Молекулярно-генетические аспекты в селекции и ранней диагностике лейкоза крупного рогатого скота 03. 00. 23. - биотехнология автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических н
На правах рукописи
КОВАЛЮК НАТАЛЬЯ ВИКТОРОВНА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ В СЕЛЕКЦИИ И РАННЕЙ ДИАГНОСТИКЕ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 03. 00. 23. - биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Дубровицы, Московская область – 2008 г.
2
Работа выполнена в лаборатории биотехнологии отдела разведения и генетики свиней ГНУ «Северо-Кавказский научно– исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук».
Научные консультанты:
доктор сельскохозяйственных наук, профессор, академик РАСХН Эрнст Лев Константинович;
доктор биологических наук, профессор, член корр. РАСХН Зиновьева Наталия Анатольевна.
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Калашникова Любовь Александровна;
доктор биологических наук, профессор Сулимова Галина Ефимовна;
доктор биологических наук, профессор Шихов Игорь Яковлевич.
Ведущая организация: Государственное образовательное учреж дение высшего профессионального образования «Кубанский госу дарственный университет».
Защита диссертации состоится «» ноября 2008 г., в 10 часов, на заседании совета по защите кандидатских и докторских диссер таций Д.006.013.01 при ГНУ «Всероссийский научно исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук».
Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, п. Дубровицы, ГНУ ВНИИЖ, т/факс (4967) 65-11-
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНУ ВНИИЖ
Автореферат разослан « » 2008 г.
Ученый секретарь совета, кандидат биологических наук В.П. Губанова 1.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Проблема широкого распространения лейкоза крупного рогатого скота является приоритетной для мо лочного животноводства России [М.И. Гулюкин, Г.А. Симонян, А.В.
Шишкин, 2004]. В настоящее время определены два пути повыше ния эффективности традиционных противолейкозных мероприя тий: разработка методов эффективной ранней диагностики [В.В.
Макаров, Д.П. Гринишин, 2005] и использование в селекционной практике признака устойчивости к персистентному лимфоцитозу [Г.Е. Сулимова, И.Г. Удина, Г.О. Шайхаев, И.А. Захаров, 1995].
Известно, что разные аллели гена BoLA DRB 3 играют не одина ковую роль в формировании устойчивости КРС к персистентному лимфоцитозу, вызываемому вирусом лейкоза КРС [H.A. Levin, M.C. Wu, J.A Steward, 1988;
M. J.T.Van Eijk, J.A. Stewart-Haynes, J.E. Beever, 1992;
А. Xu, М. J.T. Van Eijk., Ch. Park, 1993;
M.L.
Mirsky, H.A. Lewin, 1998]. Показано, что животные, несущие аллели *11,*23, *28 – устойчивые (У), не склонны к переходу лейкоза в стадию персистентного лимфоцитоза, а животные, несущие в своем генотипе аллели *22, *24,*16, *8 - чувствительные (Ч), напротив, чаще других оказываются в выборке гематологических больных.
Нейтральные (Н) аллели не ассоциируются ни с устойчивостью, ни с чувствительностью к персистентному лимфоцитозу.
Вместе с тем, внедрение новых подходов в практику требует проведения широкого спектра исследований, направленных на оценку их прикладной значимости, в частности, влияния на показа тели молочной продуктивности коров, возможности комплексного использования различных методов.
Цель и задачи исследований. Исходя из выше изложенной ак туальности, целью настоящей работы явилось изучение роли и ре зультативности применения молекулярно-генетических методов в ранней диагностике лейкоза крупного рогатого скота и в селекци онно-племенной работе для повышения резистентности и продук тивности крупного рогатого скота.
Для достижения цели работы были поставлены и решены сле дующие задачи:
разработать способ и схему эффективной ранней диагно стики вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) на основе использования ДНК-анализа;
усовершенствовать молекулярно-генетические модели ана лиза полиморфизма локуса BoLA DRB3 для массового тестирова ния животных;
установить частоты встречаемости полиморфных вариантов гена BoLA DRB3 у крупного рогатого скота различных пород;
изучить связь структуры гена BoLA DRB3 с показателями молочной продуктивности коров;
оценить экономическую эффективность применения отбора на основе использования маркера BoLA DRB3 в условиях про мышленной технологии производства молока.
Научная новизна исследований. Разработана система ДНК анализа, позволяющая выявлять телят-носителей ВЛКРС в раннем возрасте. Усовершенствован способ генотипирования крупного рогатого скота по локусу BoLA DRB3 (Патент РФ № «Способ определения генотипа крупного рогатого скота»). Впер вые установлена связь генотипа BoLA DRB3 с показателями мо лочной продуктивности коров, причем эта связь прослеживается независимо от наличия или отсутствия у коров носительства ВЛКРС. Разработан селекционно-генетический способ повышения продуктивности и устойчивости к заболеваниям крупного рогатого скота (Патент РФ № 2316207 «Селекционно-генетический способ создания высокопродуктивного и устойчивого к персистентному лимфоцитозу стада крупного рогатого скота»).
Практическая значимость и реализация результатов ис следований. С использованием системы ДНК-анализа, разрабо танной в ходе выполнения диссертационной работы, показана ре зультативность выявления в раннем возрасте телят-носителей ВЛКРС. На основе использования усовершенствованной методики массового скрининга стад по гену BoLA DRB3 разработана систе ма подбора быков-производителей, направленная на повышение в стаде доли животных, с высоким уровнем молочной продуктивно сти и генетически устойчивых к персистентному лимфоцитозу.
Данная система или ее отдельные элементы внедрены сегодня в хозяйствах Краснодарского края и Ростовской области.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
молекулярно генетический способ раннего выявления телят носителей ВЛКРС;
схема оздоровления стад от лейкоза, основанная на исполь зовании технологии ДНК-анализа;
усовершенствованная методика анализа полиморфизма гена BoLA DRB3, направленная на выявление аллелей «У», «Ч» и «Н» гена и пригодная для массового тестирования животных;
селекционно-генетический способ создания стад крупного рогатого скота с повышенной молочной продуктивностью и устой чивостью к персистентному лимфоцитозу.
Апробация результатов исследований. Материалы диссерта ции доложены и обсуждены на следующих конференциях.
III, IV, V,VI региональные научно-практические конферен ции молодых ученых: «Научное обеспечение агропромышленного комплекса». – Краснодар. - 2002-2006 гг.;
научно-практическая конференция: «Повышение конкурен тоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения». п. Быково Московской обл.- 2006 г.;
конференция грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «Юг России: Вклад фундаментальных исследований в развитие экономики Краснодар ского края». - Краснодар. – 2006 г. и других.
Материалы диссертации используются в учебном процессе ФГОУ ДПО «Краснодарский региональный институт агробизнеса».
Разработка «Селекционно-генетический способ создания высо копродуктивного и устойчивого к персистентному лимфоцитозу стада крупного рогатого скота» удостоена серебряной медали на VII Московском международном салоне инноваций и инвестиций в 2007 г.
Публикации результатов исследований. Материалы диссер тации опубликованы в 32 научных работах, все по теме диссерта ции, в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК РФ: «Вестник РАСХН», «Ветеринария», «Зоотехния», «Молочное и мясное ско товодство» - 7 работ. Приоритет исследований подтверждн двумя патентами Российской Федерации (№ 2316207, № 2287587).
Структура и объм работы. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Мате риал и методы проведения исследования», «Собственные исследо вания», «Обсуждение результатов», «Выводы», «Рекомендации производству», «Список использованной литературы». Работа из ложена на 174 страницах машинописного текста, содержит 32 таб лицы и 25 иллюстраций. Список литературы включает 289 работ, в том числе 108 зарубежных авторов.
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Работа выполнена в период с 2000 по 2008 гг. в лаборатории биотехнологии отдела разведения и генетики свиней Северо Кавказского научно-исследовательского института животноводства Россельхозакадемии в соответствии с государственной тематикой (№ 06.01.01.02 государственной регистрации) при поддержке Рос сийского фонда фундаментальных исследований (проект № 06-04 96688). Исследования проводили по схеме, представленной на ри сунке 1.
Всего проанализировано 2977 образцов крови и 220 образцов спермы животных голштино-фризской, айрширской и красной степной пород, отобранных в 15 хозяйствах Краснодарского края и областных племпредприятиях. Забор крови проводился с использо ванием одноразового инструмента;
в качестве антикоагулянта ис пользовался 1,5 М цитрат натрия или ЭДТА. Образцы спермы по ступали на анализ в виде гранул, пайет или в высушенном на фильтровальной бумаге виде.
Для выделения ДНК из различных биологических жидкостей, постановки ПЦР, ПДРФ-анализа, электрофореза использовали стандартные методики с собственными модификациями [М. J. T.
Van Eijk, J. A. Stewart-Haynes, H. A. Levin,1992;
А. Xu, М. J.T. Van Eijk., Ch. Park, 1993;
С. Херрингтон и др., 1999].
Усовершенствование системы ПЦР/ПДРФ анализов для мас сового тестирования животных Выявление частот встречаемости аллелей и генотипов локуса Разработка схемы ранней BoLA DRB3 у животных различных хозяйств (n=823) диагностики ВЛКРС Выявление Сравнительное Ежемесячное тестиро «Суворова», «Племзавод Племзавод «Дружба», наличия тестирование вание матерей и телят «Кубань», «СКВО», «Бейсуг» ВЛКРС в животных мето- в возрасте до 6 мес. на ЗАОСС (n=417) (n=117) (n=121) «Нива» (n=60) (n=48) (n=60) СЗАО ОАО АФП молозиве дами РИД и ПЦР наличие ВЛКРС ОАО ЗАО (n=10) (n= 1563) (n=110) Определение связи между генотипами локуса BoLA DRB3 Выявление распределения генотипов по локусу BoLA и показателями молочной продуктивностью коров (n=356) DRB 3 у выбракованных животных ( n=102) Разработка схемы индивидуального подбора Тестирование быков - производителей по локусу с целью повышения частот встречаемости BoLA DRB3 (n= 220) «желательных» генотипов Разработка селекционно-генетического способа повышения Тестирование группы телят, полученных продуктивности и устойчивости к заболеваниям с использованием заказного подбора крупного рогатого скота (n=80) Рис. 1. Схема исследований.
Для определения наличия провирусной ДНК лейкоза крупного рогатого скота использовали наборы фирмы «Изоген» (г. Москва).
В состав набора входят праймеры, позволяющие амлифицировать участок гена gag размером 347 пн (рис. 2).
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 –К +К 123 347 пн Рис. 2. Выявление провирусной ДНК лейкоза крупного рогато го скота методом ПЦР. –К – отрицательный контроль, +К - поло жительный контроль амплификации.
Разработку селекционно-генетического способа создания вы сокопродуктивного и устойчивого к персистентному лимфоцитозу стада крупного рогатого скота проводили совместно с директором ООО НПСХП «Астер» Сацуком В.Ф.
Статистическую обработку результатов проводили по стан дартным методикам [Меркурьева Е.А. и др., 1991] с использовани ем программного обеспечения MS Excel.
Для упрощения математической обработки результатов была разработана программа расчета частот встречаемости генотипов в выборке и характеристик продуктивности на основе шаблона MS Excel. Программа позволяет автоматически определять частоту встречаемости генотипов и отдельных аллелей, сортировать жи вотных по генотипам, определять средние показатели молочной продуктивности в группе и степень достоверности различий.
При анализе экономической эффективности внедрения моле кулярно-генетических методов рассчитывали рентабельность, ис пользуя формулу Р = (ОВ – ОЗ) / ОЗ * 100%, где Р – рентабель ность, ОВ – общая выручка, ОЗ – общие затраты).
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Разработка способа и схемы ранней диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) на основе использо вания ДНК-анализа и оценка ее результативности На основании проведенного анализа работы по оздоровлению от лейкоза ряда хозяйств Краснодарского края, в том числе (ОАО «Племзавод им. В.И. Чапаева», ООО СК «Октябрь», АПФ «Нива») нами были намечены научные приоритеты, сделан ряд общих вы водов и определен спектр экспериментальных исследований, на правленных на разработку, научное обоснование и эксперимен тальное подтверждение общей схемы оздоровления стад крупного рогатого скота от лейкоза.
Показано, что одним из основных условий успешного оздо ровления стад от лейкоза является необходимость использования обслуживающим персоналом одноразового ветеринарно зоотехнического инструмента, что позволяет предотвратить воз можность инфицирования здоровых животных. Вторым обязатель ным требованием является наличие возможности пространственно го разделения здоровых и больных животных, выпойка телят тер мически обработанным молоком. Только при выполнении этих ус ловий применение различных методов диагностики ВЛКРС являет ся результативным.
Исследование 1563 образцов крови на наличие провирусной ДНК ВЛКРС, проведенное в рамках выполнения диссертационной работы, показало идентичность результатов, полученных с помо щью реакции иммунной диффузии (РИД) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) в интервале от 30 до 100% случаев. Анализ данных собственных исследований в контексте с результатами исследова ний других авторов показывает, что наблюдаемое в ряде случаев несовпадение результатов РИД и ПЦР не является указанием на некомпетентность какого-либо из двух методов анализа, а является следствием различных методических приемов определения носите лей ВЛКРС. Если РИД-диагностика ориентирована на выявление антител к ВЛКРС, то есть затрагивает реакцию организма в ответ на наличие ВЛКРС, то ДНК-диагностика позволяет выявлять соб ственную провирусную ДНК ВЛКРС вне зависимости от реакции организма на инфекцию. Из литературных данных известно, что лейкоз – это хроническое заболевание с волнообразным течением, во время развития которого у одного и того же животного может подниматься и снижаться уровень антител, количество лимфоци тов, исчезать и появляться вирусная РНК, количественно меняться уровень провирусной ДНК. В этой связи, точность диагностики вирусоносителей определяется не только методом исследований, но и зависит от периода развития заболевания. Сопутствующие за болевания, стельность могут так же оказывать влияние на резуль таты РИД исследований. Таким образом, полученные нами данные показывают, что каждый из используемых методов анализа (РИД и ДНК-анализ) имеет свои преимущества и недостатки. Исходя из изложенного выше, становится понятным, что для результативной диагностики взрослых животных необходимо комбинировать раз личные методы анализа, подбирать оптимальный период отбора образцов, то есть работать индивидуально с каждым животным, что в условиях современного производства достаточно сложно и, в большинстве случаев, невыполнимо.
В этой связи, нами предложена схема, основанная на исполь зовании технологии ДНК-анализа и направленная на ранее выявле ние и отделение от основного стада телят-носителей ВЛКРС. Ис пользование данной схемы особенно актуально в том случае, если в стаде высок процент инфицированных животных. Так как ис пользуемая нами технология ДНК-анализа обеспечивает выявление непосредственно провируса, результаты анализа не зависят от воз раста и состояния животного. Нами установлено, что процент ин фицированных телят в возрасте 3-4 месяцев (по данным ДНК анализа) практически соответствует проценту РИД-позитивных животных того же хозяйства, но в более позднем возрасте, что по зволяет предположить, что заражение животных происходит в воз расте до трех месяцев.
С целью определения времени и возможного способа инфици рования был проведн анализ глубокостельных коров в хозяйствах ОАО «Племзавод им. В.И.Чапаева» (n=27) и АПФ «Нива» (n=27), которые по результатам РИД являлись носителями ВЛКРС. В мо мент отла у матери и телнка были отобраны пробы крови, кото рые исследовали с использованием ПЦР. Процедуру повторяли ка ждые полтора месяца до достижения телятами возраста 6 месяцев.
Последнее ПЦР исследование совмещали с плановым серологиче ским исследованием. Телята до двух месяцев содержались в инди видуальных домиках, при всех зооветеринарных манипуляциях применялся только одноразовый инструмент. Результаты анализа обобщены в таблице 1.
Таблица Динамика выявления провирусной ДНК ВЛКРС у телят в зависимости от возраста Доля телят-носителей ВЛКРС % ДНК-анализ (ПЦР) РИД Хозяйство при 1,5 3 4, 6 мес.
рождении мес. мес. мес.
ОАО «Племзавод 0 3,7 3,7 3,7 3,7 3, им.В.И. Чапаева» АПФ «Нива» 0 7,4 7,4 7,4 7,4 7, Как показано в таблице 1, исследование телят при рождении не выявило ни одного носителя провирусной ДНК ВЛКРС. Вирусоно сители в каждом из хозяйств появились по результатам второго исследования (3,7-7,4%), проведенного в возрасте 1,5 мес. Иссле дование проб молозива (n=10), полученного от носителей ВЛКРС (по данным ПЦР анализа) не выявило наличия провирусной ДНК ВЛКРС, несмотря на присутствие ее в крови коров. Результаты проведенного анализа показывают отсутствие в молозиве прови русной формы ВЛКРС (в количествах, достаточных для определе ния методом ПЦР), однако не исключают наличие в молозиве РНК формы ВЛКРС. Исследования, проведнные в возрасте 3- и 4,5-х месяцев подтвердили полученные ранее результаты. Новых инфи цированных животных в эти периоды выявлено не было. Исследо вание всей выборки телят в возрасте 6-и месяцев методом РИД по казало полное совпадение результатов анализа, полученных обои ми методами: РИД-анализ дал положительный результат только у ПЦР-положительных телят.
Важная роль соблюдения зооветеринарных мероприятий в оз доровлении стад от лейкоза была нами продемонстрирована при исследовании телят ООО СК «Октябрь» Калининского района (n=80), где были выявлены нарушения режима асептики при зоове теринарных манипуляциях, инфицированные и здоровые животные контактировали друг с другом. Исследование, проведенное в воз расте 3-х месяцев, показало наличие провирусной ДНК ВЛКРС у 8 и телят (10%). Повторное ДНК-исследование, проведнное в воз расте 6-и месяцев, показало наличие ещ 16 носителей ВЛКРС (+20%). Плановое РИД-исследование в возрасте 6-и месяцев пол ностью подтвердило данные ПЦР.
Таким образом, установлено, что ДНК-анализ, основанный на использовании метода ПЦР, позволяет выявлять инфицированных животных в возрасте 1,5 месяцев, а, следовательно, дат возмож ность разделять телят на здоровых и вирусоносителей до 2-х месячного возраста. При содержании телят в индивидуальных домиках анализ и разделение телят необходимо проводить до объе динения их в группы, что значительно снизит риск распростране ния инфекции. Предлагаемая нами схема оздоровления стад от лейкоза с описанием мероприятий, сроков и порядка их реализации представлена в таблице 2.
Важным аспектом ДНК-диагностики ВЛКРС является иссле дование импортного скота с целью предотвращения завоза ВЛКРС.
Применение ДНК-диагностики эффективно и на последних этапах оздоровления стад. Комбинированное применение ДНК-анализа с другими методами снижает риск ложноотрицательных результатов, то есть не выявления скрытого вирусоносителя, и, следовательно, избавляет от необходимости возврата к проблеме через некоторое время. Таким образом, ДНК-диагностика, основанная на методе ПЦР, - один из инструментов, позволяющих решать проблему оз доровления стад от лейкоза на качественно новом уровне.
Таблица Схема реализации оздоровительных мероприятий с использованием ПЦР – диагностики у телят Этап Срок и порядок реализации Формирование группы те- При достижении животными воз лочек (возраст 1,5-2 мес.) раста 1,5 месяцев взятие крови специалистами хозяйства и дос тавка в лабораторию в шприцах типа «Моновет» с ЭДТА или цит ратом в качестве консерванта.
Срок реализации – по мере форми рования группы от 50 голов.
ДНК-диагностика (диагно- Реализуется в специализированной стика методом ПЦР) лаборатории Формирование группы Производится специалистами хо ПЦР-отрицательных живот- зяйства по результатам анализов ных. Удаление ПЦР положительных телочек на откорм или на другую фер му РИД-диагностика в группе Реализуется специалистами хозяй ПЦР-отрицательных тело- ства чек с целью окончательного разделения групп инфици рованных и здоровых жи вотных (возраст 5-6 месяцев) 3.2. Усовершенствование способа ДНК-анализа, основан ного на ПЦР-ПДРФ, для массового тестирования животных В рамках выполнения диссертационной работы нами усовер шенствован способ генотипирования животных по локусу BoLA DRB3, предусматривающий амплификацию фрагмента гена разме ром 284 пн с использованием праймеров HLO30 и HLO32, гидро лиз продуктов ПЦР рестриктазами RsaI, HaeIII, BstYI и специаль но подобранной для массового тестирования животных эндонук леазой рестрикции Bst2UI (рис. 3, 4).
А В 1 2 3 4 5 6 7 8 Рис. 3. Электрофорез в 12% полиакриламидном геле продуктов ам плификации экзона 2 гена BoLA DRB3 после рестрикции BstYI, RsaI, HaeIII. А – ДНК от животного с генотипом BoLA DRB3 11*3: 1. Кон трольный нерестрицированный продукт амплификации;
2. Продукт ам плификации, рестрицированный рестриктазой BstY I;
3. Продукт ампли фикации, рестрицированный рестриктазой Rsa I;
4. Продукт амплифи кации, рестрицированный рестриктазой Hae III;
5. Маркер молекулярной массы (шаг маркера 50 пн). В – ДНК от животного с генотипом BoLA DRB3 22*22: 6. Контрольный нерестрицированный продукт амплифика ции;
7. Продукт амплификации, рестрицированный рестриктазой BstY I;
8. Продукт амплификации, рестрицированный рестриктазой Rsa I;
9.
Продукт амплификации, рестрицированный рестриктазой Hae III.
1 2 3 4 5 6 7 8 Рис. 4. Электрофорез в 12% полиакриламидном геле продук тов амплификации экзона 2 гена BoLA DRB3 после рестрикции эндонуклеазой Bst2UI. 1, 3, 4, 6, 8 - Bst2UI –паттерны d/f (205, 124,79, 57, 24 пн);
5 - Bst2UI –паттерны d/а (205, 111, 79, 57, 24 пн);
2 Bst2UI –паттерны b/f (180, 80, 124, 79, 57, 24 пн);
7.- Bst2UI –паттерны d/b 9 (205, 180, 79, 24 пн);
9 – маркер молекулярных весов (длины фраг ментов ДНК: 8;
11;
18;
21;
51;
57;
64;
80;
89;
104;
123;
124;
184;
192;
213;
234;
267;
434;
458;
502;
540;
587).
Анализ рестрикционной картины позволяет определить гено тип животного по локусу BoLA DRB3, который записывали в виде номеров аллелей, входящих в генотип, например, 22*11 или 16*24.
3.3. Характеристика генетической структуры стад крупно го рогатого скота различных пород по локусу BoLA DRB 3.
Установлено, что распределение частот встречаемости аллелей и генотипов локуса BoLA DRB3 зависит от породной принадлеж ности животных (табл. 3). Так, в профиле скота голштинской по роды преобладают Ч-аллели, обуславливающие чувствительность (СЗАО «СКВО», ОАО «Племзавод «Кубань»);
в профиле красной степной породы (ЗАОСС «Племзавод «Бейсуг») - У- (устойчивые) и Н- (нейтральные) аллели без акцентов на отдельные разновидно сти, у айрширской (АПФ «Нива») – Н-аллели, причм с ярко вы раженной тенденцией к доминированию отдельно взятых аллелей (BoLA DRB3 *7 и *21). Как показано в таблице 3, у исследованных нами животных найдено 30 различных аллелей гена BoLA DRB3.
Сопоставление эмпирических и теоретических частот показало вы сокую степень достоверности наблюдаемых между ними различий.
Очевидно, что существует фактор или факторы, обуславливающие отклонение фактических частот от теоретически ожидаемых при случайном спаривании. Логично предположить, что подобное смещение вызвано давлением отбора на тот или иной признак. Для каждой из пород вектор искусственного отбора был направлен на разные качества. Так, у голштинского скота основным направлени ем селекции является увеличение количественных показателей мо лочной продуктивности. К факторам, оказывающим давление на эволюцию красной степной породы, относится, кроме того, необ ходимость адаптации к неблагоприятным условиям содержания и кормления. Наименьшие различия в фактических и расчетных зна чениях частот встречаемости аллелей наблюдались у коров айр ширской породы, основное селекционное давление в которой было направлено на улучшение качественных показателей молока. Од ной из причин этого, на наш взгляд, является элиминация значи тельного числа аллелей BoLA DRB3 у животных данной породы.
Таблица Распределение генотипов по локусу BoLA DRB 3 у животных различных хозяйств Частота встречаемости генотипов (n=823), % красная айршир Генотип по голштинская помесные животные степная ская локусу BoLA DRB3 СЗАО ОАО «ПЗ ЗАО ПЗ АПФ ЗАО ЗАО «Суво СКВО» «Кубань» «Бейсуг» «Нива» «Дружба» рова» (n=117) (n=417) (n=60) (n=60) (n=48) (n=121) 4,3 0,4 - 0, 8*8 8,3 1,7 2,5 2,1 8*16 1,7 2,6 1,9 - 8*22 - Ч/Ч генотипы 3,4 2,3 2,1 1, 8*24 - 1,7 4,1 - 16*16 3,3 0,9 8,2 2,1 0, 16*22 - 2,6 7,5 - 16*24 - 3,4 8,2 4,2 0, 22*24 - 4,3 4,9 6,3 22*22 - 1,7 1,9 - 5, 24*24 1,7 Всего 41,9 16,8 9, 26,6 15,0 0, 1,7 0,8 7,8 - 1, 11*8 1,7 1,9 4,2 11*16 1,7 - 1,5 - 11*22 - 0,9 1,9 4,2 3, 11*24 1,7 Ч/У генотипы 3,4 0,8 - 3, 23*8 1,7 1,7 1,9 - 23*16 1,7 1,7 4,5 - 23*22 - 4,3 5,2 - 4, 23*24 1,7 0,9 0,4 - 28*8 - 1, 0,9 1,1 - 28*16 - - 0,4 - 0, 28*22 - 1, - - - 3, 28*24 1,7 Всего 17,2 20,4 18,0 3,4 8,4 16, 1,7 - - 2, 11*11 6,3 У/У генотипы 1,7 0,8 1,7 - 2,1 1, 11* 0,9 - 2,1 1, 11*28 - 1,7 1,1 - - - 23* - - - 1,7 - 28* Всего 6,0 1,9 8,0 1,7 4,2 4, Ч/Н 28,7 25,4 15,0 20,7 35,0 24, Н/Н 13,4 4,6 23,0 55,2 18,8 29, Н/У 8,1 5,8 21,0 19,0 16,8 16, Анализ распределения аллелей и генотипов позволил пред положить, что определенные аллели локуса BoLA DRB3 маркиру ют различные хозяйственно-ценные признаки молочного скота.
Для проверки данного предположения нами проанализированы показатели молочной продуктивности по законченной первой лак тации у животных ЗАО «Дружба», ЗАО «СКВО» и ЗАОСС «Плем завод «Бейсуг», разбитых на группы в зависимости от генотипа по локусу BoLA DRB3: Ч/Ч, Ч/У, Ч/Н, Н/У, Н/Н и У/У (табл. 4).
Таблица Удой коров за 305 дней лактации в зависимости от генотипа по локусу BoLA DRB Генотип по BoLA DRB Хозяйство Показатели У/У Ч/У Н/У Н/Н Ч/Ч Ч/Н частота встре 4,2 8,4 16,8 18,8 16,8 35, чаемости, % ЗАО удой, кг 5547 7248 6087 6108 6105* 5960* «Дружба» M±m ±550 ±270 ±240 ±360 ±300 ± (n= 48) удой в среднем, кг частота встре 6,0 17,2 8,1 13,4 26,6 28, чаемости, % ЗАО «СКВО» Ростовской удой, кг 6183* 7926 7096 6963* 7013 области M±m ±425 ±246 ±260 ±478 ±256 ± (n= 117) удой в среднем, кг частота встре 8,0 18,0 21,0 23,0 15,0 15, чаемости, % ЗАОСС «Плем удой, кг 5730* 6169 5885 5916 5867 5789* завод «Бейсуг» M±m ±142 ±124 ±185 ±162 ±214 ± (n= 60) удой в среднем, кг Примечание: здесь и далее: *p0,05;
**p0,01;
***p0,001. Разница определена в сравнении с группой Ч/У Более детальные исследования влияния генотипов BoLA DRB проведены в ОАО «Племзавод «Кубань». Выборка была представ лена 356 коровами, молочную продуктивность которых по первой лактации оценивали по 3244 контрольным дойкам (табл. 5).
Таблица Показатели молочной продуктивности коров ОАО «Племзавод «Кубань» в зависимости от генотипа по локусу BoLA DRB Генотип по локусу BoLA DRB3 Ито Показатели го Ч\Н Ч\Ч Ч\У У\Н У\У Н\Н Число животных 118 122 70 25 6 15 Число измерений 748 1376 649 254 70 147 *** *** *** Среднесуточный 23,9± 24,3± 25,3± 23,5± 24,9± 24,5± 24,5± удой, кг (M±m) 0,15 0,09 0,14 0,24 0,30 0,28 0, Содержание жира, 3,51± 3,50± 3,43± 3,51± 3,50± 3,51± 3,5± % (M±m) 0,13 0,12 0,12 0,14 0,15 0,14 0, Содержание 3,01± 3,02± 3,01± 3,03± 3,00± 3,01± 3,01± белка, г\л (M±m) 0,10 0,09 0,10 0,10 0,10 0,10 0, Содержание 4,50± 4,51± 4,50± 4,51± 4,50± 4,51± 4,5± лактозы, г\л (M±m) 0,03 0,02 0,03 0,02 0,03 0,03 0, Содержание сухого 11,8± 12,0± 11,7± 11,9± 11,8± 11,7± 11,8± вещества, г\л 0,3 0,1 0,2 0,3 0,3 0,2 0, (M±m) Удой за 305 дн лак 7289 7411 7716 7167 7594 7472 тации, кг Из данных таблиц 4 и 5 следует, что уровень удоя коров с ге нотипом Ч/Н в разных хозяйствах оказался одним из самых низких, а у коров с генотипом Ч/У и Ч/Ч - как правило, выше, по сравне нию с другими группами. Важным фактором является отсутствие статистически достоверных отличий между группами по содержа нию жира, белка и лактозы в молоке изученных животных.
Результаты анализа распределения генотипов выбракованных по состоянию здоровья животных в хозяйствах ОАО «Племзавод «Кубань» и СЗАО «СКВО» обобщены в таблице 6. Отмечается увеличение среди выбракованных коров доли животных с геноти пами Ч/Ч и Ч/Н по сравнению с распределением генотипов по группе в целом (табл. 6).
Таблица Распределение генотипов локуса BoLA DRB3 у коров, выбракованных по состоянию здоровья Частота встречаемости генотипа, % Хозяйство Распределение У/У Ч/У У/Н Н/Н Ч/Ч Ч/Н в целом по иссле дуемой группе 1,9 20,4 5,8 4,6 41,9 25, (n=266) ОАО среди выбракован- 3,1 12,3 4,6 10,8 40,0 29, «Племзавод ных (n= 65) «Кубань» среди выбракован- 2,1 6,2 4,2 8,3 45,9 33, ных, без учта трав мированных (n= 48) в целом по иссле дуемой группе 6,0 17,2 8,1 13,4 26,6 28, СЗАО (n=117) «СКВО» среди выбракован- 5,4 13,5 8,1 8,1 27,0 37, ных (n= 37) Таким образом, нами впервые установлена связь генотипов BoLA DRB3 и уровня удоя коров, причем эта связь прослеживается независимо от наличия или отсутствия у коров ВЛКРС. Для селек ционной практики установленная закономерность важна как воз можность моделирования последующих поколений животных с высокой частотой встречаемости «желательного» генотипа.
3.4. Разработка селекционно-генетического способа созда ния высокопродуктивного и устойчивого к персистентному лимфоцитозу стада крупного рогатого скота Нами была поставлена задача - найти путь повышения устой чивости стад крупного рогатого скота к персистентному лимфоци тозу и другим заболеваниям с одновременным повышением их продуктивности. С этой целью нами предложен селекционно генетический способ создания высокопродуктивного и устойчиво го к персистентному лимфоцитозу стада крупного рогатого скота (Патент РФ на изобретение № 2316207).
Разработанный способ предусматривает проведение на первом этапе ДНК-тестирования маточного поголовья и быков производителей по гену BoLA DRB3 с использованием разрабо танной в ходе выполнения диссертационной работы системы мас сового анализа.
На втором этапе животные распределяются по группам с раз личной чувствительностью к персистентному лимфоцитозу: с гено типом, включающим два аллеля, обуславливающих чувствитель ность (Ч/Ч);
с генотипом, включающим два аллеля, обуславли вающих устойчивость (У/У);
с генотипом, включающим один ал лель, обуславливающий чувствительность, а другой – устойчивость (Ч/У);
с генотипом, включающим два нейтральных аллеля (Н/Н);
с генотипом, включающим один аллель, обуславливающий чувст вительность, а другой – нейтральный (Ч/Н);
с генотипом, вклю чающим один аллель, обуславливающий устойчивость, а другой – нейтральный (У/Н).
На третьем этапе проводится подбор родительских пар таким образом, чтобы обеспечить в потомстве максимальное насыщение стада генотипами Ч/У. При этом У-аллель в генотипе выполняет функцию защиты от развития персистентного лимфоцитоза и ряда других заболеваний, а Ч-аллель является маркером высокой про дуктивности.
Изложенная выше система подбора и закрепления в той или иной степени применяется сегодня в 60 хозяйствах Краснодарского края и Ростовской области, которые приобретают сперму быков производителей в ООО НПСХП «Астер». Обязательным условием осуществления указанного способа является генетический анализ достаточного количества быков-производителей. Необходимо от метить, что такой подход не противоречит существующим прин ципам подбора быков-производителей, а лишь вводит дополни тельный критерий подбора.
С целью оценки генетического потенциала устойчивости к персистентному лимфоцитозу нами проведено генотипирование по гену BoLA DRB3 быков-производителей голштинской и айршир ской пород (n=220), используемых в системе искусственного осе менения Краснодарского края (табл. 7).
Таблица Частоты встречаемости генотипов BoLA DRB3 у быков производителей голштинской и айрширской пород (n=220), % Частоты встречаемости генотипов, % Группы быков У/У Ч/У У/Н Н/Н Ч/Ч Ч/Н Голштинская порода (n=142) Всего 4 17 6 6 38 Черно-пестрые (n=107) 4 16 3 6 41 Красно-пестрые (n=35) 3 20 14 9 26 Племпредприятия (голштинская порода) ОАО ЦСИО (n=76) 5 16 7 8 30 ОАО Московское (n=46) 2 15 4 4 55 ОАО Краснодарское - 25 5 5 30 (n=20) Линии быков голштинской породы Рефлекшн Соверинга - 14 - 8 39 (n=38) Уес Идеала (n=44) 2 16 5 5 47 Монтвик 10 25 5 5 40 Чифтейна (n=21) Айрширская порода (n=78) - 5 7 63 4 Как показано в таблице 7, у голштинских быков производителей преобладают генотипы Ч/Ч и Ч/Н (67%), в то вре мя как а у айрширских - генотипы Н/Н и Ч/Н (84%). Частота встречаемости У-аллелей по породам составляет, соответственно, 15,5% и 6,0%, что в свою очередь определяет ослабленный иммун ный ответ большинства животных обеих пород на стресс-факторы и болезни, а в случае инфицированности ВЛКРС – способствуют наступлению гематологической (клинической) стадии этого ин фекционного заболевания. Сравнивая голштинских быков черно пестрой и красно-пестрой масти, можно отметить у последних не которые положительные тенденции в плане снижения частоты встречаемости генотипов, несущих ослабленный иммунный ответ (до 54%). Различия между племпредприятиями по частоте встре чаемости генотипов невелики.
Из изученных линий по голштинской породе наиболее низкая частота втречаемости У-аллелей отмечена в линии Рефлекшен Со веринга (7%). Наиболее насыщена У-аллелями линия Монтвик Чифтейна (25%). Линия Уес Идеала занимает промежуточное по ложение (12,5%). Очевидно, что как линейное разведение, так и межлинейное кроссирование не в состоянии обеспечить частоту встречаемости У-аллелей выше 25% (15,5% в целом по породе).
Расчты показывают, что при увеличении среди быков или коров доли Ч-аллелей, а это, возможно, будет происходить при после дующей селекции на молочную продуктивность, в потомстве будет нарастать количество генотипов Ч\Ч. Это в большей степени каса ется импортных животных, отбор которых ведтся на фоне благо приятных условий внешней среды.
3.5. Практическая апробация селекционно-генетического способа создания высокопродуктивного и устойчивого к перси стентному лимфоцитозу стада крупного рогатого скота.
Практическую апробацию селекционно-генетического способа создания высокопродуктивного и устойчивого к персистентному лимфоцитозу стада крупного рогатого скота осуществляли в ОАО «Племзавод «Кубань»» Усть-Лабинского района. С этой целью бы ло протестировано 417 коров и телок. Характерно преобладание в выборке чувствительных аллелей BoLA DRB3. В структуре Ч аллелей преобладают *22 (21,4%), *16 (19,3%) и *24 (17,1%). У аллели представлены, в основном, *23 (9,9%) и *11 (4,1%).
Анализ выборки подтвердил выявленную ранее закономер ность, что различные генетические группы (Ч/Ч, Ч/У, Ч/Н, У/У, У/Н, Н/Н) отличаются по своей продуктивности. Животные группы Ч/У с высокой степенью достоверности (Р0,001) превосходили животных Ч/Н, Н/У, Ч/У групп по показателям среднесуточного удоя на 1,0-1,8 кг. При этом содержание жира и белка в молоке жи вотных изученных групп достоверно не отличалось.
Нами применена схема индивидуального подбора, согласно которой закрепление производителей было направлено на получе ние в потомстве максимального числа животных с генотипом Ч/У.
Так, например, для коров с генотипами Ч/Ч, Н/Н, Ч/Н подобраны быки с генотипами У/У, для коров с генотипами У/У, У/Н, Ч/У быки с генотипами Ч/Ч. Исходя из частот встречаемости генотипов у матерей, следовало ожидать следующее распределение частот встречаемости генотипов: Ч/У – 69,5%, Ч/Ч – 10,0%, Ч/Н – 3,0% и У/Н – 17,5%.
Результаты распределения генотипов BoLA DRB3 у дочерей, полученных от проведенного нами подбора, обобщены в таблице 8.
Таблица Частоты встречаемости аллелей и генотипов локуса BoLA DRB3 у матерей и дочерей, полученных от подбора с учетом генотипа по данному гену Частота встречаемости у матерей (n=80) аллелей, % генотипов, % Ч У Н У/У Ч/У У/Н Н/Н Ч/Ч Ч/Н 68,2 13,6 18,2 - 25,0 2,3 2,3 40,9 29, Частота встречаемости у дочерей (n=80) аллелей, % генотипов, % Ч У Н У/У Ч/У У/Н Н/Н Ч/Ч Ч/Н 43,5 44,6 11,9 - 63,1 23,9 - 13,0 Как показано в таблице 8, частоты встречаемости генотипов несколько отличаются от частот, полученных при тестировании выборки в целом. Однако очевидно, что у дочерей, полученных от подборов с учетом генотипа по локусу BoLA DRB3, произошло значительное увеличение частот встречаемости аллелей, ассоции рованных с устойчивостью к персистентному лимфоцитозу за счет сокращения количества чувствительных и нейтральных аллелей.
На 38,1 % выросла частота встречаемости «желательного» в хозяй ственном отношении генотипа Ч/У. Увеличение числа животных с генотипом Н/У – явление нежелательное в плане молочной продук тивности, но в данном случае мы сознательно произвели закрепле ние таким образом, чтобы повысить резистентность животных в новом поколении. Расчеты показывают, что при подобном подборе от коров следующего поколения можно получить за лактацию на 122 кг молока больше при сохранении условий содержания и кормления.
Таким образом, нами разработан механизм, позволяющий управлять свойствами той или иной группы животных в зависимо сти от поставленной задачи – повышения молочной продуктивно сти и резистентности к заболеваниям.
3.6. Экономическая эффективность применения молеку лярно-генетических методов в молочном животноводстве Результаты ожидаемого экономического эффекта от примене ния молекулярно-генетических методов, разработанных в рамках диссертационной работы, в расчете на 100 коров за три полных лактации приведены в таблице 9.
При проведении расчетов учитывались следующие показатели:
1. группа I (n=100) представлена животными с генотипами Ч/У, У/У, Н/У - 100%;
2. группа II (n=100) имеет следующую структуру: Н/Ч, Ч/Ч 70%;
Н/Н, Ч/У, У/У, Н/У - 30%;
3. животные первой группы получены от инфицированных матерей, но в раннем возрасте с использованием предложенной в ходе выполнения диссертационной работы схемы из данной груп пы удалены инфицированные животные, а оставшиеся свободны от носительства провирусной ДНК ВЛКРС;
4. животные второй группы являются носителями ВЛКРС, при этом процент инфицирования во время первой лактации со ставляет 40%, во время второй - 70%, во время третьей - 100%;
5. удой коров составляет в среднем 7000 кг молока в год;
6. выход телят в обеих группах составляет 78%, стоимость одного теленка приравнивается к стоимости 100 кг молока;
7. реализационная цена молока в среднем равна 12 руб/кг;
8. после 3 лет лактации животные реализуются на мясо по цене 30 руб. за 1 кг живой массы. Средняя живая масса 1 живот ного к концу 3 лактации равна 540 кг;
9. из группы II по причине персистентного лимфоцитоза вы браковывается 30% (по литературным данным, в течение жизни, гематологическими больными становятся 30% от числа инфициро ванных животных). Мясо выбракованных животных в соответствии с ветеринарным законодательством реализации не подлежит;
10. по другим причинам из опытной и контрольной групп жи вотные не выбывают;
11. затраты на выращивание телок до первой лактации одина ковы в обеих группах (структура затрат: 70% корма, 30% - прочие расходы), возраст начала 1 лактации – 2,5 года (при расходе 8 кор мовых ед./день себестоимость кормов составляет для одного жи вотного – 36 500 руб., а себестоимость выращивания 1 животного –52140 руб.);
12. затраты на производство 1 кг молока также одинаковы (структура затрат: 70% корма, 30% - прочие расходы): на произ водство 1 кг молока затрачивается 1,1 к.е., стоимость 1 к.е. – 5 руб.;
тогда себестоимость кормов составляет 5,5 руб., а себестоимость производства 1 кг молока – 8,0 руб.
Таблица Экономический эффект от внедрения генетического маркера устойчивости к персистентному лимфоцитозу Группа I Группа II Показатели (Ч/У, У/У, Н/У) (Ч/Н, Ч/Ч, Н/Н, Ч/У, У/У, Н/У) Общая выручка от реализации 27054000 всех видов продукции, руб.
Общие затраты, руб. 22014000 Затраты на ДНК анализы, руб. 47000 Прибыль, руб. 4993000 Рентабельность, % 22,6 15, Из данных таблицы 9 следует, что в результате использования молекулярно-генетических методов прибыль может составить 4993000 руб., что на 2166000 руб. больше, чем во второй группе, где данные методы не применялись. Проведенные расчеты показа ли, что внедрение методов ДНК-анализа позволяет увеличить рен табельность на 7,5%.
4. ВЫВОДЫ 1. Разработаны молекулярно-генетический способ и схема ран ней диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) на основе использования ПЦР-анализа, позволяющие выявлять и осуществлять эффективное разделение телят на здоровых и носи телей ВЛКРС, начиная с 1,5 месячного возраста.
2. Изучено распространение ВЛКРС в сельхозпредприятиях Краснодарского края и Ростовской области. Исследование образцов крови, отобранных в 13 хозяйствах показало, что процент коров-носителей ВЛКРС варьирует от 0,004 до 100% и в среднем составляет 17%.
3. Усовершенствована методика ДНК-анализа полиморфизма гена BoLA DRB3, основанная на методе ПЦР-ПДРФ анализа с ис пользованием эндонуклеазы рестрикции Bst2UI, пригодна для мас сового тестирования животных. Выполнена экспериментальная ап робация методики для исследования 500 голов скота и показана ее результативность в выявлении аллелей гена BoLA DRB3 у живот ных различных пород.
4. Исследование с использованием разработанной методики коров и телок и 220 быков-производителей голштинской, айршир ской, красной степной пород и помесей выявило наиболее высокие частоты встречаемости Ч-аллелей гена BoLA DRB3 в группах чис топородного голштинского скота (до 64,4%), что было существен но выше по сравнению с группами скота красной степной (32%), айрширской пород (14,4%) и помесей (33,7%). Наибольшая часто та встречаемости устойчивых аллелей отмечена у крупного рогато го скота красной степной породы (29,0%), что было выше по срав нению с животными голштинской (15,0%), айрширской (8,8%) и помесями (18,8%).
5. Установлено, что сочетание в генотипе голштинского и красного степного скота Ч- и Н-аллелей локуса BoLA DRB3 обу славливает пониженную молочную продуктивность и снижает пе риод их продуктивного использования. Удой в группе коров с ге нотипом Ч/Н гена BoLA DRB3 был на 339-1288 кг ниже (p0,05) по сравнению с группой коров с генотипом Ч/У. Отмечена на 7,9-9,2% повышенная частота встречаемости коров с генотипом Ч/Н в вы борке выбывших животных.
6. Показано, что оптимальными по уровню удоя и показателям здоровья у чистопородного голштинского скота являются живот ные, несущие в своем генотипе один устойчивый (У) аллель и один чувствительный (Ч) аллель, при этом У-аллель является маркером повышенной устойчивости к заболеваниям, а Ч-аллель - маркером повышенной молочной продуктивности. Животные с генотипом Ч/У гена BoLA DRB3 голштинской и красной степной пород в среднем на 339-1288 кг по удою за первую лактацию превосходили коров с другими генотипами данного гена (p0,05;
p0,001).
8. Разработан селекционно-генетический способ, предусматри вающий проведение подборов родительских пар с учетом генотипа по локусу BoLA DRB3 с целью повышения в потомстве частоты встречаемости «желательного» генотипа Ч/У, обуславливающего повышенную устойчивость животных к персистентному лимфоци тозу и другим заболеваниям с одновременным повышением их продуктивности. Проведена экспериментальная апробация разра ботанного способа на 417 коровах и телках. Исследованием выбор ки 80 матерей и их дочерей, полученных от таких подборов, пока зано повышение частоты встречаемости желательного генотипа Ч/У за 1 поколение с 25,0 до 63,1%.
9. Проведенные экономические расчеты показывают, что ожи даемая дополнительная прибыль от применения молекулярно генетических методов, разработанных в рамках диссертационной работы, в расчете на 100 коров за три полных лактации может со ставлять до 2166000 рублей при увеличении рентабельности на производства на 7,5%.
5. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ Сельхозпредприятиям по разведению молочного крупного ро гатого скота рекомендуется:
1. Для ускорения оздоровления хозяйств от лейкоза разделять телят с 1,5 месячного возраста на здоровых и вирусоносителей на основании результатов ДНК-анализа по предложенной нами схеме.
2. Для повышения уровня молочной продуктивности и рези стентности коров к персистентному лимфоцитозу проводить под бор родительских пар с учетом генотипа по локусу BoLA DRB3 в соответствии с разработанным нами селекционно-генетическим способом.
Список основных работ, опубликованных по теме диссертации.
В рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК:
1. Горковенко, Л.Г. Взаимосвязь генотипа по локусу BoLA DRB главного комплекса гистосовместимости крупного рогатого скота с молочной продуктивностью / Горковенко Л.Г., Ковалюк Н.В., Са цук В.Ф. // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. – 2007. -№ 3. – С.73-74.
2. Ковалюк, Н.В. Использование генетических маркеров в селекци онно – племенной работе / Ковалюк Н.В., Ковалюк А.А., Чурилова Е., Масленников М., Сивогривов Д. // Молочное и мясное ското водство. – 2004. - № 8. – С.20 – 3. Ковалюк, Н.В. Изучение полиморфизма некоторых генов у бы ков – производителей / Ковалюк Н.В., Ковалюк А.А., Чурилова Е., Масленников М. // Вестник Российской академии сельскохозяйст венных наук. – 2005. - № 1. С.64- 4.Ковалюк, Н.В. Селекционно-генетический способ создания высо копродуктивного и устойчивого к персистентному лимфоцитозу крупного рогатого скота./ Ковалюк Н.В., Шостак В.А., Сацук В.Ф., Фоменко Д.В. // Вестник Российской академии сельскохозяйствен ных наук. – 2005. -№ 6. – С.67-69.
5. Ковалюк, Н.В. Использование ДНК анализа при отборе матерей быков / Ковалюк Н.В., Шостак В.А., Сацук В.Ф.. Фоменко Д.В. // Зоотехния. – 2005. - №8. – С.7- 6. Ковалюк, Н.В.Использование генетических маркеров для повы шения молочной продуктивности коров / Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф., Мачульская Е.В. // Зоотехния. - 2007.- № 8. -С.2- 7. Ковалюк, Н.В. Применение молекулярно-биологических методов для оздоровления стад крупного рогатого скота от лейкоза / Кова люк Н.В. // Ветеринария. - 2008 - № 2. - С. 22- В сборниках научных трудов:
8. Ковалюк, Н.В. Изучение влияния строения гена BoLA DRB главного комплекса гистосовместимости на устойчивость крупного рогатого скота к лейкозу/Ковалюк Н.В., Ковалюк А.А., Шахназаро ва Ю.Ю.// Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики как основа улучшения продуктивных качеств и здоровья сельско хозяйственных животных: Сборник научных трудов - Ставрополь, 2003.- С.341- 9. Ковалюк, Н.В. Взаимосвязь генетической структуры популяций с устойчивостью к инфекционным заболеваниям и продуктивно стью /Ковалюк Н.В., Мачульская Е.В., Фоменко Д.В.// «Юг России «Вклад фундаментальных исследований в развитие экономики Краснодарского края»: Сборник тезисов конференции грантодер жателей регионального конкурса РФФИ и администрации Красно дарского края - Краснодар, 2006. – С. 141- 10. Ковалюк, Н.В. Проблемы и перспективы использования моле кулярно-биологических методов в ветеринарии /Ковалюк Н.В., Шумейко О.В. // Сборник научных трудов КРИА- Краснодар, 2007. - №16.- С.77- 11.Ковалюк, Н.В. Наследственная предрасположенность к лейкозу у крупного рогатого скота и методы е выявления / Ковалюк Н.В., Шумейко О.В.// Сборник научных трудов КРИА- Краснодар, 2008.
- №17.- С.83- В материалах международных конференций:
12. Ковалюк, Н. В. Типирование аллелей гена BoLA DRB 3, отве чающего за формирование устойчивости крупного рогатого скота к персистентному лимфоцитозу у быков-производителей/ Ковалюк Н. В., Ковалюк А. А., Масленников М. Г., Сивогривов Д. Е. // Роль и значение метода искусственного осеменения сельскохозяйствен ных животных в прогрессе животноводства ХХ и ХХI веков: Мате риалы международной научно – практической конференции Дубровицы, 2004. – С. 240 – 13.Ковалюк, Н.В. Способ определения BoLA DRB3 - генотипа крупного рогатого скота/ Ковалюк Н. В., Сивогривов Д.
Е.,Ковалюк А.А.// Научное наследие П. Н. Кулешова и современ ное развитие зоотехнической науки и практики животноводства:
Материалы международной научно – практической конференции – Москва, 2004.- С. 46- 14. Ковалюк, Н. В. Частоты встречаемости аллелей гена BoLA DRB 3 и генотипов по гену каппа – казеина у животных различных хо зяйств Краснодарского края / Ковалюк Н. В., Ковалюк А. А., Чу рилова Е. А., Чижевская В. В., Фоменко Д. В. // Актуальные вопро сы зоотехнической науки и практики как основа улучшения про дуктивных качеств и здоровья сельскохозяйственных животных:
Материалы III Международной научно – практической конферен ции, посвященной 75- летию факультета технологического ме неджмента Ставропольского ГАУ - Ставрополь,2005. – С. 283- 15.Ковалюк, Н.В. Использование ДНК-технологий в молочном жи вотноводстве /Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф., Мачульская Е.В., Фомен ко Д.В. // Актуальные проблемы биологии в животноводстве: Ма териалы IV Международной научной конференции,посвященной 100-летию со дня рождения академика Николая Александровича Шманенкова- Боровск, 2006. - С. 244- 16.Ковалюк, Н.В. Селекционно-генетический способ создания вы сокопродуктивных групп крупного рогатого скота / Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф., Мачульская Е.В. // Современные достижения и про блемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: Материа лы 6 Международной научной конференции- Дубровицы, 2006. – ВИЖ.- С. 82- 17. Мачульская, Е.В. Изучение частот встречаемости генотипов по локусу BoLA DRB3 у быков голштинской и айрширской пород /Мачульская Е.В., Ковалюк Н.В., Кононенко С.И.,. Сацук В.Ф. // Современные методы генетики и селекции в животноводстве: Ма териалы международной научной конференции ВНИИГРЖ- Санкт Петербург, 2007.-С.252- В других изданиях:
18. Горковенко, Л.Г. Дойное стадо юга страны / Горковенко Л.Г., Шостак В.А, Ковалюк Н.В // Животноводство России. – 2005. - № 9. – С. 40- 19. Горковенко, Л.Г. Проблему лейкоза можно решить быстрее /Горковенко Л., Ковалюк Н., Сацук В. // Животноводство России. – 2006. - № 12. – С. 39- 20. Ковалюк, Н.В., Возможные пути снижения заболеваемости крупного рогатого скота лейкозом в Краснодарском крае./ Ковалюк Н. В. // Ветеринария Кубани. – 2004. - № 4. – С. 7 – 21.Ковалюк, Н.В. Лейкоз крупного рогатого скота и методы борьбы с ним/ Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф. Серия «Библиотечка животново да» Методические рекомендации – Краснодар, 2005. – 24 с.
22. Ковалюк, Н.В. Использование ДНК-технологий в молочном животноводстве/ Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф. Серия «Библиотечка животновода» Методические рекомендации – Краснодар, 2006. – 24 с.
23. Ковалюк Н.В., Ковалюк А.А., Сивогривов Д.Е. Патент РФ на изобретение № 2287587 «Способ определения генотипа крупного рогатого скота», заявка №2004108882. Приоритет изобретения марта 2004г., зарегистрировано в государственном реестре изобре тений 20 ноября 2006 РФ 24.Ковалюк, Н.В. Современные методы диагностики лейкоза круп ного рогатого скота / Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф., Мачульская Е.В.
// Ветеринария Кубани.- 2007.- №1. - С.11- 25. Горковенко Л.Г., Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф. Патент РФ на изо бретение № 2316207 «Селекционно-генетический способ создания высокопродуктивного и устойчивого к персистентному лимфоци тозу стада крупного рогатого скота», заявка № 2005112494. При оритет изобретения 25 апреля 2005 г., зарегистрировано в государ ственном реестре изобретений РФ 10 февраля 2008 г.
26.Ковалюк, Н.В. Лейкоз крупного рогатого скота. Методы диагно стики./ Ковалюк Н.В., Шумейко О.В.// Учебное пособие с грифом «Допущено Министерством сельского хозяйства Российской Феде рации в качестве учебного пособия для системы профессионально го образования Министерства сельского хозяйства Российской Фе дерации» - Краснодар, 2008. - 69 с.