Влияние механоактивированной аморфной кальциевой соли глюконовой кислоты и её комбинации с антиоксидантным препаратом на обмен костной ткани при хронической интоксикации дихлорэтаном в эксперименте
На правах рукописи
Ганеев Тимур Ирекович ВЛИЯНИЕ МЕХАНОАКТИВИРОВАННОЙ АМОРФНОЙ КАЛЬЦИЕВОЙ СОЛИ ГЛЮКОНОВОЙ КИСЛОТЫ И ЕЁ КОМБИНАЦИИ С АНТИОКСИДАНТНЫМ ПРЕПАРАТОМ НА ОБМЕН КОСТНОЙ ТКАНИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ДИХЛОРЭТАНОМ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ 03.01.04 – Биохимия 14.03.03 — Патологическая физиология
Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Тюмень — 2012
Работа выполнена на кафедре биологической химии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального об разования «Башкирский государственный медицинский университет» Мини стерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации доктор медицинских наук, профессор Научные руководители:
Камилов Феликс Хусаинович кандидат медицинских наук Фаршатова Екатерина Рафаэлевна доктор медицинских наук, профессор
Официальные оппоненты:
Базарный Владимир Викторович, ГБОУ ВПО Уральская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России доктор медицинских наук, профессор Бышевский Анатолий Шулимович ГБОУ ВПО Тюменская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России
Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Омская государ ственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социаль ного развития Российской Федерации (г. Омск).
Защита состоится « 01» марта 2012 года в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.101.02 при ГБОУ ВПО «Тюменская госу дарственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и соци ального развития Российской Федерации по адресу: г. Тюмень, ул. Одесская, 54.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Тю менская государственная медицинская академия» Министерства здраво охранения и социального развития Российской Федерации.
Автореферат разослан « 31 » января 2012 года
Ученый секретарь диссертационного совета С.А. Орлов
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В Российской Федерации у людей старше 50 лет диагностируется в среднем 105,9 случаев переломов проксимального отдела бедренной кости, 426,2 случаев переломов дистального отдела пред плечья на 100 000 населения [О.М. Лесняк, Л.И. Беневоленская, 2010], каж дую минуту происходит 7 переломов позвонков [О.М. Лесняк, 2010]. Основ ной причиной таких переломов является остеопороз – прогрессирующее си стемное метаболическое заболевание скелета, которое характеризуется сни жением костной массы и нарушениями архитектоники костной ткани, при водящие к уменьшению её механической прочности и увеличению частоты переломов [Л.Я. Рожинская, 2002]. Смертность в течение первого года после перелома бедренной кости в России составляет 30%, а из выживших через год после перелома – 78%, через 2 года 65,5% нуждаются в постоянном ухо де [Л.В. Меньшикова и др., 2002] и требуют значительных финансовых за трат. Остеопороз вызывает летальный исход у 1 из 1 000 жителей популяции, что сопоставимо с риском смерти от инфаркта миокарда [Э.Ю. Коцелапова и др., 2009]. В 2002 г. в США ежегодные расходы на лечение и реабилитацию больных с остеопоротическими переломами оценивались в 17,5 млрд. долла ров [L.Y. Melton III, 2003]. По прогнозам экспертов затраты на лечение остео поротических переломов и, прежде всего, шейки бедра будут проградиентно увеличиваться, и к 2025 году составят в Европе около 31,8 млрд. евро [IOF, 2006]. Не случайно остеопороз, наряду с сердечно-сосудистыми, онкологиче скими заболеваниями, сахарным диабетом и хронической обструктивной бо лезнью лёгких, относится к важнейшим социально-медицинским проблемам современности [В.К. Казимирко и др., 2006].
В отличие от других наиболее социально-значимых болезней наблюда ется низкий охват нуждающихся в диагностике и лечении остеопорозом, по скольку потери минеральной плотности костной ткани (МПКТ) происходит исподволь и часто диагностируется только после переломов. В сложившейся обстановке для предупреждения неблагоприятной ситуации ведущей стратегией является своевременная диагностика и профилактика остеопороза, выявление лиц, у которых имеется высокий риск развития переломов. С этих позиций представляет интерес клинические исследования, демонстрирующие, что у пациентов с заболеваниями пародонта, приводящими к выпадению зубов, выявляются низкие показатели МПКТ [Е.Е Конопля и др., 2008;
Н.В. Плескановская и др., 2008;
В.Г. Атрушкевич, 2008;
A.R. Mohanmod et al., 2003;
Y. Watawski-Wende et al., 2005;
S. Gomes Filho et al., 2007]. У пациентов с остеопорозом в более, чем в 40% случаев диагностируется хронический генерализованный пародонтит, а у пациентов без такового – лишь в 12,5% [С.Д. Арутюнов и др., 2007;
2009]. Авторами продемонстрировано нарастание тяжести поражения пародонта по мере потери МПКТ периферического скелета.
Одним из малоизученных аспектов развития воспалительно-дис трофических изменений в пародонте и остеопороза являются химические за грязнители окружающей среды и производственных помещений [А.Ф.
Вербовой, 2002;
Т.С. Чемикосова и др., 2003;
2004;
А.Ш. Галикеева, А.И.
Булгакова, 2008;
Ф.Х. Камилов и др., 2007;
2008;
Э.Ю. Коцелапова и др., 2009].
Показано, что у работников химического предприятия, имеющих производственный контакт с различными хлорорганическими веществами (дихлорэтан, хлорпропан, хлорвинил, хлорпропен, дихлорпропан, эпихл оргидрин и др.) во всех возрастных группах чаще, чем у рабочих других про фессий обнаруживается развитие остеопенического синдрома [Ф.Х. Камилов и др., 2007;
2008;
2009;
И.А. Меньшикова и др., 2007;
2008;
Л.М. Рамазанова и др., 2008;
2009]. Авторами установлено, что при хронической интоксика ции дихлорэтаном в низких концентрациях наблюдается нарушения метабо лизма трубчатых костей экспериментальных животных с превалированием катаболических и резорбтивных процессов.
Одним из основных принципов профилактики и лечения остеопороза является обеспечение поступления в организм оптимального количества кальция [Л.И. Беневоленская, 2003;
Н.В. Торопцева, Л.И. Беневоленская, 2005;
О.А. Никитская, Н.В. Торопцева, 2011]. Препараты кальция с другими медикаментозными средствами (витамин Д и его активные формы, антире зорбтивные препараты) оказывают положительный лечебный эффект и при лечении хронических заболеваний пародонта, потере МПКТ лицевого скеле та [В.Г. Атрушкевич, 2008;
E. Kall et al., 2001]. Сотрудниками Ижевской го сударственной медицинской академии, физико-технического института УрО РАН (г. Ижевск) совместно с институтом органической и физической химии им. А.Е. Абузова Казанского научного центра РАН и Казанского физико-тех нического института им. Е.К. Завойского КазНЦ РАН разработана нанодис персная механоактивированная аморфная форма кальциевой соли глюконовой кислоты, показавшая хорошую биохимическую совместимость и терапевтическую эффективность при лечении заболеваний, связанных с нарушением обмена кальция в организме [Н.С. Стрелков и др., 2004;
2008;
Г.Н. Коныгин и др., 2005;
2006;
2009]. Положительное действие соединения авторы связывают с существенным улучшением биодоступности кальция в организме.
Цель исследования. Оценить влияние механоактивированной аморфной формы кальциевой соли глюконовой кислоты и её комбинации с антиоксидантным витаминным препаратом на метаболизм костной ткани периферического и лицевого скелета экспериментальных животных при хронической интоксикации дихлорэтаном.
Задачи исследования.
1. Изучить в костной ткани нижней челюсти и трубчатой кости белых крыс содержание свободного и белковосвязанного оксипролина, гликозаминогликанов, в плазме крови - уровни общего и ионизированного кальция, магния, фосфора, биохимических маркёров ремоделирования кости (С-концевые телопептиды, активность общей и костной щелочной фосфатаз) при хронической интоксикации дихлорэтаном в суммарной дозе 0,1ЛД50 и введении механоактивированной аморфной (нанодисперсной) формы кальциевой соли глюконовой кислоты (Кальций-МАГ), её комбинации с антиоксидантным препаратом (Триовит).
2. Оценить состояние оксидантно-антиоксидантной системы (интенсив ность хемилюминесценции, уровень первичных и вторичных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), общую антиоксидантную актив ность, активность супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы) в гомогенатах костной ткани нижней челюсти и эпифизов трубчатой кости при хронической интоксикации дихлорэтаном и лечении кальций-МАГом, комбинацией кальций-МАГа с триовитом.
3. Исследовать в плазме крови крыс при интоксикации дихлорэтаном и лечении этих животных кальций-МАГом и его комбинации с триовитом, со держание паратгормона, эстрадиола, тестостерона, гонадотропных гормонов (фолликулостимулирующего, лютеинизирующего и лактикотропного), и кортизола.
4. Изучить влияние лечения кальций-МАГом и его комбинации с трио витом на гистологическую структуру костной ткани нижней челюсти и труб чатой кости при хронической интоксикации дихлорэтаном в суммарной дозе 0,1ЛД50.
Научная новизна. Впервые установлено, что при хронической инток сикации малыми дозами хлорированных производных алифатических углево дородов (дихлорэтан) наблюдаются нарушения метаболизма костной ткани лицевого скелета, характерные для развития остеопенического синдрома в ткани трубчатых костей, и патогенетические механизмы их остеотоксического действия. Впервые показано, что введение механоактивированной аморфной (нанодисперсной) формы глюконата кальция при интоксикации дихлорэтаном способствует нормализации содержания в периферической крови общего и ионизированного кальция, снижению уровня паратгормона и пролактина, биохимического маркёра костной резорбции – С-концевых телопептидов коллагена типа 1, радиоактивного 45Са, интенсификации включения в костную ткань улучшению гистологической структуры костной ткани лицевого и периферического скелета, торможению в них катаболизма межклеточного матрикса.
Впервые установлено, что комбинированное лечение механоактивиро ванной аморфной (нанодисперсной) формой глюконата кальция с витаминным антиоксидантным препаратом при интоксикации малыми дозами дихлорэтана приводит к более выраженному терапевтическому эффекту, чем их раздельное применение, ингибируя катаболические процессы со снижением резорбции, интенсивность липопероксидации, с повышением активности антиоксидантных ферментов – супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы, общей антиокислительной активности костной ткани, усиливая продукцию половых и нормализуя выработку гонадотропных гормонов, предотвращая нарушения гистологической структуры костной ткани нижней челюсти и трубчатых костей периферического скелета экспериментальных животных.
Научно-практическая значимость. Экспериментально подтверждена эффективность использования нанодисперсной формы глюконата кальция для лечения остеопенических состояний. Показано выраженное лечебное влияние комбинированного применения механоактивированной аморфной соли глюконата кальция с витаминным препаратом антиоксидантного дей ствия – триовитом при нарушениях метаболизма костной ткани периодонта и периферического скелета в условиях длительного действия малых доз низко молекулярных ациклических хлорированных углеводородов (дихлорэтана), что может быть использовано для проведения профилактических мероприя тий у работников химических предприятий, имеющих профессиональный производственный контакт с хлорорганическими поллютантами.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Лечение белых крыс механоактивированной аморфной (нанодис персной) формой глюконата кальция (кальций-МАГ) при хронической инток сикации малыми дозами хлорированного углеводорода – дихлорэтана повы шает в крови содержание кальция, фосфора, магния и включение кальция в костную ткань, ингибируя её резорбцию.
2. Применение антиоксидантного витаминного препарата (триовит) при хронической интоксикации дихлорэтаном снижает в костной ткани экспери ментальных животных лицевого и периферического скелета процессы липо пероксидации, повышает активность основных антиоксидантных ферментов, способствует нормализации фосфорно-кальциевого обмена и гормонального баланса.
3. Использование при экспериментальной интоксикации животных ди хлорэтаном комбинации механоактивированной аморфной формы глюконата кальция и антиоксидантного препарата приводит к более выраженному терапевтическому эффекту на метаболизм и микроархитектонику костной ткани, состояние фосфорно-кальциевого обмена и гормональный статус, чем их раздельное применение.
Внедрение результатов исследования в практику.
Основные положения диссертационного исследования используются в учебном процессе кафедры биологической химии, кафедры фармакологии №1 с курсом клинической фармакологии, кафедры патологической физио логии и кафедры общей гигиены с курсом гигиенических дисциплин меди ко-профилактического факультета ГБОУ ВПО «Башкирский государствен ный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.
Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на 74-й и 76-й итоговых Республиканских научных конференциях студентов и молодых ученых «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2009, 2011), на 7-й и 8-й международных научно-практических конференциях «Достижения фундаментальных наук в решение актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2010;
2011), на IV Российском конгрессе по остеопорозу (СПб., 2010), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Современные проблемы гигиенической науки и медицины труда» (Уфа, 2010);
научно-практической конференции «Инновации в медицине – решение проблем охраны здоровья нефтехимиков», посвященной 45-летию медслужбы ОАО «Салаватнефтехиморгсинтез» (Салават, 2010);
Российской научно- практической конференции «Медицинская биохимия и клиническая лабора торная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований» (Омск, 2011);
на совместном заседании кафедр биологической химии, патологической физиологии, фармакологии №1 с курсом клинической фармакологии, общей гигиены с курсом гигиенических дисциплин медико-профилактического факультета ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития РФ (Уфа, 2012).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, включая 5 журнальных статей в изданиях, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных исследований.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописи, содержит 18 таблиц и 17 рисунков и приложения на 32 страницах (62 рисунка), состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования и их обсуждения, заключения, практических рекомендации и списка литературы, включающей 282 источника, в том числе 130 иностранных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования. Экспериментальные исследова ния выполнены на 288 белых беспородных крысах обоего пола массой 180 260 грамм с соблюдением положении Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным [Т.Б. Касаткина, 2000].
Дизайн исследования представлен на рисунке 1.
ДХЭ в оливковом масле вводили животным внутрижелудочно ежедневно с помощью специального зонда в течение 60 дней в суммарной дозе 50 мг/кг (0,1 ЛД50). Контрольная группа животных получала только оливковое масло. Исследуемые препараты вводили подопытным животным в течение последнего месяца опыта: таблетированную форму кальция глюконата и кальций-МАГ — в оливковом масле в виде суспензии в дозах 253 мг/кг массы в день, триовит — в дозе 50 мг/кг в виде суспензии в 2% растворе крахмала.
В эксперименте использовали таблетки «Кальция глюконата» (ЗАО «Ирбитский фармзавод»), кальций-МАГ — механоактивированную аморфную форму этого же официального препарата, полученного согласно патента на изобретение РФ №2373185 от 20.11.2009 г. [Г.А. Коныгин и др., 2009]. По данным комплексного физико-химического анализа, после механоактивации (измельчения в энергонапряженном устройстве — активаторе) размер частиц составляет 50-300 нм, происходит переход исходного кристаллического порошка в рентгеноаморфное состояние [Г.Н.
Коныгин и др., 2005;
Н.С. Стрелков и др., 2008]. Кальций-МАГ прошел государственную регистрацию, имеет сертификат № 77.99.23.3.У.8864.10.08, позволяющий использовать его для профилактических и лечебных целей.
Триовит производится фирмой «KRKA» (Словения), зарегистрирован в России. Одна капсула препарата содержит 40 мг токоферола ацетата (витамин Е), 10 мг бета-каротина, 100 мг аскорбиновой кислоты (витамин С) и 50 мкг селена в комплексе с порошкообразными сухими дрожжами.
Дозировки препаратов рассчитывали с учетом массы и площади поверхности тела животных согласно рекомендациям по перерасчету [И.А. Волчегорский и др., 2000]. Интенсивность хемилюминесценции оценивали с использованием хемилюминометра ХЛ-003 (Россия), содержание общего Са, Р и Мg — наборами реагентов «HUMAN» (Германия), ионов Са2+ - с помощью Fresenius Ionometr-2 (Германия), ОЩФ – «Новофосфаль» ЗАО «Вектор-Бест» (Россия), КЩФ - набором реагентов «Metra BAF EIA Kit» фирмы Quided Corporation, С-концевых телопептидов коллагена типа I (– Cross Laps) – Serum Cross Laps ELISA фирмы Nordic Biosciense Diagnostic Группы Контрольная животных 1-я, интоксикация ДХЭ в течение 2-х месяцев в суммарной дозе 0,1ЛД 2-я, интоксикация ДХЭ и введение таблетированной формы кальция глюконата 3-я, интоксикация ДХЭ и введение механоактивированной аморфной формы глюконата кальция (кальций-МАГ) 4-я, интоксикация ДХЭ и введение витаминного антиоксидантного препарата (триовит) 5-я, интоксикация ДХЭ и введение комбинации кальций-МАГа и триовита Са, Са2+, Р, Мg, -Cross Laps, КЩФ,ОЩФ в плазме крови Исследуемые показатели ФСГ, ЛГ, пролактин, тестостерон, эстрадиол, паратгормон, кортизола в плазме крови Хемилюминесценция, уровень продуктов ПОЛ, ОАА, активность СОД, ГП и каталазы в тканях бедренной кости и кости нижней челюсти Содержание СО и БСО, ГАГ, интенсивность включения С-пролина и 45Са в костную ткань Гистологическая структура тканей бедренной кости и нижней челюсти Рисунок 1. Дизайн исследования.
A/S (Дания). Уровень гормонов оценивали, используя стандартные наборы RIA Testosterone direct (Франция), RIA ESTRADIOL (Франция), PROLACTIN IRMA KIT (Чехия), LH IRMA KIT (Чехия), FSH IRMA KIT (Чехия), IMMUNOTECH CORTISOL RIA kit (Чехия), IRMA PTH (Франция). Общую антиоксидантную активность гомогената костной ткани определяли по Г.И.
Клебанову и соавт. (1988), активность каталазы по М.А. Королюку и соавт.
(1988), супероксиддисмутазы (СОД) и глутатионпероксидазы (ГП) с помощью наборов реагентов фирмы Randox Labor Ltd. Содержание продуктов ПОЛ в гептан-изопропаноловых экстрактах исследовали по И.А.
Волчегорскому и соавт. (2000), ТБК-активных продуктов — наборами реагентов «ТБК-АГАТ» (Россия), свободного (СО) и белковосвязанного (БСО) оксипролина и гликозаминогликанов (ГАГ) — по П.Н. Шараеву с соавт. (1990). Биосинтез коллагена оценивали по интенсивности включения С-пролина, интенсивность минерализации — радиоактивного 45Са. Кроме того у животных проводили гистологическую оценку состояния бедренной кости и нижней челюсти, определяли относительную массу, толщину кортикального слоя трубчатых костей по В.В. Поворознюку (2006).
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программ Statistica 6,0 фирмы Stat Soft. В группах выборки определя ли медиану (Ме) и интерквартильный интервал (25%;
75%). Достоверность межгрупповых различий средних величин оценивали по критерию U Манна Уитни. Критический уровень достоверности (Р) принимали равным 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ При хронической интоксикации ДХЭ у подопытных животных наблюдается падение относительной массы трубчатых костей (бедренной, большеберцовой, плечевой) и толщины их кортикального слоя.
Одновременно выявляется и некоторое снижение относительной массы нижней челюсти. У крыс, подвергнутых интоксикации ДХЭ, обнаруживается снижение в плазме крови уровней общего и ионизированного кальция, магния и фосфора (таблица 1), более двух раз повышается активность маркёра резорбции костной ткани — С-концевых телопептидов коллагена типа I, а активность костной щелочной фосфатазы — маркёра остеогенеза повышается незначительно (таблица 2). Эти результаты вполне определённо характеризуют превалирование процессов костной резорбции над гистогенезом костной ткани.
Введение подопытным животным таблетированной формы глюконата кальция не оказывает при интоксикации ДХЭ существенного влияния ни на один из исследуемых показателей костного и фосфорно-кальциевого обмена.
Введение крысам на фоне интоксикации кальций-МАГа несколько по вышает относительную массу трубчатых костей, препятствует падению в них толщины кортикального слоя, нормализует в плазме крови уровни общего и ионизированного Са, Р, статистически значимо повышает содержание Мg, снижает интенсивность костной резорбции и повышает остеогенез. Динамика изменений активности КЩФ и уровня -Cross Laps в плазме крови у этой группы животных практически уравновешиваются.
Более благоприятный эффект на состояние метаболизма костной ткани при хронической интоксикации ДХЭ оказывает лечение антиоксидантным препаратом. Особенно демонстративно снижается у этой группы животных уровень С-концевых телопептидов коллагена типа I и активность костной и общей щелочной фосфатаз. Однако в отношении изменений относительной массы отдельных костей и толщины кортикального слоя трубчатых костей, содержания в плазме крови Са общего и Са2+, Mg, Р у крыс, получавших триовит и кальций-МАГ, статистически значимых различий не установлено.
Таблица 1-Влияние кальций-МАГа, триовита и их комбинации на показатели минерального обмена в плазме крови у крыс, подвергнутых интоксикации дихлорэтаном, Ме [25%;
75%], n= Группа Показатели 2+ крыс Са общ., Са, ммоль/л Mg, ммоль/л Р, ммоль/л ммоль/л Контроль 2,2 [1,9;
2,3] 1,03 [0,89;
1,11] 0,78 [0,72;
1,07] 1,25 [1,19;
1,35] ная 1-я 1,9 [1,8;
2,2] 0,84 [0,80;
0,90] 0,72 [0,66;
0,78] 0,79 [0,54;
1,11] (ДХЭ) Р=0,0206 Р=0,0372 Р=0,6011 Р=0, 2-я 2,0 [1,9;
2,1] 0,87 [0,82;
0,93] 0,85 [0,82;
0,94] 0,92 [0,75;
1,13] (ДХЭ+ Р=0,0304 Р=0,0458 Р=0,3545 Р=0, глюконат Р1=0,1144 Р1=0,2318 Р1=0,0536 Р1=0, кальция) 3-я 2,1 [2,0;
2,4] 0,95 [0,82;
0,98] 1,07 [1,05;
1,15] 1,19 [1,08;
1,30] (ДХЭ+ Р=0,3480 Р=0,1864 Р=0,0049 Р=0, кальций- Р1=0,0436 Р1=0,0167 Р1=0,0033 Р1=0, МАГ) Р2=0,1387 Р2=0,0431 Р2=0,0084 Р2=0, 4-я 2,0 [1,7;
2,1] 0,90 [0,85;
0,93] 1,03 [0,88;
1,11] 1,08 [1,02;
1,19] (ДХЭ+ Р=0,0479 Р=0,0775 Р=0,0092 Р=0, триовит) Р1=0,6614 Р1=0,1038 Р1=0,0047 Р1=0, Р2=0,8974 P2=0,2455 Р2=0,0243 Р2=0, Р3=0,4462 Р3=0,0878 Р3=0,6208 Р3=0, 5-я 2,2 [2,0;
2,4] 1,05 [0,93;
1,10] 1,08 [1,02;
1,11] 1,19 [1,03;
1,22] (ДХЭ+ Р=0,3489 Р=0,7451 Р=0,0014 Р=0, триовит+ Р1=0,0342 Р1=0,0277 Р1=0,0024 Р1=0, кальций- Р2=0,8313 Р2=0,0356 Р2=0,0068 Р2=0, МАГ) Р3=0,8744 P3=0,0725 Р3=0,7953 Р3=0, Р4=0,0621 Р4=0,0473 Р4=0,5789 Р4=0, Примечание. В этой таблице и последующих: Р — различия с контрольной, Р1 — с первой, Р2 — со второй, Р3 — с третьей, Р4 — с четвертой группами крыс.
В то же время комбинированное введение кальций-МАГа и триовита способствует нормализации относительной массы костей, толщины корти кального слоя трубчатых костей, уровня в плазме крови кальция и фосфора, маркёра костной резорбции — -Cross Laps. Содержание Мg, активности КЩФ и общей щелочной фосфатазы сохраняются на более высоких значени ях, чем у контрольных животных (Р0,05).
Таблица 2- Содержание маркеров костного ремоделирования у крыс при хро нической интоксикации дихлорэтаном и терапии кальций-МАГом и анти оксидантным витаминным препаратом, Ме [25%;
75%], n= Группа крыс Показатели -Cross Laps, КЩФ ОЩФ мг/мл МЕ/л МЕ/л Контрольная 1,6 [1,1;
2,1] 45,0 [37,5;
50,0] 124 [103;
165] 1-я 3,6 [3,0;
5,3] 59,5 [55,0;
80,5] 207 [205;
212] (ДХЭ) Р0,0001 Р=0,0487 Р0, 2-я 2,9 [2,0;
3,7] 60,5 [44,5;
78,0] 187 [147;
191] (ДХЭ+глюконат Р=0,0416 Р=0,0492 Р=0, кальция) Р1=0,0638 Р1=0,7894 Р1=0, 3-я 2,4 [1,2;
4,0] 67,5 [45,5;
80,5] 165 [137;
175] (ДХЭ+кальций- Р=0,2647 Р=0,0066 Р=0, МАГ) Р1=0,0082 Р1=0,0373 Р1=0, Р2=0,5163 Р2=0,2832 Р2=0, 4-я 2,3 [2,2;
2,6] 49,5 [39,3;
56,8] 148 [137;
165] (ДХЭ+триовит) Р=0,0531 Р=0,7919 Р=0, Р1=0,0058 Р1=0,0118 Р1=0, Р2=0,4472 Р2=0,0412 Р2=0, Р3=0,2368 Р3=0,0296 Р3=0, 5-я 2,0 [1,8;
3,1] 58,1 [40,0;
60,0] 147 [138;
151] (ДХЭ+кальций- Р=0,2405 Р=0,0305 Р=0, МАГ+триовит) Р1=0,0008 Р1=0,7403 Р1=0, Р2=0,0018 Р2=0,4219 Р2=0, Р3=0,0442 Р3=0,6211 Р3=0, Р4=0,0633 Р4=0,1688 P4=0, Результаты, полученные при исследовании показателей костного мета болизма в плазме крови, подтверждаются исследованиями обмена основного белка межклеточного матрикса — костного коллагена. При интоксикации ДХЭ в трубчатых костях (табл. 3) и костной ткани нижней челюсти (табл. 4) повышается содержание свободного оксипролина, свидетельствуя об интенсификации процессов катаболизма, в то время как содержание этой иминокислоты в белковой фракции снижается.
Изучение инкорпорации радиоактивного 14С-пролина в коллагеновые белки позволили выявить, что при хронической интоксикации ДХЭ происходит одновременно и подавление биосинтеза коллагена (таблица 5).
При интоксикации ДХЭ в костной ткани нарушаются и процессы минерализации. Об этом свидетельствует снижение инкорпорации в костную ткань радиоактивного 45Са.
Таблица 3 – Влияние кальций-МАГа, триовита и их комбинации на содержа ние фракций оксипролина и ГАГ в бедренной кости у крыс при хронической интоксикации дихлорэтаном, Ме [25%,75%] Группа крыс СО, мкмоль/г БСО, мкмоль/г ГАГ, мкмоль/г Контрольная n=16 0,90 [0,86;
0,96] 3,70 [3,30;
3,80] 1145 [1122;
1174] 1-я, n=16 1,36 [1,11;
1,46] 2,51 [2,09;
2,60] 1362 [1334;
1415] Р=0,0008 Р=0,0007 Р=0, 2-я, n=16 1,29 [1,16;
1,36] 2,50 [2,10;
2,62 ] 1408 [1389;
1409 ] Р=0,0192 Р=0,006 Р=0, Р1=0,0748 Р1=0,7485 Р1=0, 3-я, n=16 1,22 [1,00;
1,27] 2,96 [2,30;
3,18] 1323 [1217;
1352] Р=0,0346 Р=0,0142 Р=0, Р1=0,0377 Р1=0,0403 Р1=0, Р2=0,0578 Р2=0,0418 Р2=0, 4-я, n=16 1,11 [0,99;
1,18] 2,82 [2,51;
2,88] 1218 [1120;
1226] Р=0,0411 Р=0,0130 Р=0, Р1=0,0233 Р1=0,0127 Р1=0, 5-я, n=16 0,98 [0,78;
1,12] 3,40 [3,15;
3,55] 1208 [1011;
1282] Р=0,0546 Р=0,0851 Р=0, Р1=0,0014 Р1=0,0056 Р1=0, Р2=0,0028 Р2=0,0061 Р2=0, Р3=0,0138 Р3=0,0355 Р3=0, Р4=0,0408 Р4=0,0312 Р4=0, Лечение подопытных крыс глюконатом кальция не оказывает статисти чески значимого влияния ни на обмен коллагена, ни на включение радиоак тивного кальция в минеральный компонент межклеточного матрикса. Изме нения всех исследуемых показателей были на уровне тенденции. Введение кальций-МАГа способствует снижению уровня СО в ткани как трубчатой (бедренной) кости, так и нижней челюсти, существенно не влияет на процессы биосинтеза коллагена, но усиливает инкорпорацию 45Са в костную ткань. Лечение подопытных животных триовитом оказывает нормализующее влияние на обмен коллагена, повышает включение радиоактивного кальция в костную ткань. Комбинированное лечение триовитом и кальций-МАГом приводит к выраженному снижению содержания СО и повышению БСО в костной ткани периферического и лицевого скелета, статистически значимо превышая эффективность раздельного применения каждого из них. Однако комбинированное лечение не усиливает лечебный эффект раздельного применения кальций-МАГа и триовита на интенсивность включения радиоактивного 14С-пролина в коллагеновые белки и радиоактивного 45Са в минеральную фазу костной ткани. Таким образом, введение кальций-МАГа оказывает влияние в основном на состояние фосфорно-кальциевого обмена, а триовита — органического матрикса костной ткани.
Процессы детоксикации дихлорэтана, как и других хлорированных уг леводородов протекает с участием микросомальных монооксигеназ, связан Таблица 4 — Влияние кальций-МАГа, триовита и их комбинации на содержание фракций в кости нижней челюсти у крыс при хронической интоксикации ДХЭ, Ме [25%;
75%], n=16 (в каждой группе) Группа крыс СО, мкмоль/г БСО, мкмоль/г ГАГ, мкмоль/г Контрольная 1,02 [0,86;
1,18] 2,12 [1,90;
2,20] 1024 [1000;
1062] 1-я (ДХЭ) 1,88 [1,80;
2,06] 1,55 [1,20;
1,66] 1147 [1114;
1156] Р=0,0008 Р=0,0006 Р=0, 2-я (ДХЭ+ глю- 1,68 [1,60;
1,88] 1,60 [1,50;
1,62] 1169 [1077;
1209] конат кальция) Р=0,0018 Р=0,0003 Р=0, Р1=0,1038 Р1=0,6346 Р1=0, 1,42 [1,20;
1,42] 1,82 [1,56;
2,02] 1026 [1012;
1028] 3-я (ДХЭ + кальций Р=0,0035 Р=0,0329 Р=0, –МАГ) Р1=0,0058 Р1=0,0686 Р1=0, Р2=0,0793 Р2=0,0743 Р2=0, 4-я (ДХЭ + трио- 1,26 [1,12;
1,44] 2,00 [1,90;
2,16] 1095 [1082;
1125] вит) Р=0,0357 Р=0,4642 Р=0, Р1=0,0014 Р1=0,0016 Р1=0, 5-я (ДХЭ + триовит 1,04 [0,76;
1,12] 2,08 [1,91;
2,10] 1028 [1020;
1046] + кальций –МАГ) Р=0,6726 Р=0,5741 Р=0, Р1=0,0007 Р1=0,0009 Р1=0, Р2=0,0024 Р2=0,0007 Р2=0, Р3=0,0042 Р3=0,0418 Р3=0, Р4=0,0470 Р4=0,8336 Р4=0, ных с разными изоформами цитохрома Р-450. Выявлена корреляция между тяжестью интоксикации ДХЭ и выраженностью в тканях процессов свобод но-радикального окисления и липопероксидации [Е.А. Лужников и др., 1989;
А.И. Карпищенко и др., 1997]. В этой связи было проведено исследование со стояния оксидантно-антиоксидантной системы в гомогенатах эпифизов труб чатых костей и костной ткани нижней челюсти. В костной ткани при хронической интоксикации ДХЭ повышаются показатели интенсивности радикалообразования, обнаруживаемые методом железоиндуцированной хемилюминесценции, наблюдается накопление первичных и вторичных продуктов ПОЛ — диеновых коньюгатов, кетодиенов и сопряженных триенов, ТБК-реагирующих соединений (таблица 6 и 7). Эти данные свидетельствуют, что одним из механизмов развития остеопенического синдрома с превалированием катаболических процессов в тканях периферического и лицевого скелета является усиление свободно радикального окисления. Остеокласты, представляющие собой модифицированные многоядерные макрофаги [G.A. Rodan, S.B. Rodan, 2000], а также мононуклеарные фагоциты, которые в значительном количестве располагаются в межтрабекулярных пространствах губчатой ткани, активно реагируют на воздействия химических соединений, принимая непосредственное участие в процессах детоксикации с активацией Р-450 зависимых микросомальных оксигеназ [С.В. Сибиряк и др., 2006], продуцируют и откликаются на регуляторные молекулы межклеточных взаи Таблица 5 — Интенсивность включения радиоактивных 14С-пролина в колла ген и 45Са в минеральную фазу костной ткани крыс при интоксикации ди хлорэтаном и терапии кальций-МАГом, триовитом и их комбинацией, Ме [25%;
27%], n= 14 Группа живот- С-пролин, имп/мин 5 мг белка Са, имп/мин 100 мг ткани ных Бедренная кость Нижняя челюсть Бедренная кость Нижняя челюсть контрольная 1486[1246;
1693] 1896[1420;
1910] 1388[1130;
1510] 1544[1420;
1680] 1-я 1203[1126;
1415] 1523[1430;
1615] 955[840;
1266] 1018[970;
1305] Р=0,0144 Р=0,0244 Р=0,0118 Р=0, 2-я 1196[1033;
1285] 1542[1450;
1742] 1013[881;
1283] 1116[1090;
1448] Р= Р=0,0320 Р=0,0278 Р=0, Р1 = Р1=0,8795 Р1=0,5475 Р1=0, 3-я 1218[1112;
1383] 1548[1088;
1372] 1212[933;
1288] 1385[1122;
1516] Р=0,0206 Р=0,0422 Р=0,0313 Р=0, Р1=0,8774 Р1=0,0776 Р1=0,0396 Р1=0, Р2=0,8638 Р2=0,6433 Р2=0,0405 Р2=0, 4-я 1418[1277;
1628] 1743[1528;
1916] 1167[1095;
1188] 1396[1216;
1458] Р=0,7326 Р=0,0473 Р=0,4322 Р=0, Р1=0,0285 Р1=0,0356 Р1=0,0583 Р1=0, 5-я 1416[1136;
1525] 1796[1509;
1970] 1345[1112;
1456] 1399[1306;
1519] Р=0,6944 Р=0,0613 Р=0,5671 Р=0, Р1=0,0270 Р1=0,0308 Р1=0,0173 Р1=0, Р2=0,0196 Р2=0,0319 Р2=0,0243 Р2=0, Р3=0,0316 Р3=0,0484 Р3=0,0468 Р3=0, Р4=0,9541 Р4=0,6415 Р4=0,6344 Р4=0, модействий в костной ткани. Активация микросомальных оксигеназ способствует интенсификации образования активных форм кислорода с усилением свободно-радикалных процессов. Костная ткань, которая обладает незначительными резервами антиокислительной и физиологической защиты, является высокочувствительной к действию окислительных агрессивных молекул [В.В. Казимирко и др., 2006]. Общая антиокислительная активность и активность основных ферментов антиоксидантной защиты костной ткани при длительном поступлении малых доз ДХЭ снижается.
Лечение обеими формами кальциевой соли глюконовой кислоты не оказывает влияния на состояние оксидантно-антиоксидантной системы. Вве дение животным на фоне интоксикации ДХЭ антиоксидантного витаминного препарата обнаруживает выраженное действие. У животных, получавших триовит и комбинацию триовита с кальций-МАГом, в костной ткани снижаются уровни радикалообразования и ПОЛ. У подопытных групп животных резко ингибируется спонтанная светимость, уменьшаются уровни амплитуды быстрой вспышки и максимальной светимости. При этом в трубчатых костях и кости нижней челюсти статистически значимо снижается образование продуктов ПОЛ. Одновременно у животных этих групп наблюдается удлинение латентного периода, отражающего состояние антирадикальной защиты, увеличивается общая антиокислительная актив Таблица 6 – Влияние кальций-МАГа и его совместного введения с триовитом на показатели железоиндуцированной хемилюминесценции гомогената костной ткани нижней челюсти при хронической интоксикации ди хлорэтаном, Ме [25%,75%], n= Группа Показатели, усл. ед.
крыс Спонтанная Амплитуда Максимальная Светосумма Латентный светимость быстрой светимость период, мин.
вспышки Контроль 1,88 4,29 2,59 6,12 0, ная [1,67;
4,07] [3,22;
5,08] [2,04;
3,16] [4,44;
7,66] [0,42;
1,02] 1-я 4,05 5,80 3,31 6,91 0, (ДХЭ) [2,09;
6,44] [4,47;
6,91] [3,05;
4,75] [4,34;
8,78] [0,18;
0,42] Р=0,0067 Р=0,0076 Р=0,0243 Р=0,6317 Р=0, 2-я 3,43 5,99 3,52 6,18 0, (ДХЭ+ [2,96;
4,18] [4,51;
7,23] [3,02;
4,00] [4,06;
6,46] [0,26;
0,39] глюконат Р=0,0311 Р=0,0075 Р=0,0274 Р=0,8163 Р=0, кальция) Р1=0,1345 Р1=0,5868 Р1=0,3425 Р1=0,6071 Р1=0, 3-я 3,55 5,27 3,37 6,58 0, (ДХЭ+ [3,18;
4,33] [4,69;
6,76] [2,29;
4,74] [4,66;
6,60] [0,22;
0,56] кальций– Р=0,0255 Р=0,0124 Р=0,0481 Р=0,4751 Р=0, МАГ) Р1=0,2166 Р1=0,3694 Р1=0,8964 Р1=0,3911 Р1=0, Р2=0,7345 Р2=0,1082 Р2=0,7422 Р2=0,3671 Р2=0, 4-я 2,45 4,98 3,09 5,51 0, (ДХЭ+ [2,11;
2,93] [4,32;
6,09] [2,99;
4,35] [4,21;
5,90] [0,28;
0,56] триовит) Р=0,0346 Р=0,0357 Р=0,2049 Р=0,0293 Р=0, Р1=0,0215 Р1=0,0306 Р1=0,3465 Р1=0,0183 Р1=0, 5-я 2,07 4,89 2,83 4,63 0, (ДХЭ+ [1,65;
3,09] [4,34;
5,82] [1,95;
4,59] [4,20;
5,28] [0,42;
1,08] триовит+ Р=0,1923 Р=0,0509 Р=0,2835 Р=0,0205 Р=0, кальций Р1=0,0096 Р1=0,0284 Р1=0,0435 Р1=0,0148 Р1=0, –МАГ) Р2=0,0135 Р2=0,0233 Р2=0,0411 Р2=0,0202 Р2=0, Р3=0,0148 Р3=0,0443 Р3=0,0443 Р3=0,0242 Р3=0, Р4=0,1455 Р4=0,7678 Р4=0,3116 Р4=0,0424 Р4=0, ность (ОАА) и активность основных антиоксидантных ферментов — СОД, каталазы и ГП (таблица 8). Комбинированное лечение подопытных крыс триовитом и кальций-МАГом оказывает более выраженное нормализующее влияние на состояние оксидантно-антиоксидантной системы костной ткани при хронической интоксикации ДХЭ, однако эти различия по сравнению с применением только триовита не достигают статистической значимости.
Результаты биохимических исследований, свидетельствующие об акти вации при действии ДХЭ в костной ткани резорбтивных процессов на фоне некомпенсированного остеогенеза с развитием остеопении, подтвердили ги стологические исследования.
Таблица 7 – Влияние введения кальций МАГа, триовита и из комбинации на содержание продуктов липопероксидации в гомогенатах эпифизов бедренной кости крыс при интоксикации дихлорэтаном, Ме [25%, 75%], n= Группа Показатели, усл.ед. ТБК крыс реагирующие Гептановая фракция Изопропаноловая фракция продукты, ДК КД и СТ ДК КД и СТ нмоль/л Контро 0,73 0,62 0,97 0,75 2, льная [0,72;
0,75] [0,59;
0,65] [0,96;
0,98] [0,70;
0,79] [2,72;
3,08] 1-я, ДХЭ 0,94 0,92 1,31 0,98 4, [0,91;
0,96] [0,85;
0,94] [1,00;
1,35] [0,93;
0,99] [4,10;
4,31] Р=0,0021 Р=0,0002 Р=0,0022 Р=0,0027 Р=0, 2-я, 0,95 0,79 1,27 0,88 3, ДХЭ+ [0,84;
0,98] [0,74;
0,84] [1,08;
1,31] [0,84;
0,94] [3,30;
3,92] глюконат Р=0,0037 Р=0,0054 Р=0,0035 Р=0,0339 Р=0, кальция Р1=0,8746 Р1=0,0346 Р1=0,2533 Р1=0,0418 Р1=0, 3-я, 0,93 0,81 1,20 0,86 3, ДХЭ+ [0,85;
0,96] [0,79;
0,83] [0,98;
1,25] [0,80;
0,87] [3,56;
4,01] кальций- Р=0,0081 Р=0,0039 р=0,0146 Р=0,0365 Р=0, МАГ Р1=0,8788 Р1=0,0455 р1=0,1483 Р1=0,0585 Р1=0, Р2=0,7685 Р2=0,6874 р2=0,4586 Р2=0,6474 Р2=0, 4-я, 0,80 0,66 0,97 0,82 3, ДХЭ+ [0,77;
0,83] [0,63;
0,66] [0,95;
1,08] [0,74;
0,92] [2,95;
3,15] триовит Р=0,0312 Р=0,0678 р=0,9673 Р=0,0536 Р=0, Р1=0,0046 Р1=0,0014 р1=0,0036 Р1=0,0346 Р1=0, 5-я, 0,75 0,67 0,95 0,79 3, ДХЭ+ [0,72;
0,81] [0,62;
0,69] [0,92;
1,30] [0,70;
0,81] [2,85;
3,26] кальций- Р=0,0788 Р=0,0804 р=0,8974 Р=0,0659 Р=0, МАГ+ Р1=0,0033 Р1=0,0009 р1=0,0021 Р1=0,0218 Р1=0, триовит Р2=0,0028 Р2=0,0056 р2=0,0046 Р2=0,0375 Р2=0, Р3=0,0031 Р3=0,0083 р3=0,0083 Р3=0,0419 Р3=0, Р4=0,1483 Р4=0,9045 р4=0,5273 Р4=0,3216 Р4=0, Гистологическая картина1) бедренных костей и нижней челюсти подопытных животных отражает развитие остеопороза с рассасыванием, истончением, дезорганизацией костных пластинок, со снижением содержания минерального вещества, деструкцией ткани, остеодистрофией и остеосклерозом. При этом наблюдается ухудшение состояния микрососудистого русла, нарушение минерализации вновь синтезированного органического матрикса, а также активация на отдельных участках эпифиза и диафиза трубчатой кости остеогенеза с заменой костной грубой волокнистой соединительной тканью. В нижней челюсти особо выраженным изменениям вплоть до некроза верхушек корня зуба подвергается поддерживающий аппарат зуба и губчатое вещество альвеол. Гистологическая картина костной ткани при введении таблетированной формы глюконата кальция на фоне _ 1) Выражаем признательность профессору кафедры гистологии ГБОУ ВПО БГМУ Минздравсоцразвития России, д.м.н. Каюмову Ф.А. за действенную помощь в выполнении этого раздела работы.
Таблица 8 – Общая антиоксидантная активность и активность антиоксидант ных ферментов костной ткани нижней челюсти крыс при интоксикации ди хлорэтаном и терапии кальций-МАГом, триовитом и их комбинацией, Ме [25%,75%], n= Группа ОАА, % тор- СОД, Е/мг белка ГП, Е/мг белка Каталаза мкмоль животных можения мин/мг белка Контроль 42,1 [20,0;
54,2] 69,5 [68,0;
71,1] 460,6 [454,2;
466,9] 7,42 [7,27;
7,85] ная 1-я (ДХЭ) 23,8 [22,0;
25,4] 40,0 [38,0;
51,0] 231,3 [184,0;
264,4] 4,11 [4,07;
4,40] Р=0,0276 Р=0,0007 Р=0,0006 Р=0, 2-я 22,9 [18,9;
52,3] 46,5 [40,3;
50,5] 236,5 [215,5;
278,5] 4,60 [4,06;
5,06] (ДХЭ+ Р=0,0422 Р=0,0018 Р=0,0017 Р=0, глюконат Р1=0,5877 Р1=0,1126 Р1=0,7014 Р1=0, кальция) 3-я (ДХЭ 24,9 [19,3;
34,2] 42,6 [39,4;
45,5] 262,7 [220,0;
304,7] 5,06 [5,02;
5,38] +кальций Р=0,0408 Р=0,0009 Р=0,0023 Р=0, –МАГ) Р1=0,5074 Р1=0,6133 Р1=0,6100 Р1=0, Р2=0,5008 Р2=0,2632 Р2=0,6744 Р2=0, 4-я 39,7 [36,7;
53,5] 54,8 [54,0;
60,2] 392,1 [362,2;
404,2] 6,08 [6,10;
6,90] (ДХЭ+ Р=0,8934 Р=0,0011 Р=0,0382 Р=0, триовит) Р1=0,0364 Р1=0,0244 Р1=0,0036 Р1=0, 5-я (ДХЭ 39,8 [35,4;
60,1] 59,3 [58,2;
62,4] 452,0 [380,3;
466,8] 6,74 [6,57;
7,52] +триовит Р=0,9041 Р=0,1938 Р=0,6428 Р=0, +кальций Р1=0,0314 Р1=0,0196 Р1=0,0023 Р1=0, –МАГ) Р2=0,0298 Р2=0,0315 Р2=0,0028 Р2=0, Р3=0,0356 Р3=0,0278 Р3=0,0033 Р3=0, Р4=0,9011 Р4=0,4333 Р4=0,5438 Р4=0, интоксикации ДХЭ мало отличается от её состояния без лечения. При введении кальций-МАГа и триовита также выявляются определённые, характерные при действии ДХЭ, изменения структуры костной ткани и тканей пародонта, но они обнаруживаются в значительно меньшей степени.
Существенному снижению деструкции иссле-дуемых тканей пародонта и кости, улучшению гистологической структуры остеонов диафиза трубчатой кости, костных балок, арок и дуг эпифизов и губчатой кости нижней челюсти, усилению процессов формирования костной ткани способствует комбинированное введение кальций-МАГ и триовита (рис. 2).
Введение кальций-МАГа и триовита приводит к определённым изменениям и гормонального статуса подопытных животных при интоксикации ДХЭ. Изменения гормонального баланса при хронической интоксикации ДХЭ свидетельствует о том, что, наряду с важной патогенетической ролью окислительного стресса в костной ткани в развитии нарушений метаболизма, имеют значение и другие механизмы. У животных выявляются изменения уровня ряда системных гормонов, оказывающих за метное влияние на регуляцию обменных процессов в костной ткани — поло вых гормонов, паратгормона, кортизола (табл. 9). Содержание половых гор монов при интоксикации ДХЭ снижается: эстрадиола у самок крыс — до 63,6%, тестостерона у самцов — до 47,9%. О дискоординации функциониро вания гормональной оси гипоталамус-гипофиз-гонады свидетельствуют и разнонаправленные изменения продукции гонадотропинов: повышение ФСГ, пролактина, снижение ЛГ. Полученные результаты со всей очевидностью Нарушение компактного строения Надкостница и наружный слой общих структур бедренной кости после хро пластинок диафиза бедренной кости нической интоксикации крыс ДХЭ контрольной группы Стенка бедренной кости с небольшими Щелевидные промежутки в наружной признаками щелевых структур вокруг или общей пластинке и около остеогенов около остеогенов белых крыс при бедренной кости при интоксикации интоксикации ДХЭ и введении триовита с ДХЭ и введении кальций-МАГа кальций-МАГом Трабекулы костной ткани с кро веносными сосудами челюсти конт- Деструкция костных трабекул губчатого вещества альвеолярного отростка нижней рольной группы животных челюсти при интоксикации ДХЭ Костная ткань нижней челюсти у Костная ткань нижней челюсти при белых крыс при интоксикации ДХЭ и интоксикации ДХЭ и комбинированном лечении кальций-МАГом лечении триовитом с кальций-МАГом Рисунок 2. Гистологическая картина костной ткани экспериментальных жи вотных. Окраска гематоксилином-эозином. Микрофотографии. Ок. 10, об. 40.
свидетельствуют об участии в механизмах развития остеопении при интоксикации ДХЭ нарушений регуляции метаболизма костной ткани половыми гормонами.
Таблица 9 — Гормональный статус у крыс при хронической интоксикации дихлорэтаном и введении кальций-МАГа, триовита и их комбинации, Ме [25%,75%].
Группа Паратгормон, Кортизол, нг/мл, Тестостерон у Эстрадиол у крыс нг/л, n=18 n=18 самцов, нмоль/л, самок, пг/мл, n=18 n= Контроль 17,5 [16,5;
18,6] 18,7 [16,7;
19,3] 11,7 [9,0;
13,5] 29,7 [18,7;
54,3] ная 1-я (ДХЭ) 50,5 [47,0;
55,1] 57,1 [36,7;
73,0] 5,6 [2,8;
6,4] 18,9 [15,6;
22,8] Р«0,0001 Р«0,0001 Р«0,0001 Р«0, 2-я 52,0 [40,5;
54,0] 52,6 [34,6;
54,4] 5,5 [4,0;
6,0] 24,3 [21,7;
30,7] (ДХЭ+ Р«0,0001 Р«0,0001 Р=0,0023 Р=0, глюконат Р1=0,3872 Р1=0,2008 Р1=0,3619 Р1=0, кальция) 3-я (ДХЭ 25,0 [24,0;
25,5] 55,0 [36,7;
62,3] 5,4 [3,0;
8,5] 20,4 [16,8;
23,1] +кальций Р=0,0014 Р«0,0001 Р=0,0157 Р=0, –МАГ) Р1=0,0088 Р1=0,6338 Р1=0,7340 Р1=0, Р2=0,0064 Р2=0,4756 Р2=0,8245 Р2=0, 4-я 32,0 [29,5;
35,5] 43,8 [36,9;
50,3] 9,3 [7,5;
11,9] 24,7 [18,8;
37,3] (ДХЭ+ Р=0,0001 Р=0,0005 Р=0,2479 Р=0, триовит) Р1=0,0038 Р1=0,0084 Р1=0,0476 Р1=0, 5-я (ДХЭ 22,5 [19,0;
28,0] 45,8 [26,9;
49,3] 10,5 [9,2;
11,5] 25,9 [19,6;
30,2] +триовит Р=0,0152 Р=0,0008 Р=0,5286 Р=0, +кальций- Р1=0,0001 Р1=0,0181 Р1=0,0014 Р1=0, МАГ) Р2=0,0001 Р2=0,0273 Р2=0,0048 Р2=0, Р3=0,1476 Р3=0,0258 Р3=0,0018 Р3=0, Р4=0,4280 Р4=0,6086 Р4=0,2431 Р4=0, При интоксикации ДХЭ наблюдается повышение в периферической крови содержание паратгормона почти в 3 раза. У подопытных животных развиваются явления вторичного гиперпаратиреоза, который способствует усилению резорбции костной ткани и активации остеолиза [В.Дж. Маршалл, 2002;
М. Peacock, 2010]. Развитию вторичного гиперпаратиреоза способствует также снижение продукции половых гормонов, повышение уровня глюкокортикоидов и гипокальцемия [В.К. Казимирко и др., 2006;
Б.А.
Фролов, 2006], т. е. факторы, которые обнаруживаются и при интоксикации ДХЭ в наших экспериментах. У животных, подвергнутых воздействию ДХЭ, обнаруживается увеличение содержания в крови кортизола, оказывающего выраженный катаболический эффект на метаболизм костной ткани, снижаю щего абсорбцию кальция в кишечнике и повышающего его экскрецию почками [Е.И. Марова, 2003;
S. Khosla, L.J. Melton III, 2000].
Введение подопытным животным триовита благоприятно отражается на состоянии гормонального статуса, повышая уровень тестостерона у самцов и эстрадиола у самок крыс, снижая продукцию ФСГ и пролактина, нормализуя выработку ЛГ. Введение кальций-МАГа способствует снижению Поступление хлорированных углеводородов (дихлорэтана) Активация микросомального окисления и других механизмов I фазы биотрансфармации Образование токсичных Повышение Повышение Повышение метаболитов выработки образования АФК, выработки глюкокортикоидов активация СРО катехоламинов Усиление процессов Активация Активация Мобилизация коньюгации и системы биоэнергетических метаболических других антиоксидантной процессов процессов механизмов защиты биотрансформации Длительное (избыточное) поступление поллютантов Недостаточность ресурсов и механизмов, регулирующих СРО и биотранформацию Повреждающее действие свободных радикалов и продуктов ПОЛ на биомембраны, структуру и активность биологически важных молекул Нарушения метаболических и физиологических процессов Изменение секреции гормонов, Нарушения метаболической регулирующих костный функции печени и кальциевый обмен Мальабсорбция Са Повышение Снижение продукции продукции паратгормона, половых Гипокальцемия кортизола гормонов Костная ткань Повышение активности Снижение образования остеокластов, и активности остеобластов резорбции (катаболизма) кости Остеопения. Остеопороз.
Рисунок 3. Общая схема остеотоксического действия дихлорэтана (хлорированных алифатических углеводородов). *) АФК — активные формы кислорода, СРО — свободно-радикальное окисление, ПОЛ — перекисное окисление липидов.
содержания паратгормона, существенно ингибируя последствия гиперпаратиреоза. Комбинированное введение обоих средств оказывает нормализующее влияние на большинство исследуемых гормонов, но практически не отражается на содержание в крови подопытных крыс кортизола.
Полученные нами результаты исследования и данные литературы поз воляют представить следующую общую схему остеотоксического действия хлорированных алифатических углеводородов, в частности дихлорэтана (рис.
3). Ведущим механизмом токсического влияния ДХЭ на метаболизм костной ткани является активация свободно-радикальных процессов. В то же время изменения эндокринного статуса, поражение печени, другие механизмы играют дополнительную роль в развитии остеопенического синдрома.
Важное значение при этом имеет состояние фосфорно-кальциевого обмена, и прежде всего развитие гипокальциемии. Эффективность действия антиоксидантного препарата подтверждает основной механизм остеотоксического влияния дихлорэтана. Существенное снижение гипокальциемии, интенсификация включения радиоактивного Са в костную ткань и повышение уровня паратгормона в периферической крови при введении подопытным животным кальций-МАГа, по всей вероятности, является следствием резкого усиления биодоступности кальция. Эти данные подтверждают имеющиеся в литературе сведения о терапевтической эффективности нанодисперсной аморфной формы глюконата кальция при лечении заболеваний, связанных с обменом кальция, включая и остеопороз [Н.С. Стрелков и др., 2004;
2008].
Однонаправленность и сопоставимая выраженность изменений метабо лизма костной ткани периферического и лицевого скелета при хронической интоксикации ДХЭ и введении лекарственных средств подтверждает немногочисленные литературные данные о взаимосвязи развития системного остеопороза и хронического генерализованного пародонтита, а также о поло жительном лечебном эффекте применения препаратов кальция с другими ме дикаментозными средствами при лечении хронических заболеваний паро донта и потери МПКТ лицевого скелета [Ю.М. Максимовский и др., 1991;
Е.Ю. Хохлова и др., 1995;
А.С. Артюшкевич, 2006;
В.Г. Артушкевич, 2008;
С.Д. Арутюнов и др., 2008;
2009]. Вероятнее всего, заболевания пародонта могут являться маркёром остеопороза [Н.В. Плескановская и др., 2008;
С.Д.
Арутюнов и др., 2009], а производственный контакт с хлорированными али фатическими углеводородами несомненно отражается на состоянии паро донта.
Таким образом, использование в терапевтических целях комбинации механоактивированной аморфной формы кальциевой соли глюконовой кислоты и антиоксидантного препарата при хронической интоксикации хлорпроизводными алифатических углеводородов (дихлорэтаном) способствует нармализации кальциевого обмена, повышению физиологических механизмов антиоксидантной защиты и восстановлению баланса костной резорбции и остеогенеза, снижению деструкции костной ткани периферического и лицевого скелета, препятствует развитию остеопороза и остеопении.
ВЫВОДЫ 1. Хроническая интоксикация дихлорэтаном в суммарной дозе 0,1 ЛД характеризуется выраженными изменениями обмена костной ткани перифе рического и лицевого скелета, проявляющимися усилением катаболизма и ингибированием синтеза коллагена, активацией свободно-радикального окис ления с развитием недостаточности антиоксидантной защиты, снижением минерализации, а также повышением содержания в крови маркёров ремоде лирования — С-концевых телопептидов, активности костной щелочной фос фатазы, снижением уровней кальция, фосфора и магния.
2. Введение животным при интоксикации дихлорэтаном механоактиви рованной аморфной формы глюконата кальция (кальций-МАГа) способству ет повышению в плазме крови кальция, фосфора, магния, активности костной щелочной фосфатазы, снижению уровня С-концевых телопептидов, усиле нию включения радиоактивного 45Са в минеральную фазу костной ткани.
Комбинированное лечение кальций-МАГом и антиоксидантным витаминным препаратом «Триовит» оказывает более выраженный терапевтический эф фект на обмен костной ткани лицевого и периферического скелета, ингиби руя свободно-радикальное окисление и накопление продуктов липоперокси дации, повышая антиокислительную способность, снижая интенсивность течения резорбтивных процессов и катаболизма коллагена, усиливая процес сы биосинтеза органического матрикса и его минерализацию.
3. Применение комбинированного лечения кальций-МАГом с триови том при хронической интоксикации экспериментальных животных ди хлорэтаном в большей степени, чем их раздельное использование препят ствует развитию нарушении гистологического строения, микроархитектони ки диафизов и эпифизов трубчатых костей и костной ткани нижней челюсти, снижая процессы остеодистрофии, деструкции и остеосклероза, усиливая яв ления остеогенеза и минерализации остеонов.
4. Комбинированное лечение нанодисперсной аморфной формой глюконата кальция с антиоксидантным витаминным препаратом при интоксикации экспериментальных животных дихлорэтаном оказывает нормализующее влияние на гормональный статус. При этом повышается продукция лютропина и половых гормонов — эстрадиола у самок и тестостерона у самцов, снижается секреция паратгормона и пролактина, что благоприятно сказывается на фосфорно-кальциевом и костном обменах.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Результаты исследования являются экспериментальной базой для даль нейшего изучения эффективности применения механоактивированной аморфной (нанодисперсной) формы кальция глюконовой кислоты при патологических состояниях, протекающих с нарушением обмена кальция.
Высокая эффективность действия на метаболизм костной ткани совместного применения антиоксидантного препарата с механоактивированной аморфной формой глюконата кальция в условиях эксперимента с длительным поступлением в организм дихлорэтана позволяет рекомендовать использование этих лекарственных средств в профилактике и лечении остеопении и остеопороза у рабочих химических производств, работающих в условиях профессионального контакта с хлорорганическими соединениями алифатических углеводородов.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Ганеев, Т.И. Метаболизм костной ткани периферического скелета и пародонта при хронической интоксикации низкими дозами дихлорэтана и эффективность действия антиоксидантного витаминного препарата / Т.И. Га неев, Э.Р. Бикметова, Е.Р. Фаршатова, Ф.Х. Камилов // Медицинская наука и образование Урала. – 2010. - Т.11, №4 (64). - С.45-49.
2. Камилов, Ф.Х. Ремоделирование костной ткани при действии хлор производных низкомолекулярных алифатических углеводородов / Ф.Х. Ка милов, Т.И. Ганеев, Е.Р. Фаршатова, Э.Р. Бикметова, И.А. Меньшикова, Г.В.
Иванова // Медицинский вестник Башкортостана. - 2011. – Т.6, №2. С.305-309.
3. Бикметова, Э.Р. Эффективность коррекции антиоксидантным вита минным препаратом изменений гистоструктуры костной ткани при хрониче ской интоксикации дихлорэтаном / Э.Р. Бикметова, Ф.А. Каюмов, Е.Р. Фар шатова, Т.И. Ганеев, Ф.Х. Камилов // Морфологические ведомости. - 2011. №3. - С.16-22.
4. Бикметова, Э.Р. Эффективность действия механоактивированной аморфной формы глюконата кальция и антиоксидантного витаминного комплекса на метаболизм костной ткани при хронической интоксикации хло рированным углеводородом / Э.Р. Бикметова, И.А.Меньшикова, Е.Р. Фарша това, Т.И. Ганеев, Г.В. Иванова // Омский научный вестник. - 2011. №1(104). - С.85-88.
5. Фаршатова, Е.Р. Эффективность комплексного применения механо активированной аморфной формы глюконата кальция и антиоксидантного витаминного препарата на показатели минерального обмена и ремоделирова ния костной ткани при хронической интоксикации дихлорэтаном / Е.Р. Фар шатова, Т.И. Ганеев, Г.В. Иванова, И.А. Меньшикова, Ф.Х. Камилов // Меди цинская наука и образование Урала. – 2011. – №4. – в печати.
6. Иванова, Г.В. Влияние интоксикации малой интенсивности хлорорганическими производными алифатических углеводородов на уровень половых и гонадотропных гормонов / Г.В. Иванова, Э.Р. Бикметова, И.А.
Меньшикова, Л.М. Рамазанова, Т.И. Ганеев // Астраханский мед. журнал.
Материалы 7-й международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». –- 2010. №1 (приложение) - С.241-245.
7. Камилов, Ф.Х. Особенности метаболизма костной ткани крыс при длительной интоксикации дихлорэтаном / Ф.Х. Камилов, Э.Р. Бикметова, И.А. Меньшикова, Л.М. Рамазанова, Т.И. Ганеев // Астраханский мед.
журнал. Материалы 7-й международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». –.2010. №1 (приложение) - С.245-247.
8. Бикметова, Э.Р. Коррекция нарушений метаболизма костной ткани при интоксикации хлорорганическими соединениями витаминным препаратом антиоксидантного действия / Э.Р. Бикметова., Г.В. Иванова, И.А.
Меньшикова, Л.М. Рамазанова, Ф.Х. Камилов, Т.И. Ганеев // Материалы IV ого Российского конгресса по остеопорозу. – Санкт-Петербург, 2010. - С.115 116.
9. Ганеев, Т.И. Влияние механоактивированной аморфной кальциевой соли глюконовой кислоты на метаболизм костной ткани при интоксикации дихлорэтаном / Т.И. Ганеев, И.А. Меньшикова, Л.М. Мустаева, Е.Р.
Фаршатова // Сборник научных трудов конференции учёных РБ с международным участием «НАУЧНЫЙ ПРОРЫВ – 2010», посвященной Году Республики, Дню Республики – Уфа, 2010. - С.32-37.
10. Камилов, Ф.Х. Ремоделирование костной ткани при действии хлорпроизводных алифатических углеводородов / Ф.Х. Камилов, Г.В.
Иванова, Е.Р. Фаршатова, Т.И. Ганеев, И.А. Меньшикова, Э.Р. Бикметова // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Связь заболевания с профессией с позиций доказательной медицины». – Казань, 2011. - С.274-276.
11. Ганеев, Т.И. Эффективность нанодисперсной кальциевой соли глюконата и антиоксидантного витаминного препарата на уровень гормонов, регулирующих костный обмен при хронической интоксикации дихлорэтаном / Т.И. Ганеев, Е.Р. Фаршатова, Э.Р. Бикметова, И.А. Меньшикова // Материалы 76-ой Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины». – Уфа, 2011. – Т.2. - С.39-41.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ БСО – белковосвязанный оксипролин ГАГ – гликозаминогликаны ГП – глутатионпероксидаза ДХЭ – дихлорэтан ДК — диеновые коньюгаты КД — кетодиены КЩФ – костная щелочная фосфатаза ЛГ – лютеинизирующий гормон ЛТГ – лактикотропный гормон МПКТ – минеральная плотность костной ткани ОАА – общая антиокислительная активность ОЩФ – общая щелочная фосфатаза ПОЛ – перекисное окисление липидов ПТГ – паратгормон СО – свободный оксипролин СОД – супероксиддисмутаза СП — сопряженные триены СРО – свободнорадикальное окисление ТБК — тиобарбитуровая кислота ТБК-РП – ТБК-реагирующие продукты ФСГ – фолликулостимулирующий гормон ЛД50 – доза, вызывающая гибель 50% животных