Молекулярно-генетическое изучение рака почки в республике башкортостан
На правах рукописи
КУТЛЫЕВА ЛИЛИЯ РАЗИФОВНА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РАКА ПОЧКИ В РЕСПУБЛИКЕ БАШКОРТОСТАН 03.02.07 – генетика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Уфа – 2013 2
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской Академии наук
Научный консультант: Хуснутдинова Эльза Камилевна доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты: Мустафина Ольга Евгеньевна доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и генетики УНЦ РАН, зав. лабораторией физиологической генетики Карпухин Александр Васильевич доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук, руководитель лаборатории молекулярной генетики сложно наследуемых заболеваний
Ведущая организация: Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова Минздрава России
Защита состоится «» июня 2013 г. в «» часов на заседании Диссертационного совета Д 002.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской Академии наук по адресу:
450054, г. Уфа, пр. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН (Уфа, пр. Октября, 71), с авторефератом – на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН ibg.anrb.ru/dissov.html e-mail: [email protected] Автореферат разослан «_» мая 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н С.М. Бикбулатова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Рак почки (РП) или почечно-клеточная карцинома (ПКК) представляет собой злокачественное новообразование почки, на долю которого приходится примерно 3% от всех онкологических заболеваний у взрослых. РП является седьмой наиболее распространенной формой рака у женщин и пятой – у мужчин (Jemal et al., 2011). По статистическим данным, заболеваемость раком почки неуклонно растет (Sun et al., 2011). Ежегодно в мире регистрируют около 210 тысяч новых случаев рака почки (РП) (GLOBOCAN 2002, http://www.dep.iarc.fr/globocan/globocan.htm;
3), в России – более 17 тысяч (Чиссов В.И. и др., 2010), в Республике Башкортостан – случаев (Чиссов В.И. и др., 2012). Распространенность злокачественных опухолей почек в России составляет 7-8 человек на 100 тысяч населения в год (Пальцев М.А. и др., 2009). Прирост заболеваемости у мужчин в течение 5 лет (2004-2009 гг) составил 15.2%, уступив новообразованиям предстательной и щитовидной желез, а также опухолям центральной нервной системы, тогда как у женщин показатели прироста заболеваемости были выше (18.5%) и уступили лишь новообразованиям центральной нервной системы (Давыдов и др., 2011).
На гистологическом уровне выделяют несколько типов ПКК:
светлоклеточный, папиллярный, хромофобный, онкоцитарный, рак собирательных протоков. За этими гистологическими различиями стоят разные молекулярно-генетические нарушения, которые обусловливают возникновение и развитие опухоли, а также позволяют прогнозировать течение заболевания (Курынин и др., 2008;
Lujambio et al., 2008). Из всех гистологических типов РП наиболее часто встречается светлоклеточная карцинома (70-85% случаев) (Алексеев и др., 2007;
Arjumand et al., 2012). Согласно современным представлениям, развитие светлоклеточного рака почки (СРП) связано с генетическими и эпигенетическими изменениями в гене-супрессоре опухолевого роста фон Хиппеля-Линдау (VHL, von Hippel-Lindau gene), локализованном на коротком плече хромосомы 3 в области 3p25 (Audenet et al., 2011), а также других генов-супрессоров опухолей, расположенных на данной хромосоме (RASSF1, FHIT, SEDT2, PBRM1 и др.) и инактивируемых в результате мутаций, протяженных аллельных делеций и/или метилирования CpG-островков промоторных областей.
При изучении генетической предрасположенности к спорадическому раку почки рассматриваются гены, участвующие в детерминации процессов детоксикации различных эндогенных и экзогенных токсинов, гены цитокинов, факторов роста, транскрипционных факторов. К настоящему времени в рамках полногеномных исследований (GWAS) выполнены анализы ассоциации рака почки с полиморфными вариантами нескольких сотен тысяч генов, в результате которых выявлены хромосомные области 2p21, 11q13.3, 12p11.23, 12q24.31, тесно сцепленные с развитием заболевания (Purdue et al., 2011;
Hun et al., 2012;
Wu et al., 2012).
Сейчас диагностика рака почки основывается на данных анамнеза, результатах ультразвуковой диагностики (УЗИ) и гистологического исследования биопсийного материала. ПКК излечим, когда диагностируется на ранних стадиях заболевания (Battagli et al., 2003). Пациенты с метастатическим раком почки имеют плохой прогноз, их средняя продолжительность жизни составляет 6-12 месяцев и только 10-20% пациентов с ПКК живут в течение лет. Известно, что РП резистентен к химиотерапии;
только у 20% пациентов наблюдается частичный ответ и менее чем у 5% – полный ответ на иммунотерапию (Campbell et al., 2003).
В настоящее время не существует надежных тестов для формирования групп риска развития рака почки, раннего выявления заболевания, а также прогноза его развития, поэтому, принимая во внимание тот факт, что некоторые молекулярно-генетические нарушения возникают еще до манифестации клинических признаков заболевания, актуальным является идентификация диагностических и прогностических маркеров, позволяющих с высокой точностью предсказывать вероятность развития заболевания и разрабатывать тактику лечения с учетом индивидуальных особенностей каждого больного.
Кроме того, понимание причин возникновения онкологических заболеваний и поиск методов их лечения будет способствовать формированию фундаментальных представлений о патогенезе данной группы заболеваний, позволит выявить генетические и эпигенетические факторы риска развития рака почки и разработать новые методы их терапии.
На основании вышесказанного были определены цели и задачи настоящего исследования.
Цель исследования – изучение генетических факторов риска развития рака почки.
Задачи исследования:
1. Провести поиск мутаций в гене фон Хиппеля-Линдау (VHL) в образцах ДНК из первичных опухолей почки и нормальной почечной паренхимы у больных светлоклеточным раком почки.
2. Оценить частоту потери гетерозиготности генов-супрессоров опухолевого роста фон Хиппеля-Линдау (VHL), Ras-ассоциированного белка семейства (RASSF1), ломкой гистидиновой триады (FHIT) в первичных опухолях почки и провести анализ корреляции обнаруженных аллельных делеций с клинико патологическими параметрами опухолей почки.
3. Определить частоту метилирования CpG-островков промоторных областей генов-супрессоров опухолевого роста фон Хиппеля-Линдау (VHL) и ингибитора циклин-зависимой киназы 2A (CDKN2A) и провести анализ корреляции метилированных генов с клинико-патологическими параметрами рака почки.
4. Провести исследование полиморфных локусов генов систем клеточной детоксикации и антиоксидантной защиты (GSTM1, CYP1A1, PON1), цитокинов (IL4, IL16), фактора роста (VEGF) и рецептора витамина D (VDR) у пациентов с раком почки и в контрольной группе здоровых индивидов.
5. Провести анализ ассоциации исследованных полиморфных вариантов с предрасположенностью к раку почки.
6. Провести анализ межгенных взаимодействий, предрасполагающих к развитию рака почки.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное молекулярно генетическое исследование рака почки в Республике Башкортостан. Определен спектр и частота мутаций в гене VHL у больных РП из РБ. Впервые в ДНК, выделенной из опухолевой ткани почки, обнаружены 11 мутаций в гене VHL, не зарегистрированных в базе данных и не описанных ранее в литературе. При изучении полиморфных вариантов гена биотрансформации ксенобиотиков CYP1A1, гена параоксоназы PON1 и гена рецептора витамина D (VDR) выявлены генотипы/аллели, ассоциированные с риском развития ПКК.
Определены оптимальные модели межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов цитокинов, гена рецептора витамина D, предрасполагающих к развитию РП у индивидов русской и татарской этнической принадлежности.
Научно-практическая значимость работы. Представленные в работе результаты исследования расширяют имеющиеся знания о механизмах развития РП, вносят вклад в формирование представлений о генетических и эпигенетических основах данного заболевания. Полученные данные могут внести вклад в разработку новых направлений и эффективных методов лечения и ранней диагностики РП. Материалы диссертационной работы могут быть использованы при чтении курсов лекций по медицинской генетике на биологических факультетах университетов, в медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников.
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на Международных конференциях европейского общества генетиков человека «European Human Genetics Conference» (Амстердам, 2011;
Нюрнберг, 2012), Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы онкогенетики» (Москва, 2011), V Всероссийской конференции с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт – основа профилактической медицины в век нанотехнологий» (Санкт Петербург, 2012), XVI Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2012), VII региональной конференции молодых ученых-онкологов, посвященной памяти академика РАМН Н.В.Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2012), II и III Всероссийском школе-семинаре «Биомика – наука XXI века» (Уфа, 2011, 2012), Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Актуальные проблемы генетики человека, животных, растений и микроорганизмов» (Уфа, 2012), а также на конференции «Медико-генетические проблемы онкологических заболеваний» (Стерлитамак, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 5 – статьи в журналах из Перечня ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 198 работ.
Диссертация содержит 19 таблиц и 16 рисунков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материал для исследования В работе использованы образцы ДНК больных раком почки, находящихся на стационарном лечении в Республиканской клинической больнице им.
Куватова и клинике БГМУ. Забор образцов проводился сотрудниками кафедры урологии с курсом ИПО ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» в соответствии с этическими стандартами биоэтического комитета, разработанными согласно Хельсинской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека». У всех обследуемых лиц образцы тканей почки и крови были получены с их информированного согласия. Диагноз был поставлен на основании данных клинического и гистологического обследования.
Исследование было проведено на двух выборках больных РП. Первая выборка больных была представлена 110 парными образцами ДНК, выделенными из опухолевой ткани почки и нормальной почечной паренхимы, вторая содержала 190 образцов ДНК, выделенных из периферической крови пациентов с РП. Возраст больных на момент постановки диагноза варьировал от 36 до 80 лет. Наибольшее число больных находилось в возрасте 51-60 лет, что согласуется с литературными данными. Средний возраст выявления заболевания составил 55±3 года. Среди больных РП было 46% женщин и 54% мужчин.
В первой группе больных 105 пациентов имели светлоклеточный рак почки (СРП), 2 – папиллярный и 3 – смешанный. Во вторую группу пациентов, ДНК которых была доступна только из периферической крови, входили больных со СРП, 7 – с папиллярным и 7 – со смешанным. Все случаи РП классифицированы по TNM-классификации согласно требованиям Международного противоракового союза. В первой выборке 68 пациентов (62%) имели начальные стадии заболевания (I-II стадии злокачественного процесса по TNM-классификации) и 42 пациента (38%) – поздние (III-IV) стадии заболевания.
По этнической принадлежности пациенты, ДНК которых была выделена из тканей, распределились следующим образом: 45% (50 пациентов из 110) русских, 32% (35/110) татар, 12% (13/110) башкир и 11% (12/110) пациентов происходили из межэтнических браков. Этнический состав второй группы пациентов был следующим: 41% (78/190) русских, 34% (65/190) татар, 13% (25/190) башкир и 12% (22/190) пациентов происходили из межэтнических браков.
Контрольная группа была сформирована из 282 практически здоровых неродственных жителей РБ, не имеющих злокачественных новообразований, которые по возрасту, полу и этнической принадлежности (русские – 98 человек, татары – 103 человек, башкиры – 61 человек) соответствовали группе больных.
Методы исследования ДНК из образцов опухолевой ткани почки и нормальной почечной паренхимы, а также из периферической крови была выделена методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew et al., 1984). Исследование образцов ДНК на наличие мутаций в гене VHL проводили методом анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP –анализа) (Orita et al., 1989). Результаты SSCP-анализа оценивали в 10%-ном полиакриламидном геле с последующим окрашиванием азотнокислым серебром. Определение нуклеотидных последовательностей образцов ДНК проводили на автоматическом секвенаторе ABI Prism модель 310 (Applied Biosystems).
Анализ потери гетерозиготности для генов-супрессоров опухолевого роста, локализованных на коротком плече хромосомы 3, проводили с использованием двух микросателлитных маркеров (STR-маркеров): для гена VHL – D3S1038 и D3S1317, гена RASSF1 – D3S966 и D3S1568, гена FHIT – D3S1234 и D3S1300.
Продукты амплификации STR-маркеров разделяли в 8% полиакриламидном геле.
Для определения метилирования CpG-островков промоторных областей исследуемых генов применяли метод метил-чувствительной полимеразной цепной реакции (МЧ-ПЦР). ДНК из опухолевой ткани и нормальной почечной паренхимы гидролизовали метил-чувствительными рестриктазами HpaII или HhaI, затем гидролизованную ДНК использовали в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции. Для исключения ложноположительных и ложноотрицательных результатов в ходе исследования использовали разаботанные ранее многолокусные ПЦР (Михайленко и др., 2012).
Анализ полиморфных вариантов генов IL4, IL16, CYP1A1, VDR, VEGF, PON1, GSTM1 осуществляли методом ПЦР и ПДРФ-анализом с последующим электрофорезом в 7-8% полиакриламидном геле.
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программного обеспечения MS Office Excel 2003 (Microsoft).
При попарном сравнении частот аллелей и генотипов в группах больных и контроля использовали критерий 2 (р) для таблиц сопряженности 2x2 с поправкой Иэйтса на непрерывность. Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя соотношения шансов Odds Ratio (OR) (Schlesselman et al., 1982).
Анализ неравновесия по сцеплению и гаплотипический анализ выполняли с помощью программы Haploview 4.2 (Barrett, 2005). Анализ межгенных взаимодействий проводили с помощью программ MDR (Ritchie et al., 2001) и GMDR (Lou et al., 2007;
Chen et al., 2011).
Для выявления ассоциации полиморфных локусов и гаплотипов сцепленных локусов в различных моделях (аддитивной, доминантной, рецессивной, модели сверхдоминирования) с учетом количественных и бинарных признаков (пол, возраст, возраст манифестации заболевания, этническая принадлежность, статус курения) применяли программу SNPStats (http://bioinfo.iconcologia.net/). Для выбора лучшей модели использовали информационный критерий Акайке (AIC). Для каждого локуса из статистически значимых выбирались модели с наименьшим значением AIC.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Поиск изменений нуклеотидной последовательности в гене фон Хиппеля-Линдау В 105 парных образцах ДНК, выделенных из опухолевой и нормальной почечной паренхимы пациентов со СРП проведен поиск мутаций в трех экзонах гена фон Хиппеля-Линдау (VHL). Мутации в гене VHL обнаружены в образцах ДНК первичных опухолей почки, что составляет 21.9% случаев. Все выявленные мутации были соматическими, присутствовали только в опухолевой ткани почки и не обнаруживались в ДНК из нормальной почечной паренхимы и периферической крови пациентов.
Результаты проведенного исследования, а также клиническая характеристика больных позволили исключить наследственный синдром фон Хиппеля-Линдау у пациентов со СРП и все случаи были отнесены к спорадическим формам РП. Характеристика выявленных мутаций приведена в таблице 1. У 23 больных обнаружено 22 мутации (рис. 1), среди которых однонуклеотидных замен (35%), выявленных в гетерозиготном состоянии, делеций (60%) и 1 инсерция (5%).
Рисунок 1. Идентификация мутаций в гене VHL в ДНК из опухолевой ткани почки у пациентов со СРП методом SSCP-анализа с последующим секвенированием: А – однонуклеотидная замена c.343CT (p.H115Y);
Б – инсерция c.394_395insCACTG (p.Q132Pfs*29);
В – делеция c.227_229delTCT (p.F76_F76del) Впервые идентифицированы одиннадцать соматических мутаций, не описанных в литературе ранее: c.185_195del (p.V62Gfs*66), c.216_228del (p.S72Ffs*83), с.276_306del (p.G93Lfs*56) c.402_407del (p.E134_F136delinsN), c.394_395insCACTG (p.Q132Pfs*29), c.492delG (p.V165Lfs*5), c.555_557delCGA (p.Y185*), c.546_559del (p.L184Gfs*67), c.530delG (p.R177Nfs*25), c.498_504del (p.V166Vfs*1), c.499_505del. (p.R167Qfs*3). Общая частота впервые выявленных мутаций у пациентов со СРП составила 50% (11/22 случаев).
Таблица Соматические мутации, выявленные в гене фон Хиппеля-Линдау (VHL) у больных со светлоклеточным раком почки из Республики Башкортостан Экзоны № Изменение нуклеотидной Изменение в структуре гена VHL п/п последовательности белка 1 c.183CG p.P61P 2 c.185_195del p.V62Gfs* 1 3 c.194CT p.S65L 4 c.216_228del p.S72Ffs* 5 c.227_229delTCT p.F76_F76del 6 c.263GA p.W88* 7 c.276_306del p.G93Lfs* 8 c.343CT p.H115Y 9 c.349TC p.W117R 2 10 c.394_395insCACTG p.Q132Pfs* 11 c.402_407del p.E134_F136delinsN 12 c.461CT (2 случая) p.P154L 13 c.469delA p.T157Lfs* 14 c.473TA p.L158Q 15 c.492delG p.V165Lfs* 16 c.498_504del p.V166Vfs* 17 c.499_505del p.R167Qfs* 18 c.530delG p.R177Nfs* 19 c.533TA p.L178Q 20 c.542_545delTCAG p.V181Gfs* 21 c.546_559del p.L184Gfs* 22 c.555_557delCGA p.Y185* Примечание: все обнаруженные мутации были сопоставлены с базами данных The Universal Mutation Database (http://www.umd.be) и Human Gene Mutation Database (http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/search.html). Мутации, обнаруженные впервые, выделены жирным шрифтом Большинство выявленных мутаций в гене VHL представляли собой делеции со сдвигом рамки считывания. В отличие от однонуклеотидных замен, которые незначительно затрагивают HIF-связанный участок, делеции, приводящие к полному нарушению регуляции HIF, вызывают тяжелое течение заболевания (Schraml P. et al., 2002;
Kim J.H. et al., 2005).
Мутация в 1 экзоне гена VHL c.227_229del (p.F76_F76del) приводит к делеции фенилаланина в 76 положении белка, который играет важную роль в сохранении структуры -домена белка VHL. Радикальная дестабилизация первого домена pVHL и нарушение его взаимодействия с HIF-1, возможно, также связано с мутациями c.185_195del (p.V62Gfs*66), c.216_228del (p.S72Ffs*83), c.276_306del (p.G93Lfs*56), c.394_395insCACTG (p.Q132Pfs*29) и c.402_407del (p.E134_F136delinsN), выявленными в данном исследовании впервые.
Ранее неописанная делеция 7 нуклеотидов (c.498_504del) в 3 экзоне гена VHL приводит к сдвигу рамки считывания, образованию стоп кодона (p.V166Vfs*1) и синтезу неполноценного белка. Данная мутация происходит в линкерном регионе гена между и -доменами и изменяет активность взаимодействия супрессора опухолевого роста с элонгином С (Leonardi E. et al., 2011). Причинами неправильного взаимодействия белка VHL с элонгином С также могут служить делеции c.469delA (p.T157Lfs*2), c.492delG (p.V165Lfs*5), c.530delG (p.R177Nfs*25), c.542_545delTCAG (p.V181Gfs*20), c.546_559del (p.L184Gfs*67), приводящие к сдвигу рамки считывания и образованию стоп кодонов в белке pVHL.
Мутации, выявленные нами впервые, приводили к возникновению делетированных участков от 1 до 31 п.о., наиболее протяженной делецией оказалась мутация c.276_306del (p.G93Lfs*56) в 1 экзоне гена VHL.
В данном исследовании мы не выявили ни одной мутации в кодонах 1-60, по всей видимости, мутации в данном регионе белка встречаются нечасто. На сегодняшний день описано всего около 60 мутаций, повреждающих кодоны 1 54 (Schraml P. et al., 2002).
Согласно литературным данным, соматические мутации в гене VHL у больных со спорадическим СРП варьируют в пределах 18-82% случаев (Nyhan et al., 2008;
Gossage et al., 2010;
Audenet et al., 2011). Возможно, что низкая частота мутаций в гене VHL у наших пациентов связана с тем, что у некоторых больных имеет место VHL-независимый путь развития спорадического СРП.
Кроме того, различия в частотах мутаций в гене VHL, согласно данным разных исследователей, могут быть связаны с этноспецифичностью исследуемых больных, гистопатологией опухоли, соотношением опухолевой и нормальной ДНК в анализируемых образцах или использованием различных методов исследования (Young et al., 2009;
Gossage et al., 2010).
Анализ аллельных делеций генов-супрессоров опухолевого роста VHL, RASSF1, FHIT, расположенных на коротком плече хромосомы Нами проведен анализ аллельных делеций областей локализации генов VHL – D3S1038 и D3S1317, RASSF1 – D3S966 и D3S1568, FHIT – D3S1234 и D3S1300 в 110 парных образцах ДНК, выделенных из опухолевой ткани почки и нормальной почечной паренхимы с помощью STR-маркеров (рис. 2).
Информативность используемых микросателлитных локусов составила для D3S1038 – 76.4% (84/110), D3S1317 – 54.5% (60/110), D3S1568 – 58.2% (64/110), D3S966 – 63.6% (70/110), D3S1234 – 82.7% (91/110), D3S1300 – 68.2% (75/110).
Рисунок 2. Примеры анализа потери гетерозиготности в локусах D3S1038, D3S1317, D3S1568, D3S966, D3S1234, D3S1300 у пациентов с раком почки. N-ДНК, выделенная из нормальной почечной паренхимы;
T- ДНК, выделенная из опухолевой ткани почки;
LOH (loss of heterozygosity) – потеря гетерозиготности.
Аллельные делеции области локализации гена VHL по локусу D3S обнаружены в 25% (22/84), по локусу D3S1317 – в 28.3% (17/60) информативных случаев ПКК, что сопоставимо с результатами многих работ (Yoshida et al., 2002;
Chen et al., 2009;
Singh et al., 2011). Общая информативность по двум вариабельным локусам для гена VHL составила 89.2% (98/110). Частота аллельных потерь по двум исследованным локусам для гена VHL в данной выборке составила 32.7% (32/98) случаев информативных образцов, что согласуется с данными как отечественных (Михайленко и др., 2012), так и некоторых зарубежных авторов (Martinez et al., 2000).
Потеря гетерозиготности области локализации гена RASSF1 по локусу D3S966 обнаружена у 17 пациентов с ПКК, что составляет 24.3% (17/70) случаев, а по локусу D3S1568 – у 19 пациентов с ПКК, что составляет 30% (19/64) информативных случаев.
Для гена FHIT ПГ выявлена в 25.3% (23/91) информативных случаев по локусу D3S1234 и в 14.7% (11/75) по локусу D3S1300.
В целом для генов RASSF1 и FHIT аллельные делеции обнаружены в 32.1% (26/81) и 29.9% (26/87) случаев информативных образцов ПКК, соответственно.
При сравнении изученных генов-супрессоров опухолевого роста, локализованных на коротком плече хромосомы 3, наиболее часто ПГ наблюдается в области локализации гена VHL, что доказывает его значимую роль в развитии СРП. Кроме того, возможно, что более высокая частота делеций в гене VHL связана с более близким его расположением к теломерному концу хромосомы по сравнению с генами FHIT и RASSF1, локализованными ближе к центромерным участкам короткого плеча хромосомы 3. Делеции хотя бы одного гена на коротком плече хромосомы 3 наблюдали в 49.1% (54/110) информативных случаев ПКК.
Анализ метилирования CpG-островков промоторных областей генов VHL и CDKN2A В связи с тем, что изменение степени метилирования ДНК может вносить вклад в развитие и прогрессирование рака, а характер метилирования генов служит одним из диагностических маркеров онкологических заболеваний, нами проведен анализ статуса метилирования CpG-островков промоторных областей генов-супрессоров опухолевого роста VHL и CDKN2A, вовлеченных в патогенез ПКК (рис. 3), в 110 образцах ДНК, выделенных из опухолевой ткани почки и нормальной почечной паренхимы, а также периферической крови пациентов с РП. Метилирование CpG-островков промоторной области гена VHL выявлено в 4 из 105 образцов со светлоклеточным раком почки, что составляет 3.8% случаев. Метилирование CpG-островков промоторной области гена VHL обнаружено только в первичной опухолевой ткани почки и не выявлено в периферической крови и нормальной почечной паренхиме. Наши данные о низкой частоте метилирования промоторного региона гена VHL в опухолевой ткани согласуются с результатами ряда работ (Clifford et al., 1998;
Nickerson et al., 2008).
Рисунок 3. Анализ метилирования CpG-островков промоторных областей А – гена VHL;
1N, 2N, 3N – отсутствие метилирования;
1Т, 2Т, 3Т – метилирование промоторной области гена VHL, Puc/MspI – маркер молекулярного веса.
Б – гена CDKN2A;
1N, 2N – отсутствие метилирования;
1Т, 2Т – метилирование промоторной области гена CDKN2A, meth – положительный контроль (негидролизованная ДНК), Puc/MspI – маркер молекулярного веса.
Метилирование CpG-островков промоторной области гена CDKN2A обнаружено в 23 из 110 опухолевых образцов ПКК (20.9%).
Ген CDKN2A относится к семейству генов-супрессоров опухолевого роста, кодирует белок p16INK4A, который является основным членом семейства ингибиторов циклинзависимых киназ lnk4, участвующих в негативной регуляции сигнального пути и отвечающего за реализацию программы клеточного цикла. Известно, что при РП частота метилирования CpG островков промоторного региона гена CDKN2A варьирует в пределах 14-80% случаев (Sanz-Casla et al., 2003;
Onay et al., 2009). Все случаи метилирования CpG-островков промоторного региона гена CDKN2A были обнаружены у пациентов с начальной стадией заболевания. Возможно, что данный механизм способствует более медленному прогрессированию заболевания у этих пациентов, предотвращая развитие опухоли в сторону метастазирования.
Таким образом, не только генетические изменения, но и эпигенетические нарушения могут быть причиной инактивации генов-супрессоров опухолевого роста при ПКК.
Анализ инактивации гена VHL Согласно теории двухударной модели канцерогенеза для перехода нормальной клетки в опухолевую необходимо два мутационных события.
Исходя из этого, с целью выявления случаев биаллельной инктивации гена VHL нами проведен анализ одновременного наличия мутаций, аллельных делеций и/или метилирования промоторной области гена VHL у пациентов с РП.
Биаллельная инактивации гена VHL выявлена у 7 пациентов, что составило 30.4% (7/23) случаев. У одного пациента с мутацией р.Р154L в гене VHL обнаружены аллельные делеции в обоих микросателлитных локусах (D3S1038 и D3S1317) гена VHL, тогда как у другого пациента с мутацией р.S65L выявлено метилирование CpG-островков промоторной области данного гена. У четырех пациентов мутации в гене VHL сочетались с ПГ по одному из изученных STR маркеров (D3S1038 или D3S1317). Наличие метилирования промоторной области гена VHL и аллельной делеции этого же гена обнаружено лишь у одного пациента с ПКК. Все больные с биаллельной инактивацией гена VHL имели начальную стадию злокачественного процесса, у них отсутствовали регионарные и отдаленные метастазы.
Существуют предположения, что потеря гетерозиготности и мутации в гене VHL у пациентов с РП коррелируют с более благоприятным прогнозом заболевания по сравнению с теми пациентами, у которых ген VHL не инактивирован (Gossage et al., 2010). Мы провели корреляционный анализ клинико-патологических параметров опухолей, а также анализ выживаемости пациентов в зависимости от наличия или отсутствия мутаций в гене VHL, потери гетерозиготности или биаллельной инактивации (мутация в гене VHL в сочетании с потерей гетерозиготности и/или метилирования промоторной области гена VHL), но каких-либо статистически значимых ассоциаций выявлено не было (p0.05).
Поиск аллельных вариантов генов-кандидатов, предрасполагающих к развитию рака почки Нами изучено 13 полиморфных вариантов в 7 генах, которые могут формировать предрасположенность к развитию рака почки. В результате исследования статистически значимые ассоциации были выявлены для полиморфных вариантов rs662 (c.530TC, p.Q192R) и rs854560 (c.163TA, p.L55M) гена PON1, rs1048943 (c.1384AG, p.Ile462Val) гена CYP1A1, rs (c.2TC, FokI) и rs731236 (c.1056TG, TagI) гена VDR. Анализ гомозиготной делеции 10 т.п.н. в гене GSTM1, полиморфных вариантов rs (g.48238837CA, ApaI) и rs1544410 (c.1024+283GA, BsmI) гена VDR, rs и rs3025039 гена VEGF, rs2243250 гена IL4, rs4778889 гена IL16 не выявил каких-либо статистически значимых результатов между пациентами с РП и контролем (р0.05).
Анализ ассоциаций полиморфных вариантов гена рецептора витамина D (VDR) с риском развития рака почки Проведен анализ четырех полиморфных вариантов rs2228570 (c.2TC, FokI), rs7975232 (g.48238837CA, ApaI), rs731236 (c.1056TG, TagI), rs (c.1024+283GA, BsmI) гена VDR с риском развития ПКК. В результате анализа обнаружено, что генотип FokI*T/T является маркером пониженного риска развития ПКК у населения РБ (2=5.36;
p=0.02;
OR=0.61 (CI95% 0.39-0.93), рис.
4). Рисунок 4. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов rs (c.2TC, FokI) и rs731236 (c.1056TG, TagI) гена VDR у больных раком почки и в контрольной группе При исследовании полиморфного варианта rs731236 (TaqI, c.1056GT), расположенного в экзоне 9 гена VDR, обнаружено, что частота генотипа TaqI*G/G в группе здоровых индивидов составляет 5.13%, в то время как в группе больных РП данный генотип встречается в 2 раза чаще (11.76%). Это свидетельствует о том, что генотип TaqI*G/G полиморфного локуса TaqI гена VDR является маркером повышенного риска развития ПКК (2=4.65;
p=0.03;
OR=2.47 (CI95% 1.07-5.77), рис. 4). Анализ неравновесия по сцеплению полиморфных вариантов rs1544410 (BsmI), rs7975232 (ApaI), rs731236 (TagI), rs2228570 (FokI) гена VDR обнаружил, что самое сильное неравновесие по сцеплению наблюдается для полиморфных локусов BsmI и TagI (D'=70%).
Полиморфный вариант rs2228570 (FokI) гена VDR оказался несцепленным с другими исследуемыми локусами (D'30%). Учитывая обнаруженные закономерности, мы провели гаплотипический анализ трех полиморфных вариантов TagI, ApaI и BsmI (rs731236, rs7975232 и rs1544410) гена VDR с использованием программы Haploview4.2. В результате анализа нами выявлены восемь гаплотипов, три из которых встречались с высокой частотой – это гаплотипы GCA (37%), GAA (24%) и TAG (21%) полиморфных вариантов TagI, ApaI, BsmI (rs731236, rs7975232 и rs1544410) гена VDR. У всех больных ПКК наиболее частым был гаплотип TCA (38%), наиболее редким – гаплотип GCG (1%) полиморфных вариантов TagI, ApaI, BsmI гена VDR. Сравнительный анализ распределения частот гаплотипов между контрольной группой и группой больных РП показал, что гаплотип TAG полиморфных вариантов TagI, ApaI, BsmI гена VDR является маркером повышенного риска развития ПКК (p=0.003, OR=1.74), тогда как гаплотипы TAA (p=0.013, OR=0.39) и GCG (p=1.9606e-5, OR=0.15) являются генетическими маркерами пониженного риска развития заболевания.
Таким образом, анализ полиморфных вариантов гена рецептора витамина D показал значимость исследованного гена в развитии заболевания.
Анализ ассоциаций полиморфных вариантов rs662 (c.530TC, p.Q192R) и rs854560 (c.163TA, p.L55M) гена параоксоназы-1 (PON1) с риском развития рака почки При анализе полиморфного варианта rs662 (c.530TC, p.Q192R) гена PON у пациентов с РП и в контроле обнаружено, что аллель rs662*T и генотип rs662*T/T полиморфного локуса rs662 гена PON1 являются маркерами повышенного риска развития РП как в целом (OR=1.49;
CI95% 1.07-2.08 и OR=3.23;
CI95% 1.40-7.65, соответственно, рис. 5), так и для женщин (OR=6.22;
CI95% 1.83-23.24 и OR=2.23;
CI95% 1.34-3.73, соответственно). Анализ у мужчин не выявил статистически значимых результатов (p0.05).
Рисунок 5. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта rs662 гена PON1 у больных ПКК и в контрольной группе Аналогичный сравнительный анализ по полиморфному варианту rs (c.163TA, p.L55M) гена PON1 позволил выявить статистически значимые результаты между больными РП женского пола и контролем. Частота аллеля rs854560*T у женщин, больных РП составляла 22.22%, в контрольной группе женщин данный показатель был выше (37.06%). Следовательно, аллель rs854560*T играет протективную роль в отношении развития РП у женщин (2=7.44;
p=0.007, OR=0.49 (CI95% 0.29-0.82)).
Анализ сцепления и гаплотипический анализ полиморфных вариантов rs662 и rs854560 гена PON1 обнаружил, что гаплотип rs662*T/rs854560*A полиморфных вариантов rs662 и rs854560 гена PON1 является маркером повышенного риска развития рака почки (OR=1.46 (CI95% 1.05-2.08)).
Исследование роли межгенных взаимодействий в формировании предрасположенности к почечно-клеточным карциномам В основе генетической предрасположенности к многофакторной патологии лежат сложные взаимодействия различных генетических факторов, которые необходимо учитывать при прогнозировании риска развития заболевания. Нами проведена оценка роли межгенных взаимодействий исследованных полиморфных локусов генов в определении риска развития РП.
При анализе больных РП русской этнической принадлежности и контроля оптимальной моделью межгенного взаимодействия, предрасполагающей к развитию РП у русских, оказалась комбинация из ДНК-локусов двух генов – интерлейкина 4 и интерлейкина 16 (rs2243250 (IL4)- rs4778889 (IL16)). Однако, вклад данных полиморфных вариантов оказался незначительным: для rs гена IL4 показатель энтропии составил 0.02%, а для локуса rs4778889 гена IL – 0.30%. В данной модели полиморфные варианты генов IL4 и IL16 действуют синергично. Сбалансированная точность модели составила 68.41%, чувствительность – 60.25%, специфичность – 76.57%, повторяемость – 10/10, OR=5.00 (CI95% 1.68-14.89). Выявлены статистически значимые сочетания генотипов полиморфных вариантов, входящих в состав модели. Сочетание генотипов rs4778889*T/T гена IL16 и rs2243250*T/C гена IL4 являлось маркером пониженного риска развития РП у русских (p=0.05;
OR=0.47 (CI95% 0.22-1.01)), тогда как сочетание генотипов rs4778889*T/C гена IL16 и rs2243250*T/C гена IL4 оказалось маркером повышенного риска развития РП в данной этнической группе (p=0.01;
OR=4.5 (CI95% 1.33-16.78)).
Анализ межгенных взаимодействий, предрасполагающих к развитию РП у татар выявил статистически значимую модель межгенного взаимодействия трех полиморфных вариантов генов IL4 и VDR (rs731236 (VDR)-rs2243250 (IL4) rs2228570 (VDR)). Установлено, что наибольший вклад в развитие РП у татар вносит полиморфный вариант rs731236 гена VDR, показатель энтропии которого составил 2.97%. Для полиморфных вариантов rs2243250 гена IL4 и rs2228570 гена VDR показатели энтропии были чуть ниже (2.80% и 1.81%, соответственно). Все три полиморфных локуса, входящих в состав модели, действуют синергично. Сбалансированная точность модели составила 80.48%, показатели чувствительности и специфичности – 87.71% и 73.24%, соответственно, повторяемость – 10/10. В данной модели статистически значимых сочетаний генотипов не обнаружено (p0.05).
В связи с небольшой выборкой больных РП и контрольной группы башкирской этнической принадлежности статистически значимых моделей межгенного взаимодействия для данной этнической группы не выявлено.
Таким образом, проведенный анализ межгенных взаимодействий позволил установить взаимосвязь между полиморфными вариантами изученных генов с риском развития рака почки в группе русских и татар. Наличие множества взаимосвязей между различными генами оказывают совокупное действие на развитие рака почки, что свидетельствует о необходимости их учета при прогнозировании заболевания.
ВЫВОДЫ 1. В опухолевой ткани больных раком почки обнаружены аллельные делеции на коротком плече хромосомы 3 в областях локализации генов-супрессоров опухолевого роста: 32.7% - делеции гена фон Хиппеля-Линдау (VHL), 32.1% гена Ras-ассоциированного белка семейства 1 (RASSF1), 29.9% - гена ломкой гистидиновой триады (FHIT). Аллельные делеции различной протяженности обнаружены в 49.1% первичных опухолей почки.
2. В гене фон Хиппеля-Линдау (VHL) выявлено 22 мутации в опухолевой ткани почки у 21.9% пациентов со светлоклеточным раком почки, 11 из которых идентифицированы впервые. Биаллельная инактивация гена фон Хиппеля Линдау (VHL) выявлена в 30.4% случаев светлоклеточного рака почки.
3. Метилирование CpG-островков промоторной области гена фон Хиппеля Линдау (VHL) выявлено в 3.8% случаев, гена ингибитора циклин-зависимой киназы (CDKN2A) – 20.9% случаев первичных опухолей почки.
4. Обнаружена ассоциация полиморфных вариантов генов рецептора витамина D (VDR, rs731236) и параоксоназы 1 (PON1, rs662) с развитием рака почки.
Генетическими маркерами повышенного риска развития рака почки для населения РБ являются генотип rs731236*G/G гена VDR, генотип rs662*T/T и аллель rs662*T гена PON1.
5. Маркерами повышенного риска развития рака почки являются гаплотип TA полиморфных локусов rs662 и rs854560 гена PON1 и гаплотип TAG полиморфных локусов rs731236, rs7975232 и rs1544410 гена VDR, маркерами пониженного риска – гаплотипы TAA и GCG полиморфных локусов rs731236, rs7975232 и rs1544410 гена VDR.
6. Показана роль межгенных взаимодействий в развитии рака почки: у русских – взаимодействие аллельных вариантов генов IL4 (rs2243259) и IL16 (rs4778889), у татар – аллельных вариантов генов IL4 (rs2243259) и VDR (rs22432250, rs731236).
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Мингазова, Л.Р. (Кутлыева Л.Р.). Исследование ассоциаций полиморфных вариантов генов GSTM1 и CYP1A1 с риском развития рака почки у жителей республики Башкортостан / Л.Р. Мингазова (Л.Р. Кутлыева), И.Р. Гилязова, Р.И.
Хусаинова, А.А. Измайлов, В.Т. Хамзин, В.Н. Павлов, Э.К. Хуснутдинова // Креативная хирургия и онкология. – 2010. – №4. – С. 35-37.
2. Павлов, В.Н. Молекулярно-генетические маркеры прогноза при почечно клеточной карциноме / В.Н. Павлов, Л.Р. Кутлыева, И.Р. Гилязова, А.А.
Загидуллин, А.Т. Мустафин, А.А. Халиуллин, Р.Р. Ямалитдинова, Е.А.
Климентова, Э.К. Хуснутдинова // Медицинский вестник Башкортостана. – 2011.
– №6. – С.185-191.
3. Кутлыева, Л.Р. Роль метилирования ДНК в развитии почечно-клеточных карцином / Л.Р. Кутлыева, И.Р. Гилязова, Р.И. Хусаинова, Э.К. Хуснутдинова // Экологическая генетика. – 2012. – Т.10, №3. – С. 60-77.
4. Кутлыева, Л.Р. Поиск изменений нуклеотидной последовательности в гене фон Хиппеля-Линдау и анализ аллельных делеций в генах-супрессорах опухолевого роста у больных светлоклеточным раком почки из Республики Башкортостан / Л.Р. Кутлыева,. И.Р. Гилязова, Р.И. Хусаинова, А.А. Загидуллин, А.А. Халиуллин, Е.А. Климентова, А.М. Шафигина, В.Н. Павлов, Э.К.
Хуснутдинова // Медицинская генетика. – 2012. – №12. – С.27-36.
5. Павлов, В.Н. Исследование роли межгенных взаимодействий в формировании предрасположенности к почечно-клеточной карциноме у жителей Республики Башкортостан / В.Н.Павлов, Л.Р. Кутлыева, И.Р. Гилязова, А.А.
Загидуллин, Р.И. Сафиуллин, А.А. Халиуллин, А.А. Измайлов, Е.А. Климентова, А.М. Шафигина, Э.К. Хуснутдинова // Медицинский вестник Башкортостана. – 2013. – Т.8, № 2. – С.193-197.
6. Mingazova, L.R. (Kutlyeva, L.R.). The analysis of somatic mutations of the VHL gene in clear cell renal carcinoma patients from Bashkortostan Republic of Russia / L.R. Mingazova (L.R. Kutlyeva), I.R. Gilyazova, R.I. Khusainova, V.N. Pavlov, A.A. Zagidullin, A.A. Khaliullin, A.A. Izmaylov, E.K. Khusnutdinova // ESHG. – Amsterdam. – 2011. – V.19. – P.233.
7. Мингазова, Л.Р. (Кутлыева Л.Р.). Исследование инактивации гена VHL у пациентов со светлоклеточной почечно-клеточной карциномой, проживающих на территории Республики Башкортостан (РБ) / Л.Р. Мингазова (Л.Р. Кутлыева), И.Р. Гилязова, Р.И. Хусаинова, В.Н. Павлов, А.А. Загидуллин, А.А. Халиуллин, Э.К. Хуснутдинова // Медицинская генетика. Материалы научной конференции «Актуальные проблемы онкогенетики». – Москва. – 2011. – №10. – С.15.
8. Мингазова, Л.Р. (Кутлыева, Л.Р.). Анализ мутаций в гене VHL у больных со светлоклеточным раком почки, проживающих на территории республики Башкортостан (РБ) / Л.Р. Мингазова (Л.Р. Кутлыева), И.Р. Гилязова, Р.И.
Хусаинова, В.Н. Павлов, А.А. Загидуллин, В.Т. Хамзин, А.А. Халиуллин, А.А.
Измайлов, Э.К. Хуснутдинова // Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии. Материалы II Всероссийской научно практической конференции с международным участием. – Курск. – 2011. – С.77 78.
9. Мингазова, Л.Р. (Кутлыева, Л.Р.). Поиск мутаций и анализ метилирования гена VHL у больных со светлоклеточным раком почки, проживающих на территории республики Башкортостан / Л.Р. Мингазова (Л.Р. Кутлыева), И.Р.
Гилязова, Р.И. Хусаинова, А.А. Измайлов, В.Т. Хамзин, В.Н. Павлов, Э.К.
Хуснутдинова // Биомика. II Всероссийская школа-конференция молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико химической биологии и биотехнологии. – Уфа. – 2011. – Т.1. – С. 78-79.
10. Kutlyeva, L. Vitamin D receptor polymorphisms and renal cancer risk in Bashkortostan Republic of Russia / L. Kutlyeva, I. Gilyazova, R. Khusainova, A.
Zagidullin, A. Khaliullin, E. Klimentova, A. Shafigina, V. Pavlov, E. Khusnutdinova // ESHG. – Nurnberg. – 2012. – P.195.
11. Кутлыева, Л.Р. Анализ потери гетерозиготности генов-супрессоров опухолевого роста у больных почечно-клеточной карциномой, проживающих на территории Республики Башкортостан (РБ) / Л.Р. Кутлыева, И.Р. Гилязова, Р.И.
Хусаинова, А.А. Загидуллин, А.А. Халиуллин, Е.А. Климентова, А.М.
Шафигина, В.Н. Павлов, Э.К. Хуснутдинова // Сибирский онкологический журнал. Приложение №1. Материалы конференции. – Томск. – 2012. – С.89-90.
12. Кутлыева, Л.Р. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов гена рецептора витамина D (VDR) с риском развития рака почки у жителей Республики Башкортостан / Л.Р. Кутлыева, И.Р. Гилязова, Р.И. Хусаинова, А.А. Загидуллин, А.А. Халиуллин, Е.А. Климентова, А.М. Шафигина, В.Н. Павлов, Э.К.
Хуснутдинова // Пренатальная диагностика и генетический паспорт – основа профилактической медицины в век нанотехнологий: Материалы V Всероссийской конференции с международным участием. – С.-Петербург. – 2012. – С.58.
13. Кутлыева, Л.Р. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов гена сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGF) с риском развития почечно клеточного рака у жителей Республики Башкортостан / Л.Р. Кутлыева, И.Р.
Гилязова, А.А. Загидуллин, А.А. Халиуллин, В.Н. Павлов, Э.К. Хуснутдинова // Материалы Российского онкологического конгресса. – Москва. – 2012. – С. 14. Кутлыева, Л.Р. Анализ ассоциации полиморфных вариантов Q192R и L55M гена параоксоназы-1 (PON1) с риском развития почечно-клеточного рака у жителей республики Башкортостан / Л.Р. Кутлыева, И.Р. Гилязова, Е.А.
Климентова, А.М. Шафигина, А.А. Загидуллин, А.А. Халиуллин, В.Н. Павлов, Э.К. Хуснутдинова//Актуальные проблемы генетики человека, животных, растений и микроорганизмов. Материалы Всероссийской школы-конференции молодых ученых. – Уфа.–2012.–С.81-85.
15. Кутлыева Л.Р. Анализ аллельного состояния ряда микросателлитных маркеров в локусах генов-супрессоров опухолевого роста VHL, RASSF1, FHIT, расположенных на хромосоме 3p / Л.Р. Кутлыева, И.Р. Гилязова, Р.И. Хусаинова, Е.А. Климентова, А.М. Шафигина, А.А. Загидуллин, А.А.Х алиуллин, В.Н.
Павлов, Э.К. Хуснутдинова // Биомика. – Уфа. – 2012. – T.3, №1. – C. 64-67.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ РП - рак почки ПКК - почечно-клеточная карцинома СРП - светлоклеточный рак почки РБ - республика Башкортостан ПГ - потеря гетерозиготности ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ПЦР - полимеразная цепная реакция - ген фон Хиппеля-Линдау VHL - ген фермента цитохрома Р450 семейства А CYP1A - ген глутатион-S-трансферазы М GSTM - ген интерлейкина IL - ген интерлейкина IL - ген рецептора витамина D VDR - ген ингибитора циклин-зависимых киназ 2A CDKN2A - ген белка, содержащего домен, гомологичный RASSF онкогену RAS семейства - ген ломкой гистидиновой триады FHIT - ген сосудисто-эндотелиального фактора роста VEGF OR (Odds Ratio) - соотношение шансов 95% CI - доверительный интервал (confidence interval)