Получение и характеристика линий мягкой пшеницы с единичными транслокациями от triticum timopheevii zhuk. c использованием молекулярно-генетических методов
На правах рукописи
ТИМОНОВА Екатерина Михайловна ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИНИЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ С ЕДИНИЧНЫМИ ТРАНСЛОКАЦИЯМИ ОТ TRITICUM TIMOPHEEVII ZHUK. C ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ 03.02.07 - генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Новосибирск 2012 1
Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики и цитогенетики растений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор, Салина Елена Артемовна
Официальные оппоненты: Бадаева Екатерина Дмитриевна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной кариологии и основ клеточной терапии, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, г.
Москва Соколов Виктор Андреевич, доктор биологических наук, заведующий лабораторией цитологии и апомиксиса растений, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, г.
Новосибирск
Ведущая организация: ГНУ Всероссийский Научно Исследовательский Институт Растениеводства им. Н.И. Вавилова Россельхозакадемии, г. Санкт-Петербург
Защита диссертации состоится «» 2012 г. на утреннем заседании диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в ИЦиГ СО РАН, в конференц-зале института по адресу: 630090, г.
Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10, тел/факс: (383) 363-49-06, факс (383) 333-12 78, e-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН.
Автореферат разослан “”2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Т. М. Хлебодарова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Генетическая эрозия, вызванная современными методами культивирования растений, привела к сужению разнообразия мягкой пшеницы Triticum aestivum L. по генам, контролирующим хозяйственно-ценные признаки, в том числе по генам устойчивости к болезням. Для увеличения генетического разнообразия и в качестве источников эффективных генов устойчивости используются сородичи пшеницы — дикие и культурные виды злаков (Friebe et al. 1996, Гончаров 2002). Одним из таких видов является T. timopheevii Zhuk. (2n=28, геномная формула GGAtAt), обладающий комплексным иммунитетом к желтой, бурой и стеблевой ржавчинам, мучнистой росе, пыльной и твердой головне, фузариозу, гессенской и шведской мухам, клопу-черепашке, зеленоглазке и пьявице (Дорофееев и др. 1979). Вид T. timopheevii недостаточно использовался в селекционных работах и потенциал этого вида как источника эффективных генов устойчивости еще далеко не исчерпан к настоящему моменту (Broun-Guedira et al. 1996, Будашкина и др. 1988). Поиск новых и эффективных генов, контролирующих устойчивость к заболеваниям, подбор доноров для селекционных программ и создание новых улучшенных генотипов пшеницы являются неизменно актуальными задачами, направленными на расширение генетического разнообразия сельскохозяйственных культур.
Одним из наиболее распространенных и вредоносных заболеваний пшеницы является бурая ржавчина, вызываемая базидиальным грибом Puccinia triticina Eriks.
При развитии сильной эпифитотии потери урожая зерна в результате поражения растений могут достигать 40-50% (Маркелова 2011, Roelfs et al. 1992). Наиболее эффективным способом борьбы является создание и культивирование сортов и линий пшеницы, обладающих устойчивостью к бурой ржавчине. Лишь немногие из интенсивно используемых Lr-генов (генов устойчивости к бурой ржавчине) способны на сегодняшний день обеспечить длительную устойчивость (durable resistance) (Kou, Wang 2010, Qi et al. 1999, Singh et al. 2005). Ранее в ИЦиГ СО РАН была создана коллекция гибридных линий мягкой пшеницы, устойчивых к бурой ржавчине, полученная на основе скрещивания T. aestivum с T. timopheevii, (Будашкина и др. 1988). Леоновой с соавторами (2008) было показано на двух сестринских линиях, что устойчивость к листовой ржавчине детерминируется тремя локусами QLr.icg-1A, QLr.icg-2A и QLr.icg-5B, картированных на хромосомах 1А, 2А и 5В, соответственно. Созданные гибридные линии содержали множественные участки интрогрессии от T. timopheevii, что негативно влияло на формирование количественных признаков и не позволяло оценить вклад отдельных локусов в формирование признака устойчивости.
Создание и изучение линий мягкой пшеницы, несущих в составе генома только целевой ген (почти изогенные линии) или фрагмент хромосомы дикого или культурного родственного вида, преследует несколько целей. В первую очередь это оценка потенциала гена (или интрогрессивного фрагмента) в формировании изучаемого признака (Салина и др. 2008, Uhrin et al. 2010). Линии, содержащие только целевой ген (или фрагмент хромосомы) от образца - донора признака, могут использоваться в качестве моделей для локализации генов, изучения их структуры и экспрессии, а также в качестве источника новых генов в селекционном процессе.
Использование маркеров для отбора нужных генотипов растений в беккроссных поколениях (marker assisted backcrossing, MAB) является одним из новых подходов, который в настоящее время используется для ускорения процессов интрогрессии целевых генов и создания почти изогенных линий (Collard, Mackill 2008). Использование молекулярных маркеров позволяет также контролировать элиминацию генетического материала донора и отбирать генотипы с минимальным размером интрогрессивного фрагмента.
Основная цель нашей работы - это создание интрогрессивных линий мягкой пшеницы с использованием молекулярно-генетических методов и изучение влияния отдельных участков хромосом Triticum timopheevii Zhuk. на формирование устойчивости к бурой ржавчине и количественные признаки мягкой пшеницы.
Задачи данного исследования:
Создание линий мягкой пшеницы с единичными интрогрессивными 1) фрагментами от T. timopheevii или их комбинациями путем контролирования процессов беккроссирования микросателлитными (SSR) маркерами.
Молекулярно-цитологический анализ интрогрессивных линий мягкой 2) пшеницы. Определение хромосомной локализации и размера интрогрессивных фрагментов в созданных линиях.
Оценка интрогрессивных линий мягкой пшеницы на устойчивость к 3) бурой ржавчине.
Оценка влияния различных фрагментов интрогрессии T. timopheevii и 4) их комбинаций на хозяйственно-ценные признаки мягкой пшеницы.
Научная новизна работы. В результате проведенной работы нами впервые с применением отбора с помощью молекулярных маркеров были получены линии мягкой пшеницы, несущие единичные транслокации от T. timopheevii. Впервые показано, что локус QLr.icg-5B, перенесенный в геном мягкой пшеницы от T. timopheevii, обеспечивает устойчивость линий мягкой пшеницы к бурой ржавчине на всех стадиях развития растения. Продемонстрирована эффективность комплексного подхода при использовании молекулярных SSR-маркеров и цитологических методов для анализа форм мягкой пшеницы, полученных с участием материала T. timopheevii.
Практическая ценность работы. В результате данного исследования получено пять цитологически стабильных линий мягкой пшеницы с единичными транслокациями от T. timopheevii, обладающие устойчивостью к бурой ржавчине, которые могут быть использованы в селекции в качестве доноров устойчивости. В ходе данной работы был отработан метод маркер-ориентированного отбора, использование которого позволяет значительно сокращать время получения новых улучшенных генотипов пшеницы. Были отобраны молекулярные маркеры, позволяющие эффективно маркировать локусы, контролирующие признак устойчивости к бурой ржавчине.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
Локус QLr.icg-5B, перенесенный в геном мягкой пшеницы от T. timopheevii, 1) обеспечивает устойчивость линий мягкой пшеницы к бурой ржавчине, характерной для Западной Сибири, на всех стадиях развития растения.
Комбинация минорных локусов устойчивости к бурой ржавчине QLr.icg-2А 2) и QLr.icg-1А у интрогрессивных линий мягкой пшеницы оказывает сдерживающий эффект на развитие болезни на стадии взрослых растений и не приводит к развитию гиперчувствительного ответа.
Личный вклад автора. Основная часть экспериментальной работы и анализ полученных результатов выполнена автором самостоятельно. Данные по устойчивости на стадии проростков предоставлены сотрудниками ГНУ СибНИИРС Россельхозакадемии Сочаловой Л.А. и Христовым Ю.А. Данные по количественным признакам у интрогрессивных линий в Омской области 2009- гг. (поле 1) предоставлены сотрудниками ГНУ СибНИИСХ Россельхозакадемии Беланом И.А. и Россеевой Л.П. Данные по микросателлитным маркерам, уточняющие границы интрогрессивных фрагментов, предоставлены Леоновой И.Н.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на 11 международных и российских конференциях, среди которых 1-ая международная школа конференция молодых учёных «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (2008, Москва-Звенигород), 5 ый съезд ВОГиС (2009, Москва), международная конференция «Генетика, геномика и биотехнология растений» (2010, Новосибирск), международная конференция «Green plant breeding technologies» (2010, Vienna, Austria), международная конференция «Генетические ресурсы и геномика пшеницы» (2011, Новосибирск), 20th ITMI/2ndWGC Joint Workshop (2011, Beijing, China) и другие, а также обсуждались на отчетной сессии ИЦиГ СО РАН (2008, 2011).
Публикации. По результатам исследования опубликовано 17 работ, в том числе статьи в рецензируемых отечественных и зарубежных изданиях, получен патент «Способ создания линий мягкой пшеницы, устойчивых к бурой листовой ржавчине», номер 2407283 RU.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 160 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 15 рисунков. Библиографический указатель содержит источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Растительный материал. Исходные гибридные линии пшеницы 744-1 и 832- (поколение BС1F18-BС1F20, 2n=42), полученные от скрещивания T. aestivum с T. timopheevii, и их родительские формы сорт мягкой пшеницы Саратовская 29 и тетраплоидный вид T. timopheevii var. viticulosum были любезно предоставлены Будашкиной Е.Б. Линии 744-1 и 832-1 содержали в геноме 5 и 7 интрогрессивных фрагментов от T. timopheevii, соответственно, и обладали комплексной устойчивостью к бурой и стеблевой ржавчинам, мучнистой росе, пыльной головне, темно-бурой пятнистости и отличались от исходного сорта Саратовская 29 по ряду морфологических и хозяйственно-ценных признаков (Леонова и др. 2002;
Leonova et al. 2011). Схема получения серии интрогрессивных линий мягкой пшеницы, содержащих различные комбинации фрагментов генома T. timopheevii, приведена на рис. 1. В данной работе проводился анализ поколения BC3 и последующее самоопыление отобранных растений.
Полученные интрогрессивные линии мягкой пшеницы, контрольный сорт Саратовская 29 и исходные гибридные родительские линии 744-1 и 832- выращивали на экспериментальном участке ГНУ СибНИИСХ Россельхозакадемии (г. Омск) в 2009-2010 гг., экспериментальном участке ИЦиГ СО РАН (Новосибирская область) в 2009-2010 гг., и экспериментальном участке ГНУ СИБНИИРС Россельхозакадемии в 2009-2010 гг., (Новосибирская область), далее в тексте обозначенных, соответственно, как поле/участок 1, 2 и 3. Растения выращивали на делянках шириной 50 см, по 20 рядов в каждой и по 30 зерен в ряду с расстоянием между делянками 60 см.
Рис. 1. Схема получения интрогрессивных линий T. aestivum T. timopheevii. Рамкой выделены этапы генотипирования и самоопыления, выполняемые в данной работе.
Выделение ДНК и микросателлитный анализ. ДНК выделяли из 5-7- дневных проростков по методу Плашке с соавторами (Plaschke et al. 1995). В работе были использованы микросателлитные маркеры Xgwm (Ganal, Rder 2007), Xgpw (Sourdille et al. 2001), Xcfe (Zhang et al. 2005) и маркер Xstm773-2 (Bariana et al.
2001) с известной локализацией в хромосомах T. aestivum и T. timopheevii (Salina et al. 2006a). Процедуру полимеразной цепной реакции (ПЦР) осуществляли с использованием меченого праймера М13 и немеченых праймеров к микросателлитным локусам согласно методике Hayden с соавт. (2002). Разделение фрагментов ПЦР выполняли на автоматическом секвенаторе ABI3100 (Applied Biosystems, ЦКП автоматического секвенирования ДНК СО РАН). Размер фрагментов рассчитывали с помощью компьютерной программы Peak Scanner (Applied Biosystems) относительно стандартных образцов ДНК известной длины.
Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH). FISH проводили в соответствии с ранее опубликованной методикой с использованием зондов Spelt1, pSc119.2, локализующихся в основном в хромосомах B- и G-геномов, и pAs1, специфичного для хромосом D генома (Салина и др. 1997, Salina et al. 2006b).
С-окрашивание. С-окрашивание проводили с соответствии со стандартной методикой согласно Бадаевой с соавторами (1994).
Оценка устойчивости к болезням. Устойчивость интрогрессивных линий на ювенильной стадии и на стадии взрослых растений оценивали у интрогрессивных линий, гибридных родительских линий 744-1 и 832-1 и сорта Саратовская 29 (в качестве контроля). Учет поражения бурой ржавчиной проводили по шкале Майнса и Джексона: 0 – иммунный тип;
1 – весьма устойчивый;
2 – умеренно устойчивый;
3 – умеренно восприимчивый;
4 – весьма восприимчивый (Mains, Jackson, 1926).
Устойчивость на стадии проростков оценивали по ранее описанной методике (Михайлова, Квитко 1970). Оценку динамики развития поражения проводили согласно модифицированной шкале Кобба (площадь покрытия листовой пластины урединиоспорами) (Peterson et al. 1948). Измерения проводились с интервалом в семь дней с момента появления первых пустул на полях 2 и 3 в 2009-2010 гг.
Анализ количественных признаков. Анализ элементов структуры урожая проводили по семи количественным признакам (высота растения, длина колоса, число колосков в колосе, число зерен в колосе, число зерен с растения, масса зерна в колосе, масса зерна с растения, масса 1000 зерен). Признаки оценивались три раза: на участке 1 в 2009 и 2010 годах и на участке 2 в 2010 году. Оценка признаков проводилась для 20 случайно выбранных растений для каждой интрогрессивной линии и родительских форм.
Статистический анализ. Сравнение количественных признаков проводили посредством однофакторного дисперсионного анализа (Фактор - генотип).
Достоверность межгрупповых различий оценивали по критерию множественных сравнений LSD Фишера. Достоверность внутриклассового коэффициента корреляции при оценке влияния окружающей среды (фактор - поле) на формирование количественных признаков оценивали с помощью критерия Фишера. Статистическую обработку осуществляли с помощью программы Microsoft Excel 2010.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Создание интрогрессивных линий с помощью SSR-маркеров. Схема создания интрогрессивных линий на основе гибридных линий 744-1 и 832-1 представлена на рисунке 1.
Основными факторами, определяющими эффективность отбора гибридных форм с помощью молекулярных маркеров, являются стратегия отбора, схема эксперимента, размер популяции, а также наличие, доступность и расположение маркеров относительного целевого локуса (Frisch et al. 1999a, Hospital et al. 2005).
Отбор с использованием маркеров проводился в два этапа. Ранее на первом этапе отбирались растения из поколения BC2F1 от скрещивания родительских линий 744 1 и 832-1 с сортом Саратовская 29 и последующего двукратного беккроссирования.
В связи с ограниченным размером популяции не было обнаружено растений, содержащих только 1 или 2 фрагмента генома T. timopheevii. По результатам SSR анализа было отобрано шесть растений (3862, 3866, 3869, 5352, 5360, 5366), содержащих комбинации из 3-4 интрогрессивных фрагментов в хромосомах 1A, 2A, 2B, 5B, 6В, и содержащих локусы устойчивости к листовой ржавчине QLr.icg 5B, QLr.icg-2A и QLr.icg-1A от T. timopheevii.
В рамках данной работы выполнен второй этап отбора интрогрессивных линий, содержащих единичные транслокации генетического материала T. timopheevii или сочетания из 2-3-х фрагментов, на более поздних этапах беккроссирования (BC3F2) и на более расширенном размере популяции ( растений). Для анализа линий был использован набор полиморфных SSR-маркеров, отобранных на основе результатов, полученных ранее при анализе гибридных T. aestivum T. timopheevii линий и данных по картированию генома T. timopheevii (Leonova et al. 2002, Salina et al. 2006a). Всего для генотипирования 178 растений BC3F2 было использовано 25 микросателлитных Xgwm, Xgpw и Xcfe маркеров с известной хромосомной локализацией у T. aestivum и T. timopheevii - от 2 до маркеров на хромосомы 1A, 2A, 2B, 5B, 6B. По результатам генотипирования было отобрано 68 растений для уточнения границ интрогрессивных фрагментов с привлечением дополнительных 23 микросателлитных маркеров. Число интрогрессивных фрагментов в потомстве линий BC3F2 составляло от 1 до 4 на геном, при этом у 18 растений генетический материал T. timopheevii не обнаружен.
Всего было получено 38 линий, содержащих только один интрогрессивный фрагмент T. timopheevii, а именно, 26 содержали фрагмент хромосомы 2G, шесть – длинного плеча хромосомы 5G, шесть – фрагмент хромосомы 6G. 72 линии содержали комбинации двух, 38 линий трех и 12 линий четырех интрогрессивных фрагментов хромосом 1At, 2At, 3G, 2G, 5G, 6G в различных сочетаниях.
Использование маркеров позволяет быстро отбирать гомозиготные формы по целевому гену или по интрогрессивному фрагменту. Были отобраны линии с транслокациями, включающими хромосомы 5В и 6В, в гомозиготном состоянии. В поколении BC3F2 не удалось получить линий, гомозиготных по 2G фрагменту, а также потомства, содержащего единичный фрагмент в хромосомах 1А и 2А. Линии гомозиготные по 2G фрагменту были получены после дополнительного самоопыления. В нашей работе успеху получения линий как с единичными транслокациями, так и с различными комбинациями при небольшом размере выборки способствовала следующая схема эксперимента: а) предварительное генотипирование родительских форм и определение хромосомной локализации интрогрессивных фрагментов, что позволило исключить отбор с помощью маркеров на стадии BC1, взять в анализ выборки небольшого размера на стадиях BC2 и BC3 (97 и 178 линий, соответственно) и снизить количество маркеров для анализа;
б) достаточное число MDPs (marker data points, вычисляемое как число маркеров на число растений) (7275 для BC2 и 4550 для BC3) для выявления фрагментов T. timopheevii различной протяженности у изучаемых линий.
Оценка протяженности интрогрессивных фрагментов T. timopheevii у полученных линий мягкой пшеницы. Важной характеристикой создаваемых интрогрессивных линий является стабильность наследования генетического материала от T. timopheevii при скрещиваниях с мягкой пшеницей. Чем выше рекомбинационная способность гомеологичных хромосом, тем больше вероятность уменьшения протяженности интрогрессивного фрагмента, вплоть до потери перенесенных в геном мягкой пшеницы полезных признаков. В связи с этим актуальным представляется изучение стабильности длины интрогрессивных фрагментов у созданных линий по сравнению с исходными гибридами.
Проведена оценка протяженности фрагментов хромосом 1At, 2At, 2G, 5G и 6G T. timopheevii в поколении BC3F2 линий 744-1 и 832-1 (рис. 2). Интрогрессивный фрагмент в хромосоме 1А у исходной линии 832-1 после проведения трех беккроссов уменьшился (до 1/2 от исходной длины у родительской линии), однако этот процесс не затронул район локуса QLr.icg-1A (рис. 2). Различий по длине фрагмента среди потомства BC3F2 не было обнаружено. Для родительской линии 744-1 показано, что хромосома 1А содержит два транслоцированных фрагмента от T. timopheevii – небольшой участок в коротком плече хромосомы и фрагмент длинного плеча. После трехкратного беккроссирования произошла элиминация 1At фрагмента в коротком плече и уменьшение длины фрагмента в длинном плече с потерей минорного локуса устойчивости к бурой ржавчине QLr.icg-1A.
Аналогичная ситуация наблюдалась при оценке протяженности интрогрессивных фрагментов хромосомы 2Аt у растений BC3F2 поколения, полученных от линии 832-1: длина фрагмента уменьшалась более чем на половину (рис. 2).
Транслокация фрагмента хромосомы 2G T. timopheevii у линии 832- затрагивала полностью короткое и часть длинного плеча хромосомы 2В. В процессе беккроссирования произошло уменьшение длины интрогрессивного фрагмента (рис. 2). У линии 744-1 интрогрессивный фрагмент состоял из длинного плеча хромосомы 2G, размер которого не изменился.
** Рис. 2. Схематическое изображение расположения и размера интрогрессивных фрагментов хромосом T. timopheevii у линий BC3F2 (темно-серого цвета) и родительских гибридных линий 744-1 и 832-1 (светло-серого цвета) относительно генетических карт ITMI. Порядок маркеров и приблизительные расстояния между ними соответствуют генетическим картам ITMI популяции (Ganal, Rder 2007).
QTLs, картированные ранее у линии 832-1, указаны сбоку (Leonova et al. 2008). Стрелки указывают на расположение центромеры. *-транслокация в 2D Транслокация, затрагивающая хромосому 5В у линии 832-1, находится в теломерной области длинного плеча. У потомства BC3F2 произошло незначительное уменьшение протяженности данного фрагмента, которое не затронуло область локализации локуса QLr.icg-5B. Линия 744-1 содержит полностью длинное плечо хромосомы 5G в геноме. Однако в потомстве BC3F данный фрагмент не сохранился.
Было показано, что у линии 744-1 полностью замещено длинное плечо и большая часть короткого плеча хромосомы 6В фрагментом хромосомы 6G. У потомков поколения BC3F2 выявлены 2 типа растений, у которых протяженность фрагмента уменьшилась приблизительно на 20% и 50% от исходной длины. Линия 832-1 содержит транслокацию фрагмента длинного плеча хромосомы 6G, расположенную в интервале между микросателлитными маркерами Xgwm1199 Xgwm889. Данный фрагмент полностью элиминировался после трехкратного беккроссирования.
Одним из важных факторов успеха использования отбора с помощью молекулярных маркеров (marker-assisted selection, MAS) для отбора генотипов, содержащих целевые гены и QTLs, является наличие тесного сцепления между молекулярными маркерами и локусами. Эффективность MAS снижается в случае рекомбинации между маркером и целевым локусом. Поэтому для отбора генов и QTLs стараются подбирать маркеры, тесно сцепленные с ними или расположенные по обе стороны локуса. В данной работе использование маркеров позволило показать уменьшение длины интрогрессивных фрагментов хромосом At и G геномов T. timopheevii. Также оказалось, что протяженность G-геномных интрогрессивных фрагментов 2GL и 5GL от T. timopeevii сохранялась практически полностью (рис. 2) после третьего этапа беккроссирования, что характерно для скрещиваний мягкой пшеницы с отдаленными видами и может быть связано со сниженным уровнем рекомбинации (Friebe et al. 1996;
Tao et al, 2000).
Использование маркеров позволило отобрать растения с уменьшением интрогрессивных фрагментов At генома T. timopheevii, содержащих локусы устойчивости, что невозможно сделать с помощью фенотипического отбора. Для дальнейшего использования созданных линий в качестве доноров интрогрессивных фрагментов от T. timopheevii необходимо в случае At генома выбирать маркеры, расположенные по обе стороны от целевого локуса. В то время как для маркирования локусов, локализованных в G геноме, достаточно одного маркера, специфичного для данной транслокации.
Цитологический анализ интрогрессивных линий. Ранее было показано, что с помощью молекулярных маркеров не всегда удается выявить транслокации, затрагивающие дистальные районы хромосом мягкой пшеницы (Салина и др. 2008, Ganal, Rder 2007). Это связано с тем, что SSR маркеры, ограничивающие генетические карты хромосом, физически локализуются в субтеломерных районах и не охватывают концевые районы хромосом (Dobrovol’skaya et al. 2007, Ganal, Roder 2007). Кроме того, микросателлитными маркерами невозможно идентифицировать случаи негомологичных транслокаций или сложных перестроек хромосом, связанных с внутрихромосомными инверсиями или слиянием хромосом, что является следствием процессов отдаленной гибридизации злаков. Поэтому для получения наиболее полного представления о структуре генома гибридов и оценки характера интрогрессии было проведен дополнительный анализ интрогрессивных линий методами in situ гибридизации и C-окрашивания. Анализ проводился для линий с единичными транслокациями и 7 линий с двумя и тремя фрагментами, несущими различные комбинации локусов устойчивости (QLr.icg-1A, QLr.icg-2A и QLr.icg-5B) к бурой ржавчине (табл. 1), отобранных по результатам SSR анализа.
Использование метода FISH для анализа интрогрессивных линий. У образца T. timopheevii var. viticulosum, участвовавшего в образовании исходных гибридов, было выявлено 7 участков гибридизации зонда Spelt1 с субтеломерными районами хромосом 2AtL, 6AtS, 1GL, 2GL, 4GL, 5GL, 6GS.
Линия 744-1. FISH на метафазных хромосомах родительской гибридной линии 744-1 показала наличие четырех интрогрессивных фрагментов хромосом T. timopheevii: 2GL, 4GL, 5GL по наличию сигнала зонда Spelt1 в субтеломерных районах хромосом мягкой пшеницы и 6G в хромосому 6В, которая определялась косвенным образом по отсутствию сигнала pSc119.2 в середине длинного плеча хромосомы 6В, что характерно для T. timopheevii. Среди них 4BS.4BL-4GL транслокация не обнаруживалась с помощью молекулярного анализа.
Транслокации фрагментов 2GL и 5GL затрагивают хромосомы 2D и 5D.
Линия 832-1. Цитологическим анализом хромосом линии 832-1 были выявлены транслокации 3BS.3BL-3GL, 4BS.4BL-4GL и 5BS.5BL-5GL, а также фрагмент 1At хромосомы T. timopheevii (рис. 3). Транслокации фрагментов 4GL и 5GL выявлялись благодаря локализации зонда Spelt1 на длинных плечах хромосом 4B и 5В, соответственно. Фрагменты хромосом 3GL и 1At обнаруживались по присутствию сайтов pSc119.2.
Рис. 3. FISH на метафазных хромосомах гибридной линии 832-1 (а), интрогрессивной линии 5352-171 (б). Зонды Spelt1 (красный) и pSc119.2 (зеленый). С-окрашивание интрогрессивной линии 5352-180 (в) Поколение BC3F2 линий 744-1 и 832-1. В анализ были взяты двадцать пять линий, содержащих в своем геноме от одного до трех интрогрессивных фрагментов от T. timopheevii по данным SSR-анализа: 1) потомки линии 744-1 (3862-*, 3866-*, 3869-*), 2) потомки линии 832-1 (5352-*, 5360-*, 5366-*), а также родители Саратовская 29, T. timopheevii и гибридные линии 744-1 и 832-1 (табл. 1).
Таблица 1. Интрогрессивные фрагменты от T. timopheevi, обнаруженные в линиях мягкой пшеницы молекулярно-генетическими и цитологическими методами Линия SSR анализ С-окрашивание N FISH 1 3862-1 2GL 2GL 2GL 2 3862-4 2GL 2GL 2GL 3 3862-5 2GL 2GL 2GL 4 3862-15 2GL 2GL 2GL 5 3862-18 2GL 2GL 2GL 6 3862-20 2GL 2GL, del6BL 2GL, del6BL 7 3869-43 6GL (2)* 6GL 6GL 8 3869-47 6GL (2)* 6GL 6GL 9 3869-50 6GL (1)* 6GL nd 10 3869-51 6GL (2)* 6GL 6GL 11 3869-54 6GL (2)* 6GL 6GL 1At, 2GS 5GL 12 5352-70 5GL 2GS, 5GL 1At, 2GS 5GL 13 5352-73 5GL 2GS, 5GL 14 5352-75 5GL 5GL 5GL 1At 5GL 15 5352-79 5GL 5GL 1Аt, 2АtL 16 5352-83 - 1At, 2AtL 17 5352-104 - 18 5360-107 2GS 2GS t 19 5366-146 2A L, 5GL 5GL 5GL 20 5366-157 5GL 5GL 5GL 21 5366-171 5GL 5GL 3GL 5GL 22 5366-180 5GL 5GL 5GL 23 5366-187 5GL 5GL 5GL t 24 5360-191/5 2A L, 5GL 5GL 5GL 25 5360-191/28 5GL 5GL 5GL 1A, 2GL, 5AtL, 5GL, t 26 744-1 2GL, 4GL, 2GL, 4GL, 5GL, 6GL 6GL 5GL, 6GL 1A, 2A S. 2AtL, 2GS, t t 1At, 3GL, 1At, 2AtS. 2AtL, 2GS, 27 832- 3AtL, 5AtL, 5GL, 6GL 4GL, 5GL, 4GL, 5GL, 6GL - интрогрессивные фрагменты не были обнаружены данным методом, nd – анализ не проводился, * - цифры 1 и 2 отмечают разные по длине интрогрессивные фрагменты одной и той же хромосомы в BC3F2 линиях. Жирным шрифтом выделены интрогрессивные фрагменты, выявляемые только одним или двумя методами.
С помощью in situ гибридизации с зондами pSc119.2 и Spelt1 были подтверждены транслокации, затрагивающие хромосомы 2G, 5G, 6G у изучаемых интрогрессивных и родительских гибридных линий, выявленные SSR-анализом (табл. 1). Было обнаружено, что транслокация 3ВS.3BL-3GL сохранилась в потомстве. C использованием зонда pAs1, специфичного для D генома, показана интрогрессия фрагмента 2GL в 2D хромосому, что невозможно определить с помощью SSR анализа. У линии 3862-20 выявлена делеция длинного плеча хромосомы 6В. Интрогрессивные фрагменты 1At, 2AtL не выявлялись с помощью FISH из-за уменьшения размеров фрагментов в процессе беккроссирования и недостаточной маркированности A и At геномов.
Использование метода С-окрашивания для анализа интрогрессивных линий.
Транслокации, затрагивающие хромосомы G генома, выявлялись более успешно, чем транслокации, затрагивающие А и Аt геномы, поскольку хромосомы В и G геномов несут больше гетерохроматина и окрашиваются более интенсивно.
Линия 744-1. С помощью дифференциального С-окрашивания хромосом линии 744-1 были выявлены интрогрессивные фрагменты, детектированные нами с помощью метода FISH: 2GL, 4GL, 5GL и 6GL. Хромосома 2D не выявлена методом С-окрашивания, так как ее структура была изменена в связи с транслокацией 2DS.2GL. Транслокация 5DS.5GL обнаруживалась по яркому теломерному и интерстициальным бэндам, характерным для длинного плеча 5G хромосомы.
Фрагмент 1At не выявлялся данным подходом.
Линия 832-1. У линии 832-1 выявлялись транслокации фрагментов 1At, 2At, 2GS, 4GL, 5GL. Также у линии 832-1 был обнаружен яркий терминальный бэнд, локализованный на длинном плече хромосомы 6D, нетипичный для данной хромосомы. Это дает нам возможность предположить наличие у данной линии терминальной транслокации хромосомы 6G T. timopheevii в длинное плечо хромосомы 6D, а не в 6В. Терминальный фрагмент 5GL в хромосоме 5В выявлялся по яркому темному теломерному бэнду. Транслокация 5BS.5BL-5GL была впервые описана Бадаевой с соавт. (Badaeva et al., 1991). В 1994 году Ямамори (Yamamori) была показана связь между устойчивостью к бурой ржавчине сортов мягкой пшеницы с присутствием в их геноме данной транслокации.
Поколение BC3F2 линий 744-1 и 832-1. С-окрашивание выявило транслокации, затрагивающие хромосомы 2G, 5G, 6G у интрогрессивных и родительских линий, выявленные SSR-анализом (табл. 1, рис. 3в). Интрогрессивные фрагменты 1At, 2AtL не выявлялись из-за уменьшения размеров фрагментов в процессе беккроссирования и недостаточной маркированности A и At геномов.
Транслокация 6DS.6DL-6GL не сохранилась в потомстве.
Сопоставление данных трех методических подходов по оценке геномного состава указывает на то, что наиболее точное описание структуры генома и хромосомных перестроек, возникающих при гибридизации видов с частичной гомеологией хромосом, можно дать с использованием только комплексного молекулярно-генетического и цитологического анализов (табл. 1). SSR-анализ позволил точно определить размеры и локализацию 70% интрогрессивных фрагментов. FISH и С-окрашивание оказались более эффективны для выявления терминальных транслокаций, делеций и транслокаций, затрагивающих хромосомы D генома.
Таким образом, среди 25 проанализированных линий встречается различающихся по геномному составу вариантов линий. Следует также отметить, что линии с транслокациями в хромосомах 5B, 2А и 1А, несут соответственно локусы QLr.icg-5B. QLr.icg-2A и QLr.icg-1A, определяющие устойчивость к бурой ржавчине (Леонова и др. 2008).
Оценка выбранных линий популяции BC3F3 на устойчивость к бурой ржавчине.
Тест на проростках. Исходный сорт мягкой пшеницы Саратовская 29, взятый в качестве контроля, сильно поражается бурой ржавчиной (балл=4), а гибридные линии 744-1 и 832-1 практически имунны к этому патогену (балл=0-1) (табл. 2). В тесте на проростках наиболее устойчивыми оказались линии, содержащие в геноме интрогрессивный фрагмент 5GL от T. timopheevii с главным локусом устойчивости QLr.icg-5B (табл. 2). Это линии 5352-70, 5352-73, 5352-75, 5352-79, 5366-146, 5366 157, 5366-171, 5366-180, 5366-187, 5360-191/5 и 5360-191/28. Все остальные линии не обладали ювенильной устойчивостью и оказались средне- и высоковосприимчивыми (балл=3 и 4). В том числе линии, содержащие в геноме интрогессивные фрагменты только с минорными локусами устойчивости QLr.icg 1A и QLr.icg-2A, также были восприимчивы к патогену (табл. 2).
Оценка устойчивости к бурой ржавчине на стадии взрослых растений в полевых условиях. Поскольку у линий, содержащих одни и те же комбинации интрогрессивных фрагментов, развитие заболевания должно происходить одинаково, то для оценки устойчивости к бурой ржавчине на стадии взрослых растений было выбрано 8 линий с единичными транслокациями и 7 линий, содержащих различные комбинации интрогрессивных фрагментов от T. timopheevii, в том числе с главным (QLr.icg-5B) и минорными (QLr.icg-1А, QLr.icg-2А) локусами устойчивости к бурой ржавчине (табл. 2). Созданные линии позволяют оценить как индивидуальный вклад главного локуса QLr.icg-5B, так и комбинаций главного и минорных локусов в формирование устойчивости. Кроме того были изучены линии, которые позволили оценить формирование устойчивости в случае комбинации только двух минорных локусов QLr.icg-1А и QLr.icg-2А.
Западно-Сибирская популяция листовой ржавчины представлена физиологическими расами, преодолевающими 28 известных Lr генов устойчивости. Большинство изолятов вирулентны к генам Lr1, 2b, 2c, 3a,3ka, 3bg, 9, 10, 11, 14a, 14b, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 26, 27+31, 29, 30, 32, 33, 44 и В и авирулентны к генам Lr19, 24, 25, 28, 36, 38, 45, 47 (Сочалова, Лихенко 2011).
Оценка устойчивости к бурой ржавчине проводилась в 2009-2010 гг. на экспериментальных участках 2 и 3. Для оценки динамики поражения линий возбудителем бурой ржавчины на поле 3 в 2009 и 2010 гг. было проведено несколько измерений с интервалом в семь дней после появления признаков болезни. Развитие бурой ржавчины у анализируемых линий в течение двух сезонов проходило сходным образом. Устойчивость на уровне 0-1 балла по шкале Майнса Джексона проявили как линии с единичными фрагментами 5G хромосомы, содержащие локус устойчивости QLr.icg-5B (Леонова и др. 2008), так и линии, содержащие этот локус в комбинации с другими фрагментами T. timopheevii.
Таблица 2. Характеристика линий мягкой пшеницы по устойчивости к бурой ржавчине на стадии проростков и взрослых растений Поле 2, Поле 3, Интрогрессивные Тест на 2010, в № Линия фрагменты от проростках, 2009/2010, баллах в баллах в баллах T timopheevii 2AtL 2GL 1 3862-1 2 3862-4 2GL 3 3862-5 2GL 3-4 4/ 4 3862-15 2GL 3 4/ 5 3862-18 2GL 2GL 6 3862-20 7 3869-43 6GL 8 3869-47 3- 6GL 3 4/ 9 3869-50 3- 6GL 3 4/ 10 3869-51 6GL 3 4/ 11 3869-54 3- 6GL t 12 5352-70 0- 1A 2GS 5GL 0-1 0-1/ 1At 2GS 5GL 13 5352-73 1- 14 5352-75 1-2, X 5GL 1At 5GL 15 5352-79 2 0-1 0-1/ 1At 2AtL 16 5352-83 3 3 3/ 1At 2AtL 17 5352-104 3 3 3/ 18 5360-107 3- 2GS 3 4/ t 19 5366-146 1, X 1 1/ 2A L 5GL 20 5366-157 5GL 21 5366-171 3GL 5GL 0-1 1/1- 22 5366-180 2, X 0-1 1/1- 5GL 23 5366-187 5GL 2AtL 5GL 24 5360-191/5 2 1 1/1- 25 5360-191/28 2 1 1/1- 5GL 1A, 2G, 4GL 5AtL, t линия 744-1 0-1 0 0/ 5GL, 6G 1A, 2At, 2GS, 3AtL, t линия 832-1 3GL, 4GL, 5AtL, 0-1 0 0/ 5GL, 6GL С 28 - 4 4/ Жирным шрифтом выделены хромосомы, несущие локусы устойчивости к бурой ржавчине.
Х – гетерогенная реакция Из литературы известно, что на хромосоме 5В локализовано два Lr гена: Lr52, происходящий из генома T. aestivum и картированный в коротком плече хромосомы, и ген Lr18, происходящий из генома T. timopheevii ssp. timopheevii, который находится в теломерной области длинного плеча (Yamamori 1994, Friebe et al. 1996, Hiebert et al. 2005). На основании данных по происхождению и локализации можно предположить, что локус на хромосоме 5В линии 832- является геном Lr18 или его аллелем. Ранее Леоновой с соавт. (2010) на основании молекулярного анализа и теста на устойчивость с использованием набора рас бурой ржавчины было показано, что ген LrTt2, картированный в области расположения QLr.icg-5B локуса, отличается от гена Lr18 и представляет, по видимому, новый более эффективный для Западной Сибири аллель данного гена, который также имеет происхождение из генома T. timopheevii.
Присутствие в геноме линий 5352-83 и 5352-104 фрагментов 1At и 2At с минорными локусами устойчивости к бурой ржавчине QLr.icg-2A и QLr.icg-1A оказывало небольшой сдерживающий эффект на проявление болезни и не приводило к развитию гиперчувствительного ответа (балл=3). Однако резкое увеличение числа пустул у линий 5352-83 и 5352-104 началось позже, чем у контрольного сорта и линий, не несущих локусы устойчивости (рис. 4). Поскольку полигенная устойчивость с большей вероятностью будет более эффективной, чем моногенная, данные локусы могут быть использованы в селекционных программах для объединения с другими генами и локусами с целью создания генотипов, обладающих расонеспецифической устойчивостью широкого спектра. Наилучшими характеристиками по устойчивости обладали линии 5352-70 и 5352-79, содержащие в геноме два локуса QLr.icg-1А и QLr.icg-5В.
Саратовская Степень поражения, % 75 3869-51 (6G) 5352-104 (1At 2AtL) 60 5352-83 (1At 2AtL) 5360-191/5 (2AtL 5GL) 5366-180 (5GL) 5352-70 (1At 2GS 5GL) 20.07 28. 13.07 03. 05. Дата оценки Рис. 4. Динамика развития бурой ржавчины у шести линий мягкой пшеницы с различными интрогрессивными фрагментами T. timopheevii в процентах пораженной площади листа в течение вегетационного периода 2010 г. на участке Таким образом, можно сделать вывод, что устойчивость интрогрессивных линий на стадии проростков коррелировала с устойчивостью на стадии взрослых растений. Полученные результаты дают возможность предположить, что локус QLr.icg-5B является эффективным на всех стадиях развития растения и его присутствие в геноме достаточно для приобретения растением устойчивости к популяции листовой ржавчины Западно-Сибирского региона России.
Характеристика интрогрессивных линий по количественным признакам.
Перенос в мягкую пшеницу небольших фрагментов генома отдаленных видов при сохранении генетического окружения коммерческого сорта является обычным подходом для изучения и использования ресурса ценных генов и аллелей, которые присутствуют в геноме диких видов. Анализ количественных признаков у линий проводился на экспериментальных участках 2 в 2010 г. и 1 в 2009 и 2010 гг.
Высота растения. Среднее значение этого параметра варьировало от 103,20±0,75 см на участке 1 в 2009 г. до 119,13±0,58 на поле 2 в 2010 г. Было обнаружено, что линии 3862-5 и 3862-15 с транслокацией 2DS.2GL (рис. 2) достоверно ниже (p0,005 для полей 1 и 2) родительского сорта Саратовская 29 по высоте. Поскольку создание сортов с короткой соломиной является предпочтительным в селекции на устойчивость к полеганию, эти линии могут иметь практическую ценность в селекционных программах. По литературным данным практически все хромосомы в различной степени оказывают влияние на высоту растения. К настоящему моменту описан 21 ген, определяющий уменьшение высоты у пшеницы, однако, лишь несколько широко используются (Liu et al. 2005).
Длина колоса и число колосков в колосе. Среднее значение длины колоса у изученных линий варьирует от 7,30 до 10,05 см. в 2009 г., от 6,70 до 9,62 см. на поле 1 и от 6,90 до 9,15 см. на поле 2 в 2010 году. По результатам сравнения каждой из анализируемых линий с родительским сортом было обнаружено, что линии 744-1 и 832-1, 5352-70, 5352-104 имеют достоверно большую длину колоса, чем сорт Саратовская 29 (p0,005). Ни одна из интрогрессивных линий не уступала по числу колосков исходному сорту. Этот показатель был достоверно выше у линий 3862-5, 3862-15 и 5360-107 на участках 1 и 2.
Число зерен в колосе. Обнаружено, что у изученных интрогрессивных линий такой показатель, как среднее количество зерен в главном колосе, колеблется в пределах от 21 до 41 шт. Число зерен в главном колосе, в среднем в повторности, соответствовало уровню родительского сорта Саратовская 29.
Масса зерна в колосе и с растения. Среднее значение массы зерна в колосе у всех линий в основном соответствовало уровню исходного сорта. Наибольшие значения по этому признаку отмечены для линий 3862-5, 3862-15 в условиях поля в 2009 г. и для линий 5352-70, 5352-104, 5360-107 в 2010 г., которые, как было отмечено выше, имеют хорошие показатели и по другим признакам колоса. Однако достоверных отличий для всех изученных линий по двум годам не выявлено.
Масса 1000 зерен. Этот признак также является зависимым от климатических условий и уровня инфекционного фона. По признаку масса 1000 зерен все интрогрессивные линии достоверно не отличались от родительского сорта.
Следует отметить, что у всех изученных линий, за исключением исходных гибридных линий 744-1 и 832-1 с множественными транслокациями, не отмечено отрицательного влияния генома T. timopheevii на показатели продуктивности, а в некоторых случаях, наоборот, показан положительный эффект.
ВЫВОДЫ Получено 38 линий мягкой пшеницы с единичными транслокациями 1) хромосом 2G, 5G, 6G от T. timopheevii и 72 линии, содержащие комбинации двух интрогрессивных фрагментов хромосом 1At, 2At, 3G, 2G, 5G, 6G в различных сочетаниях.
Выявлено, что в процессе беккроссирования происходит значительное 2) уменьшение длины интрогрессивных фрагментов 1At, 2At, 2GS, 6G (30% и более), тогда как размер фрагментов 2GL и 5GL остается практически неизменным (сокращение длины на 5% и менее).
Установлено, что цитологические методы (С-окрашивание, in situ 3) гибридизация) позволяют более эффективно выявлять терминальные транслокации, делеции и транслокации, затрагивающие хромосомы D генома по сравнению с SSR-анализом у интрогрессивных линий T. aestivum-T. timopheevii Впервые показано, что интрогрессивные линии мягкой пшеницы, несущие 4) только главный локус QLr.icg-5B, являются устойчивыми к бурой ржавчине на стадии проростков и взрослых растений. Линии, в геноме которых присутствует комбинация из минорных локусов QLr.icg-2А и QLr.icg-1А, являются среднечувствительными. Показано, что присутствие в геноме только минорных локусов QLr.icg-2А и QLr.icg-1А оказывает сдерживающий эффект на развитие болезни и не приводит к развитию гиперчувствительного ответа.
Не выявлено негативного влияния интрогрессивных фрагментов 1At, 2AtL, 5) 2GS, 2GL, 5GL, 6G от T. timopheevii на количественные признаки линий мягкой пшеницы. Показан положительный эффект для транслокации 2DS.2GL на снижение высоты у растений и на признаки, определяющие озерненность колоса.
Список публикаций по теме работы Статьи:
1) Тимонова Е.М., Леонова И.Н., Белан И.А., Россеева Л.П., Салина Е.А. Влияние отдельных участков хромосом T. timopheevii на формирование устойчивости к болезням и количественные признаки мягкой пшеницы // Вестник ВОГиС (2012), Т.16 (1), С.142- 2) Timonova E.M., Leonova I.N., Rder M.S., Salina E.A. Marker-assisted development and characterization of a set of Triticum aestivum lines carrying different introgressions from T.
timopheevii genome // Molecular breeding (2012), DOI: 10.1007/s11032-012-9776-x 3) Адонина И.Г., Петраш Н.В., Тимонова Е.М., Христов Ю.А., Салина Е.А. Создание и изучение устойчивых к листовой ржавчине линий мягкой пшеницы с транслокациями от Aegilops speltoides Tausch // Генетика (2012), Т. 48(4), С. 488– 4) Салина Е.А., Егорова Е.М., Адонина И.Г., Добровольская О.Б., Будашкина Е.Б., Леонова И.Н. ДНК-маркеры для генотипирования линий мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) с генетическим материалом Aegilops speltoides Tausch и Triticum timopheevii Zhuk. // Вестник ВОГиС (2008), Т.12 (4), С.620- Патент:
1) Пат. 2407283 RU, МПК A 01 Н 1/104. Способ создания линий мягкой пшеницы, устойчивых к бурой ржавчине / Салина Е.А., Леонова И.Н., Будашкина Е.Б., Егорова Е.М.
- Опубл. 27.12.2010. - Бюл. № 36.
Тезисы конференций:
1) Егорова Е.М., Леонова И.Н., Салина Е.А., Получение интрогресивных линий мягкой пшеницы, содержащих различные фрагменты At и G геномов тетраплоидной пшеницы T.
timopheevii / Материалы всероссийской научной конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды», Иркутск (2007), 16–19 сентября, C. 82-84.
2) Леонова И.Н., Егорова Е.М., Будашкина Е.Б., Салина Е.А., Использование методов «молекулярной» селекции для получения устойчивых к листовой ржавчине линий мягкой пшеницы, содержащих интрогрессии от Triticum timopheevii. / Материалы второй всероссийской конференции «Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам», Санкт-Петербург (2008), 29 сентября – 2 октября, С. 153-156.
3) Егорова Е.М., Леонова И.Н., Будашкина Е.Б., Салина Е.А., Получение и анализ линий мягкой пшеницы, содержащих единичные интрогрессивные фрагменты от Triticum timopheevii / V Международная научная конференция «Факторы экспериментальной эволюции организмов». г. Алушта, Украина (2009), 21-25 сентября, Т. 6 C. 298- 4) Егорова Е.М., Леонова И.Н., Салина Е.А., Будашкина Е.Б., Использование молекулярно генетических подходов для получения и характеристики линий Triticum aestivum содержащих единичные участки интрогресий от Triticum timopheevii / Международная научная школа-конференция "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях", Звенигород (2008), 7-12 декабря, С. 29.
5) Егорова Е.М., Леонова И.Н., Будашкина Е.Б., Салина Е.А., Анализ интрогрессивных линий мягкой пшеницы, содержащих генетический материал Triticum timopheevii, полученных с использованием методов молекулярной селекции / Съезд генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, V съезд Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров, Москва (2009), 21-28 июня, Ч. 1, С.
224.
6) Salina E.A., Leonova I.N., Egorova E.M., Budashkina E.B., Roder M., Biotechnology for development of resistant wheat genotypes / Proc. of the German-Russian forum Biotechnology GRFB'09, Novosibirsk (2009), 15 – 19 June, P.43.
7) Egorova E.M., Leonova I.N., Budashkina E.B., Salina E.A. Development and characterization of Triticum aestivum x T. timopheevii near-isogenic introgression lines by using marker-assisted selection / Proc. of the International Conference Plant Genetics, Genomics and Biotechnology, Novosibirsk (2010), 7-10 June, P. 60.
8) Egorova E.M., Leonova I.N., Budashkina E.B., Salina E.A. The application of microsatellite markers for development of leaf rust resistant near isogenic lines carriing QLr.icg-5B loci / Proc.
of International Conference "Green Plant Breeding Technologies", Vienna, Austria (2010), Feb 2-5, P. 46.
9) Salina E.A., Leonova I.N., Egorova E.M., Budashkina E.B., Rder M.S. Development and application of Triticum timopheevii mapping data in wheat resistance management strategies / Proc. of 8th International Wheat Conference, St.Petersburg (2010), June 1-4, P. 468- 469.
10) Egorova E., Leonova I., Budashkina E., Salina E. Application of marker assisted selection for transferring resistance genes from Triticum timopheevii to bread wheat / Proc. 20th ITMI/2ndWGC Joint Workshop, Beijing, China (2010), September 1-5, P. 78.
11) Salina E., Dobrovolskaya O., Timonova E., Silkova O., Leonova I., Sourdille P., Feuillet C., Development of molecular and genetic stocks for a physical map of 5B chromosome of common wheat / Proc. of the international Conference “Wheat genetic resources and genomics”, Novosibirsk (2011), August 28-31, p. 12) Leonova I.N., Timonova E.M., Budashkina E.B., Kalinina N.P., Salina E.A., Development and utilization of leaf rust resistance lines with multiple and single introgressions of the T.
timopheevii genome / Proc. of international Conference “Wheat genetic resources and genomics”, Novosibirsk (2011), August 28-31, p. Подписано к печати Формат бумаги.
Тираж Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10.