Факторы, определяющие процесс адсорбции высокомолекулярных белков плазмы крови на мембранах эритроцитов при мышечных нагрузках
На правах рукописи
ЧИРИКОВА Ольга Александровна ФАКТОРЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ ПРОЦЕСС АДСОРБЦИИ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ НА МЕМБРАНАХ ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ МЫШЕЧНЫХ НАГРУЗКАХ 03.00.13 – физиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Ярославль - 2006 2
Работа выполнена на кафедре медико-биологических основ спорта Ярославского государственного педагогического университета им. К.Д. Ушинского Научные руководители:
заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор В.Н. Левин
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук А.А. Мельников Кандидат биологических наук, доцент И.И. Дигурова
Ведущая организация:
Ивановская государственная медицинская академия Минздрава РФ
Защита состоится "16" июня 2006г. в 14.00 часов на заседании Диссертационного Совета Д. 212.307. при Ярославском государственном педагогическом университете им. К.Д. Ушинского по адресу 150000, г. Ярославль, ул. Республиканская, д.108.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ярославского государственного педагогического университета им. К.Д. Ушинского (150000, г. Ярославль, ул. Республиканская, д.108).
Автореферат разослан "" 2006г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент И.А. Тихомирова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
В области микроциркуляторного русла реализуются все основные функции сердечно-сосудистой системы. Состояние микроциркуляции во многом определяет функциональные возможности сердечно-сосудистой системы, а, следовательно, и физическую работоспособность организма (Козлов В.И. с соавт., 1982).
В настоящее время имеет место пристальный интерес ученых к процессам адаптации системы кровообращения и реологии крови при занятиях спортом (Викулов А.Д., 1997, 2001;
Викулов А.Д. и соавт., 1997;
Муравьев А.В. и соавт., 1990, 1995). Изучение приспособления организма к мышечным нагрузкам является удобной моделью для понимания адаптационных проблем в целом, помогает выявить потенциальные резервы различных органов и систем, устойчивость объективных критериев адаптивности организма и наметить пути управления данным процессом.
Систематические физические нагрузки разной интенсивности и длительности будут вызывать изменения, как состояния сосудистой системы, так и самой крови (Смирнов И.Ю. и соавт., 2004).
В области микроциркуляторного русла реология крови определяется двумя основными процессами – агрегацией и деформацией клеточных элементов (Катюхин Л.Н., 1995). На данный момент существуют две модели агрегации эритроцитов (мостиковая модель и модель истощения) (Вышлова М.А., 2002;
Baskurt O.K., 2001;
Fabri T.L., 1987;
Meiselman H.J., 1999;
Meiselman H.J. et al., 2001;
Rampling M.W., 2001;
и др.). В обоих случаях процесс образования агрегатов связывают с наличием или отсутствием на поверхности мембран эритроцитов адсорбированных белков. Согласно мостиковой модели высокомолекулярные белки плазмы, такие как фибриноген и макроглобулины, обеспечивают образование молекулярных мостиков между клетками, способствуя преодолению сил электростатического отталкивания между клетками (Левтов В.А. и др., 1982;
Stoltz J. et al., 1987). В то же время, низкомолекулярные белки, не перекрывающие критическое расстояние взаимного отталкивания, адсорбируясь на мембранах, препятствуют агрегации красных клеток крови. Адсорбция белков на поверхности клеток в свою очередь приводит к изменению вязко-эластических свойств мембран и, следовательно, оказывает непосредственное влияние на деформируемость клеток (Nash G.B. et al., 1981).
Помимо плазменных белков большое влияние на процессы агрегации оказывает состояние клеточного фактора (Катюхин Л.Н., 1995;
Nash G.B. et al., 1981, 1991). При циркуляции в сосудистой системе клетки подвергаются различным воздействиям и поэтому с возрастом у эритроцитов происходят изменения в биохимическом составе, структуре мембран и гликокаликса, электроповерхностных свойств и др.
Повышенное агрегатообразование ведет к возникновению нарушений периферического кровотока и тем самым оказывает отрицательное влияние на тканевой метаболизм. С другой стороны, у спортсменов в состоянии относительного покоя выявлено снижение агрегационной способности, что является приспособительной реакцией к мышечным нагрузкам (Hardeman M.R. et al., 1995).
Анализ литературных данных показал, что, несмотря на важность данных процессов, до сих пор нет точного представления о том, какие структурные субстраты на поверхности клетки ответственны за адсорбцию биополимеров, а, следовательно, и за агрегацию эритроцитов.
Вопрос о взаимодействии плазменных макромолекул с мембранами эритроцитов интересует ученых с давних пор. Образованная внешними мембранами поверхность клеток представляет собой универсальный многоточечный гетерофункциональный сорбент. Полярные «головки» липидов, образующие внешнюю поверхность двойного липидного слоя, содержат анионогенные и катионогенные группировки, а также группировки, способные образовывать водородные связи. Если рассматривать адсорбцию на поверхности липидного бислоя, то она не будет ограничена количеством мест адсорбции, что, в свою очередь, противоречит конкурентному характеру адсорбции биополимеров (Покидышева Е.Н. и др., 2000).
Участки макромолекулярных соединений могут сорбироваться на выступающих мембранных белках, которые составляют заметную долю от общей поверхности мембраны эритроцита. В структуру клеточных мембран входят и углеводы, несущие ионизируемые группировки и которые потенциально также могут быть центрами адсорбции.
Таким образом, исследование структур, ответственных за адсорбцию полимеров, позволит уточнить представления о процессах агрегации эритроцитов.
Цель исследования - изучить факторы, влияющие на процессы адсорбции белков плазмы на поверхности красных клеток крови у спортсменов при мышечных нагрузках.
Задачи исследования:
1. Исследовать адсорбцию высокомолекулярных белков плазмы на эритроцитах у спортсменов в различных функциональных состояниях.
2. Выявить влияние концентраций отдельных фракций белков плазмы на процессы адсорбции.
3. Изучить влияние возрастного спектра популяции эритроцитов на процессы адсорбции 4. Исследовать влияние сиаловых кислот, связанных с белковыми структурами, на процессы адсорбции макромолекул на эритроцитарных мембранах.
Научная новизна исследования Впервые с использованием метода импедансной спектроскопии исследовано изменение адсорбционных свойств эритроцитарных мембран у спортсменов при разных функциональных состояниях организма.
Выявлены закономерные изменения степени адсорбции высокомолекулярных белков плазмы на эритроцитах при выполнении мышечных нагрузок различной продолжительности в диапазоне от 60 до 180 минут.
Изучено влияние концентрации отдельных фракций белков плазмы на степень их адсорбции на клеточных мембранах.
В модельных экспериментах со встраиванием грамицидиновых ионных каналов показана важная роль ионных каналов в мембранах эритроцитов в обеспечении их осмотической стойкости.
Выявлено влияние сиаловых кислот связанных с мембранными белками эритроцитов на степень адсорбции белков плазмы.
Показана важная роль состояния структурных компонентов мембраны в детерминации процесса адсорбции высокомолекулярных белков плазмы на эритроцитах.
Теоретическая и практическая значимость работы Полученные в процессе исследования данные позволяют расширить имеющееся представление о факторах, обеспечивающих адсорбцию биополимеров на клеточных мембранах. В свою очередь, соотношение между адсорбирующимися высоко и низкомолекулярными фракциями белков влияет на агрегационную способность красных клеток крови.
Выявленное снижение показателя адсорбции при выполнении экстремальных нагрузок позволяет определять переносимость тренировочных нагрузок при воспитании выносливости.
Результаты работы могут быть использованы для оценки функционального состояния спортсменов и соответствующей корректировки тренировочных планов, а в медицинской практике для контроля за процессами коррекции агрегационной активности эритроцитов.
Материалы диссертации могут быть использованы для преподавания частных разделов физиологии, таких как система крови и система кровообращения, при написании соответствующих учебников и руководств. Полученные материалы и примененные методы исследования могут быть использованы для проведения дальнейших исследований в гемореологии.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Качественные характеристики процесса адсорбции макромолекул на эритроцитарных мембранах определяются концентрационными соотношениями белков плазмы.
2. У спортсменов при выполнении больших нагрузок дополнительным фактором, детерминирующим адсорбцию, является изменение возрастного спектра эритроцитов и обусловленное им наличие сиаловых кислот, связанных с мембранными белками.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: международной научно-практической конференции «Проблемы физкультурного образования детей и учащейся молодежи» (Шуя, 2002);
Международной конференции по гемореологии и микроциркуляции (Ярославль, 2003);
международной конференции по гемореологии в микро- и макроциркуляции (Ярославль 2005);
на XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004);
на II Всероссийской научной конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, 2005), на I Съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005), на 12th International Congress of Biorheology and Clinical Hemorheology (China, 2005).
По теме диссертации опубликовано 12 научных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, материал и методы исследования, результаты и их обсуждение, выводы.
Библиографический указатель включает 334 источника: отечественных и 152 зарубежных. Работа иллюстрирована 24 таблицами и 15 рисунками.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование выполнено на группе спортсменов мужчин (в возрасте 18-30лет), занимающихся циклическими видами спорта с преимущественной направленностью тренировочного процесса на выносливость и аэробным режимом энергообеспечения: легкоатлеты стайеры и лыжники-гонщики с достаточно высоким уровнем подготовки (первый спортивный разряд – мастера спорта международного класса).
Обследование выполнено в следующих состояниях:
1 – относительного покоя. Регистрация выбранных параметров проводилась в состоянии относительного покоя, т.е. не менее чем через 42 часа после последней тренировочной нагрузки (n=33). Данная группа была использована в качестве контроля.
2 – Влияние интенсивных, но не предельных по длительности нагрузок (70 - 80 мин) изучали на финише легкоатлетического полумарафона 21 км, (n=8).
3 – Влияние высокоинтенсивных и длительных нагрузок (150 - мин.) изучали на финише лыжного марафона 50км, (n=10).
Отсроченное влияние мышечной изучали нагрузки через 18- часов:
4 –после тренировок (n=27).
5 –после марафона, (n=10).
Во всех случаях кровь для анализа брали из локтевой вены в объеме 25 мл. 20 мл стабилизировали гепарином (0,05мл гепарина с концентрацией 25000ед). Для определения содержания фибриногена 5 мл крови стабилизировали 0,5 мл цитратом натрия (3,8%). Забор осуществлялся в асептических условиях квалифицированным медперсоналом.
Концентрированные суспензии нативных клеток получали центрифугированием крови в течение 15 минут при 1000g, затем тщательно отделяли от плазмы. Сравнительно малая величина ускорения использовалась с целью минимизаций гравитационных воздействия на клеточные мембраны.
Для трехкратных отмывок клеток применялся К+-Na+-фосфатный буферный раствор с осмолярностью 300 мосм/л (рН - 7,4). При первых двух отмывках время центрифугирования составило 5 минут, при третьей - 15 минут.
При ресуспендировании клетки инкубировли в аутологичной плазме в течение 15 минут, затем центрифугировали 15 минут при 1000g и готовили концентрированную суспензию.
Во всех случаях для измерений использовались клетки из нижней части образца, где достигалась наиболее плотная упаковка.
Определение гематокритного показателя нативной крови и приготовленных суспензий в различных средах производили в 100 мм капилляре центрифугированием в течение 30 минут при 1000g. 30 минутная продолжительность центрифугирования позволила получать величину гематокритного показателя такую же, как и при стандартных условиях (7 минут при 12000g).
Определение общей концентрации белков плазмы крови осуществляли рефрактометрически (Комаров Ф.И. и др., 1976).
Определение белковых фракций проводили методом электрофореза на бумаге.
Для оценки содержания фибриногена в плазме использовали сухо воздушный метод Рутберга (Рутберг Г.А., 1961). После центрифугирования крови, стабилизированной цитратом натрия, отбирали 2 мл плазмы (больший объём использовался с целью повышения точности при взвешивании) и смешивали с 0,2 мл 5 % раствора хлорида кальция. Образовавшийся сгусток высушивали сначала фильтровальной прессованной бумагой «Filtrak», а затем на воздухе в течение 4 часов, и взвешивали на аналитических весах ВЛР-200 с дискретностью 0,05 мг. Для пересчёта концентрации фибриногена в г/л вес сгустка в граммах умножали на пересчётный коэффициент.
Число эритроцитов в объеме крови оценивали с использованием подсчёта клеток в камере Горяева в млн/мкл.
Определение концентрации гемоглобина в крови проводили с использованием цианметгемоглобинового метода на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм.
Вискозиметрия концентрированных суспензий красных клеток крови проводилась на оригинальном капиллярном полуавтоматическом вискозиметре, разработанном на кафедре медико-биологических основ спорта ЯГПУ на основе принципа измерения, предложенного M. Litt et al.
(Litt M. et al., 1988). Измерения проводились при напряжении сдвига 0, Па.
Измерения импеданса проводили на фиксированных частотах 1, 100, 300 кГц. Вычисляли коэффициент дисперсии как отношение импеданса на 100кГц к импедансу на 300кГц. Показатель адсорбции определяли по разнице коэффициентов дисперсии до и после отмывки клеток.
Осмолярность плазмы рассчитывали по данным электропроводности плазмы, фосфатного буферного раствора с осмолярностью 300 мосм/л и общей концентрации белков плазмы (Смирнов И.Ю. с соавт, 2003).
Для определения сиаловых кислот 2мл отмытых в фосфатном буферном растворе клеток инкубировали 15 мин. в растворе трипсина, ( мг трипсина в 3 мл фосфатного буферного раствора) и центрифугировали 15 мин. 3 мл надосадочной жидкости и смешивали с 2 мл 7,5% раствора хлорной кислоты;
тщательно перемешивали и помещали в водяную баню на 5 мин. После охлаждения центрифугировали 10 мин. для осаждения белков. К 4 мл полученного раствора добавляли 1 мл реактива Эрлиха и снова помещали в водяную баню на 15 мин. Полученный раствор имел слабую окраску, интенсивность которой определялась концентрацией кислот. Измеряли оптическую плотность полученного раствора при длине волны 540 нм.
Обработку суспензий эритроцитов протеолитическим ферментом проводили путем ресуспендирования отмытых клеток в растворе трипсина в течение 15 минут. Затем производили повторную отмывку в стандартном фосфатном буфере и готовили концентрированную суспензию клеток центрифугированием в течение15мин.
Измерения осмотической резистентности эритроцитов проводили на двухканальном дифференциальном ФЭКе. Значения оптической плотности снимались при ступенчатом разведении по отношению к контрольному образцу.
Для каждого образца 100% разрушение клеток в опытной кювете соответствовало различным величинам оптической плотности. Поэтому производили пересчет значений оптической плотности после каждого разведения в %. Рассчитывали % эритроцитов гемолизированных при каждом дискретном значении осмолярности среды. При анализе результатов обследования спортсменов эритроциты разделяли на группы – низкостойкие (разрушающиеся при снижении осмолярности до 120 мосм/л), высокостойкие (выдерживающие снижение осмолярности ниже 91 мосм/л) и среднестойкие (гемолизирующиеся при осмолярности 120-97 мосм/л). Представленные границы 120 и 97 мосм/л выбраны нами на основании анализа распределения эритроцитов по осмотической стойкости в группе спортсменов в состоянии относительного покоя. В указанный диапазон входило 67% от общего числа эритроцитов (М±).
Эритроциты, обработанные раствором грамицидина С (3 мг грамицидина в 20мл буферного раствора) получали путем инкубирования суспензиии отмытых эритроцитов в течение 15 мин. После осаждения клеток на центрифуге и удаления супернатанта их использовали для приготовления концентрированной суспензии. Действие растворов грамицидина С разной концентрации на суспензии клеток осуществляли инкубированием последних в фосфатных буферных растворах с исходной концентрацией грамицидина и с концентрацией вдвое меньше исходной в течение 15 мин с последующим приготовлением концентрированной суспензии.
Статистическая обработка результатов выполнена с применением пакета программ «Statistiсa». В большинстве случаев использовали непараметрические методы анализа данных, т.к. для многих гемореологических параметров было выявлено распределение отличное от нормального (Гланц С.А., 1999;
Реброва О.Ю., 2002).
Для множественного сравнения использовали ранговый дисперсионный анализ по Фридмену. При подтверждении статистической достоверности при множественном сравнении, проводили попарное сравнение. Попарное сравнение выполняли по критерию Вилкоксона или критерию U - Манна – Уитни.
Корреляционный анализ экспериментально полученных результатов и расчетных характеристик производили с использованием коэффициента корреляции Пирсона (r) и ранговой корреляции Спирмена (rs).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Наблюдения, проведенные над группой спортсменов, занимающихся видами спорта с преимущественным проявлением выносливости, позволили выявить изменения в процессах адсорбции высокомолекулярных белков плазмы на поверхности эритроцитов.
Мышечные нагрузки с достаточно высокой интенсивностью и продолжительностью первоначально приводили к повышению показателя адсорбции, регистрирующего в наших измерениях адсорбцию высокомолекулярных биополимеров. Данный показатель возрастал как после тяжелой тренировки на 23,6% (р=0,049), так и на финише полумарафона на 28,2% (р=0,038). Повышенный показатель адсорбции на 48,2% (р=0,002) мы регистрировали и на следующий день после 50 км лыжной гонки. Однако непосредственно на финише этой гонки величина показателя адсорбции оказалась на 38,6% ниже по сравнению с состоянием относительного покоя (р0,001).
Согласно данным литературы адсорбция биополимеров в гетерогенном растворе осуществляется в соответствии с их концентрационными соотношениями и носит конкурентный характер (Покидышева Е.Н. с соавт., 2000). Исследование общей концентрации и белкового спектра плазмы позволило выявить их изменения при различных состояниях организма спортсменов.
Общая концентрация белков плазмы возрастала под воздействием нагрузки и возвращалась к величинам относительного покоя за 20- часа. Так на финише полумарафона концентрация белков была выше на 8,3%, чем через 20 часов после тренировки (р = 0,003). На финише лыжного марафона выше на 6,7%, чем через 20 часов восстановительного периода (р = 0,023). Поскольку состояние относительного покоя в нашем исследовании соответствует периоду восстановления после последней нагрузки равному примерно 44 часам, можно говорить о том, что за этот период происходит восстановление общей концентрации белков, которая не отличалась от величин полученных в контрольной группе практически здоровых не занимающихся спортом мужчин (Смирнов И.Ю., Левин В.Н., 2004).
Анализ фракционного состава белков плазмы показал, что концентрационные изменения затрагивали, как правило, высокомолекулярные фракции 2, и глобулинов.
Зарегистрированы изменения концентрации фибриногена входящего во фракцию глобулинов. По нашим исследованиям концентрация фибриногена слабо коррелировала с концентрацией глобулинов (rs=0,346 при p=0,0006). Концентрация альбуминов изменялась только на финише соревновательных дистанций. На финише 50 км гонки его концентрация заметно понижалась (р = 0,044), что соответствует описанному в литературе факту понижения концентрации альбуминов при длительных нагрузках (Макарова Г.А. с соавт., 1990). Повышение концентрации альбуминов на финише полумарафона (р = 0,043) стало следствием гемоконцентрации, о чем свидетельствуют результаты измерения осмолярности плазмы и концентрации красных клеток крови.
О гемоконцентрации так же говорит и тот факт, что относительная доля альбуминов в белковом спектре плазмы снизилась. В течение 20 часов восстановительного периода концентрация альбуминов возвращалась к величинам нормы.
При изменении продолжительности нагрузки изменялись и взаимосвязи показателя адсорбции с белковыми фракциями.
Корреляционный анализ позволил нам выявить статистически достоверную взаимосвязь показателя адсорбции с концентрацией фибриногена после 50 км лыжной гонки (rs=0,526 при р=0,036). На финише полумарафона влияние фибриногена на показатель адсорбции отсутствовало, но проявилось влияние 2 и глобулинов (rs = 0,738 p= 0,037 и rs =0,714, р= 0,047 соответственно). Проверка возможности такой взаимосвязи по результатам обследования спортсменов во всех состояниях показала, что изменение показателя адсорбции не было статистически значимо связано с изменениями в концентрации каких либо фракций белков плазмы. Следовательно, на процесс адсорбции высокомолекулярных белков плазмы при выполнении мышечных нагрузок оказывала влияние не только их концентрация, но и другие факторы.
С целью выяснения факторов, приводящих к изменению показателя адсорбции у спортсменов, нами проведено исследование возрастного спектра циркулирующих эритроцитов. Для анализа провели исследование осмотической резистентности эритроцитов, которая, как описано в литературе, связана с продолжительностью их нахождения в циркуляторном русле.
Используемая нами методика по определению осмотической стойкости позволяет анализировать популяционный состав эритроцитов.
Имеющиеся в литературе данные позволяют соотносить осмотическую резистентность эритроцитов с их возрастом (Барбашова З.И. с соавт., 1967, 1968;
Леонова В.Г., 1987). Наиболее осмотически стойкими оказываются молодые клетки, тогда как для клеток, достаточно длительное время находящихся в системе циркуляции, свойственна существенно меньшая способность противостоять гипоосмотическим воздействиям. Таким образом, результаты оценки осмотической резистентности клеток были использованы нами для изучения возрастного состава популяции эритроцитов.
Наблюдение над группой спортсменов (n=4) в течение года (с учетом повторных измерений 26 результатов) позволило выявить различия (по тесту Вилкоксона) в качественном составе эритроцитов.
Содержание клеток со средней и низкой осмотической стойкостью после тренировочных нагрузок было выше, чем после 50 км лыжной гонки.
Количество высокостойких эритроцитов наоборот было повышено после 50 км гонки.
По-видимому, это может объясняться тем, что при экстремальных физических нагрузках наблюдаются с одной стороны интенсивное разрушение эритроцитов, с другой стороны мобилизация эритропоэза продуктами деструкции клеток. Часть красных клеток крови, преимущественно те, которые имеют больший срок нахождения в системе циркуляции, разрушаются в ретикулоэндотелиальной системе, а их место занимают молодые клетки вышедшие из костного мозга.
Подобные реакции подтверждаются результатами регистрации содержания в крови ретикулоцитов различной степени зрелости (Шашкин А.В. с соавт., 1986). Таким образом, возрастной состав популяции клеток может изменяться как в сторону повышения доли молодых, а, следовательно, и более стойких эритроцитов при интенсивной и длительной нагрузке, так и в сторону повышения доли клеток с низкой осмотической резистентностью при сравнительно малом времени воздействия нагрузки с высокой интенсивностью. При длительных и интенсивных нагрузках происходит разрушение таких эритроцитов и выход в кровеносное русло «молодых» клеток. При прохождении 50 км дистанции, тем не менее, процесс разрушения преобладает над выходом и в результате общее содержание эритроцитов в крови снижается.
Появление в крови значительного количества молодых клеток на фоне понижения общей концентрации эритроцитов в крови проявляется в заметном сдвиге эритрограмм в область более стойких клеток.
Интенсивные, но не предельные по продолжительности физические нагрузки могут приводить к снижению осмотической стойкости всего пула красных клеток крови. Причиной этого могут быть изменения рН крови при нагрузке, оксидативное повреждение мембран и существенно повышенная скорость циркуляции крови. Однако массированного разрушения поврежденных клеток ещё не происходит, и они сохраняются в крови, приводя к понижению общей осмотической стойкости эритроцитов. Дополнительным подтверждением этому могут служить результаты измерения концентрации сиаловых кислот удаленных с поверхности эритроцитов протеолизом. После длительных соревновательных нагрузок мы отмечали самые малые их величины, тогда как согласно литературным данным, «молодые» клетки несут значительно большее количество сиаловых кислот на своей поверхности и благодаря этому обладают меньшей агрегационной способностью.
Корреляционный анализ выявил неоднозначные взаимосвязи между наличием сиаловых кислот на эритроцитах и спектром осмотической резистентности. Концентрация сиаловых кислот имела положительную выраженную корреляцию с содержанием низко- и среднестойких клеток (r = 0,709 р = 0,027 и r = 0,669 р = 0,036, соответственно), и отрицательную для высокостойких клеток r = - 0,714 при р = 0,020. Эти результаты свидетельствуют о том, что при нагрузке суммарное количество сиаловых кислот на поверхности красных клеток крови снижается, а выход молодых эритроцитов с высоким их содержанием не может маскировать этот процесс.
Причиной разрушения эритроцитов при осмотическом гемолизе является массированное поступление воды в клетки обусловленное разностью концентраций для ионов между внутренней и наружной средой. В литературе, как правило, рассматриваются механизмы изменений гемолитической стойкости связанные с поступлением воды внутрь клетки. Это может быть как повреждение липидного бислоя, так и белкового составляющего мембраны. Повышение осмотической резистентности эритрона в целом обусловлено изменениями в возрастном составе (Барбашова З.И. с соавт., 1967, 1968;
Мельников А.А. с соавт., 2002).
При помещении клеток в гипоосмолярную среду разница концентраций ионов будет вызывать не только поступление воды внутрь клеток, но и выход ионов из клетки путем пассивного транспорта.
Именно выход ионов из клетки и понижение их концентрации будет важным фактором, ограничивающим поступление воды в клетку. С этих позиций может быть объяснима более высокая стойкость молодых форм клеток по отношению к более зрелым.
Известный факт фрагментации эритроцитов при нахождении в системе циркуляции приводит к изменению соотношения между площадью поверхности клетки и её объёмом. Снижение площади поверхности при фрагментации осуществляется более интенсивно по сравнению с объёмом. В свою очередь, уменьшение такого соотношения должно приводить к ограничению скорости суммарного транспорта через мембрану и, следовательно, к снижению скорости выравнивания концентраций ионов между внутренним содержимым клетки и наружной средой. Очевидно, что повышение скорости массированного выхода ионов из клетки будет приводить к меньшему поступлению воды и соответственно к более высокой осмотической стойкости. Проверка этого положения выполнена нами путем изменения количества пассивных канальных структур мембран эритроцитов с применением грамицидина С. Данный низкомолекулярный полипептид может встраиваться в мембрану клетки и повышать проницаемость последней для неорганических катионов за счет формирования неселективных ионных каналов мембраны (Геннис Р., 1997). Подтверждением данного положения можно считать результаты измерений осмотической стойкости клеток обработанных раствором грамицидина С. Значительное понижение тоничности раствора путём постепенного ступенчатого разведения не вызывало деструкцию эритроцитов.
Скорость изменения осмолярности раствора значительно влияет на стойкость клеток. При меньшей скорости снижения осмолярности клетки разрушались при более низких значениях концентрации ионов во внешней среде. Необходимо отметить, что в условиях резкого изменения осмолярности среды количество ионных каналов, ответственных за транспорт ионов через мембрану, также будет влиять на осмотическую стойкость клеток. Подобные изменения наблюдались на образцах эритроцитов, обработанных растворами грамицидина с разной концентрацией. Повышение концентрации грамицидина приводило к увеличению количества ионных каналов в мембранах клеток, а, следовательно, и к повышению их стойкости при понижении тоничности окружающего раствора.
При резком изменении осмолярности раствора даже ионтранспортные системы клеток, обработанных грамицидином, не могут обеспечивать такой массированный выход ионов из клетки, который необходим для предотвращения критического поступления воды внутрь клетки вызывающего её гемолиз.
На основании этих результатов можно утверждать, что одним из важнейших факторов, определяющих осмотическую стойкость клеток, является наличие в их мембранах достаточного количества пассивных ионтранспортных систем.
Изменения в качественном составе эритрона при различных функциональных состояниях организма сопровождается изменением и структурного состава мембран эритроцитов. Эти изменения затрагивают содержание белковых ионтраспортных молекул. В свою очередь именно белковые молекулы, входящие в структуру мембраны эритроцита, могут быть местом адсорбции макромолекул. Эта их способность обусловлена наличием аминокислот имеющих радикальные заряженные группировки.
Наличие таких группировок и изменения их числа будут определять количественную характеристику адсорбции.
С целью изучения структурных элементов, отвечающих за процессы адсорбции, были проведены измерения на суспензиях клеток предварительно обработанных протеолитическим ферментом.
После обработки суспензий нативных клеток протеолитическим ферментом – трипсином – величина импедансов и коэффициент дисперсии оказались существенно выше по сравнению с суспензией эритроцитов трижды отмытых в стандартном фосфатном буфере (р = 0,007).
Причины такого увеличения импеданса, на наш взгляд, могут быть связаны с тем, что трипсин, разрушая пептидные связи, образованные карбоксильной группой лизина и аргинина, приводит к увеличению количества точечных зарядов на поверхности красных клеток крови, а, следовательно, и к повышению количества молекул воды, связанной с заряженными группами электростатическими силами.
Проверка влияния трипсина на молекулы белка в применяемых нами условиях выполнена путем добавления его в раствор альбумина. При измерениях импеданса растворов альбумина с одинаковой концентрацией, но в разной растворяющей среде (с трипсином и без него), мы не зарегистрировали достоверных различий. Однако по результатам фотоэлектроколориметрии выяснилось, что количество белка в растворе с трипсином было ниже на 3,1 %, чем в растворе белка той же концентрации, но приготовленном в фосфатном буфере без трипсина.
Биуретовая реакция является качественной реакцией на наличие пептидных связей в белковых макромолекулах. При этом, чем больше пептидных связей, тем интенсивнее окраска раствора. При действии же трипсина количество пептидных связей уменьшается, что мы и регистрировали как снижение оптической плотности на ФЭК. При этом общая концентрация белка в растворе остается неизменной, поэтому мы не зафиксировали динамики импеданса на растворах белка с одинаковой концентрацией, но разным растворителем. Выявить влияние увеличившегося количества концевых аминокислотных карбокси- и аминогрупп примененный метод не мог вследствие малой концентрации молекул. Однако при увеличении концентрации белковых молекул, имеющих значительно больший объём, чем гидратная оболочка вокруг заряженной группировки, регистрируется выраженное повышение импеданса.
Следовательно, обработка суспензии эритроцитов трипсином должна приводить к увеличению количества концевых карбокси- и аминогрупп вследствие протеолиза мембранных белков. Влияние таких группировок на процесс адсорбции должно проявляться увеличением числа адсорбированных молекул. Изменения формы клеток, способного свидетельствовать о повреждении мембраны после обработки трипсином при биомикроскопии клеток мы не выявили.
Результаты измерений на суспензиях клеток, ресуспендированных в собственной плазме, показали значительное повышение коэффициента адсорбции у клеток, обработанных трипсином по сравнению с просто отмытыми клетками и ресуспендированными в собственной плазме (р = 0,013). Таким образом, после обработки клеток трипсином, местом адсорбции на наружной поверхности эритроцитарных мембран могут служить заряженные группировки, формируемые как за счет диссоциации ионизируемых групп мембранных белков, так и карбоксильные и аминные группировки разорванных трипсином пептидных связей белковых макромолекул. Появление дополнительных мест способных обеспечивать адсорбцию может быть причиной повышенной адсорбции после обработки данным ферментом. О наличии на их поверхности большего количества заряженных группировок можно судить по результатам определения коэффициента дисперсии для клеток обработанных трипсином.
При действии трипсина на мембраны эритроцитов происходит удаление с поверхности клеток части сиаловых кислот. Используемый нами фермент может удалять только те молекулы кислоты, которые связаны с белками. Следовательно, на показатель адсорбции влияет не только сам факт удаления отрицательно заряженных сиаловых кислот, но и появление дополнительных положительно заряженных группировок на поверхности клеток за счет протеолиза пептидных связей, к которым впоследствии будет осуществляться адсорбция. Корреляционный анализ выявил отрицательную взаимосвязь rs= -0,664 (р = 0,018) между количеством удаляемых протеолизом сиаловых кислот и величиной адсорбции нативных эритроцитов. Следовательно, чем больше сиаловых кислот связанных с белками имеется на поверхности красных клеток крови, тем меньше возможность адсорбции высокомолекулярных белков.
Полученные результаты находятся в полном соответствии с известным влиянием сиаловых кислот на поверхностный заряд клеток (Котык А. С соавт., 1980;
Левин Г.Я. с соавт., 1981;
Clark L.J. et al., 1981;
Donath E. et al., 1980;
Greenhalt T. et al., 1973;
и др), а так же их суспензионную стабильность и способность к агрегации. Однако если только наличие сиаловых кислот было бы определяющим фактором адсорбции, то их положительная взаимосвязь должна была бы проявиться и при ресуспендировании клеток обработанных трипсином, и таким образом лишённых около половины имеющихся на поверхности молекул сиаловой кислоты. По результатам наших измерений такой взаимосвязи с показателем адсорбции клеток, обработанных трипсином, не было.
Следовательно, важнейшим фактором при адсорбции в подобных условиях является наличие мест связывания. Обработка трипсином приводит к протеолизу наружных фрагментов мембранных белков и образованию дополнительно 1 или 2 заряженных группировок на поверхности мембраны на каждый разрыв пептидной связи. По видимому, именно поэтому величина показателя адсорбции для эритроцитов, подвергнутых обработке трипсином и ресуспендированных в аутоплазме, оказывалась значительно выше. Для клеток, не подвергавшихся воздействию протеолитического фермента, при ресуспендировании выявлены противоположные изменения. Показатель адсорбции при ресуспендировании в аутоплазме был достоверно ниже исходной величины нативных клеток.
Влияние адсорбированных макромолекул на взаимодействие между клетками демонстрируют результаты измерений вязкости суспензий.
Удаление с поверхности эритроцитов адсорбированных белков приводит к выраженному снижению вязкости суспензий (р 0,001). При этом среднегрупповые величины вязкости суспензий отмытых клеток в разных состояниях оказались очень близки за исключением результатов на финише 50 км гонки, когда вязкость суспензии оказалась выше на 18,7% по сравнению с состоянием относительного покоя.
Отмеченное выше изменение текучести суспензий отмытых клеток полученных на финише 50 км гонки, по-видимому, стало следствием изменения деформационных характеристик эритроцитов, обусловленных их мембранными свойствами. Выявленные различия по концентрации гемоглобина в клетках, определяющей вязкость внутреннего содержимого, не были связаны с изменениями текучести концентрированных суспензий отмытых клеток. Возможно, одним из факторов, приведших к такому результату, может быть и массированный выход незрелых форм эритроцитов в кровеносное русло. Наши результаты по осмотической резистентности, показывающие значительное увеличение доли высокостойких клеток так же могут подтверждать это положение. Роль оксидативного повреждения клеток в ухудшении деформируемости эритроцитов маловероятна, поскольку уже через 20 часов мы наблюдали восстановление текучести данных клеток.
Ресуспендирование клеток в аутоплазме приводило к повышению вязкости суспензий до величин несколько меньших, чем у суспензии нативных эритроцитов. Факты не полного восстановления показателя адсорбции и как следствие текучести суспензий ресуспендированных клеток обусловлены сравнительно большей концентрацией в плазме низкомолекулярных белков, которые и занимают изначально несколько больше мест связывания. После обработки трипсином и повышения показателя адсорбции на 10,8% текучесть суспензий снизилась более, чем в 3 раза (р 0,001), притом, что непосредственно сама обработка трипсином приводила лишь к незначительному повышению вязкости суспензий (р = 0,447). Из этого следует, что за столь выраженное повышение вязкости суспензий эритроцитов обработанных трипсином могут быть ответственны только адсорбированные высокомолекулярные белки плазмы.
ВЫВОДЫ 1. Выполнение больших, но не предельных по длительности нагрузок (не более 1,5 часов) приводит к повышению степени адсорбции белков на эритроцитарных мембранах вследствие повышения концентраций 2 и глобулинов плазмы крови.
2. При высокоинтенсивных и околопредельных по длительности нагрузках (более 2 часов) степень адсорбции на мембранах эритроцитов снижается, несмотря на высокие концентрации высокомолекулярных фракций белков плазмы.
3. Одним из факторов, препятствующих адсорбции макромолекул к мембранным белкам, является наличие сиаловых кислот, связанных с указанными белками.
4. Важную роль в обеспечении осмотической стойкости эритроцитов играет количество канальных структур, отвечающих за пассивный транспорт ионов из эритроцитов. Увеличение содержания подобных канальных структур в мембранах повышает осмотическую стойкость клеток.
5. При не предельных по времени нагрузках ведущая роль принадлежит концентрационным соотношениям белков, а при длительных субпредельных – наличие сиаловых кислот, связанных со структурными мембранными белками.
6. При различном характере нагрузок решающую роль в обеспечении адсорбции играют разные факторы. В случаях с неизменённым возрастным спектром циркулирующих эритроцитов основным фактором является концентрационные соотношения белков плазмы.
При изменениях возрастного спектра эритроцитов ведущим фактором становится наличие на их мембранах сиаловых кислот, связанных с мембранными белками.
СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Чирикова О. А. Роль адсорбированных протеинов в процессе агрегации эритроцитов. Тезисы научно-практической конференции студентов КГУ им. Н.А. Некрасова 1-26 апреля 2002 года // Отв. ред А.Р. Наумов. – Кострома: КГУ им. Н.А. Некрасова. - 2002. – с 18-19.
2. Смирнов И.Ю., Кузнецов Э.Н., Чирикова О.А. Изменение адсорбционных характеристик эритроцитов в процессе соревновательной деятельности у спортсменов // Материалы Международной научно практической конференции «Проблемы физкультурного образования детей и учащейся молодежи». - Т.2. - Шуя: Изд-во «Весть» ШГПУ. - 2002.
– с. 73.
3. Смирнов И.Ю., Чирикова О.А., Богданов М.В. Изменения мембранных свойств эритроцитов у спортсменов при выполнении больших физических нагрузок // Материалы международной конференции по гемореологии и микроциркуляции. – Ярославль. – 2003. – с. 113.
4. Смирнов И.Ю., Чирикова О.А. Измерение осмолярности растворов электролитов по их электропроводности // Периодический научно методический журнал «Вестник КГУ им. Н.А. Некрасова». – Кострома. – 2003. - с. 39-42.
5. Смирнов И.Ю., Чирикова О.А., Дюкова А.С. Влияние реологических параметров крови на кровоснабжение скелетных мышц // Сборник научных работ «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии».
– Томск. - Т. 3. - № 1. – 2004. - с. 153-155.
6. Смирнов И.Ю, Левин В.Н., Чирикова О.А. Влияние реологических параметров крови на кровоснабжение скелетных мышц // Материалы XIX съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. – Екатеринбург. – 2004. - с. 201-203.
7. Смирнов И.Ю., Левин В.Н., Чирикова О.А. Факторы, определяющие адсорбцию белков плазмы крови на эритроцитах // Тромбоз, гемостаз и реология. – Москва. - № 4(20). – 2004. – с. 64-68.
8. Чирикова О.А. Факторы, определяющие адсорбцию белков плазмы крови на эритроцитах // Физкультура. Спорт. Здоровье: Материалы конференции «Чтения Ушинского». – Ярославль: Изд-во ЯГПУ им. К.Д.
Ушинского. – 2005. – с. 127.
9. Чирикова О.А., Смирнов И.Ю., Левин В.Н. Адсорбция белков плазмы крови на эритроцитах у спортсменов // I Съезд физиологов СНГ. – Сочи. – 2005. – с. 205.
10. Смирнов И.Ю., Чирикова О.А., Ткачук А.П. Роль поверхностных структур эритроцитарных мембран в процессах адсорбции биополимеров // Материалы II Всероссийской научной конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии». – Москва. – 2005. – с. 304.
11. Смирнов И.Ю., Чирикова О.А. Роль структурных элементов мембран эритроцитов в процессах адсорбции белков плазмы // Материалы международной конференции по гемореологии в микро- и макроциркуляции. – Ярославль. – 2005. – с. 202.
12. Smirnov I., Chirikova O. Plasma protein patterns and their adsorption at the erythrocyte membrane during muscular activity // Biorheology. – 2005. - V.
42. - № 1, 2. – p. 91-92.
Подписано в печать "_". Формат 60 Х 90 1/16 Печать офсетная.
Усл. печ. л. 1,25.
Заказ № _. Тираж 100 экз.
Ярославский государственный педагогический университет им. К.Д. Ушинского 150000. г. Ярославль. Республиканская ул., Типография ЯГПУ им. К.Д. Ушинского 150000, г. Ярославль, Которосльная наб.,