Углевод-белковые комплексы сыворотки крови лиц с острой алкогольной интоксикацией и больных алкоголизмом с абстинентным синдромом
На правах рукописи
Лукина Наталья Юрьевна УГЛЕВОД-БЕЛКОВЫЕ КОМПЛЕКСЫ СЫВОРОТКИ КРОВИ ЛИЦ С ОСТРОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИЕЙ И БОЛЬНЫХ АЛКОГОЛИЗМОМ С АБСТИНЕНТНЫМ СИНДРОМОМ 03.01.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Тюмень – 2012 1
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации заслуженный работник высшей школы РФ,
Научный консультант:
доктор медицинских наук, профессор Высокогорский Валерий Евгеньевич
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Шаповалов Петр Яковлевич ГБОУ ВПО Тюменская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации доктор биологических наук, профессор Цейликман Вадим Эдуардович ГБОУ ВПО Челябинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский Министерства государственный медицинский университет» здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Защита состоится 02 марта 2012 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.101.02 при ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, 625023, г. Тюмень, ул. Одесская, 54.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Тюменской государственной медицинской академии» Минздравсоцразвития России.
Автореферат разослан "" 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета С.А. Орлов
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Напряженная наркологическая ситуация в Российской Федерации, обусловленная высоким потреблением алкоголя, является важнейшей медико-социальной проблемой (Кошкина Е.А., 2004, Гофман А.Г., Понизовский П.А. 2005). По данным клинических наблюдений 20,9 % соматических больных многопрофильных стационаров имеют признаки злоупотребления алкоголем (Огурцов П. П., 2003).
Развитие алкогольной болезни сопряжено с широким кругом метаболических расстройств, затрагивающих практически все виды обмена веществ (Афанасьев В.В., 2002). Наблюдается изменение стационарности процессов свободнорадикального окисления биомолекул, что может привести к нарушению структуры и, соответственно, функций клеток всего организма (Lieber C., 2005, Wu D., 2000). Интенсификация свободнорадикального окисления сопровождается истощением резервов антиокислительной системы, уменьшением пула восстановленного глутатиона, а также падением активности глутатион-зависимых ферментов в печени, при этом характерно длительное сохранение данных изменений в период воздержания от алкоголя (Высокогорский В.Е.с соавт., 2006).
В результате токсического действия этанола в гепатоцитах нарушаются процессы гликозилирования белков, что приводит к появлению в крови углевод-дефицитныхгликоконъюгатов таких, как углевод-дефицитный трансферрин и аполипопротеины J, E (Lakshman M.R., 1999, Garige M., Azuine M.A, 2008). В свою очередь, увеличение содержания гликопротеинов в крови служит индикатором острофазового ответа, характер которого в определённой степени зависит от активности и длительности действия повреждающего фактора (Дати Ф., 2007). Синтез белков острой фазы регулируется целым рядом медиаторов и цитокинами, модуляторами действия которых являются глюкокортикоиды и факторы роста (PetersonK, 2005). Большинство белков острой фазы относятся к гликопротеинам и не обладают специфичностью по отношению к первопричине повреждения, но высокая степень корреляции их уровня в крови с тяжестью заболевания и с его стадией позволяет использовать определение концентрации данных белков для мониторинга течения заболеваний и контроля эффективности лечения (Pate V., 2001).
В сыворотке крови лиц, злоупотребляющих алкоголем, изменяется широкий спектр биохимических показателей, однако ни один из них не обеспечивает диагностической точности для выявления алкоголь индуцированных соматических, в том числе и отсроченных, нарушений.
Поиск идеального алкогольного биомаркера продолжается и одним из требований к нему является возможность использования такого показателя не только для выявления факта употребления спиртных напитков, но и установления количества выпитого алкоголя и применения данного маркера для контроля длительности абстиненции. Наиболее информативным показателем злоупотребления алкоголем является определение асиалоформуглеводдефицитноготрансферрина в крови, являющегося представителем фракции острофазовых гликопротеинов – серомукоидов, но выполнение данного исследования имеет ряд технических и экономических ограничений и широко в клинической практике не применяется (Тарасова О.И., 2007).
В последнее время накапливаются данные о влиянии алкогольной интоксикации на обмен углевод-белковых комплексов. В исследованиях Булгаковой В.С. и др., (2008) в эксперименте установлены нарушения обмена углевод-белковых комплексов при хронической алкогольной интоксикации, а по данным Притыкиной Т.В.(2007) в сыворотке крови лиц, злоупотребляющих алкоголем на фоне сахарного диабета, повышается уровень некоторых гликопротеинов.
Учитывая изложенное, изучение особенностей обмена углевод-белковых комплексов при острой алкогольной интоксикации и в условиях развития алкогольного абстинентного синдрома, а также разработка новых чувствительных и специфичных методов выявления метаболических нарушений при этих состояниях имеет несомненную актуальность.
Цель исследования Установить диагностическую и прогностическую роль нарушений углевод-белковых комплексов у лиц при острой алкогольной интоксикации и убольных алкоголизмомс абстинентным синдромом.
Задачи исследования:
1. Определить содержание в сыворотке крови ферментных маркеров алкогольной интоксикации у лиц с острой и хронической алкогольной интоксикацией.
2. Исследовать уровень гликопротеинов в сыворотке крови пациентов при острой алкогольной интоксикации.
3. Изучить содержание гликопротеинов сыворотки крови при алкогольном абстинентом синдроме.
4. Определить концентрацию показателей обмена протеогликанов в сыворотке крови при алкогольной интоксикации и развитии синдрома отмены.
Научная новизна Комплексное исследование углевод-белковых конъюгатов в сыворотке крови позволило получить новые сведения об особенностях и длительности нарушений их уровня в условиях острой алкогольной интоксикации и при алкогольном абстинентном синдроме. Установлена положительная корреляция между уровнем этанола и содержанием белоксвязанной сиаловой кислоты в сыворотке крови у лиц с острой алкогольной интоксикацией.
Изменение метаболизмауглевод-белковых комплексов при развитии абстинентного синдрома проявляется в повышении в сыворотке крови уровня гликопротеинов и уменьшении содержания углеводного компонента в них, накоплении продуктов метаболизма протеогликанов и изменении интенсивности процессов их деградации, что характеризуется существенным повышением уровня глюкуроновой кислоты,гликозаминогликанов, активности ММП и их ингибиторов в сыворотке крови.Изменение уровня углевод-белковых комплексов сохраняются в отдаленные сроки алкогольной абстиненции.
Теоретическое и практическое значение работы Результаты проведенного исследования позволяют расширить представления о патохимических механизмах, лежащих в основе метаболических сдвигов при токсическом действии этанола и алкогольном абстинентном синдроме. Полученные данные о характере и длительности изменений уровня гликопротеинов, их углеводных компонентов, а такжепродуктов обмена протеогликанов в сыворотке крови при алкогольной интоксикации, могут служить обоснованием для разработки диагностических критериев идентификации факта злоупотребления алкоголем.
Положения, выносимые на защиту:
1. При острой алкогольной интоксикации и алкогольном абстинентном синдроме определение ферментемии имеет низкую информативную значимость.
2. Острая алкогольная интоксикация и алкогольный абстинентный синдром характеризуются повышением уровня гликопротеинов и изменением содержания в них белкового и углеводного компонентов.
3. Алкогольная интоксикация сопровождается длительным повышением в сыворотке крови продуктов обмена протеогликанов, сохраняющимся в постинтоксикационный период.
Основные результаты проведенного Апробация работы.
исследованиядоложены на научно-практической конференции «Современные направления развития регионального здравоохранения», посвященной 90 летию Омской областной клинической больницы (г. Омск, 2010);
на научно практической конференции"Лабораторная наука - практике: первое десятилетие XXI века", посвященной Национальным дням лабораторной медицины России (г.Москва, 2010);
наВсероссийской конференции «Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований» (г.Омск, 2011);
на региональной межведомственной научно-практической конференции «Современные аспекты распространения наркологических заболеваний в молодежной среде. Пути решения проблем» (г. Омск, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 - в журналах, рекомендуемыхВАК Минобрнауки РФ для публикаций материалов диссертаций.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 121странице машинописного текста, содержит 19таблиц, 8 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследования, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Библиографический указатель содержит 242источника, в том числе 158 – на иностранном языке.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования. В соответствии с целью и задачами, исследование выполнено как простое, контролируемое.Материалом для биохимических исследований послужила сыворотка крови 201 мужчины 45±5 лет, из которых 126 пациентов, поступивших в 3-е отделение наркологического стационара Омского областного наркологического диспансера с алкогольной зависимостью продолжительностью 7-8 лет с диагнозом психические и поведенческие расстройства в результате употребления алкоголя, средняя стадия, синдром отмены (F 10.30, МКБ-10) и 32 пациентаМУЗ МСЧ № 9 г.Омска с диагнозом острая интоксикация алкоголем (F 10.0) в период с 2008 г. по 2010 г. Все больные получали стандартное лечение и разделены на группу с острой алкогольной интоксикацией(ОАИ) и 3 группы больных с алкогольным абстинентным синдромом(ААС) – 1-, 3- и 10-е сутки пребывания в стационаре.
Контрольная группа сформирована из 43 клинически здоровых мужчин данной возрастной группы – работников промышленных предприятий, сыворотка крови которых получена при проведении диспансерного осмотра.
Таблица Распределение пациентов по группам Исследуемые группы Количество наблюдений в группе Группа «Контроль» Пациенты с острой алкогольной интоксикацией (ОАИ) Больные алкоголизмом, 1 сутки лечения в стационаре (ААС-1) Больные алкоголизмом, 3 сутки лечения в стационаре (ААС-3) Больные алкоголизмом,10 сутки лечения в стационаре(ААС-10) Исследование было одобрено локальным этическим комитетом ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Минзравсоцразвития РФ. От обследуемых лиц получено информированное согласие на их участие в проведении исследования. Для формировании выборки больных были разработаны критерии включения (информированное согласие пациента на участие в исследовании, установленный диагноз, пол, возраст от 40 до лет) и исключения (отказ пациента от участия в исследовании, в проведение исследования не включались больные алкоголизмом с другими стадиями заболевания, пациенты с сопутствующей токсикоманией и наркоманией, пациенты с острыми и хроническими соматическими заболеваниями). В группу «Контроль» не включались лица при выявлении в крови этанола или эпизодического приёма алкоголя в течение двух недель перед исследованием.
Применение указанных критериев позволило сформировать группы для дальнейшего участия в исследовании в соответствии с поставленными задачами, сведения о распределение в группах пациентов представлены в таблице № 1. При формировании групп принималось во внимание, как клинический диагноз, так и лабораторные показатели.
Биохимические методы исследования выполнены в клинико диагностической лаборатории МУЗ «МСЧ № 9» и лаборатории кафедры биохимии ГБОУ ВПО «ОмГМА»Минзравсоцразвития РФ.
В сыворотке крови исследовали активность АСТ, АЛТ, ГГТ («Hospitexdiagnostics», Швейцария), содержание серогликоидов определяли с использованием коммерческого набора реактивов «Мукопротеины» («Hospitexdiagnostics», Швейцария) и по концентрации связанных с ними гексоз (Камышников В. Ф.,2004). Уровень сиаловых кислот устанавливали с помощью набора реактивов «Сиалотест - 80» (ННП «Реахим», г. Ижевск), количество свободной и связанной с белками фукозы определяли по уровню хромогена, образованного последовательным воздействием на фукозу серной кислотой и солянокислым цистеином.Содержание гликозаминогликанов (ГАГ) и глюкуроновой кислоты (ГК) определяли с помощью карбозольной реакции Дише;
содержание тканевого ингибитора металлопротеиназы- (ТИМП-1) и матриксной металлопротеиназы-3 (ММП-3) - набором реагентов «BioSoursInternationalInc. Human TIMP-1 ELISA» (США) инабором «BioSours International Inc. Human MMP-3 ELISA» (США).Уровень этанола устанавливали наборомEthanolFS (Германия), для определения уровня -1 антитрипсина, -1- кислого гликопротеина, трансферрина иС-реактивного белка применяли наборы «ChronolabSysS. L.» (Испания), для определения уровня ферритина - набор ИФА-ферритин (Алкорбио, г. Санкт-Петербург), фибронектина - ИФА наборы реагентов «TechnocloneTC, FibronectinELISAKit» (Австрия).
Измерения перечисленных биохимических показателей в сыворотке крови проводили на автоматическом биохимическом анализаторе «Eosbravo», биохимическом анализаторе с проточной кюветой «Skrinmaster» производства фирмы «Hospitexdiagnostics», Швейцария. ИФА анализ проводили на ИФА «Statfax». Для контроля качества исследований использовали контрольные сыворотки «Human», «Serodos» и «Serodosplus».
Объект Группа I: контрольная группа исследования Группа II: пациенты с острой алкогольной интоксикацией при поступлении :больныеалкоголизмо Группа: больные алкоголизмом, сроки наблюдения 1 сутки Группа III Группа: больные алкоголизмом, сроки наблюдения 3 сутки Группа: больные алкоголизмом, сроком наблюдения 10 сутки Методы Биохимические, иммунологические исследования Колориметрические: определение концентрации ГАГ, ГК, Спектрофотометрические: исследование уровня СК, мукопротеинов по тирозину, гексоз вмукопротеинах.
Иммуноферментные: определение концентрации фибронектина, ТИМП-1, ММР-3.
Иммунотурбидиметрические: исследование количества 1 кислого гликопротеина (орозомукоида), 1-антитрипсина, hsС реактивного белка, трансферрина, фибронектина.
Статистическая обработка данных:
Ме (Q1…Q3), критерий Манна – Уитни, корреляция Спирмена Характеристика показателей обмена углевод-белковых комплексов сыворотки крови.
Обсуждение, формирование выводов. Патохимическое обоснование применения показателей обмена углевод-белковых комплексов в диагностике злоупотребления алкоголем.
Рис. 1.Дизайн исследования Анализ и статистическая обработка полученных результатов проведена с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0» («StatSoftInc.», США). В связи с распределением данных, отличным от нормального, полученные результаты анализировали методами непараметрической статистики – с использованием критерия Манна-Уитни, корреляционный и регрессионный анализ с определением коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Результаты представлены как Ме (Q1…Q3), где Ме – медиана, Q1, Q3 – 1 и 3 квартиль или 25-й процентиль и 75-й процентиль. Критическим уровнем значимости принимали p=0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ При алкогольной интоксикации в клинической практике наиболее распространено определение аминотрансфераз и-глутамилтрансферазы.В нашем исследовании установлено, что в группе пациентов с ОАИ повышена активность-глутамилтрансферазы (ГГТ) и -амилазы(рис. 2). Активность ГГТ в сыворотке крови превышала результаты контрольной группы на 73% (р=0,001), -амилазы на 52% (р=0,005), однако, полученные значения оставались в пределах референтных величин.Активность АЛТ, АСТ в сыворотке крови пациентов с острой алкогольной интоксикацией существенно не отличалась от данных контрольной группы.
Рис. 2.Активность АЛТ, АСТ, ГГТ и -амилазы сыворотки крови лиц с острой алкогольной интоксикацией.
Аланиновая аминотрансераза Аспарагиновая аминотрансфераза -глутамилтрансфераза -амилаза Примечание: здесь и далее: *-статистически значимые различия с группой контроль.
У больных алкоголизмом в период абстиненции выявлено повышение активности ГГТ, АСТ и АЛТ относительно значений контрольной группы(рис. 3). Активность ГГТ во все периоды наблюдения повышена, в 1-й день - на 92%, 3-й день - на 111%, 10-й день - на 184% (p=0,001). В 1-й день активностьАСТ превышала значение контрольной группы на 81% (р=0,001), в 3-й день - на 62% (р=0,001), на 10-й день - на 30%, (р=0,002). Активность АЛТ повышена лишь на 10-е сутки на 81% (р=0,008). Стоит отметить, что полученные значения активности ферментов АСТ, АЛТ, ГГТ в группе больных алкоголизмом в период абстиненции не превышали уровня референтных значений.При алкогольном абстинентном синдроме не наблюдали существенных изменений активности -амилазы.
Корреляционный анализ не выявил статистически значимые взаимосвязи между концентрацией этанола и уровнем исследуемых ферментов сыворотки крови у лиц с острой алкогольной интоксикацией.
Таким образом, полученные данные определения активности ферментов сыворотки крови подтверждают данные О.И. Тарасовой с соавт. (2007) о недостаточной чувствительности и низкой специфичности ферментемии при алкогольной интоксикации. Некоторое повышение активности аминотрансфераз и -глутамилтрансферазы характеризует, вероятно, в большей степени реакцию печени на токсическое повреждение.
Рис. 3.Активность АЛТ, АСТ, ГГТ и -амилазы сыворотки крови больных алкоголизмом с синдромом абстиненции.
Аланиновая аминотрансераза Аспарагиновая аминотрансфераза -глутамилтрансфераза -амилаза СРОК НАБЛЮДЕНИЯ Содержание мукопротеинов в сыворотке крови пациентов с ОАИ статистически значимо не отличалось от значений группы «Контроль». При исследовании уровня белоксвязанной сиаловой кислоты – основного углеводного компонента гликопротеинов, выявлено статистически значимое повышение данного показателя на 19,52 % (р=0,030) относительно значений в контрольной группе, в то время как содержание свободной (ССК) сиаловой кислоты значимо не отличалось.Необходимо отметить, что в группе ОАИ выявлена сильная отрицательная корреляция между уровнем этанола и БССК (=-0,867;
р=0,018).
Рис. 4. Содержание hsС реактивного белка в сыворотке крови лиц с острой алкогольной интоксикацией.
Не выявлено статистически значимых различий уровня свободной (СФ) и белосвязаннойфукозы (БСФ) в сыворотке крови в группе «ОАИ» относительно группы «Контроль». Полученные результаты свидетельствуют о преобладании процессов синтеза сиалосодержаших белков, которые в большей степени представлены сывороточными гликопротеинами острой фазы (Molina P., 2010). В пользу этого свидетельствует статистически значимое повышение уровня hsС-РБ в 3,73 раза (р=0,001) относительно значений контрольной группы (рис. 4).
В сыворотке крови больных алкоголизмом с абстинентным синдромом, находящихся на лечении в стационаре, статистически значимое увеличение содержания мукопротеинов наблюдали уже в 1-е сутки алкогольного воздержания на 25,92 % (р=0,001), на 3-е сутки повышение составило 37, % (р=0,001) относительно значений группы «Контроль» (табл. 2). На 10-е сутки лечения в стационаре уровень мукопротеинов оставался значимо высоким (р=0,001).
Таблица Уровень мукопротеинов, свободных (ССК) и белоксвязанных сиаловых кислот (БССК) в сыворотке крови больных алкоголизмом с абстинентным синдромом,(Me (Q1…Q3)) Показатель группа Срок лечения в стационаре «Контроль» 1-е сутки 3-е сутки 10-е сутки Мукопротеины 10,8 13,6 14,8 16, г/л (9,3…12,4) (11,8…17,2) (11,4…18,5) (13,7…21,1) рU=0,001 рU=0,001 рU=0, БССК 12,1 13,75 14,72 16, ммоль/л (10,8…14,3) (12,0…15,8) (12,7…16,1) (14,3…17,5) pU=0,040 pU=0,009 pU=0, ССК 0,21 0,76 0,70 0, ммоль/л (0,08…0,53) (0,28…1,12) (0,54…0,99) (0,35…0,86) pU=0,041 pU=0,032 pU=0, Фукоза 0,46 0,18 0,39 0, свободная, (0,17…0,70) (0,09…0,63) (0,32…0,46) (0,19…0,28) мкг/л рU=0,205 рU=0,969 рU=0, Фукозабелоксв 0,37 0,23 0,91 1, язанная мкг/л (0,28…0,75) (0,19…0,47) (0,33…1,50) (0,75…1,50) рU=0,236 рU=0,075 рU=0, Примечание. Здесь и далее: p - статистический уровень значимости различий в сравнении с показателями контрольной группы (U – тест Манна-Уитни).
Содержание БССК в сыворотке крови больных алкоголизмом в 1-е сутки лечения в стационаре превышало значения группы «Контроль» на 13,26 % (р=0,040), на 3-е сутки на 21,25 % (р=0,009). Наибольшее повышение уровня БССК наблюдалось на 10-е сутки лечения – на 33,69 % (р=0,002), тогда как при исследовании фракции ССК более значительное содержание данного показателя выявлено на 1-е сутки лечения, превышающее значения «Контроль» в 3,62 раза (р=0,041). На 3-е сутки лечения в стационаре уровень ССК выше контрольных значений в 3,33 раза (р=0,032), на 10-е сутки лечения данный показатель имеет тенденцию к снижению, но остается статистически значимо высоким (р=0,040). Уровень свободной и белоксвязаннойфукозы(БСФ) на 1-е и 3-е сутки алкогольного воздержания не имел статистически значимых различий с контрольной группой, но на сутки повышался в 3 раза (р=0,015) уровень БСФ относительно значения контрольной группы, что по данным ряда исследований является отражением хронизации процесса и, как следствие, увеличение количества фукозы в сывороточных белках (Дати Ф., 2007).
Рис.5.Содержание С-реактивного белка в сыворотке крови больных алкоголизмом с синдромом абстиненции.
СРОК НАБЛЮДЕНИЯ Столь значительное и длительное повышение содержания мукопротеинов и высокий уровень белоксвязанных и, в особенности, свободных сиаловых кислот в крови больных алкоголизмом в период лечения в стационаре свидетельствует об интенсивном обмене гликопротеинов и сохраняющемся острофазовом ответе. В пользу этого свидетельствуют выявленные статистически значимые высокие уровни С реактивного белка (рис. 5).
Таблица Содержание фракций мукопротеинов в сыворотке крови при острой алкогольной интоксикации, (Me (Q1…Q3)) Показатель Группа Группа «Контроль» «ОАИ» -1-кислый 0,78 0, гликопротеин, (0,70…0,90) (0,80…1,38) г/л рU = 0, -1-антитрипсин, 1,27 1, г/л (1,15…1,41) (1,24…1,59) рU = 0, Фибронектин, 80,0 40, мкг/мл (60,0…90,0) (20,0…100,0) рU = 0, Трансферрин, 2,28 2, г/л (2,10..2,48) (1,81…2,42) рU = 0, Ферритин, 1,18 1, мкг/л (0,86…1,51) (0,81…1,56) рU = 0, Исследование белков острой фазы, составляющих фракцию мукопротеинов, позволило выявить в сыворотке крови пациентов с ОАИ высокий уровень -1-кислого гликопротеина, -1-антитрипсина превышающих значения контрольной группы на 14,68 % (р=0,001) и 12,16 % (р=0,023), соответственно(табл.3). Уровень ферритина статистически значимых отличий не имел, тогда как уровень трансферрина значимо снижался на 8,62 % (р=0,028). Содержание фибронектина снижалось на 50 % (р=0,030) относительно значений контрольной группы.
Таким образом, острая алкогольная интоксикация сопровождается повышением уровня сывороточных гликопротеинов: -1-кислого гликопротеина, -1-антитрипсина, а также С-реактивного белка.
В сыворотке крови больных алкоголизмом при развитии абстинентного синдрома на 1-е сутки алкогольного воздержания отмечался высокий уровень -1-кислого гликопротеина на 25,40 % (р=0,001), -1-антитрипсина на 21,03% (р=0,001) и ферритина на 87,28 % (р=0,009) относительно показателей контрольной группы( рис.6). Уровень трансферрина у больных алкоголизмом в 1-е сутки лечения в сыворотке крови был снижен относительно значений группы «Контроль» на 8,27 % (р=0,001).
Рис. 6.Содержание гликопротеинов сыворотки крови больных алкоголизмом На 3-е сутки лечения в стационаре уровень исследуемых мукопротеинов увеличивается, что отражает сохраняющийся острофазовый ответ, в пользу чего свидетельствует возрастающий уровень -1-кислого гликопротеина на 36,53 % (р=0,001), ферритина на 115,33 % (р=0,0003), а также сниженное содержание трансферрина на 17,25 % (р=0,001) относительно соответствующих значений группы «Контроль».
Кроме того на 1-е и 3-е сутки лечения в сыворотке крови нарушается динамическое равновесие между уровнем трансферрина и ферритина.
Соотношение трансферрин / ферритин статистически значимо ниже контрольных значений на 1-е сутки лечения в 2,35 раза (р=0,003), на 3-е сутки – в 3,72 раза (р=0,001). Уровень в сыворотке крови -1-антитрипсина превышал значения группы «Контроль» на 11,69 % (р=0,001).
Несмотря на проводимое лечение, на 10-е сутки в сыворотки крови больных хроническим алкоголизмом сохраняется повышенный уровень некоторых мукопротеинов. Так, уровень -1-кислогогликопротеина превышал значения группы «Контроль» на 47,44 % (р=0,001), содержание 1-антитрипсина было увеличено на 27,94 % (р=0,001).
Кроме того, на 10-е сутки лечения в крови больных происходит статистически значимое повышение фибронектина на 50,00 % (р=0,006), тогда как в 1-е и 3-е сутки наблюдения данный показатель не отличался от значений группы «Контроль».
Уровень трансферрина и ферритина, а также коэффициент соотношения данных белков на 10-е сутки алкогольного воздержания статистически значимо не отличался от значений группы «Контроль».
По данным исследования Ефременко Е.С. и др. (2006) состояния отмены этанола в первые сутки сопровождаются депрессией глутатион опосредованных ферментов и интенсификацией свободнорадикального окисления, что ведет к мобилизации белков обладающими антиокислительными свойствами и, как следствие, повышению содержания тканевого ферритина, за счет способности связывать окисленное железо (Watts R.N., Richardson D.R, 2002). Более поздние сроки синдрома отмены характеризуются восстановлением систем антиокислительной защиты, следствием чего, вероятно, является нормализация содержания в сыворотке крови трансферина и ферритина на 10-е сутки алкогольного воздержания.
Анализ полученных результатов свидетельствует о значительном нарушении метаболизма гликопротеинов, сохраняющемся в период алкогольного воздержания на протяжении длительного времени на фоне проводимой дезинтоксикационной терапии (рис.4). Наибольшая концентрация некоторых мукопротеинов, таких как -1-кислый гликопротеин, фибронектин и -1-антитрипсин, выявлена на 10-е сутки лечения в стационаре, что связано с сохраняющимся повреждением клеток. В этот же срок исследования значения С-реактивного белка сохраняются на высоком уровне.
В результате токсического действия этанола в гепатоцитах нарушаются процессы синтеза, гликозилирования и мембранного транспорта белков, что, в свою очередь, сопровождается появлением в крови углевод дефицитныхгликоконьюгатов таких, как например углевод-дефицитный трансферрин и аполипопротеины J, E (MaokaiG., 2007;
Djouss L., 2009). Для уточнения влияния алкогольной интоксикации на процессы гликозилирования белков в сыворотке крови больных с острой алкогольной интоксикацией и больных алкоголизмом был определен уровень тирозина в мукопротеинах и связанных с ними гексоз орциновым методом.
В группе пациентов с ОАИ статистически значимых различий в содержании тирозина и гексоз в мукопротеинах не выявлено (табл. 4). В группе больных алкоголизмом в состоянии абстиненции, несмотря на повышение содержания мукопротеинов и содержания тирозина в них, при исследовании уровня гексоз в мукопротеинах установлено статистически значимое снижение данного показателя на 10-е сутки стационарного лечения на 26,08% (р=0,001) в сравнении с показателями контрольной группы.
Однако стоит отметить, что при определении соотношения значений тирозина к гексозам в мукопротеинах выявлено статистически значимое повышение данного показателя на 3-е и 10-е сутки лечения в стационаре, что свидетельствует об уменьшении содержания углеводов в исследуемых белках. Так, у пациентов на 3-е сутки наблюдения коэффициент превышал значения группы «Контроль» в 1,44 раза (р=0,008), на 10-е сутки в 2,16 раза (р=0,001).
Таблица Содержание тирозина и гексоз мукопротеинах сыворотки крови лиц с острой алкогольной интоксикацией и больных алкоголизмом период абстиненции,(Me (Q1…Q3)) Показатель Тирозин в Гексозыв Соотношение мукопротеинах, мукопротеинах, МП (тирозин) / г/л г/л МП (гексозы) Группа «Контроль» 0,43 0,29 1, (0,37…0,50) (0,24…0,36) (0,96…1,71) Группа 0,44 0,33 1, «ОАИ» (0,34;
0,54) (0,29…0,38) (1,17…1,56) pU=0,122 рU = 0,270 рU=0, Больные алкоголизмом, 0,43 1, 0, 1 сутки лечения в (0,36…0,47) (1,07…2,19) (0,47…0,69) рU=0,071 рU=0, стационаре рU0, Больные алкоголизмом, 0, 0,59 1, 3 сутки лечения в (0,30…0,53) (0,46…0,74) (1,44…2,55) стационаре рU=0, рU0,0001 рU=0, Больные алкоголизмом, 0,66 0,23 2, 10 сутки лечения в (0,55…0,84) (0,20…0,32) (2,10…3,06) стационаре рU0,0001 рU=0,047 рU0, Подтверждением выявленной закономерности является значимая корреляция между мукопротеинами, определяемых по тирозину и уровнем гексоз в мукопротеинах (=0,513;
р=0,025). Причиной уменьшения углеводного компонента в мукопротеинах, может быть нарушение ферментативного гликозилирования их в печени, вследствие изменения активности гликозилтрансфераз под влиянием этанола (Shepar B.D., 2010).
Определенную роль в нарушениях углевод-белковых комплексов при алкогольной интоксикации может играть высокая активность сывороточной сиалидазы (Lakshman M.R., 1999).
Данные о влиянии острой алкогольной интоксикации и абстинентного синдрома на обмен гликопротеинов подтверждают результаты корреляционного анализа. Так, в группе больных алкоголизмом выявлена статистически значимая корреляция средней силы между показателями мукопротеины по тирозину и hsС-реактивного белка в 1-е сутки абстинентного периода (=0,575;
р=0,001) и в 3-е сутки (=0,526;
р=0,001), а также получена корреляция средней силы между мукопротеинами по тирозину и 1-кислым гликопротеином (=0,508;
р=0,003) в 1-е сутки и умеренная связь на 3-е сутки (=0,495;
р=0,001). Кроме того на 3-е сутки установлена сильная связь между БССК и -1-кислым гликопротеином(=0,697;
р=0,025) и отрицательная связь средней силы между hsС-РБ и трансферрином (= -0,538;
р=0,009). На 10-е сутки в группе больных алкоголизмом отмечалась нормализация выявленных взаимосвязей между показателями обмена гликопротеинов в 1-е и 3-е сутки, но в этот период обнаружена новая сильная корреляция между БССК и трансферрином (=-0,762;
р=0,028) и связь средней силы между мукопротеинами по тирозину и уровнем гексоз в мукопротеинах (=0,513;
р=0,025).
Нелинейный характер связи между показателями обмена гликопротеинов сыворотки крови лиц с острой алкогольной интоксикацией позволили рассчитать уравнения нелинейной регрессии для корреляции сильной степени. Функциональная зависимость между концентрацией этанола и уровнем БССК в группе «Острая алкогольная интоксикация» имела следующий вид y = 3,36 – 1,25*x (рис. 7).
Рис. 7.Линия регрессии зависимой переменной «Белоксвязанная сиаловая кислота» по предиктору «Этанол» группы лиц с острой алкогольной интоксикацией.
В реализации токсических эффектов как острой, так и хронической алкогольной интоксикации принимают участие компоненты межклеточного матрикса, что выражается в накоплении протеогликанов, коллагена и снижении активности процессов их катаболизма (Поливанова Т. В., 2007;
Wynn T.A., 2008).В результате повреждающего действия этанола, а также в процессе его метаболизма включаются механизмы образования вторичных токсических веществ, приводя к развитию эндотоксикоза (Афанасьев.В., 2002). Учитывая важную роль межклеточного матрикса в связывании и транспорте как физиологических, так и патологических метаболитов, представляет особый интерес исследование длительности и характера изменений уровня компонентов матрикса при острой алкогольной интоксикации и в постинтоксикационный период.
В сыворотке крови пациентов с ОАИ не выявлено существенных различий значенийуровня глюкуроновой кислота и гликозаминогликанов с соответствующими показателями контрольной группы.
При алкогольном абстинентном синдроме уровень глюкуроновой кислоты во все периоды наблюдения статистически значимо превышал в 1, раза значения группы «Контроль» (табл.5).
Содержание гликозаминогликанов в сыворотке крови больных алкоголизмом также превышало контрольные значения во все периоды лечения: в 1-е сутки лечения в 2,2 раза, на 3-е сутки – в 3,4 раза. На 10-е сутки лечения наблюдается снижение уровня гликозаминогликанов в сравнении с 1- и 3-сутками, но сохраняется высокое значение данного показателя в сравнении со значением группы «Контроль» – в 1,3 раза.
Увеличение содержания ГК, ГАГ в сыворотке крови, вероятно, является одним из проявлений острофазовой реакции организма (Kristen R., 2000) Таблица Содержание компонентов межклеточного матрикса в сыворотке крови больных алкоголизмом с абстинентным синдромом, Me (Q1 -Q3) Показатель группа Срок лечения в стационаре (сутки) «Контроль» 1 3 ГК 0,15 0,24 0,23 0, мг / л (0,09-0,24) (0,19-0,26) (0,16-0,29) (0,19-0,34) рU=0,048 рU=0,040 рU=0, ГАГ 0,14 0,30 0,47 0, мг / л (0,10-0,16) (0,26-0,32) (0,23-0,65) (0,15-0,29) рU=0,001 рU=0,010 рU=0, Одним из важных компонентов системы деградации межклеточного матрикса являются матриксные металлопротеиназы (ММП), активность которых на посттрансляционном уровне регулируется тканевыми ингибиторами металлопротеиназ (ТИМП) (Hemman S. 2007).
Рис. 8.Уровень матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов в сыворотке крови пациентов в сыворотке крови больных алкоголизмом в период алкогольного воздержания.
ТИМП- ММП- СРОК НАБЛЮДЕНИЯ На 1-й и 3-й день наблюдения в стационаре содержание ММП-3 в сыворотке крови больных с алкогольным абстинентным синдромом превышало в 1,5 раза значения группы «Контроль», тогда как на 10-е сутки уровень данного показателя снижался до контрольных значений (рис. 8). В свою очередь, содержание ТИМП-1 оставался статистически значимо высоким на протяжении всего периода наблюдений – более чем на 45 %.
Наблюдаемое в нашем исследовании однонаправленное повышение содержания как ММП, так и ТИМП на 1-е и 3-е сутки алкогольного воздержания отражают интенсивные процессы деградации протеогликанов, интенсивный синтез которых был вызван длительной алкогольной интоксикацией.
Однако на 10-е сутки наблюдения на фоне снижения уровня ММП- содержание ТИМП-1 остается высоким и имеет тенденцию к росту. Такой дисбаланс в системе протеолиза компонентов межклеточного матрикса при сохраняющемся высоком уровне ГК, ГАГ свидетельствует, вероятно, о преобладании процессов синтеза в межклеточном матриксе и накоплении его структурных компонентов.
Полученные данные свидетельствуют о значительном нарушении метаболизма протеогликанов, сохраняющиеся в период абстиненции на протяжении 10 суток. Это указывает на активное участие компонентов межклеточного матрикса, в структуру которого входят глюкуроновая кислота и гликозаминогликаны, в метаболических процессах, лежащих в основе абстинентного синдрома. Длительность выявленных нарушений доказывает данные ряда авторов о наличии второй волны эндотоксикоза как отражении реакции гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы на этапе формировании алкогольной абстиненции (Новиков Е.М., 2002).
Таким образом, как остраяалкогольная интоксикация, так и развитие алкогольного абстинентного синдрома сопровождаются значительными нарушениями метаболизма углевод-белковых комплексов.
У пациентов с острой алкогольной интоксикацией регистрируется повышение содержания белков острой фазы: С-реактивного белка, гликопротеинов (-1-антитрипсина, -1-кислого гликопротеина, ферритина), определение концентрации которых часто применяют в клинической практике для контроля эффективности лечения и течения соматической патологии. Особенности влияния острой алкогольной интоксикации на уровень гликопротеинов необходимо учитывать в случае сочетания острой алкогольной интоксикации с патологическим состоянием другой этиологиипри использовании их как дополнительных диагностических и прогностических маркеров.
При воздействии хронической алкогольной интоксикации в клетках происходят значительные изменения метаболизма и его нейроэндокринной регуляции, при этом некоторые патологические реакции, такие как активация свободно радикального окисления, сохраняются длительное время после приема алкоголя (Высокогорский В.Е., Ефременко Е.С, 2005). Длительное сохранение высоких концентраций острофазовых белков в крови, вероятно, являются следствием не только повреждающего действия продуктов свободнорадикального окисления, но и отражением развития адаптационных сдвигов норадрен- и дофаминэргических систем ЦНС, возникающих при формировании алкогольного абстинентного синдрома (Афанасьев В.В., 2001). Дисбаланс в системе гипоталамус-гипофиз проявляется при абстинентном синдроме высоким уровнем кортизола, стимулирующего синтез белков реакции острой фазы,и низким уровнем дигидроксиандростерона, чтоснижает стресс-протективные возможности пациентаи подкрепляет мотивацию пациента к употреблению спиртного (Kalimietal., 1994, HietalaJ., 2006).В свою очередь, рост концентрации белков острой фазы в крови в течение 10-и суток лечения указывает на развитие второй волны эндотоксикоза, повреждения клеток, что требует более длительного лечения в стационаре.
У пациентов, больных алкоголизмом с синдромом абстиненции, установлено значительное уменьшение углеводного компонента в мукопротеинах, при этом, данные изменения наблюдаются в течение длительного периода после прекращения употребления этанола. В связи с этим, определение в крови коэффициента соотношения тирозин мукопротеинов/гексозы мукопротеинов может быть предложено в качестве одного из диагностических критериев выявления пациентов, злоупотребляющих алкоголем.
Полученные данные подтверждают возможность использования показателей углевод-белковых комплексов в клинической практике для характеристики алкоголь-индуцированных метаболических нарушений и контроля эффективности лечения.
Выводы:
1. Активность аминотрансфераз и гамма-глутамилтрансферазы несколько повышается в сыворотке крови у лиц с острой алкогольной интоксикацией и при развитии алкогольной абстиненции, однако средние значения активности ферментов соответствуют значениям референтных величин.
2. Острая алкогольная интоксикация сопровождается значительными нарушениями уровня гликопротеинов в сыворотке крови, а именно повышением уровня-1-кислого гликопротеина, -1-антитрипсина, ферритина и снижением уровня трансферрина.
3. При развитии алкогольного абстинентного синдрома повышается уровень мукопротеинов, -1-кислого гликопротеина, -1 антитрипсина, ферритина, суммарных сиаловых кислот и белоксвязанных сиаловых кислот, а также hsС-РБ, но снижается уровень трансферрина.Уменьшается содержание углеводного компонента мукопротеинов в отдалённые сроки абстиненции.
4. Метаболическими появлениями алкогольного абстинентного синдрома являются нарушения обмена протеогликанов, что характеризуется увеличением концентрации гликозаминогликанов в сыворотке крови в ранний период абстиненции и их снижением в отдаленные сроки, а также нарушением соотношения активности матриксных металлопротеназ-3 и тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ-1.
Список опубликованных работ:
1. Арзамасова О. А. Динамика уровня гликопротеинов сыворотки крови при алкогольной абстиненции / О. А. Арзамасова, Н. Ю. Лукина, В. Е.
Высокогорский,А. М. Непочатов // Клиническая лабораторная диагностика. – 2010. – № 9. – С. 59.
2. Лукина Н. Ю. Показатели обмена протеогликанов в сыворотке крови при алкогольной абстиненции / Н. Ю. Лукина, О. А. Арзамасова, В. Е.
Высокогорский,А. М. Непочатов // Клиническая лабораторная диагностика. – 2010. – № 9. – С. 61.
3. Лукина Н. Ю. Ферментный спектр сыворотки крови у больных алкоголизмом / Н. Ю. Лукина, О. А. Арзамасова,А. М.Непочатов // Материалы научно-практической конференции «Современные направления развития регионального здравоохранения», посвященной 90-летию Омской областной клинической больницы. – Омск,2010. – С.
714-716.
4. Арзамасова О. А. Показатели обмена углевод-белковых комплексов в сыворотке крови при алкогольной абстиненции / О. А. Арзамасова, Н. Ю. Лукина,А. М.Непочатов // Материалы научно-практической конференции «Современные направления развития регионального здравоохранения», посвященной 90-летию Омской областной клинической больницы. – Омск, 2010. – С. 716-717.
5. Лукина Н.Ю. Гликопротеины сыворотки крови у больных алкоголизмом в период воздержания/ Н.Ю. Лукина//Материалы Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине.- Омск, 2011.- С. 181-186.
6. Арзамасова О. А. Особенности обмена гликопротеинов сыворотки кровиу больных алкоголизмом / О. А. Арзамасова, Н. Ю. Лукина // Материалы научно-практической конференции «Современные аспекты распространения наркологических заболеваний в молодежной среде.
Пути решения проблем». – Омск, 2011. – С. 95-97.
7. Лукина Н. Ю. Уровень углеводных и белковых компонентовмежклеточного матрикса в сыворотке крови больных алкоголизмом / Н.Ю. Лукина, О.А. Арзамасова, В.Е. Высокогорский // Медицинская наука и образование Урала. – 2011. – Т. 12, №4. – С.
44-45.
Список принятых сокращений:
ГАГ – гликозаминогликаны ГК – глюкуроновая кислота ПГ – протеогликаны БССК – белоксвязанная сиаловая кислота ССК – свободная сиаловая кислота СК – сиаловые кислоты ГП – гликопротеины МП (тир) – мукопротеины, определяемые по тирозину ТИМП – тканевые ингибиторы матриксныхметаллопротеиназ ММП- матриксные металлопротеиназы АСТ- аспартаттрансаминаза АЛТ – аланинтрансаминаза ГГТ –гамма- глутамилтрансфераза ОАИ – острая алкогольная интоксикация СФ – свободнаяфукоза БСФ – белоксвязаннаяфукоза Лукина Наталья Юрьевна УГЛЕВОД-БЕЛКОВЫЕ КОМПЛЕКСЫ СЫВОРОТКИ КРОВИ ЛИЦ С ОСТРОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИЕЙ И БОЛЬНЫХ АЛКОГОЛИЗМОМ С АБСТИНЕНТНЫМ СИНДРОМОМ 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Тюмень -