчивости в защите растений. Выявлены механизмы, усиливающие защиту гибридов F1 с комбинациями генов возрастной устойчивости.

Теоретическая значимость работы. Впервые выявлены цитофизио логические основы возрастной устойчивости пшеницы к бурой ржавчине и показано формирование признака в онтогенезе. Выявлены особенности про явления отдельных генов возрастной устойчивости. Получены доказательст ва роли системной приобретенной устойчивости, стимулированной биотиче скими индукторами в защите растений. Выявлены характерные особенности взаимодействия P. triticina с линиями, определяющие неспецифическое дей ствие генов возрастной устойчивости.

Практическая значимость работы. Определены эффективные в За падной Сибири гены возрастной устойчивости и их комбинации. Данные о механизмах действия отдельных генов, а также времени проявления признака в онтогенезе учтены при разработке программы создания сорта пшеницы.

Информация о дифференциальном взаимодействии химических индукторов приобретенной устойчивости с различными генотипами растений важна для построения интегрированной защиты растений.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были представ лены: на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и образования» (Самара, 2005 г.);

Ре гиональной научно-практической конференции «Современные проблемы и достижения аграрной науки в животноводстве, растениеводстве и эконо мике» (Томск, 2005);

II Всероссийском съезде по защите растений «Фито санитарное оздоровление агроэкосистем» (С-Петербург, 2005 г.);

Междуна родной научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 70-летию НГАУ (Новосибирск, 2006 г.);

конференции, посвященной 119 летию Н.И. Вавилова «Вавиловские чтения – 2006» (Саратов, 2006г.);

Меж дународной конференции «Роль молодых ученых в реализации нацио нального проекта «Развитие АПК» (Москва, 2007 г.);

Международной конфе ренции «Научное наследие Н.И. Вавилова – фундамент развития отечествен ного и мирового сельского хозяйства» (Москва, 2007 г.);

II Всероссийской конференции «Современные проблемы иммунитета растений к вредным ор ганизмам» (С-Петербург, 2008 г.);

XIII Всероссийской научно-практической конференции “Селекция и семеноводство сельскохозяйственных культур» (Пенза, 2009 г.).

Публикации. По результатам исследований опубликовано 11 работ, в том числе публикации в журналах, рекомендованных ВАК 2, материалы международных конференций 4, всероссийских съездов, конференций 3.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 6 глав, выводов и приложения. Текст изложен на 169 страницах, содержит 9 таблиц, 32 рисунка, включает 55 микрофотографий. Список лите ратуры включает 195 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Обзор литературы В обзоре литературы освещены биологические особенности возбудите ля бурой ржавчины пшеницы. Рассмотрена проблема придания культурным растениям длительной устойчивости к болезням и представления о способах ее решения. Приведены сведения об особенностях фенотипического проявле ния генов возрастной устойчивости. Описаны механизмы устойчивости, фор мирующиеся при взаимодействии биотрофных патогенов с растениями.

2. Материалы и методы исследований Объектами исследований служили:

– растения яровой мягкой пшеницы Triticum aestivum L. сорта Тэтчер и его изогенных линий (линии TcLr) с генами возрастной устойчивости Lr12, Lr13, Lr22а, Lr34, Lr35 и Lr37. Гены Lr12, Lr13 и Lr34 получены из сортов мягкой пшеницы, тогда как остальные гены являются результатом интрог рессии: ген Lr22a перенесен от Aegilops tauschii, ген Lr35 - от A. speltoides, ген Lr37 - от А. ventricosa;

– растения линии с геном Lr2a, проявляющимся на стадии проростков;

– растения гибридов F1 между линиями сорта Тэтчер с генами возрас тной устойчивости.

В качестве контроля в полевых и лабораторных исследованиях исполь зовали растения восприимчивого к бурой ржавчине сорта мягкой пшеницы Саратовская 29.

Развитие бурой ржавчины в полевых условиях изучали на естествен ном умеренном (2006 г.) или интенсивном (2005, 2007 гг.) инфекционном фоне. В экспериментах определяли тип реакции по 5-балльной шкале (0 – иммунитет, 4 – восприимчивость) (Mains, 1926) и степень поражения расте ний (%) (Peterson, 1948). Для построения кривых развития болезни степень поражения оценивали в динамике с момента проявления ржавчины до созре вания растений. На стадии молочно-восковой спелости растений учитывали распределение пустул по типу реакции и количество спор в пустулах.

Исследования действия генов устойчивости осуществляли на вазонных растениях на разных этапах онтогенеза - стадиях проростков, выхода в труб ку и колошения. Эксперименты проводили на отсеченных листьях, жизне способность которых поддерживалась 0,004%-ным раствором бензимидазола (Михайлова, 1983). Для заражения листьев использовали изоляты 77 расы с генотипом Р9Р19Р24Р28, выделенные из полевой популяции, к которым расте ния были восприимчивы на стадии проростков.

Гистологические исследования развития гриба на поверхности и в тка нях, а также проявление реакции сверхчувствительности (СВЧ) проводили на целых листьях, окрашенных анилиновым синим в лактофеноле. Генерацию растениями супероксид-аниона О2– выявляли путем витального окрашивания листьев нитросиним тетразолием (Heath, 1998). Каллозу (-1,3-глюкан) на стенках клеток определяли окрашиванием кораллином (Барыкина, 2004).

Комплекс фенольных веществ в цитоплазме и лигнин выявляли окрашивани ем сернокислым анилином (Джапаридзе, 1953), а также по их автофлуорес ценции (Rubiales, 1996). Транскоричный альдегид в составе фенолов опреде ляли окраской флороглюцином (Beardmore, 1983), сирингин – хлор сульфитным методом (Ride, 1975).

Для изучения механизмов системной приобретенной устойчивости (systemic acquired resistance – SAR) в качестве биоиндуктора использовали инокулюм, полученный размножением популяционного сбора непатогенного для пшеницы возбудителя корончатой ржавчины овса Puccinia coronata Cor da. Для индукции устойчивости в полевых условиях в делянках чередовали рядки линий пшеницы и восприимчивого к P. coronata сорта овса. Биоиндук цию устойчивости в лабораторных условиях проводили путем нанесения на нижнюю половину 2-го листа инокулюма P. coronata, через 2 дня растения заражали спорами P. triticina. Одновременно изучали проявление SAR, инду цированной разными химическими индукторами: 0,01% водными растворами янтарной и арахидоновой кислот, 0,00015% раствором Биона (бензотиадиа зол CGA245704) (Gorlach, 1996;

Список пестицидов, 2002;

Тютерев, 2002).

Гистологические исследования проводили с помощью световых микро скопов Биолам-211 и МБИ-15. Автофлуоресценцию фенольных веществ изу чали с помощью люминесцентного микроскопа Люмам-5. Микрофотосъемку осуществляли с помощью фотокамеры марки Olympus SP-320. Для статисти ческой обработки вычисляли средние значения по данным экспериментов и ошибку средней (Доспехов, 1985).

3. Феноменологическое и цитологическое проявление возрастной устойчивости линий пшеницы к бурой ржавчине Проявление возрастной устойчивости в полевых условиях Изучение реакции сорта Тэтчер и его изогенных линий с генами воз растной устойчивости Lr12, Lr13, Lr22a, Lr34, Lr35, Lr37 на заражение бурой ржавчиной проводили в полевых условиях в лесостепной зоне юга Западной Сибири (г. Омск) в течение 2005–07 гг.

В период наблюдений метеорологические условия были различны: вы сокие температуры в июле-августе отмечались в 2005 г., низкие температуры – в 2006 и 2007 гг. Сорт Тэтчер с геном Lr22b был восприимчив к болезни, что свидетельствует о неэффективности гена Lr22b в условиях Западной Си бири (рис. 1). Линии с другими генами были устойчивы. Устойчивость имела количественное проявление, то есть наблюдалась низкая степень поражения, но реакция растений, как правило, была восприимчивой (тип реакции 3- балла). Растения линий TcLr12, TcLr35 и TcLr37 были высоко устойчивы, и развитие болезни на них быстро стабилизировалось, а на линии Lr22a было существенно замедлено. Самую высокую устойчивость (степень поражения не более 20%) и наименьшую температурную чувствительность проявила линия ТcLr37.

Поражение линий TcLr13 и TcLr34 было интенсивнее при повышенных температурах воздуха, что демонстрирует зависимость действия генов от температуры. Поражение их верхних листьев было ниже, чем листьев, сфор мировавшихся в более молодом возрасте, то есть устойчивость линий усили валась в онтогенезе. Это отражалось на графике в виде загиба кривых (рис.1).

Рис. 1. Кривые развития бу К Степень поражения,% рой ржавчины на сорте Тэт 80 Тэтчер(Lr22b) чер и изогенных линиях с TcLr TcLr генами возрастной устойчи TcLr22a вости (2005г.).

20 TcLr К – сорт Саратовская 29.

TcLr 15.07. 20.07. 25.07. 30.07. 04.08.

TcLr Дата оценки По мнению ряда ученых, для растений с частичной устойчивостью ха рактерно развитие крупных пустул (тип реакции 3-4 балла), но низкая сте пень поражения (Parlevliet, 1979;

Caldwell, 1968). Нами было показано, что на линиях ТсLr12, ТсLr13, ТсLr22а наблюдалось значительное количество пус тул с типом реакции 1-3 балла (некроз и хлороз), что свидетельствует об осо бенностях их защитных механизмов. В то же время линии ТсLr34, ТсLr35 и ТсLr37 демонстрировали в основном восприимчивую реакцию, как и воспри имчивые сорта Саратовская 29 и Тэтчер. В зависимости от года и линии ко личество спор в пустулах, развивающихся на линиях с эффективными генами возрастной устойчивости, было меньше по сравнению с контролем в 1,5 – раз.

Таким образом, полученные результаты показали, что ген возрастной устойчивости Lr22b сорта Тэтчер не эффективен против бурой ржавчины на юге Западной Сибири. Высокий уровень устойчивости показали линии TcLr12, TcLr13, TcLr22a, TcLr35 и TcLr37. В большей степени была пораже на линия ТсLr34, поскольку проявление гена подавляла высокая температура среды. Проявление механизмов устойчивости растений приводило к интен сивному подавлению спорогенеза гриба.

Цитологические проявления возрастной устойчивости в онтогенезе Для определения механизмов возрастной устойчивости было исследо вано влияние растений разного возраста (фазы развития проростков, выхода в трубку и колошения) на развитие P. triticina. Установлены характерные особенности действия устойчивых линий на развитие патогена: нарушение образования аппрессориев на устьицах;

отмирание аппрессориев и подусть ичных везикул;

подавление развития колоний на разных стадиях развития (абортация), замедление развития колоний и пустул.

На листьях восприимчивых сортов Саратовская 29 и Тэтчер с увеличе нием возраста растений наблюдалось подавление образования аппрессориев в небольшой степени, других цитологических проявлений несовместимости не выявлено. На поверхности листьев линий с генами возрастной устойчиво сти было существенно подавлено образование аппрессориев на устьицах. На линиях ТсLr13, ТсLr35, ТсLr37 этот эффект наблюдался на всех стадиях раз вития растений, причем на линиях ТсLr35 и ТсLr37 существенно усиливался к стадии колошения. В то же время на линиях TcLr22a и TcLr34 подавление образования аппрессориев снижалось с возрастом растения, а на линии ТсLr12 проявлялось только на стадии колошения (рис. 2). Нарушение разви тия гриба на поверхности линий с генами возрастной устойчивости выявлено впервые, поскольку ранее изучались только особенности развития гриба в тканях.

На следующих этапах патогенеза наблюдались существенные различия взаимодействия устойчивых линий и восприимчивых сортов с патогеном. На устойчивых линиях в значительной части инфекционных мест гриб останав ливался в развитии на стадиях аппрессория на устьице, подустьичной вези кулы или первой инфекционной гифы. На растениях с генами Lr12 и Lr35 ин гибирующее действие растений на гриб оставалось относительно стабильным на всех стадиях развития, в то же время на линиях ТсLr13, TcLr22а, TcLr34 и Саратовская 29 TcLr Тэтчер (Lr22b) TcLr Доля инфекц ионны х Дол я инф ек ц ионны х Дол я инф екц ионны х Дол я инф ек ц ионны х 80 80 70 70 стру кту р, % с тру кту р,% с тру кту р,% с тру кту р,% 60 60 50 50 40 40 40 30 30 30 20 20 20 10 10 10 0 0 0 а б в а б в а б в а б в TcLr TcLr22a TcLr TcLr Дол я инфекц ионны х Д ол я инф екц ионны х Д ол я инф ек ц ионны х 80 Доля инфекц ионны х 70 70 70 с тру кту р, % с тру кткр, % с тру к ту р,% 60 структур,% 50 50 50 40 40 40 30 30 30 20 20 20 10 10 10 0 0 0 а б в а б в а б в а б в 1 2 Рис. 2. Соотношение инфекционных единиц P. triticina, прекративших развитие на разных стадиях патогенеза на листьях сорта Тэтчер и линий с ге нами возрастной устойчивости (% от нанесенного инокулюма): 1 – рост ковые трубки без аппрессориев или с аппрессориями на эпидермальных клетках;

2 – инфекционные единицы, остановившиеся на стадиях аппрессо рия на устьице, подустьичной везикулы или одной инфекционной гифы;

3 – абортивные колонии. Фазы развития растений: а – проростки, б – выход в трубку, в – колошение.

ТсLr37 этот эффект усиливался с возрастом растений (рис. 2). В целом, на линиях с генами возрастной устойчивости до 70% инокулюма прекращало развитие до внедрения гаустория гриба в мезофильную клетку, т. е. проявля лась прегаусториальная устойчивость (Niks, 1983).

После внедрения в ткани влияние растений всех линий с генами воз растной устойчивости приводило к существенному нарушению формирова ния инфекционных структур на ранних этапах патогенеза (1-3 сутки после инокуляции). Отрицательное влияние растений на развитие инфекционных структур в ткани листьев усиливалось с возрастом растений, при этом цито логических признаков защитных реакций растений не выявлено. Подавление развития структур гриба приводило к абортации части колоний в ткани ли стьев линий TcLr22a, TcLr34 и TcLr35. На линии TcLr12 остановка части ко лоний (9%) проявлялась только на стадии колошения. После абортации ко лоний в их зоне наблюдалось постепенное отмирание клеток растений и утолщение их стенок.

На линиях с генами возрастной устойчивости колонии и пустулы гриба имели существенно меньший размер, чем на восприимчивых сортах. На всех линиях в зоне медленно развивающихся колоний на поздних этапах патоге неза наблюдалось постепенное разрушение части клеток растения. В резуль тате в области пустул формировались небольшие некротические зоны. Одна ко типичного проявления реакции СВЧ в форме коллапса и быстрого разру шения клеток не наблюдалась.

4. Цитофизиологические механизмы возрастной устойчивости Нами была исследована роль окислительного взрыва, синтеза каллозы и фенольных веществ в защите растений с генами возрастной устойчивости.

Исследования проводили на трех стадиях развития растений: проростков, вы хода в трубку, колошения. Для выявления особенностей механизмов возрас тной устойчивости в эксперименты включили восприимчивую линию с ге ном Lr2а, проявляющимся на стадии проростков.

Для определения начала специфического взаимодействия и активации защитных механизмов важно определение момента узнавания партнеров. На ми впервые установлено, что при контакте аппрессориев с частью устьиц происходил окислительный взрыв через 12 часов после инокуляции. Генера цию супероксид-аниона определяли по накоплению красителя нитросинего тетразолия. Краситель интенсивно накапливался в цитоплазме аппрессориев и подустьичных везикул, но не замыкающих клеток устьиц, что свидетельст вует об экстраклеточной генерации активных форм кислорода (рис.3, а). В результате значительная часть аппрессориев и подустьичных везикул поги бала до внедрения в клетки растения. Выявлена тесная зависимость между интенсивностью окислительного взрыва на устьицах и гибелью инфекцион ных структур до проникновения в клетки растения. В части инфекционных мест гриб продолжал развитие, что свидетельствует о нестабильном прояв лении окислительного взрыва.

Нами впервые было изучено влияние двух активных механизмов в фор ме синтеза защитного полисахарида каллозы (-1,3-глюкан) и фенольных ве ществ на патогенез. Синтез каллозы считается высокоэффективным механиз мом устойчивости. Имеющиеся в литературе данные о роли фенольных ве ществ в защите пшеницы от ржавчинных болезней противоречивы.

Рис. 3. Защитные реакции линий с генами возрастной устойчивости при взаимодействии с P. triticina. а – генерация супероксид-аниона при проник новении гриба в устьичную щель (стрелка);

б – интенсивные отложения кал лозы на клеточных стенках (стрелки) в зоне абортивной колонии (9 суток по сле инокуляции);

в – интенсивные отложения лигнина в зоне абортивной ко лонии. Окраска: а – нитросиний тетразолий;

б – кораллин;

в – автофлуорес ценция фенолов. Сокращения: а – апрессорий, пв – подустьичная везикула, ст – спорогенная ткань, л – лигнин, цф – цитоплазматические фенолы.

Нами установлено, что в местах контакта стенок замыкающих клеток устьиц с погибшими аппрессориями и подустьичными везикулами появля лись отложения каллозы и лигнина (через 1 сут и 2-3 сут после инокуляции соответственно) Таким образом, при остановке гриба на этапе проникно вения в ткань первичным был окислительный взрыв, а синтез каллозы и фе нольных веществ происходил после остановки патогена.

Развитие колоний патогена в ткани листьев происходило с разной ин тенсивностью. В тканях линий TcLr22a, TcLr34, TcLr35 наблюдалась аборта ция колоний на ранних этапах развития через 3-5 сут после инокуляции. Для этих линий было характерно подавление развития инфекционных структур, необходимых для биотрофного питания патогена – материнских клеток гау сториев (МКГ) и гаусториев. Вероятно, нарушение формирования инфекци онных структур гриба было причиной остановки развития гриба, так как за щитные реакции в форме синтеза каллозы, фенольных веществ и отмирания клеток растения проявлялись после абортации колоний.

Поскольку на линиях с генами возрастной устойчивости подавление образования аппрессориев на устьицах наблюдалось до окислительного взрыва, который возникает в момент узнавания элиситоров гриба, а цитоло гические признаки несовместимости в зоне абортивных колоний проявлялись после остановки развития гриба, то мы считаем, что подобное воздействие растений является проявлением пассивного неспецифического механизма.

Оно может быть результатом отсутствия комплекса стимулов для развития инфекционных структур гриба на поверхности и в тканях растений. Такое воздействие характерно для растений с генами устойчивости, интрогрессиро ванными из далеких видов злаков (Плотникова, 2009).

В части инфекционных мест колонии гриба останавливались в разви тии на поздних этапах патогенеза, либо образовывали пустулы небольшого размера. В зоне таких колоний через 5-9 суток после инокуляции наблюда лось усиление синтеза каллозы, фенольных веществ и постепенное отмира ние клеток растений. Очевидно, угнетение развития гриба являлось следст вием проявления комплекса механизмов устойчивости растений.

Накопление фенольных веществ в клетках растений было изучено с помощью цитохимических методов и путем наблюдения их автофлуорес ценции. С помощью окраски сернокислым анилином выявляли комплекс фе нольных веществ в цитоплазме, а также отложений лигнина на клеточных стенках. Нами впервые проанализирован качественный состав фенольных веществ в тканях зараженных линий с генами возрастной устойчивости. Ус тановлено, что соединения с остатками транскоричного альдегида появляют ся в зоне колоний гриба к моменту спороношения, а вещества с остатками сирингина синтезировались раньше – через 3-5 суток после инокуляции и коррелировали с проявлением устойчивости растений.

Исследование автофлуоресценции фенольных веществ в тканях инфи цированных листьев растений с генами возрастной устойчивости показало два типа свечения фенольных веществ – красную автофлуоресценцию в ци топлазме клеток и апопласте, а также зеленую автофлуоресценцию отложе ний лигнина на клеточных стенках. Такое свечение было сходно с автофлуо ресценцией лигнина в проводящих пучках здоровых участков листьев. Зеле ный цвет автофлуоресценции отличался от желтого свечения лигнина в тка нях линии TcLr2a, для которой была характерна реакция СВЧ. В этих же зо нах с помощью хлор-сульфитной реакции установлено повышенное содер жание сирингина. Таким образом, в линиях с генами возрастной устойчиво сти впервые показано значение специфической ветви фенольного метаболиз ма в подавлении развития патогена.

С возрастом растений интенсивность защитных реакций повышалась (рис. 4). Отложения каллозы на клеточных стенках растений становились бо лее мощными, в тканях линий TcLr13, TcLr34 и TcLr37 образовывались сет чатые структуры в зоне инфекционных гиф (рис.3, б). Поскольку ранее пока зана взаимозависимость между генерацией активных форм кислорода и син тезом каллозы, то можно предполагать развитие второго окислительного взрыва в этих зонах листьев.

а б 1600 Площадь, тыс.кв.мкм 1400 1200 1200 Колония 1000 1000 Пустула 800 800 Каллоза 600 600 Фенолы 400 200 0 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 Рис. 4. Накопление каллозы и фенолов в области колоний P. triticina, суток после инокуляции. Фазы развития растений: а – проростки, б – коло шение. 1 – сорт Саратовская 29, 2 – Тэтчер (Lr22b), 3 – TcLr12, 4 – TcLr13, – TcLr22a, 6 – TcLr34, 7 – TcLr35, 8 – TcLr37.

С возрастом растений усиливался синтез фенолов и лигнификация кле точных стенок. На стадии проростков лигниновые отложения были пред ставлены в виде тонкой сетки, а на стадии колошения отложения были мощ ными, часто имели форму сетки в зоне контакта с инфекционными гифами (рис. 3, в). Поскольку лигниновые отложения наблюдались только в центре колоний на поздних этапах патогенеза, то лигнификация не могла быть при чиной замедления распространения мицелия гриба. Вероятно, основное фун гицидное действие имели предшественники лигнина, накапливавшиеся в ци топлазме и апопласте.

На листьях линий TcLr22a и TcLr37 активные реакции растений про являлись в большей части зоны колонии, одновременно рост мицелия ин тенсивно подавлялся. Вероятно, эти механизмы имели значение в сдер живании роста колоний. На остальных линиях синтез каллозы и фенолов был сосредоточен в центральной части колоний, хотя развитие колоний было су щественно подавлено (рис. 4). Поэтому можно предположить влияние допол нительных защитных механизмов, в частности, синтеза защитных PR – бел ков. Сигналом для развития SAR может быть окислительный взрыв на части устьиц. Это предположение подтверждается тем, что интенсивность окисли тельного взрыва на устьицах линий TcLr13, TcLr34, TcLr37 повышалась с возрастом растений, одновременно усиливалось угнетение развития гриба в ткани растения.

5. Роль индуцированной устойчивости в возрастной устойчивости пшеницы к бурой ржавчине Известна гипотеза о том, что неспецифическая устойчивость сортов в агроценозах может быть связана с формированием системной приобретенной устойчивости растений (SAR) при контакте с авирулентными микроорганиз мами (Metraux, 2001;

Tuzun, 2001). Однако доказательства гипотезы отсутст вуют. Для проверки гипотезы нами впервые был проведен комплекс полевых и лабораторных исследований с использованием в качестве биоиндуктора инокулюма, полученного размножением популяции непатогенного для пше ницы гриба P. coronata. Одновременно с этим возможность развития SAR была проверена в экспериментах с химическими индукторами с известными механизмами действия. Янтарная и арахидоновая кислота являются индукто рами окислительного взрыва, Бион – синтеза PR-белков.

Результаты полевых и лабораторных экспериментов показали, что предварительный контакт растений с биоиндуктором (иммунизация) приво дил к повышению устойчивости растений. Эффект иммунизации был, как правило, более сильным на линиях с генами возрастной устойчивости, чем на восприимчивых сортах Саратовская 29 и Тэтчер и линии TcLr2a. Исключение составили опыты с линиями ТсLr13 и ТсLr34 в полевых условиях. Возмож ной причиной отклонений в результатах экспериментов было подавление действия генов высокой температурой среды.

В лабораторных условиях изучали проявление SAR в 3-х зонах расте ний: на нижней половине листа в месте нанесения P. coronata, на верхней ин тактной половине того же листа и на верхнем незараженном листе. Линии с генами возрастной устойчивости отличались особенностями проявления ин дуцированной устойчивости. На линиях TcLr12, TcLr34, TcLr35 эффект про являлся только в месте нанесения биоиндуктора. На линии TcLr22а наблю далась индукция SAR на целом листе, включая обработанные и необработан ные индуктором части. На линиях TcLr13 и TcLr37 дополнительно выявлено проявление SAR на верхних интактных листьях растений. Это свидетельст вует о генетически обусловленных особенностях распространения сигнала для развития SAR в организме растений.

Наши данные, полученные с помощью химических индукторов, под твердили возможность влияния SAR на проявление бурой ржавчины. Выяв лено разное влияние индукторов на линии, защищенные различными генами устойчивости. Наиболее эффективным оказалось применение Биона – индук тора синтеза PR-белков, менее эффективными были обработки индукторами окислительного взрыва – арахидоновой и янтарной кислотой. Это подтвер ждает наше предположение о роли PR-белков в формировании возрастной устойчивости пшеницы. Вероятно, отзывчивость на обработку разными ин дукторами отражает генетическую предрасположенность растений к актива ции разных метаболических путей.

Для выявления особенностей биотической индукции были проведены цитофизиологические исследования реакций растений. Особое внимание уделяли влиянию SAR на ранее выявленные механизмы возрастной устойчи вости. Исследования показали, что только на листьях линии TcLr35 наблю далось подавление образования аппрессориев на устьицах, на остальных ли ниях влияния SAR на развитие поверхностных структур гриба не отмечено.

На линии TcLr13 отмечено существенное (на 25%) повышение гибели иноку люма гриба на этапе внедрения в устьица за счет усиления окислительного взрыва. Общим проявлением устойчивости на всех линиях было увеличение доли абортивных колоний. Наибольший эффект наблюдался на линии TcLr35, на ее листьях иммунизация P. coronata приводила к абортации 95% колоний на ранних этапах патогенеза. На листьях всех линий развивающиеся колонии были меньше по площади в сравнении с контролем, в них наблюда лось существенное подавление формирования инфекционных структур. В зоне колоний был усилен синтез каллозы и фенольных веществ.

Таким образом, наши эксперименты показали, что биондукция приво дит к усилению разных механизмов возрастной устойчивости: подавлению развития инфекционных структур гриба на поверхности и в тканях, усиле нию окислительного взрыва на устьицах и синтеза каллозы и фенолов. Этот эффект может играть существенную роль в защите растений от болезни в аг роценозах. Полученные данные также подтверждают роль SAR в формиро вании возрастной устойчивости растений.

6. Механизмы устойчивости межлинейных гибридов Для защиты растений считается перспективным создание растений с набором эффективных генов и комплексом механизмов устойчивости. Нами изучены механизмы устойчивости гибридов, полученных в результате скре щивания линий с генами возрастной устойчивости. Оценка развития ржавчи ны на гибридах F1 в полевых и лабораторных условиях показала, что их ус тойчивость была выше по сравнению с восприимчивыми сортами Саратовс кая 29 и Тэтчер.

Мы предположили, что в результате скрещивания линий при сочетании одинаковых механизмов устойчивость гибридов F1 не должна усиливаться, а различных механизмов – будет повышаться. Цитологические исследования показали, что общее повышение устойчивости гибридов обеспечивалось уси лением разных механизмов защиты (рис. 5). На растениях гибридов с комби нациями генов TcLr34xTcLr13 и TcLr34xTcLr12 было существенно подавле но формирование аппрессориев на устьицах, но не наблюдалось усиления гибели патогена при внедрении в устьица, а в части комбинаций проникно вение гриба усиливалось. Это свидетельствует о том, что усиления окисли тельного взрыва на устьицах в гибридах не происходило.

Доля инфекционных структур, % б а 100 90 80 70 70 60 50 40 40 30 20 10 0 Tc b) Tc 2а Tc Tc r Tc Tc Lr Tc xT r Lr Tc a Lr Tc a Lr К LT Lr xT r Lr cL Lr cL к Tc 13x Lr Tc 34x Lr Tc 4xT Lr r Tc 13 х r Tc 34 х r Lr Lr Lr Lr L Tc r34 cL cL 34 L Lr c р( Tc 3xT че т Тэ Lr Tc Рис. 5. Соотношение инфекционных единиц P. triticina, прекративших развитие на разных стадиях патогенеза: а - на растениях родительских линий сорта Тэтчер;

б – на гибридных растениях (% от нанесенного инокулюма);

– ростковые трубки без аппрессориев или с аппрессориями на эпидермаль ных клетках;

2 – инфекционные единицы, остановившиеся на стадиях ап прессория на устьице, подустьичной везикулы или одной инфекционной ги фы;

3 – абортивные колонии.

Для действия большинства гибридных растений (за исключением TcLr34xTcLr13 и TcLr34xTcLr22a) было характерно усиление абортации ко лоний в ткани растений в сравнении с родительскими линиями. При этом в растениях гибридов TcLr13xTcLr22a, TcLr34xTcLr13, TcLr34xTcLr35, TcLr34xTcLr37 абортация была связана с нарушением формирования инфек ционных структур в ткани растений. Особенностью реакции гибрида TcLr34xTcLr37 было проявление реакции СВЧ при остановке развития гриба.

В тканях всех гибридов в зоне развивающихся и абортивных колоний усили вался синтез каллозы и фенольных веществ, а также лигнификация клеточ ных стенок.

Таким образом, нами впервые показано, что взаимодействие генов ус тойчивости может приводить как к усилению, так и подавлению отдельных механизмов защиты. Эти результаты необходимо учитывать при создании сортов с комплексом механизмов устойчивости.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведенные исследования выявили цитофизиологические механизмы возрастной устойчивости пшеницы к бурой ржавчине и формирование их в процессе онтогенеза. Полученная информация представляет интерес для раз вития теории иммунитета растений, а также важна для селекции сортов с длительной устойчивостью к бурой ржавчине.

ВЫВОДЫ 1. Устойчивость Triticum aestivum L. к Puccinia triticina Erikss. на юге Западной Сибири (г. Омск) обеспечивают гены возрастной устойчивости Lr12, Lr13, Lr22a, Lr34, Lr35, Lr37. Ген Lr22b в генотипе сорта Тэтчер в За падной Сибири не эффективен. Действие генов устойчивости Lr34 и Lr существенно зависит от температуры, а эффект гена Lr37 не зависел от усло вий среды.

2. Выявлены характерные особенности нарушения развития изолятов P. triticina, приводящие к неспецифической защите линий с генами возрас тной устойчивости: подавление образования аппрессориев на устьицах и ин фекционных структур в тканях, отмирание части инокулюма при внедрении в устьица, отмирание части колоний;

ограничение роста мицелия и спороге неза гриба.

3. Резистентность к бурой ржавчине повышалась с возрастом растений, при этом у разных линий усиливались разные механизмы устойчивости.

4. Выявлена экстраклеточная генерация активных форм кислорода за мыкающими клетками устьиц при контакте с частью аппрессориев, приво дящая к остановке проникновения гриба в ткани.

5. Накопление защитного полисахарида каллозы (-1,3-глюкан) на кле точных стенках происходило на поздних этапах патогенеза и было одним из механизмов ограничения развития колоний и пустул гриба. Синтез каллозы усиливался с возрастом растений.

6. Синтез фенольных веществ в цитоплазме растений и лигнификация клеточных стенок происходили на поздних этапах патогенеза и усиливались с возрастом растений. Впервые установлено, что фенольные соединения обогащены сирингином и имели зеленый цвет автофлуоресценции, отличный от наблюдавшегося в растениях с проявлением реакции СВЧ.

7. Доказана роль системной приобретенной устойчивости, индуциро ванной биоиндукторами, в защите линий с генами возрастной устойчивости.

Продемонстрированы различия в наборе индуцированных механизмов ус тойчивости разных линий.

8. На примере межлинейных гибридов F1 с генами возрастной устойчи вости показано, что взаимодействие генов может приводить как к усилению, так и подавлению отдельных механизмов устойчивости растений: окисли тельного взрыва, синтеза каллозы и фенолов, реакции СВЧ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Плотникова Л.Я., Кнаус Ю.К., Штубей Т.Ю. Цитологические меха низмы проявления действия перспективных генов устойчивости пшеницы к бурой ржавчине // Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и об разования: сб. тр. II Междунар. науч.-практ. конф. – Самара, 2005 – С. 237– 240.

2. Плотникова Л.Я., Штубей Т.Ю. Механизмы действия генов возрас тной устойчивости мягкой пшеницы к бурой ржавчине и перспективы их ис пользования в селекции // Современные проблемы и достижения аграрной науки в животноводстве, растениеводстве и экономике: Сборник трудов ре гиональной науч.-практ. конференции. – Томск, 2005. – Выпуск 8, с. 244-247.

3. Плотникова Л.Я., Шаманин В.П., Штубей Т.Ю. Изучение цитофи зиологических аспектов проявления генов возрастной устойчивости пшени цы к бурой ржавчине // Фитосанитарное оздоровление агроэкосистем: мате риалы II Всерос. съезда по защите растений (С-Петербург 5–10 декабря г.). – СПб., 2005. – С. 540–542.

4. Штубей Т.Ю., Плотникова Л.Я. Изучение особенностей проявления генов возрастной устойчивости мягкой пшеницы к бурой ржавчине в услови ях Западной Сибири // Современные тенденции развития агарной науки Си бири: материалы IV Междунар. научн.-практ. конф. молодых ученых, по свящ. 70-летию НГАУ (Новосибирск, 28–30 марта 2006 г.). – Новосибирск, 2006. – С. 91–94.

5. Плотникова Л.Я., Алексеева О.А., Штубей Т.Ю. Эффективные соче тания генов устойчивости для защиты пшеницы от бурой ржавчины в Запад ной Сибири // Материалы конференции, посвященной 119-летию Н.И. Вави лова «Вавиловские чтения – 2006» (Саратов, 4 – 8 декабря 2006г.). – Саратов, 2006. – с.45-48.

6. Плотникова Л.Я., Штубей Т.Ю. Роль биоиндукции в возрастной ус тойчивости пшеницы к бурой ржавчине // Роль молодых ученых в реализа ции национального проекта «Развитие АПК»: сб. материалов Междунар.

конф. (Москва, 29–30 мая 2007 г.). – М., 2007. – Ч.1. – C.105–108.

7. Штубей Т.Ю., Плотникова Л.Я. Биоиндукция как механизм дейст вия генов возрастной устойчивости пшеницы к бурой ржавчине // Материалы междунар. конф. «Научное наследие Н.И. Вавилова – фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства» (Москва, 27–28 ноября г.) / ФГОУ ВПО РГАУ– МСХА им. К.А. Тимирязева. – М., 2007. – С. 188– 189.

8. Плотникова Л.Я., Штубей Т.Ю. Индуцированная устойчивость как фактор «медленного ржавления» пшеницы при поражении бурой ржавчиной // Материалы II Всерос. конф. «Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам» (С-Петербург, 29 сентября – 2 октября 2008 г.). – СПб., 2008. – С. 265–268.

9. Плотникова Л.Я., Штубей Т.Ю. Эффективность генов возрастной устойчивости к бурой ржавчине пшеницы Lr12, Lr22a, Lr34 и механизмы их действия // Материалы XIII Всерос. научно-практической конф. «Селекция и семеноводство сельскохозяйственных культур» (Пенза, февраль 2009 г.).

Пенза, 2009. – С. 95-99.

10. Плотникова Л.Я., Штубей Т. Ю. Влияние салициловой и янтарной кислот на цитофизиологические реакции пшеницы, инфицированной бурой ржавчиной // Цитология. – 2009. – Т. 51. – №1. – С. 41–50.

11. Плотникова Л.Я., Штубей Т. Ю. Фенотипическое и цитологическое проявление возрастной устойчивости пшеницы к бурой ржавчине, детерми нированное генами Lr13, Lr22b и Lr35 // Микология и фитопатология. – 2009.

– Т.43. - №3. – С. 258–271.

БЛАГОДАРНОСТИ Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю доценту канд. биол. наук Л.Я. Плотниковой за помощь в подготовке диссер тации, а также благодарит заведующего лабораторией иммунитета СибНИ ИСХ канд. биол. наук Л.В. Мешкову за предоставление материала для иссле дований. Автор благодарит сотрудников кафедры селекции, генетики и фи зиологии растений и лаборатории селекции мягкой пшеницы и тритикале ОмГАУ за помощь в выполнении диссертационной работы.