Авторефераты диссертаций >> Авторефераты по Биологии

Взаимодействие тиофлавина т с амилоидными фибриллами: механизм встраивания, параметры связывания, изменение фотофизических характеристик красителя

На правах рукописи

СУЛАЦКАЯ Анна Игоревна ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТИОФЛАВИНА Т С АМИЛОИДНЫМИ ФИБРИЛЛАМИ:

МЕХАНИЗМ ВСТРАИВАНИЯ, ПАРАМЕТРЫ СВЯЗЫВАНИЯ, ИЗМЕНЕНИЕ ФОТОФИЗИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК КРАСИТЕЛЯ 03.01.03 – Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2013 2

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук (ИНЦ РАН), Санкт-Петербург доктор биологических наук Научные руководители:

Ирина Михайловна КУЗНЕЦОВА, ИНЦ РАН, Санкт-Петербург доктор физико-математических наук Константин Константинович ТУРОВЕРОВ, ИНЦ РАН, Санкт-Петербург доктор физико-математических наук

Официальные оппоненты:

Андрей Леонидович ТИМКОВСКИЙ Федеральное государственное бюджетное учреждение Петербургский институт ядерной физики им. Б.П.Константинова, Санкт-Петербург доктор биологических наук Алексей Николаевич Скворцов Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный политехнический университет» Федеральное государственное бюджетное

Ведущая организация:

учреждение науки Институт биохимии им. А.Н.

Баха Российской академии наук

Защита диссертации состоится "28" июня 2013 года в 12 ч. на заседании Диссертационного совета Д 002.230.01 на базе ИНЦ РАН по адресу: 194064, Санкт Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.

Сайт института: www.cytspb.rssi.ru Электронный адрес: [email protected] Факс: 8(812) 297-35-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНЦ РАН.

Автореферат разослан "27" мая 2013 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Е. В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Вопрос о том, как полипептидная цепь глобулярных белков сворачивается в уникальную, компактную, высокоорганизованную, функционально активную структуру, является одним из центральных вопросов физико-химической и кле точной биологии. Уже давно было замечено, что при сворачивании белков могут возникать частично-свернутые состояния, содержащие элементы структуры, которых нет в нативном белке и возникновение которых определяет склонность белка к образованию агрегатов. Кроме того, необходимо учитывать, что жизненный цикл белка проходит в условиях густо населенной среды клетки, т.е. в условиях молекулярного краудинга, что стимулирует про цессы, приводящие к увеличению доступного клеточного объема, в том числе процессы аг регации белков.2, Долгое время процессам агрегации белков при фолдинге не уделялось должного вни мания. Ситуация резко изменилась, когда стало очевидным, что возникновение упорядочен ных агрегатов – амилоидных фибрилл сопряжено с возникновением многих тяжелых заболе ваний, таких как нейродегенеративные болезни Альцгеймера и Паркинсона, прионные забо левания и др., которые часто называют "конформационными болезнями".4-10 Дальнейшие ис следования показали, что образование амилоидных фибрилл – свойство, присущее не только тем белкам, фибриллогенез которых связан с возникновением болезней, но и многим другим (если не всем) белкам.11-15 Оказалось также, что, несмотря на многообразие структур ами лоидогенных белков, все амилоидные фибриллы имеют сходную архитектуру: они представ ляют собой неразветвленные образования, богатые бета-складчатой структурой, в которой антипараллельные бета-листы направлены перпендикулярно оси фибриллы.16,17 В связи с этим долгое время считалось, что структура амилоидных фибрилл, полученных на основе разных белков, идентична. Впоследствии, однако, оказалось, что это не совсем так: были об наружены различия в структуре амилоидных фибрилл на основе различных амилоидогенных белков18,19 и даже фибрилл, полученных при разных условиях на основе одного и того же белка. Поскольку фибриллярное состояние, обогащенное бета-складчатыми структурами, по видимому, является одним из основных состояний белковой молекулы, исследование амило идных фибрилл актуально для решения фундаментальной проблемы фолдинга белков.

Для диагностики возникновения амилоидных фибрилл in vivo и in vitro давно и эффек тивно используется бензтиазольный краситель тиофлавин Т (ThT).20-27 Это обусловлено вы сокой специфичностью взаимодействия ThT с амилоидными фибриллами. Краситель не вза имодействует с белками в нативном состоянии (за исключением ацетилхолинэстеразы и сы вороточных альбуминов), с белками в развернутом и промежуточных частично-свернутых состояниях, а также с аморфными агрегатами белков. При взаимодействии с белками в со стоянии амилоидных фибрилл, его квантовый выход флуоресценции возрастает в несколько тысяч раз, тогда как свободный краситель в водном растворе имеет очень низкий квантовый выход флуоресценции. Несмотря на широкое использование ThT в качестве флуоресцент ного зонда до сих пор нет единого мнения о механизме встраивания ThT в амилоидные фиб риллы и о фотофизических свойствах этого красителя.28, В последнее время стало очевидно, что ThT можно использовать не только для диагно стики образования амилоидных фибрилл, но и для изучения их структуры. В связи с этим ак туальной задачей является определение параметров связывания ThT с амилоидными фиб риллами.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в исследовании взаимодействия флуоресцентного зонда ThT с амилоидными фибриллами, полученными на основе различ ных белков. В задачи исследования входило:

1. Изучение спектральных свойств свободного и связанного с амилоидными фибрилла ми ThT и выяснение причин возрастания квантового выхода флуоресценции красителя при встраивании в амилоидные фибриллы.

2. Определение механизма встраивания ThT в амилоидные фибриллы.

3. Разработка методики определения параметров связывания ThT с амилоидными фиб риллами (числа центров связывания с различным сродством к ThT (мод связывания), кон стант связывания и числа мест связывания) и фотофизических свойств красителя, связанного с амилоидными фибриллами (спектров поглощения, коэффициентов молярной экстинкции и квантового выхода флуоресценции).

4. Получение амилоидных фибрилл на основе различных амилоидогенных белков и сравнение их структуры с использованием разработанного подхода.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. «Коротковолновые» полосы флуоресценции (max=440 нм) и возбуждения флуорес ценции (max=340 нм) водных растворов ThT обусловлены тем, что часть молекул имеет кон формацию с нарушенной системой -сопряженных связей бензтиазольного и аминобензоль ного колец красителя.

2. Максимум спектра поглощения ThT, встроенного в амилоидные фибриллы, сдвинут относительно максимума спектра поглощения свободного ThT в водном растворе (max= нм) в длинноволновую область, в то время как максимумы спектров флуоресценции свобод ного и связанного с фибриллами красителя близки (max=480 нм).

3. Значение квантового выхода флуоресценции красителя при встраивании в амилоид ные фибриллы определяется не только подвижностью фрагментов молекулы ThT (бензтиа зольного и аминобензольного колец) друг относительно друга в возбужденном состоянии, но и конформацией молекул красителя в основном состоянии.

4. Существующие предположения об образовании димеров или мицелл молекулами ThT в водном растворе и при встраивании в амилоидные фибриллы не обоснованы. ThT встраивается в амилоидные фибриллы в мономерной форме.

5. Метод, основанный на абсорбционной спектрофотометрии растворов, полученных с использованием равновесного микродиализа, позволяет определить параметры связывания ThT с амилоидными фибриллами, а также фотофизические характеристики связанного кра сителя. Предложенный подход может быть использован для сравнительного изучения струк туры амилоидных фибрилл.

Научная новизна работы. Результаты исследования позволили по-новому взглянуть на фотофизические свойства свободного и связанного с амилоидными фибриллами ThT. Да но новое объяснение существованию «коротковолновых» полос флуоресценции и возбужде ния флуоресценции ThT в водных растворах. Сделано заключение о том, что эти аномальные полосы обусловлены наличием в растворе молекул ThT с нарушенной системой сопряженных связей бензтиазольного и аминобензольного колец. Измерение интенсивности флуоресценции ThT в водно-глицериновых смесях позволило пересмотреть существующие представления о причинах возрастания квантового выхода флуоресценции красителя при его встраивании в амилоидные фибриллы. Впервые показано, что значение квантового выхода флуоресценции красителя при встраивании в амилоидные фибриллы обусловлено не только подвижностью бензтиазольного и аминобензольного колец молекулы ThT друг относительно друга в возбужденном состоянии, но и ее конформацией в основном состоянии. Были про анализированы существующие гипотезы о механизме встраивания ThT в амилоидные фиб риллы и сделано заключение о том, что краситель встраивается в фибриллы в мономерной форме, а предположения об образовании им димеров и мицелл не обоснованы.

Впервые для определения параметров связывания ThT с амилоидными фибриллами использован метод, основанный на прямом спектрофотометрическом определении концен трации свободного и связанного с фибриллами красителя в растворах, полученных методом равновесного микродиализа. Этот подход позволяет также определять спектры поглощения, коэффициенты молярной экстинкции и квантовый выход флуоресценции ThT (при измере нии интенсивности флуоресценции тех же растворов), взаимодействующего с сайтами каж дой из мод связывания.

Показано что, параметры связывания ThT с амилоидными фибриллами на основе ин сулина, лизоцима и Абета-пептида и характеристики встроенного в них красителя сущест венно различаются. Подход, разработанный в настоящей работе, может быть использован для изучения полиморфизма амилоидных фибрилл и сравнительного изучения структуры амилоидных фибрилл, полученных на основе различных белков.

Теоретическое и практическое значение работы. В связи с эффективным примене нием ThT в качестве флуоресцентного зонда и перспективами его использования для изуче ния структуры амилоидных фибрилл, а его аналогов – в качестве терапевтических агентов, выяснение специфических особенностей этого красителя и формирование представлений о его фотофизических свойствах имеет существенное теоретическое и практическое значение.

Разработка специальной методики, позволяющей получать информацию о параметрах связывания ThT с амилоидными фибриллами, а также о спектральных свойствах и квантовом выходе флуоресценции связанного красителя, является важным шагом на пути изучения структуры амилоидных фибрилл, что, в свою очередь, может дать важнейшую информацию для выяснения факторов, способствующих фибриллообразованию, и о механизмах этого процесса. Таким образом, результаты проведенной работы могут быть существенны для по нимания фундаментальных основ фолдинга и агрегации (нарушения фолдинга) белков.

Проведенные исследования имеют существенное прикладное значение в виду широкого распространения заболеваний, вызванных или сопровождающихся образованием амилоид ных фибрилл. Показано, что образованием амилоидных бляшек сопровождаются все нейро дегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, Гентингтона, Пи ка. Известны также амилоидозы, которые не связаны напрямую с основным заболеванием, а являются осложнениями лечебных мероприятий. К этому виду патологии можно отнести ин сулиновый амилоидоз и так называемый гемодиализный амилоидоз, которые приводят к су щественному снижению качества жизни больных. Изучение взаимодействия флуоресцент ных красителей с амилоидными фибриллами может рассматриваться как перспективный подход для создания биосенсорных систем для ранней диагностики заболеваний, сопровож даемых различного рода амилоидозами.

Поскольку разработанный нами подход к исследованию взаимодействия ThT с амило идными фибриллами универсален, он может быть востребован в молекулярной фармаколо гии при определении параметров связывания белков с активными веществами (лигандами), в том числе с лекарствами. В частности, чрезвычайно важно правильное определение констан ты связывания красителей, способных преодолевать гематоэнцефалический барьер. Кроме того, результаты работы могут быть использованы для анализа взаимодействия амилоидных фибрилл с химическими веществами (в том числе нефлуоресцирующими), которые способ ны подавлять процесс образования амилоидных фибрилл.

Результаты работы используются при проведении лекционно-практических занятий для студентов 4 курса Кафедры биофизики СПбГПУ.

Личный вклад автора. Все экспериментальные процедуры и обработка результатов выполнены автором лично. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научными руководителями.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на 37-й и 38-й Неделе науки СПбГПУ (Санкт-Петербург, 2008, 2009), Политехническом симпозиуме: «Мо лодые учёные – промышленности Северо-Западного региона», (Санкт-Петербург, 2008, 2010);

XIII Европейской конференции спектроскопии биологических молекул (Италия, 2009), II и III Конференции молодых ученых Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2010, 2012);

6-й и 8-й Санкт-Петербургской конференции молодых ученых (Санкт Петербург, 2010, 2012), III Конференции "Современные проблемы молекулярной биофизи ки" (Санкт-Петербург, 2011), 17-м Международном биофизическом конгрессе (Китай, 2011), VІ Международной научной конференции молодых ученых «Биология: от молекулы до био сферы» (Украина, 2011), 37-м Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ (Испания, 2012) и семинарах Лаборатории структурной динамики, стабильности и фолдинга белков ИНЦ РАН.

По материалам диссертации опубликовано 26 печатных работ, в том числе 11 статей в рецензируемых научных журналах из перечня изданий, рекомендованных Высшей аттеста ционной комиссией для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук.

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке про граммы президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», Министерства образования и науки (Соглашение № 14.132.21.1311), Российского фонда фундаментальных исследований (гранты 07-04-01454, 08-04-90052_Бел, 10-04-90038_Бел, 12-04-01651, 12-04-90022_Бел, 13 04-02068, 13-04-01842), Президента РФ (стипендия № СП – 776.2012.4), фонда «Династия» (грант № ДП-Б-35/10) и Правительства Санкт-Петербурга (гранты ПСП № 10652, ПСП № 11566, ПСП № 12360).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из Введения, трех Глав, Выводов, Списка публикаций по теме диссертации и Списка цитируемой литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы. Для проведения исследований были использованы следующие материалы:

ThТ (Sigma-Aldrich and AnaSpec, США), ATTO-425 (ATTO-TEC, Германия), глицерин (Merk, Германия), ацетилхолинэстераза Electrophorus electricus (AChE), инсулин, уксусная кислота и NaCl (Sigma, США), лизоцим (Fluka, США), Абета-пептид (GL Biochem Ltd., China), KH2PO и NaOH (Реахим, Россия), GdnHCl (ICN Biomedicals, США).

Подготовка образцов. Амилоидные фибриллы на основе инсулина получали путем ин кубирования инсулина (10 мг/мл) в 20%-ной уксусной кислоте в присутствии 100 мМ NaCl (рН 2.0) при температуре 37° С и интенсивном перемешивании в течение 24 ч.30 Амилоидные фибриллы на основе лизоцима получали путем инкубирования лизоцима (2 мг/мл) в 0.05 М буфере KH2PO4-NaOH в присутствии 3М GdnHCl, рН 6.3 при температуре 50° С и интенсив ном перемешивании в течение 24 ч.31 Концентрацию GdnHCl проверяли рефрактометрически с использованием рефрактометра Abbe фирмы Ломо. Амилоидные фибриллы на основе Абе та-пептида получали путем инкубирования Абета-пептида (2 мг/мл) в 50%-ном hexafluoro-2 propanol (HFIP)/H2O и 0.02%-ном азиде натрия в течение 7 сут.32 Затем HFIP был выпарен в потоке азота, и образцы инкубировались при постоянном перемешивании еще 7 сут. AChE была растворена в 40 мМ фосфатном буфере (pH 7.0) в концентрации 1.5 мг/мл. Измерение спектров поглощения было выполнено с использованием спектрофотомет ра U-3900H (Hitachi, Япония). Для того чтобы охватить широкий диапазон концентраций красителя измерения проводились в кюветах фирмы Helma (Германия) c разной длиной оп тического пути (0.1, 0.2, 0.5, 1, 5 см).

При обработке измеренных спектров поглощения растворов ThT с амилоидными фиб риллами исключение из зарегистрированного спектра кажущейся оптической плотности, обусловленной светорассеянием амилоидных фибрилл, проводили с помощью стандартной процедуры. Измерение спектров флуоресценции проводили с использованием спектрофлуоримет рической установки собственного изготовления и установки фирмы Cary Eclipse (Varian, Ав стралия) со стационарным возбуждением. Для определения квантового выхода ThT в качест ве эталона был использован раствор флуоресцентного красителя ATTO-425 (ATTO) с из вестным квантовым выходом флуоресценции (0.9), спектры поглощения и флуоресценции которого по положению совпадают со спектрами ThT. Флуоресценция ThT и ATTO возбуж далась при длине волны 450 нм, а регистрировалась при длине волны 480 нм.

При определении квантового выхода флуоресценции ThT в водно-глицериновых смесях была учтена зависимость коэффициента молярной экстинкции красителя и коэффициента преломления раствора от вязкости раствора.35 Вязкость водно-глицериновых смесей была определена на основании данных о концентрации глицерина, полученных рефрактомериче ски с использованием рефрактометра Abbe фирмы LOMO.

Равновесный микродиализ проводился с использованием приспособления фирмы Harvard Apparatus/Amika (USA), которое состоит из двух камер равного объема (500 мкл), разделенных мембраной. В одну из камер помещались амилоидные фибриллы в буфере, в котором они были получены, в другую – краситель в том же растворителе. При проведении экспериментов использовали мембраны, непроницаемые для частиц c молекулярной массой больше 10000 Da.

Метод электронной микроскопии был использован для визуализации амилоидных фиб рилл. Эксперименты были выполнены с использованием электронного микроскопа Carl Zeiss Libra 120. Для негативного контрастирования препаратов использовали 1%-ный водный рас твор уранил-ацетата (Миронов и др. 1994). Белок наносили на медные сетки, покрытые кол лодиевой пленкой-подложкой, напыленной углем.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Несмотря на широкое и эффективное использование флуоресцентного красителя тиоф лавина Т (ThT) в качестве флуоресцентного зонда в тот момент, когда мы начинали эту рабо ту, не существовало однозначного представления о причинах возрастания квантового выхода флуоресценции красителя при встраивании в фибриллы, о его спектральных свойствах, а также о способах связывания ThT с амилоидными фибриллами.28,29 В связи с этим целью данной работы стало исследование взаимодействия флуоресцентного зонда ThT с амилоид ными фибриллами, полученными на основе различных белков.

Спектральные свойства ThT и механизм связывания красителя с амилоидными фибриллами Объяснение существования коротковолновых спектров флуоресценции и возбужде ния флуоресценции красителя в водном растворе. В первых работах, посвященных иссле дованию спектральных свойств ThT, было отмечено, что спектры возбуждения флуоресцен ции и спектры флуоресценции красителя, инкорпорированного в амилоидные фибриллы, существенно сдвинуты в длинноволновую сторону по сравнению с аналогичными спектрами для свободного красителя в водном растворе (рис.1, б). В связи с этим рядом авторов были выдвинуты предположения о том, что длинноволновый сдвиг спектров флуоресценции и возбуждения флуоресценции, а также высокое значение квантового выхода флуоресценции ThT, инкорпорированного в амилоидные фибриллы, обусловлены димерами или даже ми целлами молекул красителя.28, Однако коротковолновый спектр возбуждения флуоресценции ThT в воде не совпада ет с длинноволновой полосой спектра поглощения красителя, как это должно быть, а сдви нут относительно длинноволновой полосы поглощения в коротковолновую область так, что максимум спектра возбуждения приходится на минимум в спектре поглощения. При этом спектр возбуждения флуоресценции ThT, связанного с амилоидными фибриллами, спек трально совпадает с длинноволновой полосой поглощения свободного красителя в водном растворе (рис. 1, б). Таким образом, специального объяснения требует не длинноволновое положение спектров возбуждения флуоресценции и спектров флуоресценции ThT в фибрил лах, а коротковолновые спектры возбуждения флуоресценции и флуоресценции ThT в вод ном растворе. Для того чтобы понять природу аномальных коротковолновых спектров кра сителя в водном растворе, необходимо обратить внимание на тот факт, что молекула ThT от носится к классу молекулярных роторов, поскольку бензтиазольное и аминобензольное кольца красителя способны поворачиваться друг относительно друга (рис.1, а). Согласно ре зультатам квантово-химических расчетов, наличие метильной группы у атома азота бензтиа зольного кольца красителя препятствует существованию строго планарной конформации ко лец красителя.36 Стерическое взаимодействие этой группы с атомом водорода бензольного кольца определяет существование энергетического барьера при конформации с углом между бензтиазольным и аминобензольным кольцами, равным 0° (180°) (рис.1, в). Существование энергетического барьера при =90° (270°) связано с нарушением сопряжения между бен зтиазольным и аминобензольным кольцами ThT. Результаты квантово-химических расчетов свидетельствуют о том, что в основном состоянии минимуму энергии соответствует конфор мация красителя с углом между кольцами, равным 37° (145°, 217°, 325° и т.д.), а максимуму б а 1. Оптическая плотность Инт.флуоресценции, водный 0. раствор 0. 0. 0. в 0.0 300.01 350.01 400.01 450.01 500.01 550. 1. Оптическая плотность амилоидные Инт.флуоресценции, 0.8 фибриллы 0. E 0. 0. 0. 300 350 400 450 500 Длина волны Рис. 1. (а) Структура молекулы ThT: I – бензтиазольное кольцо, II – аминобензольное кольца, III - диметиламино группа, (б) Спектры поглощения (кривые черного цвета), возбу ждения флуоресценции (кривые синего цвета) и флуоресценции (кривые красного цвета) ThТ в водном растворе (верхняя панель) и при инкорпорации в амилоидные фибриллы (ниж няя панель), (в) Зависимость энергии молекулы ThT в основном состоянии от угла между бензтиазольной и аминобензольной группами (красным показаны данные для ThT, зеленым – для аналога ThT с заменой метильной группы атомом водорода). энергии – с углом между кольцами, равным =0° и 90° (180°, 270° и т.д.). Наличием метиль ной группы можно объяснить относительно низкие величины энергетических барьеров при =0° и 90°(180°, 270° и т.д.). Это означает, что часть молекул ThT имеет в основном состоя нии конформацию с нарушенной системой -сопряженных связей бензтиазольного и амино бензольного колец, которые в этом случае выступают в качестве отдельных хромофоров.

Увеличение размера системы -связей, как известно, сопровождается длинноволновым сдви гом спектра, поэтому любой изолированный фрагмент ThT должен иметь более коротковол новое положение спектров поглощения и флуоресценции по сравнению с целой молекулой красителя. Таким образом, появление коротковолновых спектров возбуждения флуоресцен ции и спектров флуоресценции ThT обусловлено существованием в основном состоянии фракции молекул красителя с, близкими к 90° (270°). Коротковолновую флуоресценцию можно зарегистрировать только в растворах с низкой вязкостью, когда интенсивность длин новолновой флуоресценции ThТ низка. При встраивании в амилоидные фибриллы происхо дит существенное увеличение квантового выхода длинноволновой флуоресценции (из-за ог раничения вращения фрагментов ThT друг относительно друга), на фоне которой коротко волновая флуоресценция становится незаметной.

Флуоресцентные свойства ThT в растворителях с различной вязкостью и темпе ратурой. Причины возрастания квантового выхода флуоресценции ThT при его встраи вании в амилоидные фибриллы. Были измерены зависимости квантового выхода флуорес ценции ThT от вязкости водно-глицериновых смесей (содержание глицерина изменялось от 13 до 99%) и от температуры растворов T (от 3 до 50° C). Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что нагревание раствора или уменьшение его вязкости со провождается существенным уменьшением квантового выхода флуоресценции ThT. Это оз начает, что существует процесс безызлучательной дезактивации возбужденного состояния молекулы ThT, величина константы которого зависит от температуры и вязкости раствори теля.

Согласно данным квантово-химических расчетов минимуму энергии в возбужденном состоянии соответствует конформация молекул красителя с углом = 90 (270)°. Такие моле кулы с высокой вероятностью переходят в основное состояние безызлучательно. Мы полага ем, что возможность перехода молекул в такую конформацию (а значит, и величина кванто вого выхода флуоресценции) обусловлена поворотом фрагментов молекул красителя друг относительно друга в возбужденном состоянии. Линейный характер зависимости квантового выхода флуоресценции от температуры и вязкости растворителя, представленной в коорди натах (1/q-1) от T/ (рис. 2), подтвердил нашу гипотезу о том, что возрастание квантового выхода флуоресценции красителя при встраивании в амилоидные фибриллы обусловлено ограничением подвижности колец красителя друг относительно друга в возбужденном со стоянии.

Кроме того, полученные данные (рис. 2 (вставка)) свидетельствуют о том, что кванто вый выход флуоресценции ThT в жестких изотропных растворах (Т 0, ), ограничи вающих подвижность фрагментов красителя друг относительно друга в возбужденном со стоянии, существенно меньше 1.0 (составляет 0.28). Мы полагаем, что это обусловлено бе зызлучательной дезактивацией возбужденного состояния молекул ThT, имеющих в основ ном состоянии (при поглощении света) непланарную конформацию. Вероятность безызлуча тельного перехода таких молекул в основное состояние будет тем выше, чем ближе значение угла к 90°. В связи с этим было сделано предположение (получившее затем эксперимен тальное подтверждение37) о том, что поскольку конформация красителя, встроенного в ами лоидные фибриллы, может существенно отличаться от его конформации в жестких изотроп ных средах, величина квантового выхода флуоресценции связанного ThT может быть как больше, так и меньше 0.28.

Модель встраивания ThT в амилоидные фибриллы. В ряде работ, посвященных изу чению спектральных свойств ThT, существуют противоречивые гипотезы о том, что длинно волновое положение спектров флуоресценции и возбуждения флуоресценции и высокое зна чение квантового выхода флуоресценции ThT, инкорпорированного в амилоидные фибрил 4200 1/q- 3500 2800 1/q- 0,02 0,07 0,12 0, сп- T/cp 0 20 40 60 80 - - сп T/cp Рис 2. Зависимость квантового выхода флуоресценции ThT от температуры и вязкости растворителя;

на вставке показан участок зависимости, соответствующий низким температу рам и высокой вязкости растворителя.

лы, обусловлены димерами или даже мицеллами молекул красителя. Однако мы уже показа ли, что спектральные свойства и значение квантового выхода флуоресценции ThT, опреде ляются другими причинами.

Нами был проведен ряд дополнительных экспериментов для того, чтобы подтвердить необоснованность гипотезы об образовании ThT димеров и мицелл. Были измерены спектры поглощения растворов ThT в широком диапазоне концентраций красителя (рис. 3, а). Полу ченные результаты свидетельствуют о том, что положение и форма спектров поглощения, а также величина коэффициента молярной экстинкции ThT в диапазоне концентраций от 7.5·10-6 до 3.7·10-4 М не зависит от концентрации красителя, а значит, образования агрегатов ThT не происходит.

В работе29 на основании того, что зависимость интенсивности флуоресценции ThT от его концентрации, построенная в полулогарифмическом масштабе, имеет точку перегиба (вставка на рис. 3, б), была выдвинута гипотеза об образовании молекулами ThT мицелл.

Нами показано, что зависимость интенсивности флуоресценции ThT от его концентра ции, построенная в обычных координатах (рис. 3, б), ничем не отличается от зависимостей для любого другого флуоресцирующего вещества, которые в полулогарифмическом масшта бе аналогично будут состоять из двух участков, имеющих существенно различный наклон (вставка на рис. 3, б). Нами сделано заключение, что характер зависимости, представленной в работе29, связан не с агрегацией молекул красителя, а с особенностями представления экс периментальных данных. Это означает, что представления об образовании красителем ми целл в водном растворе и при связывании с амилоидными фибриллами не обоснованы. Наши экспериментальные данные хорошо согласуются с моделью Кребса38, согласно которой ThT Оптическая плотность D 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1, 1,0 1-5 б а Оптическая плотность флуоресценции 0,8 Инт. Fl. Intensity 0,6 300 флуоресценции D Инт. Fl. Intensity 0,4 200 0,2 0,01 0,1 1 10 [ThT],T], mkM [Tht мкМ 0, 350 400 450 500 550 0 20 40 60 [ThT], мкМ Длина волны, нм [Tht T], mkM Wavelength, nm Рис. 3.(a) спектры поглощения ThT в воде для разных концентраций красителя: от 10- до 10-4 М (кривые 1—5);

(б) зависимость интенсивности флуоресценции ThT от концентра ции красителя, на вставке эта зависимость представлена в полулогарифмическом масштабе.

в мономерной форме встраивается в бороздки, образованные боковыми цепями аминокислот и ориентированные вдоль оси волокна амилоидных фибрилл перпендикулярно -листам.39- Структурные параметры связывания ThT с амилоидными фибриллами Выбор подхода для определения параметров связывания ThT с амилоидными фиб риллами. В последние годы в литературе появилось около десятка работ, в которых пред принимались попытки определения параметров связывания ThT с амилоидными фибриллами (см., например, обзор Groenning M.42). Поскольку раствор ThT с амилоидными фибриллами представляет собой равновесную систему свободного и связанного с фибриллами красителя, а флуоресцирует только связанный краситель, казалось бы, при определении параметров связывания можно основываться исключительно на измерении зависимости интенсивности флуоресценции ThT от его концентрации в растворах, содержащих амилоидные фибриллы, как это и делалось ранее. Авторы работ, результаты которых обобщены в обзоре40, основы вались на предположении, что измеренная интенсивность флуоресценции всегда пропорцио нальна концентрации связанного с фибриллами красителя и что эта зависимость выходит на плато, когда все сайты связывания заняты. На самом деле даже теоретическая зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации для любого флуоресцирующего вещества (независимо от присутствия амилоидных фибрилл) не является линейной и представляет со бой кривую с насыщением. Более того экспериментально регистрируемая интенсивность флуоресценции может даже уменьшаться с увеличением оптической плотности раствора.

Это происходит за счет того, что при увеличении суммарной оптической плотности все большую часть возбуждающего света поглощают слои раствора, прилегающие к передней стенке кюветы, в то время как приемная система спектрофлуориметра "видит" центральную часть кюветы, до которой доходит все меньшая доля возбуждающего света. Таким образом, зарегистрированные значения интенсивности флуоресценции могут быть использованы для определения параметров связывания только при введении коэффициентов, корректирую щих описанные эффекты.

Кроме того, концентрация свободного красителя не равна суммарной концентрации ThT в растворе, как это предполагалось практически во всех работах. Нами было показано, что зависимость интенсивности флуоресценции ThT от общей концентрации красителя в растворе может быть использована только для случая существования одного набора центров с различным сродством к ThT (одной моды связывания). При этом данный подход сам по се бе не позволяет оценить число мод связывания красителя. В связи с этим появилась необхо димость разработать универсальный подход для определения параметров связывания ThT с амилоидными фибриллами.43,44 Для решения этой задачи нами впервые был использован прямой метод изучения связывания ThT с амилоидными фибриллами, – метод абсорбцион ной спектрофотометрии растворов, полученных методом равновесного микродиализа, по зволивший впервые определить концентрацию свободного и концентрацию связанного с фибриллами красителя. Применимость предложенного подхода была продемонстрирована при изучении взаимодействия ThT с амилоидными фибриллами, полученными на основе ин сулина, лизоцима и Абета-пептида. Исследуемые амилоидные фибриллы были визуализиро ваны с использованием электронной микроскопии (рис.4).

Определение спектров поглощения ThT, связанного с амилоидными фибриллами.

Равновесный микродиализ был выполнен с использованием приспособления, состоящего из двух камер равного объема, разделенных мембраной, проницаемой для красителя и непро ницаемой для фибрилл (рис.5). В одну из камер (#2) помещался раствор красителя с концен трацией (С0), в другую (#1) – амилоидные фибриллы в том же растворителе. Содержание амилоидных фибрилл в камере #1 можно охарактеризовать концентрацией раствора белка, используемого для получения фибрилл с учетом последующего разведения (Сp). Спектр по глощения раствора в камере #2 после достижения равновесия представлял собой спектр пглощения свободного ThT (Df ()), а спектр поглощения раствора в камере #1 – суммарный Рис. 4. Амилоидные фибриллы на основе инсулина (данные электронной микроскопии) через 1.5 (а) и 3 (б) ч. после начала эксперимента (после растворения инсулина в буфере).

Рис. 5. Приспособление для проведения равновесного микродиализа. Показаны две ка меры, разделенные мембраной, проницаемой для красителя и непроницаемой для амилоид ных фибрилл. Условия проведения эксперимента см. в разделе «Материалы и методы иссле дования».

Оптическая плотность в а б Оптическая плотность Оптическая плотность 0. 2 1.2 1. 3 3 0. 3 0.8 1. 0. D D 4 4 0.4 0.5 0. 1 0. 0. 0. 350 400 450 500 550 350 400 450 500 350 400 450 500 Wavelength, nm Длина волны, нм Длина волны, нм Wavelength, nm Wavelength, nm Длина волны, нм Оптическая плотность Оптическая плотность Оптическая плотность 0.3 0. 5 5 0. 6 0. 0.2 D D D 0. 0. 0. 0. 0.0 0. 350 400 450 500 550 350 400 450 500 550 350 400 450 500 Длина волны, нм Длина волны, нм Длина волны, нм Wavelength, nm Wavelength, nm Wavelength, nm Рис. 6. Определение спектра поглощения ThТ, инкорпорированного в фибриллы на ос нове инсулина (а), лизоцима (б) и Абета-пептида (в). Кривые 1 и 2 – спектры поглощения раствора ThТ в камере #2 (свободный ThТ в водном растворе) и в камере #1 (наложение спектров свободного и связанного с фибриллами ThT, а также светорассеяния амилоиднных фибрилл). Кривая 3 представляет собой оптическую плотность, которая определяется свето рассеянием фибрилл, Кривая 4 – суммарный спектр поглощения свободного и связанного с фибриллами красителя после исключения вклада светорассеяния фибрилл. Кривая 5 - спектр поглощения связанного с фибриллами красителя. Кривая 6 - спектр поглощения свободного красителя в концентрации, равной концентрации связанного красителя.

спектр поглощения свободного ThT (Df ()) и связанного с фибриллами красителя (Db ()) на фоне "кажущегося поглощения", обусловленного светорассеянием фибрилл (Dscat()) (рис.6).

Предлагаемый нами подход позволил впервые определить спектры поглощения ThT, инкорпорированного в фибриллы на основе инсулина, лизоцима и Абета-пептида (рис. 6).

Полученные данные свидетельствуют о том, что спектр поглощения красителя, встроенного в амилоидные фибриллы, является существенно более длинноволновым по сравнению со спектром свободного красителя в водном растворе. Положение спектров поглощения ThT в водном растворе определяется существенным ориентационным диполь-дипольным взаимо действием молекул красителя с молекулами полярного растворителя.

Определение параметров связывания ThT с амилоидными фибриллами. Для каждого эксперимента по микродиализу были определены концентрация свободного (Сf) и концен трация связанного с фибриллами (Cb) красителя. Для того чтобы получить наглядное пред ставление о количестве мод связывания красителя с фибриллами экспериментальные резуль таты были представлены в координатах Скетчарда (рис. 7). Нелинейный характер экспери ментальных зависимостей однозначно свидетельствует о том, что в фибриллах на основе ин сулина, лизоцима и Абета-пептида существуют как минимум две моды связывания (i), с раз личными значениями константы связывания (Kbi). Концентрация связанного с амилоидными фибриллами красителя определяется соотношением:

ni C p C f Cb, (1) K di C f i где K d i – константа диссоциации, ni – число мест связывания в пересчете на молекулу K bi белка. Величины констант связывания и числа мест связывания, наилучшим образом описы вающие экспериментальные данные, были определены в предположении существования двух мод связывания методом множественной нелинейной регрессии. Полученные значения Kb1, Kb2, n1 и n2 приведены на рис. 7. Оказалось, что константы связывания красителя с фиб риллами на основе различных белков существенно различаются. Можно отметить, что число мест связывания в пересчете на молекулу белка для всех исследуемых фибрилл меньше еди ницы. Это означает, что для образования одного места связывания молекулы ThT необходи мо взаимодействие нескольких молекул белка, что согласуется с литературными данными.

Нужно отметить, что с использованием предложенного нами подхода было также исследо вано взаимодействие ThT с ацетилхолинэстеразой (рис. 7, в). Активный центр этого фермен та располагается в углублении, или так называемом «ущелье», в которое, согласно сущест вующим представлениям, встраивается ThT. Полученные нами результаты, свидетельст вующие о стехиометрии связывания 1:1, соответствуют этому представлению.45, а б 1, (Cb/Cp)/Сf.10-5, M- Kь,1 = (7.5±0.5)·10 M- (Cb/Cp)/Сf.10-5, M- 7 - Kь,1 = (2.0±0.5)·10 M 0, n1 = (1.1±0.1)·10- n1 = (1.2±0.3)·10-2 Kь,2 = (5.6 ±1.2)·104 M- Kь,2 = (1.2 ±0.4)·105 M- 0, n2 = (2.4±0.3)·10- n2 = (8.4±2.2)·10- 0,3 0, 0,00 0,06 0,12 0,18 0,24 0, 0,00 0,02 0,04 0,06 0, Cb/Cp Cb/Cp в 15 г Kь= (8.1±0.6)·103 M- Kь,1 = (2.4±0.7)·106 M-1 - -3 - (Cb/Cp)/Cf 10, M n = 1.0±0. (Cb/Cp)/Cf.10, M n1 = (6.0±1.1)·10- - Kь,2 = (2.5 ±0.6)·104M-1.

n2 = (2.1±0.3)·10- 0 0,00 0,05 0,10 0,15 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0, Cb/Cp Cb/Cp Рис. 7. Зависимости Скетчарда, характеризующие связывание ThT с амилоидными фиб риллами на основе инсулина (а), лизоцима (б), Абета-пептида (в) и с глобулярным белком ацетилхолинэстеразой (г). На рисунке показаны экспериментальные значения (точки) и рас четные кривые (линии), построенные с использованием констант n1, n2, Kb1 и Kb2, определен ных с использованием GraphPad Prizm5.

Определение коэффициентов молярной экстинкции ThT, связанного с амилоидны ми фибриллами. С использованием полученных значений параметров связывания ThT с амилоидными фибриллами на основе инсулина, лизоцима и Абета-пептида была определена концентрация красителя, связанного с каждой из мод связывания:

n1C p C f n2 C p C f Cb1 и Cb 2 (2) K d1 C f Kd2 C f Принимая во внимание, что Db Db1 Db 2 b1 C b1l b 2 C b 2 l, (3) где l – это длина оптического пути, а b1 () и b 2 () – коэффициенты молярной экстинкции красителя, связанного с сайтами каждой из мод связывания, значения b1 () и b 2 () были определены методом множественной линейной регрессии (SigmaPlot) с использованием из вестных величин Db, C b1 и Cb 2. На рис. 8 показаны спектры поглощения красителя, вза имодействующего с сайтами каждой из мод связывания, представленные в единицах коэф фициента молярной экстинкции. Полученные данные свидетельствуют о том, что величина коэффициента молярной экстинкции красителя, связавшегося с сайтами, отличающимися высокой константой связывания, имеют коэффициент молярной экстинкции, суще ственно 10 b 8 b b1 б bb10 -4,М см - а в b.b10 -4,, М -1 cm - b.b10 -4-4, M -1см-1-. 10, M -1 cm - - 10, М cm 10 M см - - f b2 f b1 f - - b 2 00 400 350 400 450 350 400 450 500 350 400 450 500 350 400 450 350 400 450 Длина волны, нм Wavelength, nm Длина волны, нм Длина волны, нм Wavelength, nm Wavelength, nm Рис. 8. Спектры поглощения ThT, связанного с сайтами каждой из мод связывания ами лоидных фибрилл основе инсулина (а), лизоцима (б) и Абета-пептида (в), представленные в единицах коэффициента молярной экстинкции (b1 и b2). На рисунке также представлен спектр поглощения свободного красителя в водном растворе (f).

превышающий коэффициент молярной экстинкции красителя в водном растворе. Это, по видимому, обусловлено различием конформации молекул красителя (углом между бензтиа зольным и аминобензольным кольцами), которая определяется его микроокружением.

Определение квантового выхода флуоресценции ThT, связанного с амилоидными фибриллами. Как уже упоминалось выше, зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации красителя может быть использована для определения параметров связывания лишь в случае существования одной моды связывания. Однако измерение интенсивности флуоресценции растворов, полученных методом равновесного микродиализа, в сочетании с данными, полученными с использованием абсорбционной спектрофотометрии тех же рас творов, позволяют определить квантовый выход флуоресценции ThT, связанного с сайтами, принадлежащими каждой из мод связывания (qb1, qb2):

коэффициента молярной экстинкции красителя, связавшегося с сайтами, отличающимися высокой константой связывания, имеют коэффициент молярной экстинкции, существенно превышающий коэффициент молярной экстинкции красителя в водном растворе. Это, по видимому, обусловлено различием конформации молекул красителя (углом между бензтиа зольным и аминобензольным кольцами), которая определяется его микроокружением.

I Cb11lqb1 Cb 2 2lqb 2, где I – это зарегистрированное значение интенсивности флуоресценции, скорректирован ное на эффект внутреннего фильтра. Значения qb1 и qb2, рассчитанные методом множествен ной линейной регрессии, свидетельствуют о том, что квантовый выход флуоресценции ThT, инкорпорированного в амилоидные фибриллы на основе разных белков, а также квантовый выход красителя, связанного с сайтами, принадлежащими разным модам, различен. Это мо жет быть обусловлено разной конформацией связанного красителя. В частности, молекулы красителя, имеющие более высокое значение квантового выхода флуоресценции, скорее все го, являются более плоскими по сравнению с молекулами с более низким значением кванто вого выхода флуоресценции.

Величины параметров связывания ThT с амилоидными фибриллами на основе инсули на, лизоцима и Абета-пептида, а также характеристики связанного с фибриллами красителя, представленные в Таблице, существенно различаются. Этот факт подтверждает данные о том, что фибриллы, полученные на основе разных белков, различны и что предлагаемый на ми подход может использоваться для изучения их структуры. Таблица. Параметры связывания ThT с амилоидными фибриллами и ацетлхолинэстеразой, характеристики свободного и связанного красителя i, maxx10-4, Мода Kbi x10-5, Объект исследования ni qi M-1cm-1 M- связывания Амилоидные фибриллы на 1 8.7 200 0.01 0. основе инсулина 2 3.5 1.2 0.08 0. Амилоидные фибриллы на 1 5.1 75 0.11 0. основе лизоцима 2 6.7 0.56 0.24 0. Амилоидные фибриллы на 1 8.0 23.8 0.01 0. основе Абета-пептида 2 1.7 0.25 0.21 0. Ацетилхолинэстераза 1 2.4 0.081 1.0 0. Свободный ThT в водном рас - 3.2 - - 0. творе ВЫВОДЫ 1. На основании измерения спектров поглощения и спектров возбуждения флуоресцен ции свободного и связанного с амилоидными фибриллами ThT, с учетом результатов кванто во-химических расчетов молекулы красителя, сделан вывод о том, что существование «ко ротковолновых» полос флуоресценции и возбуждения флуоресценции ThT в водных раство рах обусловлено наличием в растворе молекул ThT с нарушенной системой -сопряженных связей бензтиазольного и аминобензольного колец.

2. На основании измерения зависимости квантового выхода флуоресценции ThT от температуры и вязкости растворителя сделано заключение о том, что квантовый выход флу оресценции красителя при встраивании в амилоидные фибриллы определяется не только подвижностью фрагментов молекулы ThT друг относительно друга в возбужденном состоя нии, но и конформацией молекул красителя в основном состоянии.

3. Показано, что существующие предположения об образовании димеров или мицелл молекулами ThT в водном растворе и при встраивании в амилоидные фибриллы не обосно ваны. ThT встраивается в амилоидные фибриллы в мономерной форме.

4. Метод, основанный на абсорбционной спектрофотометрии растворов, полученных с использованием равновесного микродиализа, позволяет определять параметры связывания ThT с амилоидными фибриллами, а также фотофизические характеристики связанного кра сителя. Предложенный подход может быть использован для изучения структуры амилоид ных фибрилл.

5. Параметры связывания ThT с амилоидными фибриллами на основе инсулина, лизо цима и Абета-пептида, а также фотофизические характеристики связанного с фибриллами красителя, существенно различаются, что свидетельствует о различии их структуры.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Sulatskaya A.I., Turoverov K.K., Kuznetsova I.M. 2010. Spectral properties and factors deter mining high quantum yield of thioflavin T incorporated in amyloid fibrils. Spectroscopy. 24: 169 171.

2. Sulatskaya A.I., Maskevich A.A., Kuznetsova I.M., Uversky V.N., Turoverov K.K. 2010. Fluo rescence quantum yield of thioflavin T in rigid isotropic solution and incorporated into the amyloid fibrils. PLoS ONE. 5(10): e15385 1- 3. Сулацкая А.И., Кузнецова И.М. 2010. Взаимодействие тиофлавина Т с амилоидными фибриллами как инструмент для изучения их структуры. Цитология 52 (11): 955-959.

4. Сулацкая А.И. 2011. Взаимодействие флуоресцентного красителя тиофлавина Т с амило идными фибриллами. Научно-технические ведомости СПбГПУ. 3 (129): 123-127.

5. Сулацкая А.И., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. 2011. Использование флуоресцентного красителя тиофлавина Т для изучения структуры амилоидных фибрилл. Вестник Санкт Петербургского университета. 4 (4): 152- 6. Sulatskaya A.I., Kuznetsova I.M. and Turoverov K.K. 2011. Interaction of Thioflavin T with amyloid fibrils: stoichiometry and affinity of dye binding, absorption spectra of bound dye. Journal of Physical Chemistry B. 115: 11519- 7. Sulatskaya A.I., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K. 2012. Interaction of thioflavin T with amy loid fibrils: fluorescence quantum yield of bound dye. Journal of Physical Chemistry B. 116(8):

2538- 8. Kuznetsova I.M., Sulatskaya A.I., Uversky V.N., Turoverov K.K. 2012. Analyzing Thioflavin T binding to amyloid fibrils by an equilibrium microdialysis-based technique. PLoS ONE. 7(2):

e 9. Sulatskaya A. I., Povarova O.I., Kuznetsova I.M., Uversky V.N., Turoverov K.K. 2012. Binding stoichiometry and affinity of fluorescent dyes to proteins in different structural states. In Intrinsi cally Disordered Proteins: Volume I. Experimental Techniques. In the series "Methods in Molecu lar Biology" (Humana Press, series editor John Walker). 1: 441-460.

10. Kuznetsova I.M., Sulatskaya A. I., Uversky V.N., Turoverov K.K.. 2012. A new trend in the experimental methodology for the analysis of the Thioflavin T binding to amyloid fibrils. Molecular Neurobiology. 45: 488-498.

11. Kuznetsova I.M., Sulatskaya A.I, Povarova O.I., Turoverov K.K. 2012. Reevaluation of ANS binding to human and bovine serum albumins. Key role of equilibrium microdialysis in ligand - re ceptor binding characterization. PLoS ONE. 7(7): e Тезисы:

1. Сулацкая А.И., Кузнецова И.М. 2008. Связывание тиофлавина T с амилоидными фибрил лами. 37-я Неделя науки СПбГПУ. Материалы Всероссийской межвузовской научной конфе ренции студентов и аспирантов. (Санкт-Петербург). Стр. 9- 2. Сулацкая А.И. 2008. Причины возрастания квантового выхода флуоресценции бензтиа зольного красителя тиофлавина T при его встраивании в амилоидные фибриллы. Политехни ческий симпозиум: Молодые ученые – промышленности Северо-Западного региона. Мате риалы конференций политехнического симпозиума. (Санкт-Петербург). Стр. 130- 3. Сулацкая А.И., Кузнецова И.М. 2009. Изучение взаимодействия тиофлавина Т с амило идными фибриллами с помощью метода равновесного микродиализа. 38-я Неделя науки СПбГПУ. Материалы международной научно-практической конференции. (Санкт Петербург). Стр. 11- 4. Sulatskaya A.I., Turoverov K.K., Kuznetsova I.M. 2009. Spectral properties and factors deter mining high quantum yield of thioflavin T incorporated in amyloid fibrils. XIII European Confer ence on the Spectroscopy of Biological Molecules. Book abstracts (Palermo, Italy). P. 5. Сулацкая А.И., Туроверов К.К., Кузнецова И.М. 2010. Стехиометрия взаимодействия флуоресцентного красителя тиофлавина Т с амилоидными фибриллами. Спектральные свой ства связанного красителя. Сборник тезисов Политехнического симпозиума «Молодые уче ные - промышленности северо-западного региона». Стр. 194- 6. Сулацкая А.И. 2010. Взаимодействие тиофлавина Т с амилоидными фибриллами как ин струмент для изучения их структуры. Тезисы докладов и сообщений, представленных на II конференцию молодых ученых Института цитологии РАН. Стр. 508- 7. Sulatskaya A.I., Turoverov K.K., Kuznetsova I.M. 2010. Thioflavin T as an instrument for stud ying amyloid fibrils structure.

Abstract

book of 6th Saint-Petersburg Young Scientists Conference.

P. 8. Сулацкая А.И. 2011. Использование флуоресцентного красителя тиофлавина Т для изу чения структуры амилоидных фибрилл. Тезисы докладов III Конференции "Современные проблемы молекулярной биофизики". Стр. 58.

9. Sulatskaya A.I., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K. 2011. Thioflavin T – a tool for amyloid fi brils studies: mechanism of specific interaction and binding parameters. The 17th International Bio physics Congress (IUPAB) and the 12th Chinese Biophysics Congress abstracts.(Beijing, China). P.

10. Sulatskaya A.I. 2011. Characteristics of the interaction of fluorescent dye thioflavin T with amyloid fibrils. Сборник тезисов VІ Международной научной конференции молодых ученых «Биология: от молекулы до биосферы». Стр. 11. Сулацкая А.И., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. 2012. Встраивание флуоресцентного красителя тиофлавина Т в амилоидные фибриллы: стехиометрия взаимодействия и констан ты связывания. Цитология. Тезисы докладов и сообщений, представленных на III конферен цию молодых ученых Института цитологии РАН. Стр. 357- 12. Фонин А.В., Сулацкая А.И., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. 2012. Интенсивность флу оресценции как мера произведения оптической плотности флуорофора и квантового выхода его флуоресценции. Материалы докладов IV Съезда биофизиков России и IV Симпозиума «Новые тенденции и методы в биофизике». Стр. 95.

13. Sulatskaya A.I., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K. 2012. A new trend in the experimental methodology of amyloid fibril structural investigation with the use of thioflavin T. FEBS Journal (Suppl. 1). 279: 415.

14. A. Fonin, A. Sulatskaya, O. Povarova, I. Kuznetsova, K. Turoverov. 2012. Pitfalls in the use of fluorescence for determination ligand-receptor binding stoichiometry and binding constants. Weak Protein-Ligand Interaction: New Horizons in Biophysics and Cell Biology. Abstract book. P. 54.

15. Sulatskaya A.I. Kuznetsova I.M., Turoverov K.K. 2012. Investigation of the interaction of am yloid fibrils on the basis of different amyloidogenic proteins with fluorescent probe thioflavin T. 8th Saint-Petersburg young scientists conference. Abstract book. (Saint-Petersburg). p. 60.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Jahn T.R.;

Radford S.E. FEBS J 2005, 272, 5962-5970. 2. Чеботарева Н.А. и др., Биохимия 2004, 69, 1522-1536. 3. Чеботарева Н.А., Автореферат диссертации 2006, 50 стр. 4. Harper J.

D. et.al, Chem Biol 1997, 4, 951-959. 5. Kelly J.W. Structure 1997, 5, 595-600. 6. Carrell R.W.;

Gooptu B. Curr Opin Struct Biol 1998, 8, 799-809. 7. Hashimoto M.;

Masliah, E. Brain Pathol 1999, 9, 707-720. 8. Koo E.H et.al, Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96, 9989-9990. 9. Uversky V.N.

et.al, Med Sci Monitor 1999, 5, 1238-1254. 10. Uversky V.N. et.al,. Med Sci Monitor 1999, 5, 1001-1012. 11. Dobson C. M. Trends Biochem Sci 1999, 24, 329-332. 12. Uversky V.N., Fink A.

L. Biochim Biophys Acta 2004, 1698, 131-153. 13. Chiti F., Dobson C.M. Annu Rev Biochem 2006, 75, 333-366. 14. Fandrich M. et.al, Nature 2001, 410, 165-166. 15. Pertinhez T. A. et.al, FEBS Lett 2001, 495, 184-186. 16. Dobson C.M. Nature 2003, 426, 884-890. 17. Dobson C.M.

Methods 2004, 34, 4-14. 18. Makin O.S., Serpell L.C. FEBS J 2005, 272, 5950-5961. 19. Nielsen L.

et.al, Biochemistry 2001, 40, 6036-6046. 20. Naiki H. et.al, Lab Invest 1990, 62, 768-773. 21. Naiki H. et.al, Amyloid 2005, 12, 15-25. 22. LeVine H., 3rd. Protein Sci 1993, 2, 404-410. 23. Levine H., 3rd. Neurobiol Aging 1995, 16, 755-764. 24. LeVine H., 3rd. Arch Biochem Biophys 1997, 342, 306-316. 25. LeVine H., 3rd. Methods Enzymol 1999, 309, 274-284. 26. Yoshiike Y. et.al, J Biol Chem 2003, 278, 23648-23655. 27. Allsop D. et.al, Biochem Biophys Res Commun 2001, 285, 58 63. 28. Schirra R. Chem Phys Letters 1985, 119, 229-238. 29. Khurana R. et.al, J Struct Biol 2005, 151, 229-238. 30. Goers J. et.al, Biochemistry 2002, 41, 12546-12551. 31. Vernaglia B. A. et.al, Biomacromolecules 2004, 5, 1362-1370. 32. Kayed R. et.al, Molecular neurodegeneration 2007, 2, 18. 33. De Ferrari G. V. et.al, Rosenberry T. L. J Biol Chem 2001, 276, 23282-23287. 34.

Владимиров Ю. А.;

Литвин Ф. Ф. Фотобиология и спектральные методы исследования;

Издательство "Высшая школа": Москва, 1964. 35. Lakowicz J. R. Springer, New York 2006. 36.

Turoverov K. K. et.al, Proc of SPIE 2007, 6733. 37. Sulatskaya A. I. et.al, PLoS One 2010, 5, e15385. 38. Krebs M. R. et.al, J Struct Biol 2005, 149, 30-37. 39. Сулацкая А. И.;

Кузнецова И.

М. Цитология 2010, 52, 65-69. 40. Сулацкая А. И. Научно-технические ведомости СПбГПУ 2011, 3, 123-127. 41. Сулацкая А.И. и др., Вестник Санкт-Петербургского университета 2011, 4, 152-160. 42. Groenning M. J Chem Biol 2009, DOI 10.1007/s12154-12009-10027-12155. 43.

Kuznetsova I. M. et.al, PLoS One 2012, 7, e40845. 44. Kuznetsova I. M. et.al, Molecular neurobiology 2012, 45, 488-498. 45. Kuznetsova I.M. et.al, PLoS One 2012, 7, e30724. 46.

Sulatskaya A.I. et.al, J Phys Chem B 2011, 115, 11519-11524. 47. Sulatskaya, A. I. et.al, J Phys Chem B 2012, 116, 2538-2544.

Авторефераты диссертаций >> Авторефераты по Биологии

<< ГЛАВНАЯ | КОНТАКТЫ

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

Взаимодействие тиофлавина т с амилоидными фибриллами: механизм встраивания, параметры связывания, изменение фотофизических характеристик красителя