Система перекисное окисление липидов - антиоксиданты у крыс на разных стадиях онтогенеза и канцерогенеза

На правах рукописи

АРСЛАНОВА Динара Ришатовна СИСТЕМА «ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ - АНТИОКСИДАНТЫ» У КРЫС НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ОНТОГЕНЕЗА И КАНЦЕРОГЕНЕЗА 03.00.13 – физиология 16.00.02 – патология, онкология и морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ульяновск – 2009

Работа выполнена на кафедре физиологии и патофизиологии в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Ульяновский государственный университет Научные руководители:

Доктор биологических наук, Генинг Татьяна Петровна профессор кандидат медицинских наук, доцент Антонеева Инна Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Балашов Владимир Павлович професcор доктор биологических наук, Каталымов Леонид Лазаревич профессор Государственное образовательное

Ведущая организация:

учреждение высшего профессионального образования Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет

Защита диссертации состоится « 11 » июня 2009г. в 1300 часов на заседании диссертационного совета Д 212.278.07 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Ульяновский государственный университет по адресу: ул. Набережная реки Свияги,106, корпус 1, аудитория 703.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ульяновского государственного университета, а с авторефератом – на сайте ВУЗа http://www.uni.ulsu.ru Отзывы на автореферат направлять по адресу: 432000, г.Ульяновск, ул.Л.Толстого,42, Ульяновский государственный университет, управление научных исследований

Автореферат разослан «» 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент С.В. Пантелеев

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Перекисное окисление липидов (ПОЛ) - в строго ограниченных пределах - это физиологический процесс, который принимает участие в регуляции клеточных функций [Зенков Н.К.,2001;

Сазонтова Т.Г.,2007]. При повышении уровня свободнорадикального окисления возможно быстрое разрушение клеточных структур в результате их повреждения. Показано, что практически все патологические состояния помимо специфического ответа сопровождаются повышенным уровнем ПОЛ [Анисимов В.Н.,2003;

Биленко М.В.,1989;

Коган А.Х.,1997]. Повреждающим фактором при этом служит избыточный уровень активных форм кислорода (АФК), которые меняют свою физиологическую, сигнальную роль на патогенетическую. Одним из универсальных механизмов защиты клетки от избыточного ПОЛ является многоуровневая система антиоксидантов. Оценить баланс прооксидантов и антиоксидантов позволяет соотношение ПО-АО [Лю Б.Н.,2003].

На сегодня показано, что процесс физиологического старения организма носит многофакторный, многоочаговый, необратимый характер. Современная свободно радикальная теория старения предполагает, что наступающая с возрастом дезадаптация связана с повреждениями важных биомолекул продуктами ПОЛ [Лю Б.Н., 2003;

Harman D.,1994;

Liu L.Z.,2006]. В ходе многочисленных экспериментов выяснено, что митохондрии – наиболее уязвимое и основное «стартовое» звено в старении клетки [Скулачев В.П., 2001;

Gershon D.,1999;

Lestienne P.,1997]. Внутриклеточная гипероксия, как результат первичного процесса старения митохондрий, становится фактором поражения не только всех субклеточных структур, но внеклеточных образований.

Полагают также, что модификация структуры плазматической мембраны – один из наиболее вероятных механизмов нарушения регуляции тканевого метаболизма при старении [Голубев А.Г.,1996]. Исследование параметров системы ПОЛ-АО в крови, тканях печени, мозга у животных разных возрастных групп позволило определить существенную роль избыточности процессов пероксидации и недостаточности антиоксидантной защиты в возрастных перестройках этих тканей [Анисимов В.П.,1999;

Гусев В.А.,1997;

Tian L.,1998]. Однако работ, посвященных возрастной динамике в системе ПОЛ-АО в яичнике, являющимся органом, рано подверженным инволютивным процессам, нет.

Накопление соматических мутаций в клетке, как результат воздействия эндогенных метаболитов вообще и продуктов повышенного ПОЛ в частности, может представлять один из механизмов патогенеза – общий для процессов старения и канцерогенеза [Имянитов Е.Н.,1999;

Anisimov V.N., 1998;

Cortopassi P.,1995;

Nusbaum N.J.,1998].

Злокачественный рост, который является болезнью регуляции, в первую очередь регуляции размножения и дифференцировки, может сопровождаться изменениями или сбоями в работе системы ПОЛ-АО [Горожанская Э.Г., 2002;

Кондакова И.В.,2005;

Desuoki M.M.,2005;

Франциянц Е.М.,1995]. Установлено, что как для малигнизации, так и для поддержания трансформированного состояния клеток активно растущих участков опухоли необходимо создание внутри клеток гипероксических условий [Лю Б.Н.,2004].

Однако оксидативный стресс, наблюдаемый в неопластической клетке, может возникнуть не только при избыточности активных форм кислорода, но и при недостаточности антиоксидантов.

Существует мнение, что дисбаланс в системе продукции и инактивации АФК может с одной стороны вызывать изменения функциональной активности яичников в процессе онтогенеза, а с другой, являться одной из причин, провоцирующей канцерогенную ситуацию [Антонеева И.И.,2006;

Франциянц Е.М.,1995]. Однако в доступной литературе отсутствуют данные, позволяющие оценить динамику компонентов системы ПОЛ-АО в яичнике в онтогенезе и на различных стадиях канцерогенеза.

Целью настоящей работы явилось изучение системы «перекисное окисление липидов-антиоксиданты» у крыс на разных стадиях онтогенеза и канцерогенеза.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить динамику активности компонентов системы «перекисное окисление липидов - антиоксиданты» в ткани яичников, плазме крови и эритроцитах у крыс в процессе онтогенеза.

2. Оценить уровень митоза и апоптоза в покровном эпителии яичника крыс на разных стадиях онтогенеза.

3. Определить изменения в системе ПОЛ-АО в опухолевых клетках, асцитической жидкости, плазме крови и эритроцитах животных-опухоленосителей с асцитной опухолью яичника на разных стадиях канцерогенеза.

4. Изучить динамику в системе ПОЛ-АО в опухолевых клетках, асцитической жидкости, плазме крови и эритроцитах у животных-опухоленосителей на разных стадиях онтогенеза.

Научная новизна: Получены новые данные об изменении системы ПОЛ-АО в яичниках крыс в процессе индивидуального развития и при прогрессировании асцитной опухоли яичника у крыс. Также впервые оценен уровень ферментативного звена АОС (супероксиддисмутазы, каталазы, глутатион-редуктазы) в плазме и эритроцитах крови животных-опухоленосителей. Проведены морфологические исследования покровного эпителия яичника крыс в процессе старения органа. Впервые установлена корреляционная связь между накоплением продукта ПОЛ - МДА в яичниках крыс с возрастом животных, а также с уровнем митоза и апоптоза в покровном эпителии яичников. Проведена оценка параметров системы ПОЛ-АО в опухолевых клетках, асцитической жидкости, плазме крови и эритроцитах крыс с асцитной опухолью яичников в логарифмическую и терминальную фазу процесса в разных возрастных группах.

Научно-практическая значимость. Результаты работы о роли липопероксидации в онтогенезе могут быть использованы в теоретической и прикладной геронтологии при разработке теории старения и методов коррекции оксидативного стресса на поздних этапах онтогенеза. Данные полученные в результате оценки уровня ПОЛ в ткани яичников на разных этапах онтогенеза и канцерогенеза могут быть использованы в онкогинекологии при оценке факторов риска заболевания раком яичников. Полученные показатели митотического и апоптотического индексов в клетках покровного эпителия яичников, а также данные по оценке их коррелятивных связей с динамикой МДА могут быть использованы в возрастной физиологии при оценке функций репродуктивной системы. Результаты изучения активности ферментативного звена антиоксидантной системы в опухолевой ткани, асцитической жидкости, плазме и эритроцитах животных опухоленосителей могут быть использованы в теоретической и практической онкогинекологии, а также в экспериментальной онкологии животных при разработке терапевтических схем на разных стадиях опухолевого процесса.

Положения, выносимые на защиту:

1. В ходе индивидуального развития в яичниках и крови крыс происходят разнонаправленные изменения в системе ПОЛ-АО. Старение яичника сопровождается накоплением МДА и снижением активности ферментов антиоксидантной защиты.

Наиболее выраженный дисбаланс в системе ПОЛ-АО в ткани яичников наблюдается у старых животных в возрасте 21 месяц.

2. На исследуемых этапах онтогенеза (4,9,15,21 месяц) одновременно с нарастанием уровня МДА в ткани яичников крыс в покровном эпителии отмечено снижение митотического и возрастание апоптотического индексов.

3. Функционирование системы ПОЛ-АО в клетках асцитной опухоли яичников зависит от стадии роста опухоли. На терминальной стадии по сравнению с логарифмической наблюдается усиление окислительного стресса, что проявляется в снижении активности СОД и каталазы на фоне увеличения содержания МДА.

4. Рост асцитной опухоли яичников сопровождается увеличением уровня МДА в асцитической жидкости, плазме крови и эритроцитах. У молодых животных опухоленосителей (4 месяца) по мере прогрессирования опухоли степень и направленность динамики ферментов антиоксидантной защиты в эритроцитах, плазме и асцитической жидкости отлична от аналогичных показателей животных 15 месяцев.

5. Динамика активности компонентов системы ПОЛ-АО в яичниках крыс в процессе онтогенеза сходна с таковой в процессе канцерогенеза.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на Всероссийской научной конференции «Механизмы индивидуальной адаптации» (Томск, 2006), конгрессe с международным участием «Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении» (Турция, 2006), на 2-й Всероссийской конференции с международным участием «Медико-физиологические проблемы экологии человека» (Ульяновск, 2007), Всероссийской конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно приспособительных процессов» (Новосибирск, 2007), Всероссийской молодежной научной конференции «Молодежь и наука на севере» (Сыктывкар,2008), VIII Молодежной научной конференции Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар,2009).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации: диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 97 страницах машинописного текста, иллюстрирована 33 рисунками и 8 таблицами. Список используемой литературы содержит 172 источника, из которых 89 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования послужили инбредные крысы возраста 4 месяцев – начало репродуктивного периода (молодые), 9 месяцев – пик репродуктивной активности (взрослые), 15 месяцев – начало снижения репродуктивной функции (стареющие), месяц – отсутствие циклической деятельности яичников (старые) по классификации Фролькиса В.В.[1982].

Для биохимического исследования использовалась ткань яичников и стабилизированная кровь, которая после центрифугирования 10 мин при 3000 оборотов разделялась на плазму и эритроцитарную массу. Гомогенат яичников готовился на Tris HСl-буфере, рН=7,4.

Интенсивность ПОЛ оценивали по уровню вторичного продукта – МДА в тесте с тиобарбитуровой кислотой [Андреева Л.И.,1988]. При высокой температуре в кислой среде малоновый диальдегид (МДА) реагирует с 2-тиобарбитуровой кислотой, образуя окрашенный триметиновый комплекс, содержащий 1 молекулу МДА и 2 молекулы ТБК с максимумом поглощения при 535 нм.

Метод изучения активности СОД в биологическом материале основан на способности этого антиоксидантного энзима конкурировать с нитросиним тетразолием (НСТ) за супероксидный анион. Эти анионы образуются в результате аэробного взаимодействия восстановленной формы НАДН2 с феназин-метасульфатом (ФМС). В результате этой реакции НСТ восстанавливается с образованием гидразин тетразолия. В присутствии СОД процент восстановления НСТ уменьшается. По расчетному проценту торможения Т%, Т%=(Еф-Еоп)/(Еф-Ек) – определяется процент торможения НСТ [Дубинина Е.Е.,1989;

Nishikimi M.,1972].

Определение активности каталазы основано на определении скорости утилизации Н2О2 в реакционной смеси, в которую вносится биологический материал, содержащий фермент. Об интенсивности утилизации Н2О2 судят по скорости снижения экстинции при длине волны 260 нм, на которой Н2О2 имеет максимум светопоглощения [Карпищенко А.И.,1999].

Активность глутатион-редуктазы оценивалась по степени окисления восстановленного НАДФ в присутствии окисленного глутатиона [Асатиани В.С.,1969].

Определение концентрации GSH проводили с использованием дитио-бис-нитробензойной кислоты (ДТНБК). Окисленный глутатион (GSSG) вначале восстанавливали глутатионредуктазой до GSH, а затем определяли в реакции с ДТНБК [Ellman G.L.,1972].

Активность антиоксидантных ферментов и уровень МДА оценивалась спектрофотометрическим методом и пересчитывались на 1 мг белка для ткани, для эритроцитов - с учетом разведения (1:100). Белок определяли по методу Брэдфорда [Bradford M.M, 1976].

Для морфологического исследования яичник животного, освобожденный от жировой ткани, помещался в 10% нейтральный формалин. Парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм окрашивались стандартно гематоксилин-эозином. Апоптотический индекс определяли как частоту клеток с апоптотической морфологией ядра. Апоптотические клетки выглядят как округлые или овальные скопления интенсивно эозинофильной цитоплазмы с плотными фрагментами ядерного хроматина [Погорелов В.М.,1995]..

Митотические изменения также оценивались по фигурам митоза. Индексы митоза и апоптоза подсчитывались на 500 клеток эпителия при увеличении х1000.

Для моделирования опухоли использованы инбредные крысы в возрасте 4 месяцев массой 120 г (n=16) и 15 месяцев массой 220 г (n=18), которым внутрибрюшинно перевивали штамм ОЯ (асцитная опухоль яичника, банк опухолевых штаммов РОНЦ им. Блохина) в объеме 0,5 мл 9-дневного инокулята (АЖ с опухолевыми клетками) + 0, мл питательной среды 199 на 100 гр массы животного.

Прогрессирование данного типа опухоли проходит в три этапа: логарифмическая (с 4-х суток после перевивания), стационарная (с 9-х суток) и терминальная (с 14-х суток) фазы. На 4-е сутки отмечался рост опухоли. На 5-е и 14-е сутки у животных опухоленосителей под эфирным наркозом забирались асцитическая жидкость с опухолевыми клетками и периферическая кровь. После центрифугирования при оборотов для биохимического и цитологического исследования использовались асцитическая жидкость, не содержащая опухолевых клеток, и взвесь опухолевых клеток, разведенных в 10 раз физиологическим раствором. В этом материале, а также в отмытых эритроцитах определялись активность каталазы [Карпищенко А.И.,1999], супероксиддисмутазы [Дубинина Е.Е.,1989], содержание малонового диальдегида (МДА) [Андреева Л.И.,1988], глутатион-редуктазы [Асатиани В.С.,1969]. Белок определяли по методу Брэдфорда [Bradford M.M.,1976].

Статистическая значимость полученных результатов оценивалась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни и корреляционного критерия Спирмена (Stata 6.0). Различия между группами считали достоверными при р0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Анализ системы ПОЛ-АО в яичниках, эритроцитах и плазме крови крыс в процессе индивидуального развития.

Полученные в эксперименте данные свидетельствуют о значительном изменении в процессе онтогенеза в яичниках крыс уровня МДА – вторичного продукта ПОЛ.

В нашем исследовании уровень МДА в яичниках крыс, составляющий в возрасте мес. 7,13±0,86 мкмоль/мг белка ткани в процессе онтогенеза статистически значимо возрастал до уровня 12,35±0,98 в 9 месяцев и 16,05±0,89 мкмоль/мг белка ткани у 15 месячных животных. У старых животных в 21 месяц происходило некоторое снижение уровня ПОЛ в яичниках до 14,72±0,84 мкмоль/мг белка. Повышение его у крыс с возраста 4 месяцев до 21 месяца составило 206% (рис.8). Нами выявлена сильная корреляционная связь (р=0,72) между возрастом животных и содержанием МДА в яичниках.

В доступной литературе мы обнаружили данные о состоянии ПОЛ в крови, печени, мозге – в тканях с высокой функциональной нагрузкой в течение всего периода жизни организма [Гусев В.А.,1997;

Tian L.,1998]. Яичники же относят к органам с циклическими колебаниями физиологической активности. Наши данные показывают, что у старых животных, несмотря на отсутствие растущих фолликулов, уровень МДА остается высоким по сравнению с таковым в молодом и репродуктивном возрасте.

Известно, что интенсивность окислительного метаболизма обратно пропорциональна продолжительности жизни для многих далеко отстоящих друг от друга видов (в расчете на единицу активности супероксиддисмутазы). Супероксидисмутаза – ключевой фермент антирадикальной защиты клеток, инактивирующий супероксид анион радикал и работающий в клетке в каскаде с ферментами, способными разлагать перекись водорода - каталазой и глутатион-пероксидазой. Установлено, что активность ферментов антиоксидантной защиты – СОД и каталазы - в ткани яичников достигает максимума в репродуктивный период (9-15 месяцев), а в яичниках молодых и старых животных – оба показателя снижены (рис.1).

120 4, 4,08 3, 100 3,65 3, 80 102, 113, 80,64 2, 2, 40 1, 59, 0, 0 4 мес 9 мес 15 мес 21 мес СОД, усл.ед/мг белка каталаза,ммоль/мин/мг белка Рис.1 Активность СОД (усл.ед/мг белка) и каталазы (ммоль/мин/мг белка) в ткани яичников крыс разного возраста.

Глутатион-редуктаза обеспечивает регенерацию глутатиона из окисленной формы в восстановленную, при этом глутатион, являясь акцептором АФК, способен ингибировать свободнорадикальное окисление. Содержание GSH в ткани яичников возрастает с уровня 1,29±0,11ммоль/мг белка в 4 месяца до 1,81±0,14 ммоль/мг белка в месяцев, значительно снижаясь в яичниках 21-месячных крыс (0,91±0,08ммоль/мг белка).

Фермент, восстанавливающий GSH, глутатион-редуктаза также наиболее активен в возрастных периодах 9 и 15 месяцев - 1,47±0,1 и 1,22±0,13 ммоль/мин/мг белка соответственно.

Таким образом, несмотря на нарастание уровня МДА в ткани яичников в возрасте 9 и 15 месяцев у крыс активность ферментативного звена АОЗ также увеличивается, то есть система работает сопряженно, сбалансировано. Однако в 21 месяц наблюдаются разнонаправленные изменения в системе ПОЛ-АО, что, по мнению ряда авторов [Б.Н.Лю,2003;

] может быть причиной создания в клетке канцерогенной ситуации.

Показатели системы ПОЛ-АО в плазме крови и эритроцитах животных важны для оценки антиоксидантного статуса в процессе онтогенеза на уровне целостного организма.

Усиление процессов ПОЛ приводит к уменьшению содержания полиненасыщенных жирных кислот, снижения активности мембрансвязанных ферментов, что в свою очередь приводит к окислительному гемолизу эритроцитов. Установлено, что в процессе онтогенеза происходит статистически значимое увеличение содержания МДА в эритроцитах крыс: с 362,7±15,2 мкмоль/л в 4 месяца до 457,5±10,8 мкмоль/л в 15 месяцев (p0,05). Активность СОД в эритроцитах крыс возрастает с уровня 158,93±9,15 усл.ед/л ( мес) до 172,15±11,63 усл.ед/л у взрослых половозрелых самок (9 мес). У более старых животных наблюдается снижение антиоксидантной активности СОД (140,62±9,46 в мес и 121,55±8,58 усл.ед/л в 21 мес соответственно). Активность каталазы в эритроцитах крыс в 4 мес составляет 7,83±0,35 ммоль/мин/л. У 9-месячных крыс она возрастает до максимального значения 8,95±0,42 ммоль/мин/л. У стареющих и старых животных (15 и 21 месяц) активность этого фермента статистически значимо снижается до уровня 6,33±0,17 и 6,02±0,28 ммоль/мин/л соответственно. Активность глутатион-редуктазы в эритроцитах крыс в 4 месяца равна 49,37±2,61 ммоль/мин/л. В 9 месяцев активность этого фермента составляет 47,16±1,92 ммоль/мин/л. Далее в процессе старения животных она снижается до уровня 40,61±2,04 и 34,85±1,76 ммоль/мин/л у животных 15 и 21 месяца соответственно. Наиболее выраженный дисбаланс отмечен нами в возрасте 15 месяцев, когда уровень МДА высок, а активность ферментов уже значительно снижена, т.е. ПО АО – условный показатель по Б.Н.Лю(2003) высокий по сравнению с таковой у 4 и месячных крыс.

350 250 100 0 4 мес 9 мес 15 мес 21 мес МДА,мкмоль/л СОД,усл.ед/л 158,9 ГР,мкмоль/мин/л Рис.2 Изменение компонентов системы ПОЛ-АО в эритроцитах крыс в процессе онтогенеза В плазме крови подобное проявление окислительного стресса наблюдается у старых крыс в возрасте 21 месяца.

2 1,8 4, 1,6 1,4 3, 1,2 1 2, 0,8 0,6 1, 0,4 0,2 0, 0 4 мес 9 мес 15 мес 21 мес каталаза,ммоль/мин/л ГР,ммоль/мин/л МДА,мкмоль/л Рис.3 Изменение компонентов системы ПОЛ-АО в плазме крыс в процессе онтогенеза В процессе онтогенеза в яичниках имеет место понижение активности ферментативного звена эндогенной антиоксидантной системы, в результате чего возможно увеличение ПО-АО, что может явиться причиной патологичных изменений в органе.

Уровень митоза и апоптоза в покровном эпителии яичников крыс на разных этапах индивидуального развития.

Известно, что клетки, имеющие дефекты антиоксидантной защиты, наиболее чувствительны к воздействиям вызывающим их запрограммированную гибель [Papa S.,1997]. В ходе проведенных морфологических исследований выяснено, что с увеличением возраста животного митотический индекс в покровном эпителии яичников снижается, составляя у молодых животных 8,4±0,6 клеток на 500 клеток, у старых ( месяц) – 5,6±0,2 клеток. В возрасте 9 и 15 месяцев наблюдается относительно равное число митозов в эпителии (7,6±0,4 и 7,4±0,4 клеток на 500 клеток соответственно).

Изменение апоптотического индекса (АИ) в покровном эпителии яичников крыс имеет другую направленность. АИ в процессе онтогенеза возрастает. У молодых животных он составляет - 1,8±0,2, у 15-месячных – 5,2±0,2, а у 21-месячных -7,2±0,6 клеток на клеток.

Рис.4 Митоз в клетках покровного Рис.5 Митоз в клетках покровного эпителия яичника крыс 4 месяцев. эпителия яичника крыс 15 месяцев.

Окраска гематоксилин-эозином. Окраска гематоксилин-эозином.

Микрофото х1000. Микрофото х1000.

Рис.6 Апоптоз в клетках покровного Рис.7 Апоптоз в клетках покровного эпителия яичника крысы 4 месяцев. эпителия яичника крысы 9 месяцев.

Окраска гематоксилин-эозином. Окраска гематоксилин-эозином.

Микрофото.x1000 Микрофото.x АИ коррелирует с уровнем накопления МДА в яичниках в процессе онтогенеза.

Коэффициент корреляции по Спирмену р=0,070, то есть связь положительная и сильная.

МИ обратно пропорционален уровню МДА (р= -0,037). Следовательно, интенсивность ПОЛ в яичниках крыс коррелирует с уровнем апоптоза и митоза в покровном эпителии.

9 число клеток на 500 клеток 8 7 мкмоль/мг белка 6 эпителия 5 4 3 2 1 0 4 мес 9 мес 15 мес 21 мес МИ АИ МДА Рис. 8 Митотический и апоптотический индекс в эпителии яичников и уровень МДА в яичниках крыс на разных стадиях онтогенеза Таким образом, полученные данные о динамике компонентов системы ПОЛ-АО в яичниках, эритроцитах и плазме крови крыс в процессе онтогенеза подтверждают положение свободнорадикальной теории старения о существенной роли АФК в проявлении возрастных биохимических и морфологических перестроек [Анисимов В.Н.,2003;

Лю Б.Н., 2003].

Анализ параметров системы ПОЛ-АО в организме животных опухоленосителей с асцитной ОЯ.

Известно, что супероксидный радикал и перекись водорода в низких концентрациях стимулируют деление клеток. Вследствие относительно слабой утилизации О2 дефектными митохондриями опухолевых клеток устанавливается состояние внутриклеточной гипероксии. Возникающий при этом окислительный стресс является важным повреждающим фактором для всех компонентов клетки [Кондакова И.В.,2005;

Поцелуева М.М.,1999].

Результаты, полученные в эксперименте по моделированию асцитной опухоли яичников, показали, что в процессе роста опухолевых клеток в брюшной полости животных система ПОЛ-АО как в неоплазме, так и в эритроцитах и плазме животных с ОЯ меняет свой уровень функционирования.

Уровень МДА в опухолевых клетках и асцитической жидкости коррелирует со стадией роста опухоли (р=0,057, р=0,041 соответственно). Уровень МДА у 4-месячных животных на логарифмической стадии роста в опухолевых клетках составляет 8,07±0, мкмоль/мг белка, возрастая к терминальной стадии (на 15 сутки) до 12,34±1,13. У животных – опухоленосителей 15 месяцев этот показатель увеличивается в 1,8 раза (с 10,25±0,51 до 18,62±1,45мкмоль/мг белка).

Существуют данные литературы, согласно которым возрастание митотической активности злокачественных опухолей может сопровождаться увеличением продукции супероксидного радикала. В опухолевых клетках не происходит должной элиминации активированных метаболитов кислорода.

Динамика СОД (рис.9) и каталазы в опухолевых клетках в процессе развития ОЯ у крыс сходна. По мере увеличения клеток опухоли в асцитической жидкости их активность угнетается. Нами установлено, что активность каталазы в клетках опухоли яичников у молодых животных на терминальной стадии ниже, чем на логарифмической (0,385±0, против 0,412±0,057 ммоль/мин/мг белка соответственно). Та же динамика данного фермента сохраняется и с увеличением возраста животного-опухоленосителя – активность каталазы в опухоли падает с 0,460±0,042 до 0,327±0,051 ммоль/мин/мг белка. Активность ГР в процессе прогрессирования ОЯ возрастает у 4-месячных самок с уровня 6,73±0, на логарифмической до 7,85±0,71 ммоль/мин/мг белка на терминальной стадии. ГР в опухолевых клетках имеет тенденцию к повышению активности и в организме крыс месяцев, ее активность возрастает с 5,58±0,43 до 6,04±0,36 ммоль/мин/мг белка. Уровень ПОЛ при этом значительно возрастает. Таким образом, создается ситуация повышения ПО-АО и состояние гипероксии в опухолевых клетках.

174, 180 155, ммоль/мин/мг белка 160 усл.ед/мг белка 130, 140 112, 0 4 мес log-фаза 4 мес term- 15 мес log- 15 мес term фаза фаза фаза СОД ГР Рис. 9 Активность СОД и ГР в клетках асцитной опухоли яичников крыс в зависимости от возраста животного-опухоленосителя и стадии роста В организме животных с опухолью яичников также нарастает состояние окислительного стресса. Уровень МДА в эритроцитах статистически значимо повышается: у животных 4 месяцев на логарифмической фазе он составляет 485,9±35, мкмоль/л, на терминальной-682,3±58,7 мкмоль/л. У стареющих животных (15 мес) также отмечено увеличение содержания МДА при прогрессировании опухоли (623,7±27, мкмоль/л на log-фазе до 805,4±50,4 мкмоль/л на term-фазе). Причиной могут служить выделение опухолью в окружающую их среду цитотоксичных веществ, иммунный ответ, фагоцитоз, усиление продукции АФК дефектными митохондриями неопластических клеток. Изучение ферментов АОС показало, что активность СОД и каталазы в плазме и эритроцитах крыс с ОЯ увеличивается, а ГР – снижается. Причем эта тенденция наблюдается у животных обеих возрастных групп (табл.1). Таким образом, можно говорить о включении в процесс противораковой защиты организма ферментов, непосредственно направленных на удаление АФК. Глутатионовая система эритроцитов в процессе канцерогенеза более уязвима.

Таблица Активность антиоксидантных ферментов в эритроцитах крыс 4 и 15 месяцев при прогрессировании асцитной опухоли яичников ферменты СОД, усл.ед/ л Каталаза, ГР, ммоль/мин/л ммоль/мин/л 4 мес (n=16) 15мес 4 мес 15мес 4 мес (n=16) 15 мес (n=18) фаза роста (n=18) (n=16) (n=18) опухоли яичников 203,9±27,2 187,5±15,8 11,3±0,65 12,6±0,43 47,63±3,81 32,57±4, Log-фаза 235,4±30,3* 211,9±22,4* 14,81±0,79* 13,45±0,78 38,41±5,36* 25,88±5, term-фаза *- данные, статистически значимо отличающиеся от таковых на предыдущей стадии.

В возрасте 4 месяцев наблюдаются разнонаправленные изменения активности каталазы в АЖ и плазме крови животных-опухоленосителей, в возрасте 15 месяцев подобная тенденция – в отношении ГР. Степень изменения активности ГР в плазме и асцитической жидкости менее значительная, чем активность каталазы. Таким образом, можно предположить более значительный вклад каталазы в процесс антиоксидантной защиты (табл.2).

Таблица Активность каталазы и глутатион-редуктазы в асцитической жидкости и плазме крыс с асцитной опухолью яичника в зависимости от возраста животного и стадии роста опухоли ферменты Каталаза, ммоль/мг белка ГР, ммоль/мг белка 4 мес (n=16) 15 мес (n=18) 4 мес (n=16) 15 мес (n=18) фаза роста АЖ плазма АЖ плазма АЖ плазма АЖ плазма опухоли яичников 0,439± 0,935± 0,524± 0,746± 3,16± 1,68± 2,65± 1,55± Log-фаза 0,052 0,066 0,028 0,034 0,33 0,13 0,17 0, 0,916± 0,708± 0,485± 0,652± 4,02± 1,82± 2,97± 1,42± Term-фаза 0,07* 0,012* 0,039 0,027* 0,25* 0,29* 0,13 0, * - данные, статистически значимо отличающиеся от таковых на предыдущей стадии.

Размножение инокулированных опухолевых клеток происходит в брюшной полости на фоне прогрессивного увеличения объема перитонеальной жидкости, накопление которой связано с воспалительной реакцией брюшины, повышением осмотического и онкотического давления в брюшной полости, возможно, вследствие механического препятствия для оттока жидкости через закупоренные опухолевыми клетками лимфатические сосуды. По данным Sylven B., Wu R. [1972], важным фактором, способствующим инвазивному росту асцитных клеток, является выделение ими токсических веществ, вызывающих деструкцию нормальной ткани.

В ходе проведенных исследований выяснено, что в процессе роста опухоли яичников динамика накопления МДА в плазме и АЖ животных разных возрастных групп отличается по интенсивности (рис.10). У стареющих (15 месяцев) крыс он возрастает в 1,75 раза в АЖ и в 1,67 раза в плазме, тогда как у молодых – в 1,33 раза и в плазме, и в АЖ.

15, 10, 10 7, 8 5, 3,87 Term 0 7, 4,25 9,17 Log АЖ- Пл- АЖ- Пл- Log Term Рис. 10 Динамика МДА (мкмоль/л) в асцитической жидкости и плазме крови 4- и 15-месячных животных при росте опухоли яичников При моделировании асцитной опухоли яичников у крыс двух возрастных групп – мес(молодые) и 15 мес (стареющие) – было выяснено, что существует общая тенденция развития опухолевого процесса, сопровождающаяся накоплением продукта ПОЛ на фоне снижающейся активности СОД и каталазы в клетках опухоли и возрастающей активности ГР. Различия в динамике ГР наблюдаются в плазме крови 4 и 15-месячных крыс, в отношении каталазы – в асцитической жидкости. Таким образом, степень и направленность активации системы ПОЛ-АО в организме крыс разных возрастных групп неодинакова.

Сравнительный анализ показателей системы ПОЛ-АО в плазме крови и эритроцитах животных 4 и 15 месяцев в процессе индивидуального развития (контрольная группа) и на логарифмической стадии роста асцитной опухоли яичников (опытная группа) показал следующее.

Установлено, что в эритроцитах животных-опухоленосителей на логарифмической стадии процесса уровень МДА значительно выше по сравнению с контрольной группой. В плазме крови контрольной и опытной групп содержание МДА возрастает более чем в раза. Активность СОД и каталазы в эритроцитах животных с опухолью яичников также повышена по сравнению со здоровыми животными этой же возрастной группы. В плазме сохраняется та же динамика. Однако показатели другого антиоксидантного фермента, входящего в глутатионовую антиоксидантную систему,- глутатион-редуктазы (ГР) имеют другую направленность. Как в эритроцитах, так и в плазме крови животных на логарифмической стадии роста опухоли яичников наблюдается снижение активности ГР (рис.11,12).

700 623, 49, 600 47,63 40, 485,9 457,5 32, 362, 203,9 187, 158, 200 140, 0 контроль опыт контроль опыт 4 мес 4 мес 15 мес 15 мес МДА,мкмоль/л СОД,усл.ед/л ГР,ммоль/мин/л Рис.11 Изменение параметров системы ПОЛ-АО в эритроцитах животных 4 и 15 месяцев в процессе онтогенеза (контроль) и логарифмической стадии развития опухоли яичников (опыт) 12 0, 0,854 10,04 0, 0, 10 0, 0, 7,52 0, 0, 6 0, 4,07 0, 3, 4 0, 1,78 1,68 1,7 1,55 0, 0, 0 контроль опыт контроль опыт 4 мес 4 мес 15 мес 15 мес МДА,мкмоль/л ГР,ммоль/мин/л каталаза,ммоль/мин/л Рис.12 Изменение параметров системы ПОЛ-АО в плазме крови животных 4 и 15 месяцев в процессе онтогенеза (контроль) и логарифмической стадии развития опухоли яичников (опыт) Полученные данные позволяют говорить о переходе системы ПОЛ-АО в организме опухоленосителя на более высокий уровень функционирования.

Таким образом, наши данные позволяют предполагать, что в процессе онтогенеза в яичнике крыс – органе, рано подверженном инволютивным процессам, имеет место разнонаправленная динамика компонентов системы ПОЛ-АО. При этом имеет место увеличение уровня МДА при одновременном снижении уровня активности ферментативного звена АОЗ. Аналогичная динамика имеет место в плазме крови и эритроцитах крыс в процессе онтогенеза. Анализ компонентов вышеуказанной системы в эритроцитах, плазме, асцитической жидкости и опухолевых клетках у крыс с перевиваемой опухолью (штамм ОЯ) показал снижение активности ферментативного звена антиоксидантной системы на фоне увеличения содержания МДА на терминальной стадии по сравнению с логарифмической.

Таким образом, динамика компонентов системы ПОЛ-АО в плазме крови, эритроцитах и ткани яичников крыс в процессе онтогенеза сходна с таковой в процессе канцерогенеза.

Выводы:

1. В процессе онтогенеза в яичниках, плазме крови и эритроцитах крыс имеет место возрастание уровня МДА при одновременном снижении активности ферментативного звена антиоксидантной защиты.

2. В покровном эпителии яичника крыс в процессе онтогенеза имеет место значимое снижение уровня митоза и возрастание апоптоза.

3. У крыс с асцитной опухолью яичника в опухолевых клетках имеет место фазные изменения в системе ПОЛ-АО: на терминальной стадии по сравнению с логарифмической имеет место увеличение содержания МДА при одновременном снижении активности ферментативного звена антиоксидантной защиты.

4. При развитии асцитной опухоли яичников динамика уровня МДА и активности ферментов антиоксидантной защиты в эритроцитах, плазме и асцитической жидкости молодых (4 месяца) животных отлична от таковой у стареющих животных ( месяцев).

5. Динамика активности компонентов системы ПОЛ-АО в яичниках крыс в процессе онтогенеза сходна с таковой в процессе канцерогенеза.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Арсланова Д.Р. Функциональное состояние нейтрофилов и антиоксидантный статус крыс с асцитной опухолью яичников / Генинг Т.П., Абакумова Т.В., Арсланова Д.Р. // Вестник новых медицинских технологий. 2008.

№1. с.32-33.

2. Арсланова Д.Р. О патогенетической взаимосвязи процессов липопероксидации, ферментативного звена антиоксидантной системы неоплазмы и функционального состояния нейтрофилов асцитической жидкости при прогрессировании рака яичников у крыс / Антонеева И.И., Абакумова Т.В., Арсланова Д.Р., Чеснокова Н.П. // Вестник новых медицинских технологий. 2008.

Т.XV. №4. с.16-17.

3. Арсланова Д.Р. Система ПОЛ-Антиоксидант в яичниках крыс в процессе онтогенетической адаптации / Арсланова Д.Р., Антонеева И.И. // Вестник Томского государственного университета. 2006. №21. С.9-11.

4. Арсланова Д.Р. Межнуклеосомальная фрагментация ДНК в опухолевой ткани при раке яичников / Антонеева И.И., Арсланова Д.Р. // Паллиативная медицина и реабилитация. 2006. №2. С.5.

5. Арсланова Д.Р. Активность системы ПОЛ-антиоксиданты в плазме крови у больных раком яичников / Антонеева И.И., Ксейко Д.Р., Арсланова Д.Р. // Ученые записки УлГУ. Серия: Клин. Мед. 2005. №1(9). С.6-10.

6. Арсланова Д.Р., Генинг Т.П. Состояние системы ПОЛ-антиоксидант яичников крыс на разных стадиях онтогенеза. / Арсланова Д.Р., Генинг Т.П. // Сборник материалов 2-й Всероссийской конференции с международным участием «Медико-физиологические проблемы экологии человека». Ульяновск. 2007. С.17-18.

7. Арсланова Д.Р. Динамическое равновесие в системе ПОЛ-Антиоксидант яичников крыс в процессе онтогенеза / Арсланова Д.Р., Генинг Т.П. // Сибирский консилиум. 2007. №7. с.157.

8. Арсланова Д.Р. Функциональное состояние системы ПОЛ-антиоксидант у крыс с асцитной опухолью яичника на разных стадиях онтогенеза / Генинг Т.П., Арсланова Д.Р. // Сборник материалов «Актуальные проблемы физиологии, физического воспитания и спорта». Ульяновск, УлГПУ. 2008. с.7-9.

9. Арсланова Д.Р. Состояние нейтрофильных гранулоцитов и антиоксидантной системы у крыс с асцитной опухолью яичников / Арсланова Д.Р., Абакумова Т.В. // Материалы докладов I Всероссийской молодежной научной конференции «Молодежь и наука на Севере». Сыктывкар. 2008. с.192-194.

10. Арсланова Д.Р. Паранеопластические изменения в системе крови в процессе прогрессирования асцитной опухоли яичников у крыс / Антонеева И.И., Абакумова Т.В., Арсланова Д.Р. // Материалы VIII Молодежной научной конференции института физиологии КНЦ УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике». Сыктывкар. 2009. с.17-20.

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ АЖ – асцитическая жидкость АО – антиоксиданты АФК – активные формы кислорода ГР – глутатионредуктаза МДА – малоновый диальдегид НАДН – восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотида ОЯ – опухоль яичников ПОЛ – перекисное окисление липидов СОД – супероксиддисмутаза ТБК – тиобарбитуровая кислота ТХУ – трихлоруксусная кислота GSH – глутатион восстановленный GSSG – глутатион окисленный Log-фаза – логарифмическая фаза Term-фаза – терминальная фаза