Определение компонентов комплексов белка suur drosophila melanogaster
На правах рукописи
ПОСУХ Ольга Витальевна ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОМПОНЕНТОВ КОМПЛЕКСОВ БЕЛКА SUUR DROSOPHILA MELANOGASTER 03.02.07 – генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Новосибирск 2013
Работа выполнена в лаборатории молекулярной цитогенетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск и в лаборатории геномики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной и клеточной биологии СО РАН, г. Новосибирск Научные руководители: Жимулёв ИгорьФедорович академик РАН, доктор биологических наук профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, г. Новосибирск
Официальные оппоненты: Омельянчук Леонид Владимирович доктор биологических наук, заведующий лабораторией генетики клеточного цикла, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, г. Новосибирск Шевченко Александр Игоревич кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории эпигенетики развития, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Национальный исследовательский Томский государственный университет», г. Томск
Защита диссертации состоится «_» 2013 г. на утреннем заседании диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, по защите на соискание ученой степени доктора наук в ИЦиГ СО РАН в конференц-зале Института по адресу:
630090, г. Новосибирск, проспект ак. Лаврентьева, д. 10, тел. (383) 363-49-06, факс (383) 333-12-78, e-mail: [email protected].
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН.
Автореферат разослан «_» _ 20_ г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Реализация эпигенетической программы в развитии эукариотических организмов является на данный момент одной из наиболее изучаемых проблем современной биологии. То или иное состояние отдельных участков генома (эухроматиновое или гетерохроматиновое) эпигенетически наследуется в ряду клеточных поколений. Было показано, что эухроматиновые и гетерохроматиновые районы реплицируются неодновременно (Schubeler et al., 2002;
MacAlpine et al., 2004). Параметры пространственно-временной картины репликации генома четко контролируются в клеточном цикле (Berezney et al., 2000;
Blow and Dutta, 2005;
DePamphilis et al., 2006;
Groth et al., 2007;
Gilbert et al., 2010). Однако многие аспекты регуляции такой дифференцированной программы остаются невыясненными.
У Drosophila melanogaster временная картина репликации в политенных тканях имеет свои характерные особенности: в силу укороченного общего времени S-фазы, поздно реплицирующиеся гетерохроматиновые районы политенных хромосом слюнных желез не успевают завершить свою репликацию до конца S-фазы и последовательности ДНК в них остаются недопредставленными (Gall et al., 1971;
Smith and Orr-Weaver, 1991;
Lilly and Spradling, 1996). У D. melanogaster фактором, влияющим на регуляцию времени репликации таких районов в политенных хромосомах слюнных желез личинок, является белок SUUR (Suppressor of Underreplication). Он способен связываться с районами прицентромерного и интеркалярного (расположенного в плечах хромосом) гетерохроматина (Makunin et al., 2002, Zhimulev et al., 2003). В мутации SuUR эти районы хромосом заканчивают репликацию раньше в S-фазе, вследствие чего, недореплицированные в норме районы становятся полностью политенизированными (Belyaeva et al., 1998). В экспериментах на культуре клеток дрозофилы для белка SUUR было показано, что его геномные мишени соответствуют транскрипционно неактивным типам хроматина (Pindyurin et al., 2007;
Filion et al., 2010). Кроме того, была продемонстрирована способность SUUR замедлять скорость движения вилок репликации при амплификации хорионовых генов в фолликулярных клетках яичников (Sher et al., 2012). Однако остается открытым вопрос - как именно SUUR осуществляет свою функцию? Связано ли это с прямым воздействием на машину репликации или же основное влияние SUUR оказывает на структуру хроматина, что, в свою очередь, уже регулирует скорость репликационной вилки?
Чтобы исследовать механизм работы SUUR, необходима информация о его взаимодействиях с другими белками. К настоящему моменту, единственным белком, для которого было показано физическое взаимодействие с SUUR, является гетерохроматиновый белок НР1 (Pindyurin et al., 2008). Однако, этой информации недостаточно, чтобы объяснить эффект белка SUUR в разных тканях.
В данной работе, чтобы приблизиться к пониманию механизмов действия SUUR, был осуществлен поиск новых белков, с которыми SUUR может взаимодействовать. Была создана система для выделения и очистки белковых комплексов, в которые входит SUUR, на основе метода двойной аффинной очистки (TAP – tandem affinity purification). Эта система была использована для выделения комплексов SUUR-TAP из белковых экстрактов, полученных из линии культуры клеток S2 дрозофилы, и их состав был проанализирован при помощи масс спектрометрических методов. После обработки данных масс-спектрометрии был получен список вероятных белков-партнеров SUUR и проведены эксперименты по исследованию функциональности этих взаимодействий генетическими методами.
Кроме того, система экспрессии химерного белка SUUR-TAP была использована для проверки гипотезы взаимодействия SUUR и репликационной машины методом коиммунопреципитации белков из эмбриональных экстрактов дрозофилы.
Результаты данной работы указывают на возможное участие SUUR в процессе ремоделинга хроматина во время репликации. Дальнейшая биохимическая проверка обнаруженных взаимодействий позволит построить конкретную модель механизма работы SUUR.
Основная цель данной работы - прояснить роль белка SUUR в процессе репликации у D. melanogaster через выявление белков, способных взаимодействовать с SUUR, методом двойной аффинной очистки белковых комплексов.
Задачи данного исследования:
1. Создать систему экспрессии функционального химерного белка SUUR-TAP в организме и в культуре клеток дрозофилы.
2. Проверить взаимодействие SUUR с PCNA, как с основной структурной компонентой репликационной машины, в эмбрионах дрозофилы.
3. Выделить комплексы белка SUUR-TAP из экстрактов культуры клеток S дрозофилы при помощи метода двойной аффинной очистки белковых комплексов.
Идентифицировать компоненты комплекса при помощи масс-спектрометрии.
4. Проверить обнаруженные потенциальные взаимодействия SUUR генетическими методами.
Научная новизна работы. Создана система для выделения комплексов белка SUUR дрозофилы при помощи метода двойной аффинной очистки. Выявлены ранее не описанные взаимодействия SUUR: установлено физическое взаимодействие SUUR и PCNA (структурной основой репликационной машины) в эмбрионах дрозофилы;
определены потенциальные компоненты комплексов SUUR-TAP в культуре клеток дрозофилы S2, среди которых оказались белки, участвующие в процессах регуляции клеточного цикла, репликации, репарации двуцепочечных разрывов ДНК и ремоделинга хроматина. Первичный анализ обнаруженных взаимодействий выявил генетические взаимодействия SuUR с генами Ssrp1, CG (ss Dpol ) и hd, что позволяет предположить участие SUUR в ремоделинге хроматина во время репликации.
Научно-практическая ценность работы. Результаты данного исследования вносят вклад в фундаментальные знания о процессе репликации у дрозофилы и дают серьезные предпосылки для изучения роли SUUR в таких процессах, как ремоделинг хроматина, контроль репликации и репарации ДНК. В ходе работы была создана система экспрессии SUUR-TAP и проведен ряд необходимых проверок функциональности этого химерного белка. Полученную систему можно эффективно использовать не только для дальнейшего изучения белок-белковых взаимодействий SUUR, но и в качестве более удобного и точного инструмента для цитологического анализа функции SUUR в клетке.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
Белок SUUR физически взаимодействует с PCNA, структурной основой репликационной машины, что отражает связь SUUR с процессом репликации ДНК.
В культуре клеток дрозофилы S2 SUUR ассоциирован с белками, связанными с процессами регуляции клеточного цикла и репликации, ремоделинга хроматина, детекции и репарации двуцепочечных разрывов ДНК, а также гетерохроматиновым белком НР1.
Личный вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Эксперименты по трансформации культуры клеток дрозофилы конструкцией SuUR-TAP были проведены при участии к.б.н. А.А. Горчакова и к.б.н.
А.А. Алексеенко. Анализ локализации SUUR и PCNA на политенных хромосомах слюнных желез был проведен при участии к.б.н. Т.Д. Колесниковой. Анализ частот разломов на политенных хромосомах слюнных желез был проведен совместно с д.б.н. Е.С. Беляевой. Фракционирование экстрактов проведено при участии С.В.
Кулемзина.
Апробация работы. Результаты работы представлены на российских и международных конференциях в устных докладах: на 44-ой Международной научной студенческой конференции (Новосибирск, Россия, 2006 г.), на 1-ой Международной научной конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, Россия, 2007 г.), на 12-ой Всероссийской молодежной школе конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, Россия, 2009 г.), на 10-й Международной конференции по гетерохроматину дрозофилы (Губбио, Италия, 2011 г.);
а также в стендовых сообщениях: на 1-ой Международной научной конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, Россия, 2007 г.), на 8-м Европейском симпозиуме по изучению белков (Цюрих, Швейцария, 2009 г.), на 51-ой конференции по изучению дрозофилы (Вашингтон, США, 2010 г.), на 72-м симпозиуме лаборатории Колд Спринг Харбор «Метаболизм и заболевания» (Колд Спринг Харбор, США, 2011 г.), на 3-ей конференции Европейского общества молекулярной биологии «The EMBO Meeting» (Вена, Австрия, 2011 г.).
Публикации. По теме исследования опубликовано 3 статьи и 14 тезисов конференций.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в которые входит 126 ссылок. Работа изложена на 121 странице печатного текста, содержит 3 таблицы и 12 рисунков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Линии мух. В работе использовали линии мух, полученные из Bloomington Stock Center, описанные в базе данных FlyBase (http://flybase.org/), а также линии w;
ru h SuURES и w;
UAS-SuUR;
ru h SuURES, описанные в Belyaeva et al., 1998. Линии с конструкциями для РНК-интерференции были получены из Vienna Drosophila RNAi Center (http://stockcenter.vdrc.at/).
Молекулярное клонирование и работа с нуклеиновыми кислотами.
Выделение и анализ ДНК и РНК проводили по стандартным протоколам или в соответствии с рекомендациями фирм-производителей (QIAGEN, Invitrogen, Promega). Эксперименты с бактериями и плазмидами также проводили по стандартным протоколам. Плазмида pZome-C предоставлена фирмой CELLZOME (www.cellzome.com).
Культура клеток. Трансфекцию культуры клеток S2 конструкцией SuUR-TAP проводили кальций-фосфатным методом по протоколу Invitrogen.
Цитологический анализ политенных хромосом. Приготовление и окрашивание препаратов слюнных желез для подсчета числа разломов политенных хромосом проводили по методике, описанной в Zhimulev et al., 1982. Подробности методики иммуноокрашивания политенных хромосом, использованной в этой работе, описаны в Kolesnikova et al., 2013.
Работа с белками. Белковые экстракты из эмбрионов и культуры клеток дрозофилы получали согласно методике, описанной в Soeller et al., 1988 с небольшими модификациями. Иммунопреципитации белков проводили по протоколу, описанному в Puig et al. 2001, а также согласно инструкциям фирм производителей SIGMA, Invitrogen, Stratagene. FPLC-фракционирование белковых экстрактов проводили с использованием реактивов и оборудования GE Healthcare.
Вестерн блот анализ проводили по стандартной методике.
Масс-спектрометрический анализ. Обработка белковых образцов трипсином и масс-спектрометрический анализ проводился на базе центра Taplin Biological Mass Spectrometry Facility (г. Бостон, CША, http://taplin.med.harvard.edu). Спектральные данные анализировали при помощи программного обеспечения Mascot (http://www.matrixscience.com).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Создание системы для экспрессии химерного белка SUUR-TAP.
Использование химерных белков с аффинными эпитопами является одним из наиболее эффективных подходов к изучению белок-белковых взаимодействий. Для создания химерного SUUR был выбран аффинный эпитоп TAP для выделения целых белковых комплексов методом двойной аффинной очистки (Tandem Affinity Purification) (Puig et al., 2001). Аффинные свойства этого эпитопа также позволяют проверять потенциальные взаимодействия SUUR методом коиммунопреципитации.
Первым этапом этой работы было создание векторных конструкций для экспрессии химерного белка SUUR-TAP в клетках дрозофилы. В таком химерном белке TAP-эпитоп расположен на С-конце и содержит аффинные домены СВР (кальмодулин-связывающий) и ProtA (IgG-связывающий), разделенные сайтом для разрезания TEV-протеазой (Рис. 1А). Для условий экспрессии химерного белка, наиболее приближенных к нативным, была создана конструкция SuUR-TAP (Рис. 1Б), обеспечивающая экспрессию под контролем промотора гена SuUR. Кроме того, была создана конструкция UAS-SuUR-TAP (Рис. 1В) для контролируемой экспрессии SUUR-TAP в различных органах и тканях дрозофилы при помощи GAL4-UAS системы. Использование такой схемы экспрессии позволяет получать достаточно большое количество белка в клетке в зависимости от целей эксперимента.
Следующим этапом работы было внедрение полученных конструкций в геном дрозофилы. Для решения поставленных задач в полном объеме оптимально было добиться экспрессии SUUR-TAP и в культуре клеток, и в целом организме дрозофилы. Культура клеток S2 была трансформирована смесью векторной конструкции SuUR-TAP и плазмиды, несущей устойчивость к гигромицину. После поддержания культур на селективной среде при помощи Вестерн блот анализа отбирали те клоны клеток, где стабильно экспрессировался SUUR-TAP. Помимо трансформированной линии культуры клеток, мы получили трансгенные линии мух, содержащие геномные встройки конструкций SuUR-TAP и UAS-SuUR-TAP.
SUUR-TAP функционален в организме дрозофилы. Для дальнейшей работы необходимо было убедиться, что и SUUR и TAP-эпитоп являются функциональными в составе химерного белка SUUR-TAP. Критерием функциональности SUUR в составе SUUR-TAP является восстановление до нормы (или «спасение») мутантного фенотипа SuUR. Фенотипом мутации является супрессия недорепликации в клетках слюнных желез дрозофилы и, как следствие, исчезновение разломов на политенных хромосомах (Belyaeva et al., 1998). Для проведения теста на «спасение» в линии мух, содержащей встройку конструкции SuUR-TAP, аллели нормального гена SuUR были заменены на мутантные из линии y1w67;
ru h SuURES. Из слюнных желез личинок полученной линии SuUR-TAP;
ru h SuURES были сделаны препараты политенных хромосом и посчитаны частоты разломов в девяти тестовых хромосомных районах.
На рисунке 2А видно, что в линии, где эндогенный SUUR заменен на SUUR-TAP, разломы хромосом в тестовых районах встречаются не реже, чем в диком типе (биномиальный тест, P 0,05). В линии с мутацией SuUR частоты разломов в этих районах равны нулю (Belyaeva et al., 1998). Ранее для белка SUUR был показан характерный паттерн его локализации на политенных хромосомах слюнных желез личинок дрозофилы (Makunin et al., 2002). Методом иммунолокализации мы показали, что SUUR-TAP способен связываться с хроматином политенных хромосом слюнных желез. Мы также показали, что SUUR-TAP в условиях эктопической экспрессии с различными GAL4-драйверами дает такие же эффекты, как и белок SUUR (Volkova et al., 2003).
Чтобы оценить функциональность ТАР-эпитопа в составе SUUR-TAP, мы использовали белковые экстракты из линии клеточной культуры S2 c экспрессией SUUR-TAP. Клеточные экстракты инкубировали с аффинным IgG-матриксом, затем отмывали матрикс от несвязавшегося материала. Матрикс был разделен на две равных части, к одной из которых был добавлен буфер с TEV-протеазой, а к другой буфер без протеазы. Вестерн блот с полученными элюатами представлен на рисунке 2Б. Видно, что в образцах без добавления TEV-протеазы полноразмерный белок SUUR-TAP связан с IgG-агарозой (Рис. 2Б). Это свидетельствует о функциональности домена ProtA в TAP-эпитопе. После добавления TEV-протеазы полноразмерная форма SUUR-TAP на матриксе не детектируется (Рис. 2Б), это означает, что сайт узнавания TEV стерически доступен в составе TAP-эпитопа химерного белка SUUR-TAP и успешно расщепляется TEV-протеазой.
Таким образом, мы создали систему для выделения белковых комплексов SUUR-TAP методом двойной аффинной очистки. Были получены трансгенные линии мух и трансформированная клеточная линия с экспрессией полностью функционального химерного белка. Такая система значительно расширяет методические возможности изучения SUUR.
SUUR взаимодействует с репликационной машиной. Предыдущие исследования функции SUUR указывают на его участие в регуляции процесса репликации ДНК (Zhimulev et al., 2003;
Yurlova et al., 2009). В одной из последних работ было показано, что SUUR способен замедлять движение репликационной вилки при амплификации хорионовых генов (Sher et al., 2012). Однако не было ясно, связан ли этот эффект SUUR с изменением структуры хроматина или же с непосредственным взаимодействием SUUR с вилкой репликации. Параллельно с данной работой, в нашей лаборатории были проанализированы паттерны хромосомной локализации SUUR в клетках слюнных желез для исследования его динамики в клеточном цикле. В качестве маркера стадий эндоцикла использовались паттерны локализации белка PCNA, структурной основы репликационной машины.
Сигналы иммунолокализации PCNA точно показывают, какие районы хромосом реплицируются в данный момент S-фазы. При совмещении паттернов SUUR и PCNA была обнаружено, что, начиная с середины S-фазы, эти белки почти полностью колокализуются на политенных хромосомах (Kolesnikova et al., 2013).
Рис. 1. Создание химерного белка SUUR-TAP. (А) Структурные элементы химерного белка SUUR-TAP. (Б) Схема генетической конструкции SuUR-TAP на основе геномного клона SuUR и вектора pWhiteRabbit. (В) Схема генетической конструкции UAS-SuUR-TAP на основе вектора pUAST и кДНК SuUR. CBP – кальмодулин-связывающий домен, ProtA – IgG-связывающий домен, miniwhite – репортерный ген, 5хUAS – пятикратно повторенная последовательность UAS, hsp70 – промотор гена теплового шока. Последовательность TAP эпитопа взята из плазмиды pZome-C. Треугольниками обозначены фрагменты Р-элемента.
Рис. 2. SUUR и TAP-эпитоп функциональны в составе химерного белка SUUR-TAP.
(A) Частоты разломов в тестовых районах политенных хромосом в линии с экспрессией SUUR-TAP на фоне мутации SuUR и в линии дикого типа. Для каждого района было оценено 40-50 ядер. * - биномиальный тест, P0,05. В линии с мутацией SuUR частоты разломов в тестовых районах равны нулю (Belyaeva et al., 1998). (Б) Детекция химерного белка SUUR-TAP в элюатах с IgG-агарозы после инкубации с TEV-протеазой и без добавления TEV-протеазы. Вестерн блот с РАР-конъюгатами (-ТАР). Образцы использовали в нескольких разведениях (10%, 5%, 2%, 1%).
Эти наблюдения коллег позволили нам предположить, что корреляция динамики SUUR и PCNA в S-фазе может быть следствием их физического взаимодействия. Биохимически показать взаимодействие между SUUR и PCNA можно при помощи коиммунопреципитации. Наиболее доступным материалом для приготовления белковых экстрактов служат эмбрионы дрозофилы. Известно, что и PCNA и SUUR оба присутствуют в эмбрионах во время S-фазы (Makunin et al., 2002;
Kolesnikova et al., 2013;
FlyBase, http://flybase.org).
Чтобы убедиться, что белковый комплекс SUUR/PCNA в принципе может существовать, мы проанализировали профили элюции этих белков в ходе FPLC фракционирования всех белковых комплексов в нативных эмбриональных экстрактах (Рис. 3А). Всего было отобрано 11 фракций (пронумерованы от тяжелых к легким), образцы из которых были затем использованы для Вестерн блот анализа с антителами против SUUR и PCNA. На рисунке 3А видно, что фракции, содержащие SUUR и PCNA, перекрываются: во фракциях 7 и 8 присутствуют оба белка. Это свидетельствует о том, что SUUR и PCNA могут входить в состав общего, достаточно крупного (~232 - 440 кДа) белкового комплекса в эмбрионах дрозофилы.
Стоит отметить, что в этом эксперименте впервые удалось оценить размер комплексов, образуемых SUUR.
Чтобы продемонстрировать физическое взаимодействие SUUR и PCNA, из FPLC-фракции 7, содержащей оба белка, были иммунопреципитированы комплексы PCNA (при помощи высокоэффективных антител к PCNA). Вестерн блот с антителами против SUUR показал, что полноразмерный SUUR (~130 кДа) присутствует в иммунопреципитированных комплексах PCNA (Рис. 3Б). Это указывает на то, что SUUR и PCNA входят в состав общего комплекса в эмбрионах дрозофилы.
Для подтверждения специфичности такого взаимодействия был необходим реципрокный эксперимент по коиммунопреципитации, где белком-мишенью был бы SUUR. Чтобы повысить эффективность иммунопреципитации и повысить уровень полноразмерного SUUR в эмбриональных экстрактах, было решено использовать полученную нами ранее систему контролируемой экспрессии химерного белка SUUR-TAP (мы использовали повсеместную экспрессию трансгена UAS-SuUR-TAP в эмбрионах с драйвером da-GAL4). Используя первый этап метода двойной аффинной очистки (Рис. 4Б), белковые комплексы SUUR-TAP были иммунопреципитированы из полученных эмбриональных экстрактов при помощи IgG-матрикса (Рис. 3В).
После серии отмывок SUUR и связанные с ним белки были элюированы добавлением в образцы TEV-протеазы (Рис. 4В, Г). Анализ полученных элюатов при помощи Вестерн блот с антителами против PCNA подтвердил взаимодействие SUUR и PCNA (Рис. 3В).
Чтобы дополнительно убедиться, что в предыдущем эксперименте PCNA взаимодействует именно с SUUR, а не с ТАР-эпитопом в SUUR-TAP, мы провели контрольные эксперименты по иммунопреципитации. При ТАР иммунопреципитации контрольных образцов неспецифического взаимодействия PCNA с аффинным матриксом или с ТАР-эпитопом (без участия SUUR) обнаружено не было (Рис. 3Г). PCNA является структурной основой для различных клеточных процессов и может связываться с множеством белков, обладающих разнообразными функциями. Большинство этих белков взаимодействуют с PCNA посредством канонических пептидных мотивов, называемых PCNA interacting peptides (PIPs) (Naryzhny, 2008). Анализ пептидной последовательности SUUR не выявил подобных мотивов, что может указывать на вероятное непрямое взаимодействие с PCNA.
Рис. 3. SUUR взаимодействует с PCNA в эмбрионах дрозофилы. (А) FPLC фракционирование нативных эмбриональных экстрактов. Индивидуальные фракции окрашены при помощи Вестерн блот (ВБ) антителами против SUUR и PCNA. Стрелками обозначен молекулярный вес фракций. (Б) SUUR коиммунопреципитируется с PCNA из FPLC-фракции 7. Стрелками отмечен полноразмерный SUUR (~130 кДа). (В) PCNA коиммунопреципитируется с SUUR-TAP из эмбриональных ядерных экстрактов генотипа da-GAL4UAS-SuUR-TAP. PCNA детектируется в TEV-элюатах, содержащих связанные с SUUR белки. Стрелкой обозначен полноразмерный SUUR-TAP. (Г) PCNA не взаимодействует с IgG-агарозным матриксом («no tag») и ТАР-эпитопом отдельно от SUUR (MSL3-TAP экстракты (Alekseyenko et al., 2006)).
Выявление компонентов комплексов SUUR-TAP. Одним из ключевых экспериментов данной работы являлось собственно выделение комплексов белка SUUR-TAP из ядерных экстрактов методом двойной аффинной очистки. Схема эксперимента (Puig et al., 2001) представлена на рисунке 4.
Рис. 4. Схема экспериментов по двойной аффинной очистке белковых комплексов SUUR-TAP. (A-Г) Аффинная очистка на IgG-матриксе. (Д-Е) Аффинная очистка на кальмодулиновом матриксе. (Ж-И) Анализ состава комплексов SUUR ТАР. М – маркер молекулярного веса белков. Подробности этапов описаны в тексте.
Основные этапы были следующими:
Полученные из клеток ядерные белковые экстракты (Рис. 4А) были добавлены к предварительно промытому IgG-агарозному матриксу. После аффинного связывания комплексов SUUR-TAP c IgG-агарозой несвязавшийся материал был удален промывкой (Рис. 4Б).
Для специфической элюции комплексов SUUR-TAP к матриксу была добавлена TEV-протеаза в активирующем буфере (Рис. 4В).
После разрезания TEV-протеазой, супернатант, содержащий SUUR-TAP (без ProtA домена) и связанные с ним белки, был отделен от матрикса (Рис. 4Г).
К полученному на предыдущем этапе элюату добавляли буфер с CaCl2 и наносили на аффинную колонку, содержащую кальмодулиновый матрикс. На этом этапе CBP-домен в SUUR-TAP обеспечивает специфическое связывание комплексов с матриксом. Комплексы повторно отмывали от контаминантов (Рис. 4Д).
Комплексы SUUR-TAP элюировали, удаляя ионы кальция (Рис. 4Е).
Дважды очищенные комплексы преципитировали 30% ТХУ и растворяли в буфере для нанесения. Компоненты комплексов разделяли электрофорезом в полиакриламидном геле. Бэнды, соответствующие белкам, выявляли окраской нитратом серебра (Рис. 4Ж).
Так как на предыдущем этапе было детектировано довольно большое для индивидуальной диссекции количество белковых бэндов (Рис. 4Ж), мы решили анализировать фрагменты геля, соответствующие целым дорожкам. Белки в образцах геля (опытном и контрольном – экстракты из клеток без экспрессии SUUR TAP) расщепляли трипсином и полученные наборы коротких пептидов анализировали при помощи масс-спектрометрии (Рис. 4З).
Из общего пула сигналов для образца SUUR-TAP были вычтены неспецифические сигналы («шум») из контрольного образца. При помощи программного обеспечения Mascot (http://www.matrixscience.com/) был идентифицирован набор пептидов в образце SUUR-TAP. Список предполагаемых белков-партнеров SUUR получали в результате поиска совпадений всех коротких пептидов в белковых базах данных через Protein BLAST (Рис. 4И).
Полученный в итоге список наиболее вероятных взаимодействий SUUR приведен в таблице 1. Белки в таком списке проранжированы в зависимости от относительной представленности в спектре (Табл. 1). Первую строку в этом списке, как и ожидалось, занимает cам белок SUUR. В итоговом списке мы обнаружили и гетерохроматиновый белок НР1, взаимодействие SUUR с которым было показано ранее (Pindyurin et al., 2008).
Таблица 1. Белки, обнаруженные масс-спектрометрически при выделении комплексов SUUR-TAP методом двойной аффинной очистки.
количество покрытие относительная Белок Размер (ак.) совпадений белка представленность пептидов (шт.) пептидами в спектре* SUUR 962 55 50% 57. HMGZ 111 6 49% 54. HP1 213 11 52% 51. Cyclin A 491 22 35% 44. SSRP1 723 32 40% 44. HD 568 24 42% 42. RAD51 336 14 58% 41. ORC1 924 35 36% 37. Ss Dpol 431 15 35% 34. BLM 1487 50 33% 33. * Относительная представленность белка в спектре отражает количество совпадений пептидов на 1000 аминокислот.
Анализ данных о клеточных функциях белков из списка (взяты из базы данных FlyBase, http://flybase.org) показал, что вместе с SUUR, в основном выявились белки, участвующие в таких процессах как: контроль клеточного цикла и репликация (Cyclin A, малая субъединица ДНК полимеразы, ORC1, белковый продукт гена humpty dumpty), репарация двуцепочечных разрывов ДНК (RAD51, BLM), ремоделинг хроматина (SSRP1, HMGZ) и поддержание гетерохроматинового состояния (НР1) (Lehner, O'Farrell, 1989;
Adams et al., 2003;
Shimojima et al., 2003;
Staeva-Vieira et al., 2003;
Bandura et al., 2005;
DePamphilis, 2005;
Ragab et al., 2006).
Интересно отметить, что такой набор клеточных процессов, так или иначе, коррелирует с известными на данный момент эффектами SUUR.
Анализ литературы и баз данных о белковых взаимодействиях (BioGRID http://www.thebiogrid.org/, DroID http://www.droidb.org/) показал, что для большинства этих белков (Табл. 1) ранее были показаны те или иные варианты взаимодействия друг с другом, а также с обнаруженным в этой работе белком-партнером SUUR PCNA.
Анализ генетических взаимодействий SUUR. Для подтверждения обнаруженных потенциальных взаимодействий SUUR, мы решили проверить, повлияет ли нарушение экспрессии белков-кандидатов в партнеры SUUR на его хромосомную локализацию. Так, если исследуемый белок взаимодействует с SUUR и участвует в механизме его действия, то серьезные изменения экспрессии такого белка (супрессия или оверэкспрессия) с большой вероятностью приведет к нарушениям функции SUUR, а значит и нарушению его связывания с хромосомами.
Наиболее удобной для работы системой супрессии генов является РНК интерференция (RNAi супрессия). Мы подобрали доступные в Vienna Drosophila RNAi Center линии мух со встройками конструкций, кодирующих RNAi-шпильки против интересующих нас генов из списка (Табл. 1). Для запуска RNAi супрессии такие линии скрещивают с GAL4-драйверными линиями и эффект наблюдают в потомстве.
Для запуска повсеместной экспрессии RNAi-шпилек мы использовали драйвер da-GAL4. Скрещивания и культивацию личинок проводили при повышенной температуре (29°С), затем диссектировали слюнные железы личинок третьего возраста и анализировали цитологические препараты целых желез и иммуноокрашенные препараты политенных хромосом. В таблице 2 приведены эффекты RNAi cупрессии исследованных генов-кандидатов (кроме Su(var)2-5 (HP1), так как его взаимодействие с SUUR уже было показано биохимически (Pindyurin et al., 2008). Супрессия некоторых генов (HmgZ, Orc1, hd) в такой системе приводила к образованию маленькой слюнной железы. Такой эффект часто свидетельствует о нарушениях процесса репликации (Park and Asano, 2008). Интересно отметить, что к подавлению репликации и образованию маленькой слюнной железы приводит и нарушение экспрессии SuUR, но не супрессия, а оверэкспрессия с драйвером AB1 GAL4 (Volkova et al., 2003).
Чтобы понять, влияет ли супрессия исследуемых генов на хромосомную локализацию SUUR, препараты политенных хромосом слюнных желез были окрашены антителами против SUUR и PCNA (для визуализации репликации). В качестве контроля была использована линия Oregon R в тех же температурных условиях. В Таблице 2 приведены данные этих экспериментов. При супрессии генов Rad51 и Blm нарушений репликации и локализации SUUR на хромосомах обнаружено не было. Для некоторых генов (Ssrp1, HmgZ и Orc1) в таких условиях не удалось получить пригодных для цитологического анализа препаратов политенных хромосом, поэтому мы провели дополнительные скрещивания всех RNAi линий с драйвером AB1-GAL4, специфическим для слюнных желез, при 29°С (Табл. 2).
Таблица 2. Эффекты RNAi супрессии кандидатов в партнеры SUUR, наблюдаемые в слюнных железах (СЖ).
da-GAL4 29°C AB1-GAL4 29°C тонкие хромосомы;
Летальность есть PCNA, почти нет Ssrp1 RNAi SUUR маленькие СЖ HmgZ RNAi Маленькие СЖ;
тонкие хромосомы;
нет hd RNAi PCNA, нет SUUR нарушения CG12018 RNAi нарушения морфологии ядер и хромосом;
морфологии хромосом;
(мал. суб. ДНК есть PCNA, нет SUUR есть PCNA, нет SUUR полимеразы ) тонкие хромосомы;
маленькие СЖ, нарушения морфологии ядер Orc1 RNAi есть PCNA, есть SUUR рыхлые хромосомы;
есть PCNA, есть SUUR нет эффекта Cyclin A RNAi нет эффекта нет эффекта Rad51 RNAi нет эффекта нет эффекта Blm RNAi Суммируя эти данные, можно утверждать, что то или иное нарушение общей морфологии слюнных желез и политенных хромосом наблюдалось в большинстве скрещиваний (Табл. 2), кроме случаев Rad51 и Blm, возможно в связи с низкой эффективностью РНК-интерференции. Однако, возможность взаимодействия SUUR с белками репарации двуцепочечных разрывов ДНК (BLM и RAD51) нельзя исключать. В политенных хромосомах слюнных желез сайты локализации SUUR в недореплицированных районах обогащены двуцепочечными разрывами (Andreyeva et al., 2008). Влияние же на хромосомную локализацию SUUR мы наблюдали в следующих скрещиваниях:
AB1-GAL4RNAi Ssrp1 – SUUR в малом количестве присутствует только в хромоцентре при нормальной репликации в плечах хромосом;
da-GAL4RNAi CG12018 (ss DNA pol ) – нет сигналов SUUR при нормальной репликации в плечах хромосом;
da-GAL4RNAi hd – нет сигналов SUUR, нет сигналов PCNA, что свидетельствует об отсутствии репликации.
RNAi супрессия гена CG12018, кодирующего малую субъединицу ДНК полимеразы, привела к одному из самых удивительных эффектов на структуру хромосом и фенотип SUUR. ДНК полимераза – один из ключевых ферментов синтеза ДНК, состоящий из двух субъединиц: большой каталитической и малой регуляторной (Aoyagi et al., 1994). При такой важной клеточной функции, супрессия ее активности с большой вероятностью могла привести к летальности. Однако, даже при множественных морфологических нарушениях структуры хромосом и ядер, репликация в слюнных железах при супрессии малой субъединицы ДНК полимеразы все же происходит. При этом SUUR на хромосомах не выявляется, что указывает на необходимость полимеразы для функциональной хромосомной локализации SUUR. Известно, что полимераза напрямую взаимодействует с PCNA (Naryzhny, 2008). Таким образом, малая субъединица полимеразы может быть промежуточным звеном в обнаруженном нами в этой работе взаимодействии SUUR и PCNA, что может объяснить отсутствие PCNA в списке белков, выявляемых с SUUR-ТАР в культуре клеток.
В коллекциях линий мух Bloomington Stock Center мы обнаружили две линии, которые содержат встройки ЕР-конструкций (UAS-hsp70 последовательность) в промоторные области генов Ssrp1 и HmgZ. Скрещивание таких линий c GAL4 драйверами может запускать оверэкспрессию этих генов. Для проверки влияния оверэкспрессии SSRP1 и HMGZ в слюнных железах на хромосомную локализацию SUUR мы использовали драйвер Sgs3-GAL4 при 29°С. Оказалось, что оверэкспрессия SSRP1 в таких условиях приводит к полному исчезновению сигналов SUUR при абсолютно нормальной репликации. При скрещивании Sgs3-GAL4/EP-HmgZ локализация SUUR на хромосомах и репликация не были нарушены.
Итак, в этой работе проведены эксперименты по исследованию функциональных взаимодействий SuUR с обнаруженными генами генетическими методами: установлены генетические взаимодействия SuUR с генами Ssrp1, CG и hd. В дальнейших исследованиях мы планируем провести масштабную работу по биохимическому подтверждению взаимодействий SUUR со всеми белками, выявляемыми вместе с SUUR при двойной аффинной очистке его комплексов из клеточной культуры. Это позволит построить конкретную модель механизма работы SUUR в клетках дрозофилы.
Весьма интересным представляется взаимодействие SUUR с факторами ремоделинга хроматина (SSRP1 и HMGZ) с одной стороны, и с машиной репликации (с PCNA, например, через регуляторную субъединицу ДНК полимеразы ) с другой стороны. Это означает, что SUUR может оказаться частью механизма регуляции пострепликационного ремоделинга гетерохроматиновых районов. Например, было показано, что в мутации SuUR в большинстве районов, которые в норме маркированы метилированием Н3К27, эта гетерохроматиновая гистоновая метка исчезает. В контексте тормозящего влияния SUUR на вилку репликации, показанного в работе Sher et al., 2012, можно предположить, что в этих районах SUUR контролирует процесс пострепликационного восстановления H3K27me метки. А поскольку, вероятно, процесс поставки таких модифицированных гистонов в вилку репликации требует времени, SUUR через физическое взаимодействие может замедлять скорость этой вилки, чтобы Н3К27me3 метка успела полностью восстановиться для обеих молекул ДНК. Конечно, эта перспективная гипотеза нуждается в специальной экспериментальной проверке, которая, обязательно будет проведена в будущей работе.
ВЫВОДЫ 1. Создана система для выделения комплексов белка SUUR дрозофилы методом двойной аффинной очистки.
2. Установлено, что химерный белок SUUR-TAP является полностью функциональным.
3. Показано, что белок SUUR входит в состав крупных белковых комплексов с размерами ~232 - 440 кДа.
4. Было установлено, что SUUR и PCNA входят в состав общего белкового комплекса в эмбрионах дрозофилы.
5. Определены белки, выявляемые вместе с SUUR при выделении комплексов SUUR-TAP в культуре клеток дрозофилы. Эти белки участвуют в процессах регуляции клеточного цикла, репликации, репарации двуцепочечных разрывов ДНК и ремоделинга хроматина. Также в составе комплексов SUUR-TAP был обнаружен белок НР1, взаимодействие с которым было установлено ранее.
6. Показаны генетические взаимодействия SuUR с генами Ssrp1, CG12018 (ss Dpol ) и hd.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ Статьи:
Посух О.В., Юрлова А.А., Беляева Е.С., Жимулев И.Ф. Система для очистки 1) комплексов хромосомного белка SUUR Drosophila melanogaster // Докл. Акад. Наук.
2007. Т. 416. N.4. С. 550-554.
2) Anna A. Yurlova, Igor V. Makunin, Tatyana D. Kolesnikova, Olga V. Posukh, Elena S. Belyaeva and Igor F. Zhimulev. Conservation of domain structure in a fast evolving heterochromatic SUUR protein in Drosophilids // Genetics. 2009. V.183 (1). Р.
119-129.
3) Tatyana D. Kolesnikova, Olga V. Posukh, Eugeniya N. Andreyeva, Darya S.
Bebyakina, Anton V. Ivankin, Igor F. Zhimulev. Drosophila SUUR protein associates with PCNA and binds chromatin in a cell cycle-dependent manner // Chromosoma. 2013. V. (1-2). P. 55-66.
Тезисы конференций:
Посух О.В. Конструкции для выделения комплексов белка SUUR Drosophila 1) melanogaster // Сборник трудов МНСК. Новосибирск. 2006. С. 54.
Посух О.В., Горчаков А.А., Алексеенко А.А., Юрлова А.А. Система для 2) выделения комплексов хромосомного белка SUUR Drosophila melanogaster // Сборник трудов I Международной научной конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии». 9 – 12 мая, 2007. Томск. С. 145.
Посух О.В., Горчаков А.А., Алексеенко А.А., Юрлова А.А. Определение 3) компонентов комплекса белка SUUR Drosophila melanogaster// Сборник трудов V Съезда ВОГиС. Москва. 2009. С. 93.
4) D. Koryakov, E. Andreyeva, E. Belyaeva, S. Belyakin, L. Boldyreva, T.
Kolesnikova, I. Makunin, A. Pindyurin, G. Pokholkova, O. Posukh, V. Shloma, A.
Yurlova, I. Zhimulev. The SUUR protein plays key role in DNA late replication and underreplication in polytene chromosomes of Drosophila melanogaster // Abstracts of the VIII European Symposium of The Protein Society. June 14 – 18, 2009. Zurich, Switzerland. P. 133.
Посух О.В., Горчаков А.А., Алексеенко А.А., Юрлова А.А. Компоненты 5) комплекса белка SUUR Drosophila melanogaster // Сборник трудов Международной конференции «Хромосома 2009». 31 августа – 6 сентября, 2009. Новосибирск. С. 150.
Юрлова А.А., Макунин И.В., Колесникова Т.Д., Посух О.В., Беляева Е.С., 6) Жимулев И.Ф. Доменная консервативность быстро эволюционирующего гетерохроматинового белка SUUR дрозофилы // Сборник трудов Международной конференции «Хромосома 2009». 31 августа – 6 сентября, 2009. Новосибирск. С. 55.
Посух О.В., Горчаков А.А., Алексеенко А.А., Юрлова А.А. Определение 7) компонентов комплекса белка SUUR Drosophila melanogaster // Сборник трудов XII Всероссийской молодежной школы-конференции по актуальным проблемам химии и биологии. 7 – 14 сентября, 2009. Владивосток. С. 60.
8) Olga Posukh, Andrey Gortchakov, Igor Zhimulev. SUUR copurifies with proteins involved in replication, DSB repair, cell cycle control, and heterochromatin maintenance // Proceedings of 51st Annual Drosophila Research Conference. April 7 – 11, 2010.
Washington, DC, USA. P. 106.
9) Tatiana D. Kolesnikova, Darya S. Bebyakina, Olga V. Posukh, Evgenia N.
Andreyeva, Dmitri E. Koryakov. Cell cycle-dependent binding of SUUR to Drosophila melanogaster polytene chromosomes // Proceedings of 51st Annual Drosophila Research Conference. April 7 – 11, 2010. Washington, DC, USA. P. 105.
10) Посух О.В. Белки, выявляемые в комплексах белка SUUR Drosophila melanogaster // Сборник научных статей II Международной конференции «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии». 6 - 10 сентября, 2010.
Одесса, Украина. С. 60.
11) Posukh O., Koryakov D., Kolesnikova T., Zhimulev I. Genetic analysis of SUUR protein interactions // Proceedings of 52nd Annual Drosophila Research Conference. March 30 – April 3, 2011. San Diego, CA, USA. P. 209.
12) Olga Posukh, Tatyana Kolesnikova, Igor Zhimulev. SUUR protein regulates heterochromatin replication timing by physical interaction with replication machinery in Drosophila melanogaster // Abstracts of 72nd Symposium “Metabolism and Disease”. June 1 – 6, 2011. Cold Spring Harbor, NY, USA. P. 98.
13) Kolesnikova T.D., Posukh O.V., Andreyeva E.N., Belyaeva E.S., Zhimulev I.F.
SUUR protein physically interacts with replication machinery in Drosophila melanogaster // Abstracts of the X International Conference on Drosophila Heterochromatin. June 12 – 18, 2011. Gubbio, Italy. P. 3.
14) Olga Posukh, Dmitriy Koryakov, Igor Zhimulev, Stepan Belyakin. The role of ORC1 in regulation of DSB repair in drosophila salivary gland cells // Abstracts of the EMBO Meeting 2011. September 10 – 13, 2011. Vienna, Austria. P. 94.