Оглы новые подходы к разработке противотуберкулезных средств и их биологическая активность
На правах рукописи
Азаев Мамедьяр Шакир оглы НОВЫЕ ПОДХОДЫ К РАЗРАБОТКЕ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ СРЕДСТВ И ИХ БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ 03.01.06 – биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
на соискание ученой степени доктора биологических наук
Кольцово - 2010 1
Работа выполнена в ФГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России
Научный консультант:
доктор медицинских наук Ставский Евгений Александрович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Аликин Юрий Серафимович доктор биологических наук Беклемишев Анатолий Борисович доктор медицинских наук, профессор Никонов Сергей Данилович
Ведущая организация:
ФГУН «Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича» Роспотребнадзора, Москва
Защита состоится «23» апреля 2010 года в 9-00 часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при «ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (383)336-74-28.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
Автореферат разослан « » января 2010 года
Ученый секретарь диссертационного совета д.б.н. Л.И. Карпенко ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Актуальность проблемы В Российской Федерации ежегодно регистрируется около 40 млн.
случаев инфекционных заболеваний. Экономический ущерб, наносимый инфекционными болезнями, составляет свыше 18 млрд. рублей в год. В связи с этим одной из приоритетных государственных задач является создание в Российской Федерации собственной государственной системы разработки и производства лечебно-профилактических препаратов против возбудителей опасных и особо опасных инфекционных заболеваний1.
Росту заболеваемости туберкулезом в Российской Федерации способствуют неблагоприятные изменения социально-экономических условий, резкое увеличение миграционных потоков, снижение качества противотуберкулезной службы и объема профилактических обследований.
Эксперты ВОЗ подразделяют страны мира на три группы по частоте заболеваний туберкулезом: с заболеваемостью менее 25,0 на 100 тыс.
населения, от 25,0 до 100,0 и свыше 100,0. Российская Федерация с показателем заболеваемости 70,99 на 100 тыс. населения (2006 г.) относится к странам с относительно высоким уровнем заболеваемости (Волкова К.И. и др., 2001;
Петрухина М.И. и др., 2003;
Кондратенко Т.А. и др., 2007).
Распространение лекарственно-устойчивого туберкулеза в настоящее время приняло характер мировой пандемии, способной дестабилизировать общество. Несмотря на все предпринимаемые меры, положение с этой формой туберкулеза продолжает ухудшаться. Это вызвало необходимость введения нового термина – туберкулез с широкой лекарственной устойчивостью к препаратам первого и второго (резервного) ряда, а также ко всем фторхинолонам (Surikova O.V. et al.,2005;
Сивков А.Ю. и др., 2006;
Воронкова О.В. и др., 2007).
Для борьбы с лекарственно-устойчивыми формами туберкулеза в настоящее время ведутся интенсивные научные работы с целью повышения антимикобактериальной активности противотуберкулезных препаратов, изучение их механизма действия и адресной доставки антибиотиков и химиопрепаратов в зараженные микобактериями макрофаги, что имеет важное клиническое значение.
Концепция «Национальной системы химической и биологической безопасности РФ (2009 - 2013)», утв. постановлением Правительства Российской Федерации от 27 октября 2008 года.
В Российской Федерации для борьбы с туберкулезом была разработана система не только федеральных, но и региональных программ борьбы с этим заболеванием (Шевченко Ю.Л., 2000). На период 2007-2011 гг. в России действует федеральная целевая программа "Предупреждение и борьба с социально значимыми заболеваниями", где 34% всего финансирования программы направлены на противотуберкулезные мероприятия. Важной целью программы является поддержка исследований, направленных на создание современных средств диагностики, профилактики и лечения туберкулеза. Данное положение актуализировало проблему импортозамещения лекарственных препаратов зарубежного производства на отечественные и показало государственную значимость задач по разработке новых средств лечения и иммунопрофилактики опасных инфекционных заболеваний для обеспечения биологической безопасности Российской Федерации (Пальцев М.А., 2003).
Как известно, вакцинный штамм BCG из M. bovis был получен французскими учёными Кальметтом А. (Calmette A.) и Гереном К. (Gurin C.) в результате 13-летнего культивирования M. bovis (230 пассажей) на картофельно-глицериновой среде с желчью (Petroff S.A., Branch A., 1928).
Однако этот вакцинный штамм и его подтипы не обеспечивают полной защиты от туберкулеза (Cole S.T., 1998) и способны вызывать генерализованные BCG-инфекции (Малярова Е.Ю. и др., 2005;
Rezai M.S. et al., 2008).
В существующем в настоящее время комплексе мер по борьбе с туберкулезом, наряду со специфической химиотерапией, по-прежнему имеет большое значение вакцинопрофилактика. Поэтому исследования, направленные на совершенствование эффективности и безопасности вакцины против туберкулеза, являются актуальной задачей (Ryan A.A. et al., 2007;
Maue A.C. et al., 2007).
Повышение иммуногенности вакцины BCG, создание на ее основе новых вакцинных композиций, конструирование вакцин против туберкулеза на основе достижений современной молекулярной биологии и иммунологии имеют важное значение для общественного здравоохранения. Учитывая широкий иммунобиологический эффект цитокинов, лекарственные композиции, изготовленные на их основе, могут быть использованы для иммунопрофилактики инфекционных заболеваний (Кетлинский С.А., 1992;
Воробьев А.А., 1999;
Авдеева Ж.И., 2000). Показано, что совместное введение вакцины BCG с гамма-интерфероном (ИФН-) приводит к ускорению дифференцировки Т- и В-лимфоцитов, а совместное введение c фактором некроза опухоли (ФНО-) стимулирует их пролиферацию (Ярилин А.А., 1997).
Одним из многообещающих подходов к решению проблемы туберкулеза является создание субъединичных вакцин (Elhay M.J., 1997;
Orme I.M., 1997).
К настоящему времени обнаружено несколько антигенов (Ag85B, Ag85A, ESAT-6, Ag38, Ag19, PstS-3 и др.) M. tuberculosis, которые индуцировали иммунопротективный ответ на грызунах (Lowrie D.B., 1997;
Strugnell R.A., 1997;
Ulmer J.B., 1997;
Zhu X., 1997;
Denis O., 1998;
Tanghe A., 1999;
Dhiman N., 1999;
Brandt L., 2000). Однако для существенного повышения иммунопротективного действия при вакцинации новыми более перспективными иммуногенами необходимо разрабатывать более эффективные системы доставки антигенов. Особый интерес вызывают липосомы (Fries L.F., 1992) и биодеградируемые микрочастицы (Vordermeier H.M., 1995) в качестве систем доставки антигенов для избирательного воздействия на иммунокомпетентные клетки макроорганизма, имеющие в своей основе высокоочищенные протективные антигены, например белки теплового шока (Murray P.J., 1992). Перспективность этого направления была продемонстрирована конструированием вирусоподобных частиц на основе реополиглюкина и специально отобранных В- и Т-клеточных эпитопов, которые содержат только необходимые для формирования специфического иммунитета фрагменты вирусных белков (Лебедев Л.Р. и др., 2000;
Karpenko L.I. et al., 2003). Публикации по аналогичным исследованиям, направленным на создание иммунопрофилактических средств против бактериальных патогенов в доступной литературе отсутствуют.
Известно, что иммуногенный потенциал антигенов в составе микрочастицы намного выше, чем в виде растворимых белков (Gregoriadis G., 1999;
Venkataprasad N., 1999;
Beyer T., 2001). Кроме того, искусственные частицы должны имитировать везикулы, образующиеся при апоптозе инфицированных M. tuberculosis макрофагов, что является особенно важным с учетом незавершенного характера фагоцитоза при туберкулезной инфекции. Такие везикулы и, предположительно, микрочастицы способны эффективно процессироваться дендритными клетками и активировать цитотоксические лимфоциты, что является необходимым фактором повышения иммунного ответа на введение противотуберкулезных вакцин (Sibille Y., 1990;
Kaufmann S.H., 2001).
Таким образом, широкое распространение лекарственно-устойчивых форм туберкулеза в мире и в Российской Федерации и высокая значимость для общественного здравоохранения разработки и создания новых эффективных средств профилактики и лечения туберкулеза явились основанием для проведения данной исследовательской работы.
Цель и задачи исследования Цель настоящего исследования – конструирование средств иммунопрофилактики туберкулеза, оценка их эффективности и безопасности и изучение антимикобактериальных свойств препарата на основе конъюгата карбоксиметил-(1g3)--D-глюкана с моксифлоксацином.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
– разработать методы получения микобактериальных частиц (МБЧ) на основе антигенов вакцинного штамма M. bovis и иммуномодулирующих препаратов;
– исследовать физико-химические свойства полученного препарата;
– оценить противотуберкулезную и иммунологическую эффективность и безвредность токсичность, хроническая токсичность, (острая анафилактогенность, пирогенность) применения микобактериальных частиц по сравнению с вакциной M. bovis BCG на лабораторных животных;
изучить антимикобактериальную активность конъюгата – моксифлоксацин-карбоксиметил-(1g3)--D-глюкана in vitro и in vivo.
Научная новизна и практическая значимость работы Впервые разработан и предложен метод получения искусственных микобактериальных частиц на основе белков вакцинного штамма M. bovis для создания экспериментальных серий иммунопрофилактических препаратов против туберкулеза.
В экспериментах на лабораторных животных показана перспективность использования искусственных микобактериальных частиц на основе белков вакцинного штамма M. bovis для формирования противотуберкулезного иммунитета при экспериментальной туберкулезной инфекции у морских свинок, вызванной M. bovis (штамм 14х ВНИИБТЖ).
Впервые предложены вакцинные композиции на основе искусственных микобактериальных частиц (МБЧ-ИФН- и МБЧ-ИФН--ФНО-), которые обладают выраженными протективными свойствами и не уступают по эффективности вакцине M. bovis BCG.
Показано, что микобактериальные частицы на основе дсРНК (двуспиральная рибонуклеиновая кислота) и белков M. bovis BCG безвредны для лабораторных животных (атоксичны, апирогенны, не анафилактогенны).
Впервые показана элиминация микобактерий туберкулеза в линии макрофагальных клеток J774, а также в органах и тканях инфицированных экспериментальных лабораторных животных под действием конъюгата моксифлоксацин-карбоксиметил-(1g3)--D-глюкана с дозозависимым эффектом.
Результаты проведенных исследований являются экспериментальным обоснованием дальнейших работ по конструированию лечебно профилактических препаратов нового поколения на основе искусственных иммуногенов в виде микрочастиц и получения конъюгированных форм химиопрепаратов. Научная новизна и приоритетность выполненных исследований подтверждена 2 патентами Российской Федерации на изобретения: №2190417 от 10.10.2002 «Средство для снижения токсичности химически синтезированных противотуберкулезных лекарственных препаратов» и №2242245 от 20.12.2004 «Искусственные микобактериальные частицы и противотуберкулезная вакцинная композиция на их основе».
Апробация работы Материалы исследований по теме диссертации были представлены на российских и международных конференциях и симпозиумах:
Международном симпозиуме «Интегративная Медицина в XXI веке» (Судак, Украина, 2004);
Международном Кейстоуновском симпозиуме «Интеграция хозяина и патология патогена» (Вистлер, Канада, 2005);
VI-м конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, Россия, 2005);
Международном междисциплинарном семинаре «Новые технологии в интегративной медицине и биологии» (Бангкок-Паттая, Таиланд, 2006);
II-ой интернациональной конференции «ТБ вакцины в мире» (Вена, Австрия, 2006);
III-ей Российской научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, Россия, 2006);
Работа выполнена в 2001–2009 годах в ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора в рамках научных тем организации и по грантам МНТЦ.
Основные положения, выводы и практические предложения диссертации были обсуждены и одобрены на заседании научного семинара ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (2009).
Основные положения, выносимые на защиту 1. Искусственные микобактериальные частицы на основе антигенов вакцинного штамма M. bovis BCG и дсРНК являются атоксичными и апирогенными для лабораторных животных и обладают высокой стабильностью и хорошей растворимостью.
2. Искусственные микобактериальные частицы обладают выраженным иммуностимулирующим воздействием на факторы Т-клеточного иммунного звена.
3. Созданные противотуберкулезные искусственные микобактериальные частицы (МБЧ) на основе антигенов вакцинного штамма M. bovis BCG и дсРНК обладают высокой иммуногенностью при экспериментальной туберкулезной инфекции.
4. Совместное введение МБЧ и цитокинов (ИФН- и ФНО-) формируют более высокую степень защиты лабораторных животных к экспериментальной туберкулезной инфекции. При этом степень резистентности и интенсивность факторов клеточного иммунного ответа возрастает в ряду: BCG МБЧ МБЧ-ИФН--ФНО- МБЧ-ИФН-.
5. Препарат карбоксиметил-(1g3)--D-глюкана с ковалентно связанным моксифлоксацином обладает выраженным антимикобактериальным эффектом.
Публикации результатов исследований По теме диссертации опубликовано 27 научных работ, в том числе статей в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации. Получено 2 патента Российской Федерации.
Структура и объем работы Диссертация изложена на 215 страницах машинописного текста, включает 23 таблицы и 32 рисунка и содержит следующие разделы:
введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, практические предложения, выводы и список литературы, содержащий 356 работ отечественных и зарубежных авторов.
СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы исследований Штаммы микроорганизмов В работе использовали следующие штаммы микобактерий:
- вакцинный штамм M. bovis (вакцина BCG), полученный из НИИ вакцин и сывороток, Ставрополь. Штамм использовали для получения белков-антигенов и для иммунизации морских свинок и мышей линии BALB/c;
- возбудитель бычьего туберкулеза M. bovis, штамм 14х ВНИИБТЖ (предоставлен д.в.н. Донченко Н.А., заведующим лабораторией туберкулеза сельскохозяйственных животных НИИ экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН). Штамм культивировали на плотной питательной среде Финн-2. Образцы готового материала хранили после сбора биомассы не более 72 ч при температуре +4С и использовали в дальнейшем для заражения морских свинок и мышей линии BALB/c;
- штамм M. tuberculosis Erdman получен из ГИСК им. Л.А. Тарасевича.
Штамм культивировали до концентрации 5 108 бактериальных клеток/мл на плотной питательной среде (Левенштейна – Йенсена) и на жидкой питательной среде (Middlebrook 7H9 agar base, Difco Laboratories) с добавлением бычьего сывороточного альбумина (фракция 5). После пассажа на питательных средах проводили подтверждение стабильности культуральных, морфологических, ферментативных свойств штамма в соответствии с паспортом культуры микроорганизма. Штамм использовали для заражения моноцитов и макрофагов;
- лекарственно-устойчивые штаммы M. tuberculosis выделены в бактериологической лаборатории Новосибирского научно-исследовательского института туберкулеза из мокроты больных с деструктивными и диссеминированными формами туберкулеза легких (в работе использован штамм №131, устойчивый к изониазиду, и штамм №234, устойчивый к рифампицину).
Для модели туберкулезной инфекции использовали штамм M. tuberculosis H37Rv, полученный из коллекции микроорганизмов ГИСК им. Л.А. Тарасевича.
Штамм депонирован в Коллекцию культур микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» под номером В-900.
Животные В работе использовали кроликов породы «Советская шиншилла» весом 2-2,2 кг, аутбредных морских свинок весом 250-300 г, нелинейных белых мышей весом 18-20 г, мышей линии C57Bl/6J (генотип H-2b) весом 18-20 г, мышей линии BALB/c весом 18-20 г. Все животные были получены из питомника лабораторных животных ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» и содержались на стандартном рационе с достаточным количеством воды. Все манипуляции с животными в экспериментах проводили в соответствии с требованиями биоэтического комитета ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» и на основе «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». Уход за инфицированными животными и работу с ними осуществляли в условиях инфекционного вивария с уровнем биологической безопасности BSL-2.
Биохимические методы Получение препарата МБЧ. 20 мг сухой биомассы бактерий вакцинного штамма M. bovis (вакцина BCG) суспендировали в 5,0 мл буфера (10 мМ калий-фосфат, рН 7,5, 150 мМ NaCl) и обрабатывали ультразвуком (УЗДН 2Т, 22 кГц) 5 экспозиций по 20 сек. К полученной суспензии для удаления липополисахаридов добавляли 250 мкл хлороформа, интенсивно перемешивали 5 мин и центрифугировали (20 мин при 10000 об/мин).
Отбирали водную фазу и к ней для осаждения ДНК добавляли 1,3 мл раствора 5 М NaCl и 0,3 мл 10%-ного раствора полиэтиленимина. Смесь перемешивали, инкубировали 20 мин на ледяной бане и центрифугировали ( мин при 10000 об/мин). Водную фазу диализовали против карбонатного буфера (25 мМ NaHCO3, рН 9,0), содержащего 150 мМ NaCl.
Для синтеза конъюгата суммарных антигенов BCG с полиглюкином 3 мг полиглюкина растворяли в 0,5 мл 10 мМ раствора периодата натрия и инкубировали 2 ч при 20С. Активированный полисахарид отделяли гель фильтрацией на колонке с сефадексом G-50 (V=2 мл) и добавляли 6 мл раствора, содержащего 1,0 мг спермидина и 5,0 мг антигенов BCG. После инкубации в течение ночи при 6С непрореагировавшие компоненты удаляли гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-50 (V=20 мл).
В качестве «центрального ядра» искусственной МБЧ использовали дсРНК дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae M437 Y116 (L форма – 3 МДа, M-форма – 1,2 МДа). Для сборки частиц к 3,0 мг дсРНК, растворенной в 1 мл физиологического раствора, добавляли полученный конъюгат, смесь инкубировали 2 ч при 4С и образовавшийся комплекс отделяли гель-фильтрацией на колонке с сефарозой CL-6B (V=25 мл).
Полученный препарат стерилизовали ультрафильтрацией на фильтрах Millipore с размером пор 0,45 мкм.
Для получения вакцинных композиций на основе препарата МБЧ в раствор с полученными МБЧ добавляли препараты цитокинов: ИФН- (препарат МБЧ-ИФН-) или совместно: ИФН- и ФНО- (препарат МБЧ-ИФН--ФНО ) из расчета на 30 мкг белков-антигенов BCG 10 мкг (105 ME) ИФН- или мкг (105 ME) ИФН- и 10 мкг (105 ME) ФНО-. В работе использовали препараты дсРНК, ИФН- и ФНО- производства ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор».
Молекулярную массу компонентов препарата МБЧ определяли электрофорезом в 1%-ном агарозном геле (Маниатис Т., 1984). В качестве стандарта молекулярных масс использовали гидролизат ДНК фага /EcoRI. В соседние лунки геля вносили по 1-3 мкг препаратов. Электрофоретическое разделение проводили в течение 1 ч при 120 В. Нуклеиновые кислоты в геле окрашивали раствором бромистого этидия и визуализировали в ультрафиолетовом свете.
Биофизические методы Для электронной микроскопии препарат МБЧ адсорбировали на сеточках с формваровой подложкой в течение 1-2 мин. Был применен метод негативного контрастирования образцов 1%-ным раствором уранилацетата.
Электронная микроскопия была проведена д.б.н., профессором Е.И.
Рябчиковой (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора). Исследование проводили с использованием электронного микроскопа JEM100C (Япония).
Статистическую обработку результатов проводили с помощью вычислений средних значений и среднестатистических отклонений (M±m) с использованием пакета программ для статобработки Microsoft Excel. Оценку специфичности и чувствительности серологических методов проводили с использованием таблиц Генеса (Генес В.С., 1967). Достоверность полученных данных оценивали с использованием различных уровней значимости (0,05;
0,01;
0,001) (Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Результаты, связанные с получением препарата МБЧ и вакцинных композиций и оценкой их иммуногенных и протективных свойств, изучением токсикогенных эффектов препарата МБЧ (пирогенность, острая и хроническая токсичность, анафилактогенность) В данной работе мы использовали принцип объединения в одной композиции цитокинов и антигенов BCG. В качестве средств доставки иммуногенов использовали искусственные микобактериальные частицы.
Стадии получения МБЧ:
n Стадия 1. Получение белков-антигенов вакцинного штамма M. bovis (вакцины BCG).
n Стадия 2. Синтез конъюгата антигены BCG-спермидин-полиглюкин.
n Стадия 3. Сборка МБЧ.
n Стадия 4. Получение противотуберкулезной вакцинной композиции.
Организация микобактериальной частицы представлена на рис. 1.
Рис. 1. Организация микобактериальной частицы:
1- антигены BCG в составе конъюгата спермидин-полиглюкин 2- дсРНК дрожжей 3- спермидин-полиглюкин Известно, что синтетические и природные двуспиральные РНК усиливают иммунный ответ на целевой иммуноген при иммунизации (Лебедев Л.Р. и др., 2000). В связи с этим в качестве «центрального ядра» конструкции была использована дсРНК дрожжей (2). Второй компонент – полиглюкин собственно формирующий МБЧ, представлен (3), низкомолекулярной фракцией природного декстрана с молекулярной массой 60±10 кДа.
Спермидин содержит 3 аминогруппы и в составе конъюгата придает последнему положительный заряд. За счет этого молекулы конъюгата формируют внешнюю оболочку, взаимодействуя с отрицательно заряженными молекулами нуклеиновой кислоты.
Для получения конъюгата использовали окисление декстрана периодатом натрия до образования альдегидных групп, которые затем реагировали с аминогруппами вносимых веществ (спермидина и антигенов).
Не вступившие в реакцию альдегидные группы блокировали компонентами буфера, содержащими аминогруппы. Промежуточные соединения, несущие азометиновую группу, восстанавливали внесением боргидрида натрия. Такой метод иммобилизации не требует присоединения дополнительных химических реагентов к конечному продукту в виде спейсерных групп (глутаровый альдегид, эпихлоргидрин и т.п.). В этом случае не повышается токсичность получаемого препарата. Конечный препарат МБЧ переводили в физиологический раствор.
Известно, что ведущую роль в стимуляции иммунного ответа играет ИФН-, и индивиды с нарушенной системой продукции ИФН более подвержены воздействию инфекционных агентов (Lalvani A., 1998). Исходя из этих данных, и были сконструированы МБЧ с индуктором ИФН- – композиция, включающая один из цитокинов. В состав другой вакцинной композиции помимо ИФН- был введен цитокин ФНО- из расчета по 10 мкг (105 ME) ИФН- и ФНО- на 30 мкг белков-антигенов BCG.
Таким образом, был получен препарат МБЧ и две вакцинные композиции на его основе: препарат МБЧ в комбинации с ИФН- и препарат МБЧ в комбинации с ИФН- и ФНО- одновременно.
Изучение физико-химических свойств препарата МБЧ По физико-химическим свойствам препарат МБЧ представляет собой набор микрочастиц с молекулярной массой 10-12 МДа. Основные физико химические показатели представлены в табл. 1.
Таблица Физико-химические свойства препарата МБЧ Показатель Описание Порошок белого цвета, без запаха, Внешний вид гигроскопичен Растворим в воде, практически не растворим в Растворимость спирте, хлороформе, эфире 10-12 МДа Молекулярная масса Содержание белка в одной Не более 40% дозе (30 мкг) На электрофореграмме в агарозном геле (рис. 2) видно, что дсРНК (L- и М-формы), покрытая конъюгатом «полиглюкин-спермидин», имеет меньшую подвижность. Это можно объяснить увеличением молекулярной массы и тем, что положительно заряженный спермидин частично нейтрализует в комплексе отрицательный заряд РНК. МБЧ (дсРНК, покрытые конъюгатом «спермидин-полиглюкин-белки BCG») имеют еще меньшую подвижность в геле агарозы – на уровне фрагментов ДНК с молекулярной массой около 10 12 МДа.
МДа 1 2 3 15, 6, Рис. 2. Электрофореграмма компонентов препарата МБЧ в 1%-ном геле агарозы:
1 – исходная дсРНК;
2 – дсРНК в оболочке из конъюгата «спермидин-полиглюкин»;
3 – дсРНК в оболочке из конъюгата «спермидин-полиглюкин-антигенные белки BCG»;
4 – маркеры молекулярной массы (гидролизат ДНК фага /EcoRI) На рис. 3 представлена электрофореграмма белков вакцинного препарата BCG и МБЧ, полученная после электрофореза в 10%-ном ДСН-ПААГ.
66 кДа 45 кДа 36 кДа 29 кДа 20,1 кДа 14,4 кДа Рис. 3. Электрофореграмма белков вакцинного препарата BCG и МБЧ. Электрофорез проводили в 10%-ном ДСН-ПААГ:
1. Маркеры молекулярных масс белков (66 кДа, 45 кДа, 36 кДа, 29 кДа, 20,1 кДа и 14,4 кДа);
2. Белковый спектр микобактерий BCG;
3. Белковый спектр препарата МБЧ Электрофореграмма белков вакцинного препарата BCG и МБЧ в 10% ном ДСН-ПААГ показывает, что в состав препарата МБЧ входят белки вакцинного препарата BCG с молекулярными массами в диапазоне от 14, кДа до 66 кДа.
Для проверки полноты упаковки нуклеотидного материала в собранной конструкции и его защищенности от воздействия нуклеаз проводили обработку конструкции РНКазой (0,05 мг/мл). Реакционные смеси анализировали с помощью гель-электрофореза. Микрочастицы в полученном препарате сохраняли свою компактную структуру при 4С не менее месяцев.
Электронная микроскопия препарата МБЧ Полученные искусственные микрочастицы имели шарообразную форму с диаметром в диапазоне 10-25 нм (рис. 4). Такой размер частиц позволяет использовать МБЧ для иммунизации без адъювантов как полноценные антигены.
Рис. 4. Электронная микрофотография препарата МБЧ Оценка иммуногенных и протективных свойств препарата МБЧ и вакцинных композиций Изучение протективных свойств препарата МБЧ и вакцинных композиций на его основе проводили на однородной партии здоровых морских свинок, предварительно проверенных на отсутствие контаминации M. bovis. Заражение животных проводили внутримышечно возбудителем M.
bovis (штамм 14х ВНИИБТЖ) в объеме 0,5 мл физиологического раствора, содержащего 105 микробных клеток, на 30-е сутки после иммунизации животных вакциной BCG, препаратом МБЧ и вакцинными композициями МБЧ-ИФН- и МБЧ-ИФН--ФНО-.
Протективные свойства препарата МБЧ и вакцинных композиций оценивали по количеству выживших животных после заражения M. bovis.
Полученные данные представлены в таблице 2.
Таблица Восприимчивость морских свинок к заражению M. bovis через суток после иммунизации вакциной BCG, препаратом МБЧ и вакцинными композициями Количество % гибели СПЖ Наименование препарата, Количество погибших заболевших доза и способ иммунизации животных животных от животных в опыте туберкулезной инфекции (сутки) 1. BCG, 30 мкг, в/к 20 14 94± 2. МБЧ, 30 мкг, п/к 20 11 102± 3. МБЧ-ИФН-:(МБЧ + 10 мкг (105 ME) ИФН- на 20 10 135± 30 мкг белков-антигенов BCG), п/к 4. МБЧ-ИФН--ФНО-:
(МБЧ + 10 мкг (105 ME) ИФН– + 10 мкг (105 МЕ) 20 12 105± ФНО- на 30 мкг белков антигенов BCG), п/к 5. Контроль (К+): M.bovis, 10 10 71± в/м 6. Контроль (К-): здоровые неиммунизированные 10 - - животные (физ. р-р 0,5 мл), в/м Примечание: СПЖ – средняя продолжительность жизни МЕ – международная единица В результате проведенного эксперимента установлено, что при применении вакцины BCG количество больных и павших животных достигало 70%, а при применении вакцинной композиции МБЧ-ИФН- – не более 50%. Количество больных и павших животных при применении МБЧ ИФН--ФНО- составило 60%. Следует особо отметить, что сам препарат МБЧ также способствовал формированию противотуберкулезного иммунитета у морских свинок без совместного введения с цитокинами. При макроскопическом исследовании павших после заражения M. bovis животных отмечались поражения бронхиальных, брыжеечных, предлопаточных лимфатических узлов. Наиболее высокая частота патологических изменений отмечалась в легких и в печени. Средняя продолжительность жизни (СПЖ) морских свинок, иммунизированных вакциной BCG, составила 94±13 суток, а в группе морских свинок, иммунизированных препаратом МБЧ-ИФН- – 135±5 (наиболее продолжительная СПЖ относительно других групп животных). Гибель неиммунизированных животных (из контрольной группы) наступала на 71±7 сутки после заражения возбудителем M. bovis.
Максимальный протективный эффект наблюдался при использовании вакцинной композиции МБЧ-ИФН-.
Изучение воздействия препарата МБЧ и вакцинных композиций на факторы клеточного иммунного ответа у морских свинок Для изучения состояния клеточного иммунного ответа в клинической и экспериментальной иммунологии чаще всего используется РБТЛ (реакция бластной трансформации лимфоцитов), заключающаяся в определении пролиферации лимфоцитов и появлении бластоцитов при воздействии на пул лимфоцитов антигенами и митогенами. Проведенное сравнительное изучение интенсивности пролиферативного ответа лимфоцитов иммунизированных морских свинок in vitro показало, что уровень пролиферативного ответа у иммунизированных животных вакцинными композициями МБЧ-ИФН-, МБЧ-ИФН--ФНО- выше, чем при применении вакцины BCG (табл. 3). У морских свинок, иммунизированных препаратами МБЧ-ИФН-, МБЧ-ИФН -ФНО-, лимфоциты периферической крови лучше отвечали на туберкулин (PPD), чем на ФГА в реакции РБТЛ. Это свидетельствует о том, что введение микобактериальных частиц совместно с гамма-интерфероном человека дополнительно усиливало уровень клеточного иммунного ответа.
Таблица Пролиферативная активность лимфоцитов периферической крови морских свинок, иммунизированных вакциной BCG, препаратом МБЧ и вакцинными композициями Наименование Сутки от ИС = антиген (митоген) / контроль, имп/мин препарата начала Контроль:
иммунизации ИС : PPD ИС : ФГА спонтанная пролиферация 1,91 ± 0,4 2,92 ± 0,4 4102 ± 3-и 1,88 ± 0,2 2,98 ± 0,3 4119 ± МБЧ 7-е 3,40 ± 0,3* 2,63 ± 0, 3-и 4256± МБЧ-ИФН 3,20 ± 0,1* 2,74 ± 0, 7-е 4132± 1,92 ± 0,3 2,82 ± 0, МБЧ-ИФН-- 3-и 4230± 1,99 ± 0,2 2,79 ± 0, ФНО- 7-е 4489± 2,77 ± 0, 3-и 1,87± 0,1 4213± 2,94 ± 0, BCG (контроль) 7-е 1,84± 0,2 4225± Примечание:-*данные достоверно отличаются от контроля (P=0.05) Индекс стимуляции (ИС) пролиферативной активности лимфоцитов во всех группах морских свинок, иммунизированных препаратами МБЧ-ИФН-, МБЧ-ИФН--ФНО-, был выше относительно вакцины BCG. В дальнейшем под воздействием туберкулезного процесса, протекающего в организме животных, ИС пролиферативной активности лимфоцитов снижался (табл. 4).
Таблица Пролиферативная активность лимфоцитов периферической крови морских свинок, иммунизированных вакциной BCG, препаратом МБЧ и вакцинными композициями на 5-е сутки после заражения M. bovis Наименование препарата ИС = антиген (митоген) / контроль, имп/мин ИС: PPD ИС: ФГА Контроль:
спонтанная пролиферация 1,87 ± 0,3* 2,37 ± 0,4* 3008 ± МБЧ МБЧ-ИФН- 2,88 ± 0,6* 2,12 ± 0,6 3088 ± МБЧ-ИФН--ФНО- 2,14 ± 0,6* 2,18 ± 0,3* 3178 ± 1,26 ± 0,1 2,05 ± 0, BCG (контроль) 3112± Примечание:-*данные достоверно отличаются от контроля (P=0.05) Пролиферативная активность лимфоцитов у морских свинок, иммунизированных вакциной BCG и вакцинными композициями МБЧ-ИФН и МБЧ-ИФН--ФНО-, сохранялась на высоком уровне и после заражения M. bovis. У морских свинок, иммунизированных BCG, наблюдали сравнительно низкую пролиферативную активность лимфоцитов.
Изучение факторов неспецифического иммунного ответа у морских свинок, иммунизированных вакциной BCG, препаратом МБЧ и вакцинной композицией МБЧ-ИФН- при экспериментальном заражении возбудителем туберкулеза Неспецифическая резистентность организма проявляется как через активность таких факторов, как система ИФН, ИЛ, ФНО, так и посредством макрофагов и НК. Из исследованных образцов сывороток наиболее высокие титры сывороточного ИФН установлены в сыворотках крови морских свинок, иммунизированных вакцинной композицией МБЧ-ИФН- (рис. 5).
После заражения морских свинок патогенным штаммом M. bovis максимальные титры сывороточного ИФН незначительно возрастали.
Максимальные титры сывороточного ИФН в группах морских свинок, иммунизированных вакциной BCG и препаратом МБЧ, не поднимались выше 40-50 МЕ/мл.
Группы животных: 1 – BCG;
2 – МБЧ;
3 – МБЧ-ИФН Рис. 5. Динамика активности ИФН в сыворотках крови морских свинок иммунизированных вакциной BCG, препаратом МБЧ и вакцинной композицией МБЧ ИФН- до и после заражения M. bovis (на 2-е сутки) Наиболее выраженный эффект специфической защиты при экспериментальной туберкулезной инфекции установлен при использовании МБЧ-ИФН-, что связано с активацией клеточных факторов иммунного ответа и индукцией ИЛ-1, способного активировать антиген презентирующие клетки. Неспецифические факторы иммунного ответа участвуют взаимосвязанно во всех фазах иммунного ответа с индукцией эндогенного ИФН- и синтезом ИЛ-1 и ИЛ-2.
Изучение иммуногенных свойств препарата МБЧ и вакцинных композиций на модели мышей BALB/c Изучение иммуногенных свойств препарата МБЧ и вакцинных композиций на его основе проводили на однородной партии мышей BALB/c массой тела 18-20 г. Иммунизацию мышей проводили внутримышечно 3 кратно с интервалом 10-12 дней препаратом МБЧ (30 мкг) и вакцинными композициями на его основе (в объеме 0,1 мл). Иммунологические показатели снимали после всего цикла иммунизаций.
Из данных, представленных на рис. 6, видно, что уровень суммарных антимикобактериальных антител при иммунизации мышей BALB/c препаратом МБЧ и вакцинными композициями на его основе выше, чем при использовании вакцины BCG. Введение в состав вакцинной композиции цитокина ИФН- способствует повышению уровня антител;
введение ФНО, напротив, способствует снижению их индукции.
Рис. 6. Уровень суммарных антимикобактериальных антител у мышей BALB/c после иммунизации различными образцами препаратов:
1. BCG (30 мкг) 2. МБЧ: дсРНК (20 мкг)-белки-антигены BCG (30 мкг) 3. МБЧ-ИФН- [10 мкг (105 МЕ)] 4. МБЧ-ИФН- [10 мкг (105 МЕ)]-ФНО- [10мкг (105 МЕ)] 5. Физиологический раствор (контрольные животные) Фагоцитарную активность МНК иммунизированных мышей изучали на 35-й день после иммунизации. Результаты экспериментов по влиянию на фагоцитарную активность МНК испытанных препаратов представлены на рис. 7. Видно, что фагоцитарная активность МНК в группе мышей, иммунизированных препаратом МБЧ, выше, чем в группе животных, иммунизированных вакциной BCG. Введение в состав композиции цитокинов ИФН-, а также ИФН--ФНО-, приводило к повышению фагоцитарной активности.
Рис. 7. Фагоцитарная активность МНК на 35-е сутки после иммунизации мышей BALB/c вакциной BCG, препаратом МБЧ и вакцинными композициями:
1. BCG (30 мкг) 2. МБЧ: дсРНК(20 мкг)-белки BCG (30 мкг) 3. МБЧ-ИФН- [10 мкг (105 МЕ)] 4. МБЧ-ИФН- [10 мкг (105 МЕ)]-ФНО- [10 мкг (105 МЕ)] 5. Физиологический раствор (контрольные животные) Изучение токсикогенных и пирогенных эффектов препарата МБЧ и вакцинных композиций Для изучения биологических свойств полученного препарата, необходимо исследовать его безвредность. Исследование препарата МБЧ на безвредность проводили с определением гематологических и биохимических показателей при однократном и многократном введении возрастающих доз препарата: 100 мкг, 200 мкг, 300 мкг на каждое животное. Взятие крови у животных для гематологических исследований осуществляли на 7-е сутки, а для биохимических исследований – на 1-е, 7-е и 14-е сутки после введения препарата.
Изучение острой токсичности препарата МБЧ Однократное введение препарата МБЧ в дозах 100 мкг, 200 мкг, 300 мкг внутривенно и подкожно нелинейным белым мышам и внутримышечно морским свинкам не вызывало гибели и снижения массы тела животного. На месте инъекции препаратов патологические изменения (абсцессы, некрозы) отсутствовали. Коэффициенты прироста массы тела в течение эксперимента также не отличались от контроля.
Таким образом, после однократного введения препарата МБЧ нелинейным белым мышам и морским свинкам различными способами в дозах 100 мкг, 200 мкг, 300 мкг биологические показатели остаются в пределах физиологической нормы.
Изучение хронической токсичности препарата МБЧ Изучение хронической токсичности препарата МБЧ проводили при 3 кратном введении препарата нелинейным белым мышам подкожно и морским свинкам внутримышечно с интервалом введения в 3 дня.
Введение препарата МБЧ в дозах 100 мкг, 200 мкг, 300 мкг подкожно нелинейным белым мышам и внутримышечно морским свинкам не вызывало гибели и снижения массы тела животных. На месте инъекции препаратов патологические изменения некрозы) отсутствовали.
(абсцессы, Коэффициенты прироста массы тела в течение эксперимента также не отличались от контрольной группы животных.
Изучение биохимических показателей периферической крови у экспериментальных животных Определение АсТФ, АлТФ, мочевины и общего белка проводили с использованием наборов фирмы «Boehringer Mannheim», Германия. При большом разнообразии экспериментальных и методических приемов, применяемых в биохимии для изучения обменных функций печени и почек при введении чужеродных агентов, использование этих наборов гарантирует высокую чувствительность и воспроизводимость.
Известно, что основными органами в системе биотрансформации чужеродных агентов являются печень и почки. При введении препарата МБЧ нелинейным белым мышам подкожно и морским свинкам внутримышечно наблюдалась незначительная тенденция в сторону повышения АсТФ, АлТФ и мочевины по сравнению с контрольной группой животных на всех сроках определения. Незначительные сдвиги биохимических показателей не связаны с патологией печени и почек, т.к. при патоморфологическом исследовании паренхиматозных органов нелинейных белых мышей и морских свинок отмечено нормальное состояние микроциркуляторного русла печени и почек, архитектоника печени нормальная. Дольковое строение подчеркивалось характерным распределением гликогена с преобладанием его в гепатоцитах, расположенных по периферии долек. В почках экспериментальных животных патологических изменений не выявлялось. Архитектоника была сохранена. Кровенаполнение умеренное. Базальные капилляры клубочков не утолщены. Канальцевый эпителий без дегенеративных изменений. Таким образом, введение препарата МБЧ нелинейным белым мышам и морским свинкам не вызывало патологических изменений в органах и тканях экспериментальных животных;
нарушений обменных функций печени и почек отмечено не было.
Изучение анафилактогенности препарата МБЧ Препарат МБЧ в разрешающей дозе 100 мкг (1 мл) не вызывал у морских свинок симптомов анафилактического шока (отсутствовала взъерошенная шерсть, чихание, почесывание и гибель животных) на 25-й день от начала сенсибилизации.
Изучение пирогенных свойств препарата МБЧ При разработке инъекционных форм лекарственных препаратов показатель пирогенности является одним из существенных параметров при контроле качества иммунобиологических препаратов. Динамика температурной реакции кроликов при изучении пирогенных свойств препарата МБЧ представлена в табл. 5.
Таблица Оценка пирогенных свойств препарата МБЧ Температура тела до Температура тела после Повышение Сумма введения препарата, С введения препарата, температуры максимальных С тела, С изменений температуры по Через Через Через 3-м животным, 1ч 2ч 3ч С 39,0 39,0 39,2 39,3 0, 38,8 39,1 39,2 39,1 0,4 1, 38,9 39,3 39,3 39,2 0, В ходе проведенного исследования установлено, что препарат МБЧ апирогенен в иммунизирующей дозе 30 мкг на одного кролика.
Получение препарата МБЧ и вакцинных композиций и обсуждение механизмов иммунологического реагирования Одной из особенностей возбудителя туберкулеза является бактерионосительство. Это свидетельствует о недостаточной стимуляции Т клеточного иммунного ответа после иммунопрофилактики вакциной BCG (активация цитотоксических лимфоцитов, способных элиминировать зараженные клетки организма). Поэтому проблема повышения иммуногенности вакцины BCG имеет важное эпидемиологическое и эпизоотологическое значение.
Для вакцинации людей и животных перспективным представляется создание такой конструкции противотуберкулезной вакцины, которая бы сочетала в себе широкий спектр антигенов возбудителя, стимуляторов иммунного ответа и имела бы размер, сравнимый с микобактерией, т.е.
имитировала бы полный антиген. Известна молекулярная конструкция вирусоподобного типа как средство доставки иммуногенов, содержащая в центре полирибонуклеотид дсРНК (стимулятор иммунной резистентности организма), покрытый слоем конъюгата: спермидин-полиглюкин-субстрат и/или аналог субстрата фермента, а на поверхности частиц – гибридные белки, содержащие эпитопы инфекционного агента и фермент. Такого рода вирусоподобные частицы вызывали повышение и пролонгацию иммунного ответа, выступая в качестве своеобразного депо антигенов инфекционного агента (например, ВИЧ) (Лебедев Л.Р., 2000). Описанная конструкция до нашей работы применялась только для создания противовирусных вакцин.
Основной задачей нашей работы являлось создание противотуберкулезной вакцинной композиции на основе широкого спектра антигенов микобактерий вакцинного штамма BCG, способной эффективно стимулировать Т- и В-клеточные звенья иммунного ответа у млекопитающих. Поставленная задача решалась путем создания молекулярной конструкции, которая представляет собой МБЧ, в центре которых находится дсРНК, а на поверхности – набор белков-антигенов вакцинного штамма BCG в составе конъюгата спермидин-полиглюкин.
В механизме иммунного ответа при вакцинации препаратом МБЧ существенным фактором является воздействие дсРНК на макрофаги и НК клетки клетки-киллеры) и индукция синтеза (неспецифические интерферонов, в основном ИФН-. Известно, что важнейшим событием в процессе формирования иммунного ответа является определение пути, по которому пойдет развитие Т-хелперов. Индукция синтеза ИФН- при вакцинации наряду со стимуляцией гуморального (В-клеточного, T2 хелперного) пути стимулирует Т-клеточный (Т1-хелперный) иммунный ответ. Совместное введение микобактериальных антигенов с индуктором ИФН- (дсРНК) в составе МБЧ приводит к ускорению дифференцировки Т лимфоцитов.
Результаты исследования противотуберкулезной эффективности конъюгата моксифлоксацина с карбоксиметилглюканом в экспериментах in vitro В работе исследована противотуберкулезная активность соединения, в котором моксифлоксацин конъюгирован с высокомолекулярным носителем карбоксиметил-(1g3)--D-глюканом. Конъюгат для исследований противотуберкулезной активности был предоставлен в рамках проекта МНТЦ 2174р д.м.н. М.И. Душкиным и к.м.н. Я.Ш. Шварцем, обосновавшими возможность использования карбоксиметил-(1g3)--D-глюкана в качестве средства целенаправленного транспорта лекарственных средств в макрофаги и показавшими селективный захват через скавенджер-рецепторы и повышенную аккумуляцию конъюгата в макрофагах (Dushkin et al., 1996;
Schwartz et al., 2006).
Используемый в работе конъюгат содержал 107 мг моксифлоксацина на 1 г конъюгата. Рабочая концентрация конъюгата 2,5 мкг/мл была выбрана на основании литературных данных (Roseeuw E. et al., 2003) как минимальная ингибирующая концентрация моксифлоксацина для M. tuberculosis in vitro, которая соответствует концентрации 0,25 мкг/мл моксифлоксацина по активному веществу.
Внесение конъюгата в концентрации 2,5 мкг/мл в инкубационную среду макрофагальных клеток линии J774, инфицированных микобактериями туберкулеза, приводило к значительному подавлению роста высеваемых микобактерий. Через 4 часа после добавления моксифлоксацина или конъюгата количество микобактерий туберкулеза снижалось в среднем в раз. В то же время в культуре необработанных макрофагов или макрофагов после добавления карбоксиметилглюкана количество микобактерий не уменьшалось. Увеличение концентрации конъюгата приводило к дальнейшему снижению количества высеваемых микобактериальных клеток.
Оценка действия карбоксиметилглюкана и моксифлоксацина на фагоцитарную активность макрофагов по отношению к микобактериям Макрофагальные клетки линии J774 культивировали в 24-луночных планшетах до формирования монослоя (0,5-1,0 106 кл/лунку) при 37С в атмосфере 5% СО2 в питательной среде RPMI-1640 с добавлением 10% FCS и 2 мМ L-глутамина, далее клетки инкубировали 3 часа в присутствии моксифлоксацина, карбоксиметилглюкана. Затем для оценки поглотительной активности клеток в монослои вносили микобактерии BCG (M. bovis) из расчета 100 микробных тел/клетку, инкубировали в течение 60 мин, 3-кратно отмывали PBS с pH 7,4, клетки фиксировали, окрашивали по Романовскому – Гимза и определяли процент фагоцитирующих клеток.
Монослои макрофагов были подразделены на группы: интактные клетки (контроль), клетки, инкубированные с M. bovis, моксифлоксацином ( мкг/мл) + M. bovis, и клетки, инкубированные с карбоксиметилглюканом ( мкг/мл) + M. bovis. Результаты оценки поглотительной активности представлены на рис. 8.
*- различия статистически значимы по отношению к группе BCG при Р0,05.
Рис. 8. Фагоцитарная активность клеток J774 по отношению к M. bovis Полученные данные (рис. 8) показывают, что более 60% M. bovis фагоцитируются макрофагальными клетками в течение 60 мин. При этом карбоксиметилглюкан стимулирует фагоцитарную активность макрофагов, что, очевидно, может способствовать более активной элиминации микобактерий макрофагами.
Изучение противотуберкулезного действия конъюгата моксифлоксацина с карбоксиметилглюканом в экспериментах in vivo В модели острой туберкулезной инфекции, вызванной заражением мышей линии С57Bl/6 микобактериями штамма M. tuberculosis Erdman, было показано, что как свободный моксифлоксацин, так и конъюгат моксифлоксацина с карбоксиметилглюканом подавляют размножение микобактерий. При высеве 10%-ных гомогенатов органов (печень, селезенка) на питательную среду Middlebrook 7H10 в контрольной группе животных наблюдали значительно более интенсивный рост микобактериальных колоний, чем в группах животных, обработанных свободным или конъюгированным моксифлоксацином (рис. 9).
Примечание: *- различия при дозах конъюгата 50 и 200 мкг/кг достоверны по сравнению с эквимолярными дозами свободного моксифлоксацина, при P0, Рис. 9. Влияние моксифлоксацина и его конъюгата на размножение микобактерий Из представленных данных (рис. 9) видно, что при введении максимальной дозы конъюгата 200 мкг/кг из органов экспериментальных животных высевались единичные колонии микобактерий. Конъюгированный препарат оказывал более выраженный антимикобактериальный эффект, чем свободный моксифлоксацин (различия при дозах конъюгата 50 и 200 мкг/кг высокодостоверны по сравнению с эквимолярными дозами свободного моксифлоксацина). Эффективность подавления размножения микобактерий в органах животных, которым вводили моксифлоксацин и конъюгат, была дозозависимой.
Таким образом, конъюгат моксифлоксацина с карбоксиметилглюканом обладает выраженным антитуберкулезным эффектом, проявляющимся в ингибировании размножения микобактерий в органах инфицированных животных.
Известно, что макрофаги имеют множество специфических рецепторов на цитоплазматической мембране (Kodama T., 1990;
Suzuki H., 1997), с которыми связываются различные лиганды. Среди рецепторов имеются так называемые маннановые, глюкановые и галактановые рецепторы, которые связываются с нейтральными полисахаридами бактериальной природы, в результате чего осуществляется перенос этих полисахаридов внутрь клетки через рецептор-опосредованный фагоцитоз (РОФ) (Koren H., 1992). Низкая эффективность иммунного ответа против туберкулезной инфекции связана в том числе и с супрессированием продукции ИФН-, вызываемой отсутствием активации макрофагов и снижением в них продукции ИЛ-12 основного цитокина, стимулирующего антитуберкулезный ответ (Zhang M., 1995;
Flynn Можно предположить, что адресная доставка J., 1995).
противотуберкулезного препарата в инфицированные макрофаги не только снизит бактериальную нагрузку на организм, но и приведет к активации как специфических, так и неспецифических факторов иммунитета при лечении туберкулеза. Способность конъюгированных с лекарствами нейтральных полисахаридов активировать макрофаги является дополнительным механизмом антитуберкулезной активности. Кроме этого известны макрофагальные рецепторы, связывающие заряженные макромолекулы для захвата лиганда. Данные рецепторы высокоаффинны не только к незаряженным полисахаридам (арабиногалактану, маннану, -глюкану и др.), но и к полианионным молекулам, включая отрицательно заряженные полисахариды гепарин, бактериальные (декстрансульфат, липополисахариды) и модифицированные липопротеины и протеины (Krieger M., 1994). Кроме того, химическое связывание лекарственных средств (препаратов) с глюканами по карбоксильным или сульфатным группам ведет к селективному захвату лекарственных средств макрофагами через РОФ (Groman E.V., 1995;
Dushkin M., 1996).
Первичное распознавание микобактериальных клеток, которое происходит благодаря набору генетически кодируемых рецепторов, приводит к клеточной активации и в конечном счете к селективной доставке конъюгатов антитуберкулезных препаратов с лигандами непосредственно внутрь клетки, что способствует созданию высоких концентраций антитуберкулезных препаратов непосредственно в местах интенсивного размножения микобактерий, т.е. внутри макрофагов. Такой подход (доставка лекарственных средств посредством лигандов к клеткам-мишеням через специфические рецепторы к незаряженным полисахаридам) уже широко используется для лечения различных инфекционных заболеваний (Groman E.V., 1995;
Groman E.V., 1996). Аналогичный подход – через РОФ – в противотуберкулезной терапии применен при использовании конъюгата пара-аминосалициловой кислоты с бычьим сывороточным альбумином. Эта работа продемонстрировала повышение антибактериальной эффективности конъюгата в сравнении с неконъюгированным препаратом как в культуре мышиных макрофагов in vitro, так и на модели инфицированных морских свинок in vivo (Majumdar S., 1995).
В заключение необходимо отметить, что в вопросах разработки эффективных лечебно-профилактических препаратов против туберкулеза приходится искать новые пути решения этой сложнейшей задачи в русле современных знаний о биологии возбудителя туберкулеза, с использованием новейших методов молекулярной биологии и биотехнологии.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ Полученные результаты научных исследований являются основой к созданию и производству препаратов нового поколения для профилактики и лечения туберкулеза. Федеральная целевая программа «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 годы) предусматривает разработку современных средств профилактики, диагностики, лечения и реабилитации, а также технологий производства противотуберкулезных препаратов.
Материалы диссертации используются, в том числе и в учебно образовательном процессе при проведении курсов повышения квалификации специалистов микробиологических лабораторий Министерства здравоохранения и социального развития РФ и Министерства сельского хозяйства РФ на базе в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
ВЫВОДЫ 1. Впервые созданы конструкции искусственных микобактериальных частиц (МБЧ) на основе антигенов BCG и дсРНК и разработан метод их получения.
2. Показано, что сконструированные искусственные микобактериальные частицы на основе антигенов вакцинного штамма M. bovis могут быть использованы для формирования противотуберкулезного иммунитета.
3. Иммунизация лабораторных животных микобактериальными частицами на основе антигенов BCG и дсРНК с включёнными в их состав цитокинами (ИФН- и ФНО-) существенно повышает степень их резистентности к экспериментальной туберкулезной инфекции (на 20% и 10% относительно вакцины BCG соответственно).
4. Искусственные микобактериальные частицы на основе белков BCG и дсРНК устойчивы к действию рибонуклеаз и обладают высокой стабильностью и хорошей растворимостью.
5. Искусственные микобактериальные частицы в иммунизирующей дозе мкг/животное обладают высокой иммуногенностью, апирогенны и не анафилактогенны.
6. Искусственные микобактериальные частицы в дозах, в 3-10 раз превышающих иммунизирующую дозу, являются безвредными (не приводят к изменению основных биохимических и гематологических показателей у экспериментальных лабораторных животных и не вызывают токсических эффектов).
7. Введение -интерферона и искусственных микобактериальных частиц обеспечивает повышенный уровень специфического клеточного иммунного ответа по сравнению с таковым, вызванным иммунизацией вакциной BCG.
8. Впервые показана противотуберкулезная эффективность конъюгирован ной формы карбоксиметил-(1g3)--D-глюкана с моксифлоксацином in vivo и in vitro.
10. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ для публикации основных результатов диссертации 1. Азаев М.Ш., Лебедев Л.Р., Кузьмичёва Г.А., Туманов Ю.В., Донченко Н.А., Татьков С.И., Носарева О.В., Ильичёв А.А. Исследование роли искусственных микобактериальных частиц в реализации иммунологических процессов при экспериментальном туберкулезе животных. // Проблемы туберкулеза и болезней легких. -№ 2.- 2007. - С. 38-42.
2. Носарева О.В., Нестеров А.Е., Смирнова О.Ю., Болдырев А.Н., Порываев В.Д., Азаев М.Ш., Татьков С.И.. Конструирование и изучение иммуногенных свойств препарата на основе рекомбинантной плазмиды, кодирующей микобактериальный антиген ESAT-6, и модифицированного полисахаридного конъюгата. Биотехнология. -2007. - №6. - С. 18-26.
3. Schwartz YS, Dushkin MI, Vavilin VA, Melnikova EV, Khoschenko OM, Kozlov VA,Agafonov AP, Alekseev AY, Rassadkin Y, Shestapalov AM, Azaev MSh, Saraev DV,Filimonov PN, Kurunov Y, Svistelnik AV, Krasnov VA, Pathak A, Derrick SC,Reynolds RC, Morris S, Blinov VM. Novel Conjugate of Moxifloxacin and Carboxymethylated Glucan with Enhanced Activity against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. Jun;
50(6):1982-8.
4. Сивков А.Ю., Болдырев А.Н., Азаев М.Ш. и др. Определение причин распространения MDR-штаммов на основе анализа популяции рифампицин и /или изониазидустойчивых изолятов M. TUBERCULOSIS // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология: научно-теоретический журнал. - № 2. - 2006. - С. 20-25.
5. Азаев М.Ш., Агафонов А.П., Боднев С.А., Блинов В.М. Исследование противотуберкулезной активности молекулярно-биологических конструкций на основе конъюгата антибиотика моксифлоксацина с лигандом к скавенджер-рецептору макрофага // Антибиотики и химиотерапия. - № 11- (ноябрь-декабрь). – 2006. - С. 5-8.
6. Азаев М.Ш., Лебедев Л.Р., Туманов Ю.В. и др. Получение искусственных микобактериальных частиц и исследование их иммуногенных свойств // Биотехнология.- №4.- 2004.- С.34-40.
7. Мокеева А.В., Орешкова С.Ф., Попова А.Г., Сивков А.Ю., Туманов Ю.В., Азаев М.Ш., Татьков С.И., Ильичев А.А.. Генотипический полиморфизм клинических штаммов микобактерий туберкулеза, циркулирующих на территории Новосибирской области // Вестник Российской АМН. - № 1.
2005. - С. 20-23.
8. Татьков С.И., Норкина О.В., Филипенко М.Л., Сивков А.Ю., Болдырев А.Н., Азаев М.Ш., Киншт В.Н., Курунов Ю.Н., Краснов В.А., Медведева Е.В., Баранова О.И., Ивлев-Дунтау А.П., Боднев С.А., Блинова Л.Н., Пасечников А.Д. Молекулярно-генетическая характеристика устойчивых к рифампицину и (или) изониазиду изолятов Mycobacterium tuberculosis, выделенных в Новосибирской и Томской областях // Вестник Российской АМН. - №7. - 2005. - С.26-36.
9. Лебедев Л.Р., Азаев М.Ш., Туманов Ю.В, Сизов А.А., Ильичев А.А., Татьков С.И. Искусственные микобактериальные частицы для иммунизации против туберкулеза // Доклады Академии наук. Т. 387. - № 2. – 2002. - С.272 275.
10. Туманова О.Ю., Кувшинов В.Н., Азаев М.Ш., Машарский А.Э., Климов Н.А., Козлов А.П., Ильичев А.А., Сандахчиев Л.С. Получение пептидов имитаторов эпитопа белка gp41 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), узнаваемого вируснейтрализующими антителами 2F5. Молекулярная биология.- 2001.- Т.35. - №.1.- С.1-6.
11. Лебедев Л.Р., Карпенко Л.И., Порываева В.А., Азаев М.Ш. и др.
Конструирование вирусоподобных частиц, экспонирующих эпитопы ВИЧ-1.
Молекулярная биология. - 2000. -Т.34.- №3. - С.1-6.
Патенты:
12. Азаев М.Ш., Татьков С.И., Донченко Н.А.
Средство для снижения токсичности химически синтезированных противотуберкулезных лекарственных препаратов. Патент на изобретение № 2190417 г. Москва, 10 октября 2002 г.
13. Азаев. М.Ш., Лебедев Л.Р., Кузьмичева Г.А., Татьков С.И.
Искусственные микобактериальные частицы и противотуберкулезная вакцинная композиция на их основе. Патент на изобретение. № 2242245.
Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20 декабря 2004 г.
Методические указания 14. Покровский А.Г., Азаев М.Ш., Федюк Н.В.
Лабораторная диагностика туберкулеза. Методические указания для студентов. – Новосибирский государственный университет. – 2003.
Работы, опубликованные в сборниках научных трудов, материалах конференций и других изданиях 15. Татьков С.И., Смирнова О.Ю., Туманов Ю.В., Азаев М.Ш., Кожина Е.М., Дунтау А.П., Медведева Е.В., Баранова О.И., Гришаева О.Н. Исследование генетических причин устойчивости к рифампицину штаммов M.Tuberculosis, циркулирующих в г. Новосибирске // Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера. Вторая научная конференция с международным участием. Новосибирск. Россия. 29-30 мая 2002. - С.212.
16. Сивков А.Ю., Болдырев А.Н., Азаев М.Ш., Медведева Е.В., Дунтау А.П., Туманов Ю.В., Татьков С.И. Рекомбинантные белки M.tuberculosis в серологической диагностике туберкулеза // Межрегиональная научная конфе ренция, посвященная 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С.П. Карпова (Тезисы докладов 7-10 октября, 2003), Томск-2003. - С.170-171.
17. Азаев М.Ш., Лебедев Л.Р., Кузьмичева Г.А., Туманов Ю.В., Сизов А.А., Татьков С.И. Иммунобиологические свойства искусственных микобактериальных частиц // Межрегиональная научная конференция, посвященная 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С.П.
Карпова (Тезисы докладов 7-10 октября, 2003), Томск-2003.- С.140-141.
18. Душкин М.И., Шварц Я.Ш., Сенников С.В., Вавилин В.А., Мельникова Е.В., Козлов В.А., Агафонов А.П., Алексеев А.Ю., Рассадкин Ю.Н, Шестапалов А.М., Иванькина Т.Ю., Сараев Д.В., Азаев М.Ш., Фрейдин М.Б., Фрейдин А.В., Рудько А.В., Пузырев В.П., Курунов Ю.Н., Краснов В.А., Reynolds R., Morris R., Блинов В.М. Целенаправленная доставка противотуберкулезных антибиотиков в макрофаги, инфицированные Mycobacterium tuberculosis // Международная конференция: «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний». Новосибирская область, «Сосновка», 8-10 сентября 2004 г.
- С.142-143.
19. Татьков С.И., Болдырев А.Н., Сивков А.Ю., Боднев С.А., Кузьмичева Г.А., Смирнова О.Ю., Азаев М.Ш., Туманов Ю.В., Дунтау А.П., Медведева Е.В., Лисиченко Г.М., Курунов Ю.Н., Краснов В.А., Уразова О.И., Стрелис А.К., Сурикова О.В., Филипнеко М.Л., Блинова Л.Н., Пасечников А.Д.
Генетический анализ MDR-штаммов M. tuberculosis, распространенных на территории Новосибирской и Томской областей // Международная конференция: «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний». Новосибирская область, «Сосновка», 8- сентября 2004 г. - С.153-154.
20. Nosareva O., Smirnova O., Boldyrev A., Tumanov Yu., Azaev M., Lebedev L., Tatkov S. Construction of artificial virus-like particles exposing Mycobacterial ESAT-6, and the study of their immunogenic properties //
Abstract
book Keystone Symposia “Tuberculosis: Integrating Host and Pathogen Biology”. Whistler, British Columbia, Canada.-2005.-P.94.
21. Azaev M.Sh., Korolev St.A., Lebedev L.R., Kuzmicheva G.A., Tumanov Yu.V., Nosareva O.V., Tatkov S.I. Artificial mycobacterial particles as a novel, compound for immunoprophylactic against tuberculosis // Proceedings of international scientific interdisciplinary workshop. Thailand- Bangkok. March, 2006. -P.6-7.
22. Туманов Ю.В., Болдырев А.Н., Смирнова О.Ю., Лебедев Л.Р., Азаев М.Ш., Носарева О.В., Ивлев-Дунтау А.П., Татьков С.И. Выявление маркеров Т-клеточного иммунитета в видоспецифической диагностике туберкулеза // III Российская конференция с международным участием "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" г. Новосибирск, 27-29 сентября 2006. - С. 166-167.
23. Лебедев Л.Р., Карпенко Л.И., Бажан С.И., Белявская В.А., Порываева В.А., Азаев М.Ш., Рябчикова Е.И., Зайцев Б.Н., Масычева В.И., Ильичев А.А. Конструирование искусственных иммуногенов // III Российская конференция с международным участием "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" г.
Новосибирск, 27-29 сентября 2006. - С.74-75.
24. Азаев М.Ш., Лебедев Л.Р., Туманов Ю.В., Донченко Н.А., Кузьмичева Г.А., Татьков С.И., Ильичев А.А. Создание искусственных микобактериальных частиц и исследование их роли в реализации иммунологических процессов при экспериментальном туберкулезе животных) // III Российская конференция с международным участием "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" г. Новосибирск, 27-29 сентября 2006. - С.132-133.
25. Азаев М.Ш., Лебедев Л.Р., Татьков С.И., Азаева Э.М., Вердиханова А.М., Ильичев А.А. Создание вакцинных композиций для профилактики туберкулеза // Труды Национального научно-исследовательского института медицинской профилактики им. В. Ахундова Минздрава Азербайджана, том 1, Баку, 2007. - С. 535-536.
26. Азаев М.Ш., Донченко Н.А., Кузьмичева Г.А., Ильичев А.А., Татьков С.И. Исследование действия ФНО-, Реаферона и ДНК из молок лососевых рыб на инфекционный и вакцинальный процессы при экспериментальном туберкулезе // Проблемы биологической и экологической безопасности.
Международная конференция. Тез. докл. Оболенск, 2000.- С. 219-221.
27. Мордвинов В.А., Татьков С.И., Сивков А.Ю., Азаев М.Ш. и др.
Генетическое разнообразие штаммов M.tuberculosis в Западной Сибири и проблема иммунопрофилактики туберкулеза // Международная научно практическая конференция: «Перспективы сотрудничества государств членов ШОС и противодействия угрозе инфекционных болезней.
Новосибирск. Россия. 14-15 мая 2009.- С.153.