Исследования структуры архейного фактора инициации трансляции 2
На правах рукописи
СТОЛБОУШКИНА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ АРХЕЙНОГО ФАКТОРА ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ 2 03.00.03 – Молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2009
Работа выполнена в Институте белка РАН
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Гарбер Мария Борисовна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Фролова Людмила Юрьевна доктор химических наук Шатский Иван Николаевич
Ведущая организация:
Филиал Института биооpганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
Защита состоится « 13 » ноября 2009 года в 12 часов на заседании совета Д 501.001.76. по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу:
119992, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова
Автореферат разослан « 28 » сентября 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук И.А. Крашенинников
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Инициация биосинтеза белка на рибосоме – важнейший этап в реализации генетической информации и клеточной регуляции.
Это сложное многоэтапное событие, в котором участвуют различные белковые факторы, молекулы РНК и низкомолекулярные соединения. Наименее изучен механизм инициации трансляции у архей. Чтобы разобраться в этом сложном процессе необходимо знание функциональной роли и структурной организации белковых факторов инициации трансляции. Ключевую роль в процессе инициации биосинтеза белка у архей играет гетеротримерный фактор инициации трансляции (aIF2), который осуществляет доставку инициаторной метионил-тРНК в Р участок малой рибосомной субчастицы и гомологичен эукариотическому фактору eIF2. Кроме этого, архейная -субъединица aIF2 имеет неканоническую функцию:
защищает мРНК, на 5'-конце которых находится трифосфат, от 53 направленной деградации. Исследования структуры e/aIF2 очень актуальны ввиду важности его функции. Такие исследования в последние годы ведутся интенсивно в лабораториях ряда стран.
Цель работы: исследование структуры aIF2 из гипертермофильной археи Sulfolobus solfataricus (SsoIF2).
Основные задачи работы:
– получение штаммов-суперпродуцентов Escherichia coli для всех субъединиц белка SsoIF2 и инициаторных тРНК E. coli и S. solfataricus и разработка методов выделения данных макромолекул из клеток штаммов-суперпродуцентов, – получение гетеротримера SsoIF2, – разработка метода сборки тройственного комплекса Met-tRNAf•SsoIF2D3•GDPNP in vitro из индивидуальных компонентов, – кристаллизация -субъединицы SsoIF2 в нескольких функциональных состояниях (в свободной форме и в комплексе с ГДФ и негидролизуемыми аналогами ГТФ), интактного гетеротримерного SsoIF2 и тройственного комплекса Met-tRNAf•SsoIF2D3•GDPNP, – экспериментальная проверка предположения о том, что дополнительный сайт связывания ГТФ на -субъединице SsoIF2 является местом для взаимодействия 5 концевого гуанозин-трифосфата мРНК.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые были получены кристаллы полноразмерного архейного фактора инициации трансляции 2, на основе которых была определена его пространственная структура. Анализ этой структуры выявил высокую подвижность в - и -субъединицах данного фактора.
Определение структуры изолированной -субъединицы SsoIF2 в различных состояниях привело к выдвижению оригинальной модели взаимодействия aIF2 с инициаторной метионил-тРНК и к обнаружению дополнительного, ранее никем не обнаруживавшегося, сайта связывания ГТФ на поверхности белка. Этот дополнительный ГТФ-связывающий сайт, согласно проведенным в данной работе экспериментам, может являться местом для взаимодействия 5-концевого гуанозин трифосфата мРНК. Также впервые в данной работе получены кристаллы тройственного комплекса Met-tRNAf•SsoIF2D3•GDPNP.
Результаты по структуре гетеротримерного фактора инициации трансляции и по структурам комплексов -субъединицы aIF2 с нуклеотидами имеют фундаментальный характер и могут быть включены в курсы лекций по молекулярной биологии, читаемых на биологических факультетах различных ВУЗов. В методическом аспекте данная работа будет полезна для специалистов, работающих в области препаративной биохимии и кристаллизации макромолекул, как в нашей стране, так и за рубежом. Штаммы-суперпродуценты E. coli для всех субъединиц белка SsoIF2 и инициаторной тРНК E. coli, полученные в данной работе, используются в ИБ РАН. Препарат фактора SsoIF2 предоставлен для функциональных исследований в НИИ физико-химической биологии им. А.Н.
Белозерского.
Структура диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работу иллюстрируют 31 рисунков и 5 таблиц. Общий объем диссертации 119 страниц. Библиография включает 237 названий.
Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи. Результаты данной работы докладывались на Российских и международных конференциях.
Обзор литературы посвящен структурным и функциональным особенностям второго фактора инициации трансляции эукариотического типа.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Выделение гетеротримерного фактора SsoIF2 и его субъединиц С 2002 года в печати стали появляться структуры отдельных субъединиц фактора инициации трансляции 2 как эукариотического так и архейного происхождения. Четыре года назад мы подключились к этим исследованиям и приступили к выделению и кристаллизации aIF2 из гипертермофильной археи S.
solfataricus. Ранее SsoIF2 и его изолированные субъединицы никем не выделялись в препаративных количествах, поэтому нам пришлось разрабатывать собственные методики. Доктором У. Блэзи (Венский биоцентр, Австрия) нам были предоставлены плазмиды, содержащие гены субъединиц SsoIF2. С этих плазмид можно было получить субъединицы SsoIF2 с олигогистидиновыми «хвостами» на С концах. Мы переклонировали гены субъединиц SsoIF2 в экспрессионные векторы без нуклеотидной последовательности для олигогистидинового «хвоста».
Экспрессию клонированных генов проводили в клетках E. coli штамм BL21(DE3). В отличие от - и -субъединиц, синтез -субъединицы наблюдался на низком уровне.
Этот белок смогли наработать только в клетках штамма С41(DE3), предназначенного для продукции токсичных белков, причем продукция белка была настолько низкой, что идентифицировать его удалось только с помощью масс спектрометрии. Поэтому для получения -субъединицы SsoIF2 в препаративных количествах нам пришлось выращивать культуру клеток штамма-суперпродуцента в большом объеме.
Общая схема выделения субъединиц SsoIF2 из клеток штаммов суперпродуцентов E. coli изображена на рис. 1А. Очистка термостабильных субъединиц SsoIF2 была существенно облегчена тем, что прогрев белковых экстрактов при 65°С приводил к денатурации и выпадению в осадок большей части белков клетки-хозяина. После этой процедуры субъединицы SsoIF2 очищали всего лишь в две стадии колоночной хроматографии (рис. 1Б). Как правило, выделение белка из клеток суперпродуцента осложняется его неспецифическим взаимодействием с нуклеиновыми кислотами в клеточном экстракте. В растворах с высокой ионной силой возможно разрушение таких ассоциатов. Поэтому для очистки всех субъединиц SsoIF2 использовали гидрофобную хроматографию, которая позволяет связать белок с носителем при высоких концентрациях солей.
Включение в схему выделения катионообменной хроматографии обусловлено щелочной природой субъединиц. Расчетные изоэлектрические точки (pI) для субъединиц SsoIF2 лежат в пределах 8.3 – 9.2. Обычно белки оказываются достаточно заряженными и хорошо сорбируются на обменник при значениях рН, отличающихся от pI примерно на единицу. Для работы мы использовали буфер с рН 7.5. Однако -субъединица при таком значении рН не задерживалась на катионообменнике и свободно проходила через колонку, что скорее всего обусловлено недостаточно выраженным положительным зарядом белка. Между тем при сдвиге значения рН буфера в кислую сторону нам не удавалось полностью сорбировать -субъединицу на катионообменник. Поэтому для очистки субъединицы мы провели повторно гидрофобную хроматографию и добились этим желаемой чистоты препарата. Описанные в данной работе методики выделения изолированных субъединиц SsoIF2 позволяют получать из 1 л культуры до 10 мг белка (в случае -субъединицы только 2 мг) с чистотой не менее 95% (рис. 1В).
А разрушение биомассы Б Название Название Название суперпродуцента субъединицы носителя для носителя для SsoIF2, хроматографии хроматографии выделенной №1 № из биомассы осаждение дебриса суперпродуцента дебрис или D3 S-сефароза Butyl прогрев клеточного экстракта (65°) Toyopearl (в случае выделения -субъединицы – 650S предварительное удаление рибосом) Butyl- Butyl Toyopearl Toyopearl осаждение денатурированных белков 650S 650S осадок денатурированных КМ-сефароза Butyl белков Toyopearl 650S хроматография № В хроматография № Рис. 1. А – Схема выделения изолированных субъединиц SsoIF2 из клеток штаммов суперпродуцентов E. coli. Б – Таблица стадий хроматографической очистки изолированных субъединиц SsoIF2. В – Электрофоретический анализ (в 15%-ном ДДС-Na-ПААГ) чистоты препаратов изолированных субъединиц SsoIF2, полученных на конечной стадии хроматографической очистки.
Полноразмерный SsoIF2 можно получить, если смешать очищенные заранее субъединицы, а затем провести гель-фильтрацию реконструированного гетеротримера. Недостатки такого подхода – многостадийность и невысокий выход SsoIF2, недостаточный для широкого поиска условий кристаллизации. В 2006 году была опубликована более эффективная методика получения и очистки рекомбинантного aIF2 S. solfataricus [Yatime et al., 2006]. Авторы смешивали клетки штаммов-суперпродуцентов субъединиц в равных количествах, разрушали, дебрис удаляли, клеточный лизат прогревали и фракционировали на смолах S-сефароза и супердекс-75. Преимуществом такой методики является то обстоятельство, что сборка и очистка aIF2 происходит с самого начала и это обуславливает достаточно высокий выход очищенного гетеротримера. В своей работе мы предлагаем модификацию вышеописанного метода (рис. 2). Основанием для изменений послужил тот факт, что нам не удавалось осуществить реконструкцию SsoIF2 в клеточном лизате до стадии прогрева. Модифицированная нами методика начинается с того, что клетки суперпродуцентов разрушали и клеточный лизат прогревали индивидуально для каждой субъединицы, а уже затем супернатанты объединяли и фракционировали. Мы также учитывали разный уровень синтеза субъединиц в клетках и по этой причине увеличивали количество биомассы суперпродуцента -субъединицы в три раза. Таким способом мы получали до 40 мг биологически активного SsoIF2 из 5 л общей культуры клеток. Важно, что полученный препарат SsoIF2 с течением времени не подвергался протеолитическому расщеплению в отличие от препарата aIF2, который был выделен в работе Yatime et al., 2007.
А разрушение биомассы разрушение биомассы разрушение биомассы суперпродуцента суперпродуцента суперпродуцента для -субъединицы для -субъединицы для -субъединицы осаждение дебриса осаждение дебриса осаждение дебриса дебрис дебрис дебрис прогрев клеточного экстракта (65°) прогрев клеточного экстракта (65°) прогрев клеточного экстракта (65°) осаждение денатурированных белков осаждение денатурированных белков осаждение денатурированных белков осадок осадок осадок денатурированных денатурированных денатурированных белков белков белков SsoIF Б объединение супернатантов хроматография на смоле S-сефароза хроматография на смоле гепарин-сефароза хроматография на смоле супердекс- Рис. 2. А – Схема выделения и очистки полного гетеротримера SsoIF2 из клеток штаммов продуцентов E. coli. Б – Электрофоретический анализ (в 15%-ном ДДС-Na-ПААГ) чистоты препарата SsoIF2, полученного на конечной стадии хроматографической очистки.
2. Кристаллизация SsoIF2 и исследования его структуры На тот момент, когда мы приступили к кристаллизации SsoIF2, были известны структуры только изолированных субъединиц фактора инициации трансляции [Cho and Hoffman, 2002;
Nonato et al., 2002;
Schmitt et al., 2002;
Dhaliwal and Hoffman, 2003;
Gutierrez et al., 2004;
Ito et al., 2004;
Roll-Mecak et al., 2004;
Yatime et al., 2005]. Позднее появились структуры межсубъединичных димеров и [Sokabe et al., 2006;
Yatime et al., 2006], затем структура неполноразмерного гетеротримерного aIF2, в котором первый и второй домены -субъединицы были удалены [Yatime et al., 2007]. В течение четырех лет мы вели интенсивный поиск условий кристаллизации полноразмерного фактора инициации трансляции 2, и нам, в конце концов, удалось получить пригодные к структурным исследованиям кристаллы, на базе которых структура интактного aIF2 была определена [Stolboushkina et al., 2008].
Поиск условий кристаллизации SsoIF2 мы проводили, используя препарат, полученный уже после первой стадии хроматографической очистки, и получили две формы микрокристаллов. Однако этот результат оказался невоспроизводимым.
Анализ причин невоспроизводимости кристаллов показал, что белок в растворе с течением времени агрегирует, а примесь даже небольшого количества агрегатов ингибирует кристаллизацию. Можно было убрать агрегаты гель-фильтрацией и получить гомогенный препарат SsoIF2, который начинал кристаллизоваться, но после непродолжительного времени в растворе снова появлялись белковые агрегаты. Мы предположили, что агрегация SsoIF2 связана с окислением SH-групп белка и образованием межмолекулярных S-S–связей, и стали добавлять в буферные растворы -меркаптоэтанол или ДТТ на всех стадиях выделения SsoIF2, а по окончании очистки препарат белка либо сразу переводили в условия кристаллизации, либо замораживали в жидком азоте и хранили при – 70°С.
После отработки условий выделения и хранения кристаллизуемых препаратов SsoIF2 мы приступили к оптимизации условий его кристаллизации.
Перспективными условиями для получения кристаллов пригодных для рентгеноструктурного анализа оказались те, в которых осаждающий реагент состоял из формиата натрия и смеси полиэтиленгликолей. Появление кристаллов сильно зависело от pH раствора. Белок кристаллизовался только при pH 8.5, т. е. вблизи своей изоэлектрической точки. Оптимальная концентрация белка в капле была 10 – 12 мг/мл, а температура 22°С. Решающим фактором для появления крупных кристаллов SsoIF2 оказалось добавление в кристаллизационную смесь ММЭПЭГ 5000 до конечной концентрации 1%. Следует отметить, что от выделения к выделению препараты SsoIF2 отличались по способности образовывать высокоупорядоченные одиночные кристаллы. Наилучшие по качеству кристаллы были получены из объединенных фракций со склонов пика SsoIF2 при хроматографии на колонке с гепарин-сефарозой. Такие кристаллы (рис. 3) были получены только один раз, они отражали рентгеновские лучи с разрешением до 2. и были использованы для сбора дифракционных данных.
Набор дифракционных данных, использовавшийся для определения кристаллической структуры, был собран на синхротроне в Гамбурге (линия X станции DESY, Германия) при температуре 100°К. Непосредственно перед заморозкой в струе жидкого азота кристаллы SsoIF2 переносили в криораствор.
Криораствор содержал следующие компоненты: 15%-ный этиленгликоль, 80 мМ Tris-HCl, pH 8.5, 600 мМ формиат натрия, 7.5 %-ный ПЭГ 8000, 7.5 %-ный ПЭГ 1000, 1 %-ный ММЭПЭГ 5000. Кристаллы SsoIF2 принадлежат к пространственной группе Р21 с параметрами элементарной ячейки a = 79.2, b = 162.92, c = 161., = = 90°, = 90.04°. Ассиметричная часть элементарной ячейки содержит четыре молекулы SsoIF2.
Рис. 3. Кристаллы белка SsoIF2, полученные в присутствии 0.05 M Tris-HCl, pH 8.5, 0.36 M формиата натрия, 4.5%-ного ПЭГ 8000, 4.5%-ного ПЭГ 1000, 1%-ного ММЭПЭГ 5000, появлялись через 2 – 3 дня и росли в течение недели до размеров 60020040 мкм.
Работа по решению и анализу структуры SsoIF2 проводилась совместно с группой С.В. Никонова (ИБ РАН, Пущино). Фазовая проблема решалась методом молекулярного замещения. Процесс решения включал два этапа. Вначале в качестве стартовой поисковой модели использовали определенную нами ранее структуру SsoIF2, в результате чего удалось получить модель -димера, которая затем использовалась для поиска положения -субъединицы в структуре полного гетеротримера. Поиск положения -субъединицы SsoIF2 значительно осложнялся из-за твиннинга кристаллов. С помощью программы PHENIX была получена электронная плотность для целой -субъединицы, но только для двух из четырех молекул SsoIF2. Для остальных двух молекул SsoIF2 в ассиметричной части элементарной ячейки карту электронной плотности смогли построить только для N концевой -спирали -субъединицы. Таким образом, окончательная модель SsoIF включает по четыре молекулы - и -субъединиц, две молекулы -субъединицы и две N-концевых -спирали SsoIF2, что в целом соответствует аминокислотным остаткам. Координаты атомов данной модели занесены в банк белковых структур (PDB код 3cw2). Следует отметить, что у одной из четырех молекул -субъединицы отсутствует электронная плотность для аминокислотных остатков с 36 по 45, которые соответствуют району петли switch1. Кроме того, ни в одном из цинк-связывающих мотивов - и -субъединиц не обнаружено атомов цинка. В результате С-концевые домены -субъединиц в нашей структуре SsoIF слабо структурированы, а Cys109 в одной из молекул -субъединицы образует дисульфидный мостик с Cys127, тогда как Cys109 второй молекулы -субъединицы завязывает водородную связь с Glu25. В целом доменная организация -, -, субъединиц SsoIF2 схожа с ранее описанными в литературе структурами субъединиц фактора инициации трансляции 2.
Общими очертаниями молекула SsoIF2 напоминает английскую букву L, длинное плечо которой образовано -субъединицей, короткое – -субъединицей, а угол – -субъединицей (рис. 4). Подвижные и функционально значимые участки субъединицы, петли-переключатели switch1 и switch2, расположены у внутреннего угла L-образной молекулы SsoIF2, между - и -субъединицами. Центральная субъединица взаимодействует с двумя другими субъединицами, тогда как - и субъединицы SsoIF2 между собой не контактируют. G-домен -субъединицы связывает N-концевую -спираль и С-концевой цинк-связывающий домен субъединицы, а второй домен -субъединицы взаимодействует с третьим доменом -субъединицы. Полученный нами результат находится в хорошем соответствии с данными по структуре -димера и неполного гетеротримера [Yatime et al., 2004;
Pedulla et al., 2005, Yatime et al., 2006;
2007]. Имеется, однако, различие со структурой -димера P. furiosus, где -субъединица взаимодействует не с С концевым, а с центральным доменом -субъединицы [Sokabe et al.,2006].
Рис. 4. Схематическое изображение пространственной структуры SsoIF2 (PDB код 3cw2). Римскими цифрами обозначены домены.
Петли switch1 и switch2 обозначены как sw1 и sw2, соответственно.
Между - и -субъединицами SsoIF2 образуются две области контактов, расположенные друг от друга на расстоянии 12. Одна из них содержит три водородные связи, в результате которых формируется антипараллельный -лист, сложенный из тяжей 6, 7, 8 -субъединицы и 7-тяжа -субъединицы. Второй участок связывания включает две водородные связи, образованные петлей 7–8 и N-концевой частью 6-спирали -субъединицы и петлей 13–6 -субъединицы. В свою очередь -субъединица формирует тоже два межсубъединичных интерфейса с -субъединицей SsoIF2 площадью 1135 2 (между 1-спиралью -субъединицы и участком -субъединицы, содержащим петли 5–4, 4–6, 4-спираль и 6-тяж) и 376 2 (между участком С-концевого домена -субъединицы, остатки 134 – 139 и N концевой частью switch1 и петли 2–3 -субъединицы). Области указанных контактов между - и -субъединицами стабилизированы водородными связями и гидрофобными взаимодействиями. Следует отметить, что в изолированном состоянии -субъединица имеет неструктурированную N-концевую часть, которая приобретает -спиральную структуру, по-видимому, при связывании с субъединицей. Эта N-концевая -спираль содержит высококонсервативные аминокислотные остатки, которые важны для узнавания и связывания субъединицы. Четыре молекулы гетеротримера SsoIF2, расположенные в ассиметричной части кристалла, хотя и эквивалентны по структуре, но не идентичны. Наиболее нестабильную структуру имеет -субъединица. Во всех четырех молекулах -субъединицы конформации функционально-важных switch участков несколько отличаются друг от друга.
Чтобы проанализировать конформационную гибкость и взаимное расположение субъединиц в гетеротримере, было проведено наложение всех известных структур этих субъединиц на структуру гетеротримера. Субъединицы e/aIF2 накладывались по третьему домену, который жестко связан с субъединицей. Оказалось, что домены 1 и 2 aIF2 очень подвижны и могут свободно вращаться в плоскости, расположенной под углом около 120 относительно длинной оси домена 3. Следует отметить, что в первом домене -субъединицы aIF расположен Ser48, который в пространстве занимает положение аналогичное положению эукариотической -субъединицы. Известно, что Ser фосфорилирование Ser51 приводит к ингибированию синтеза белка в клетках эукариот. В археях роль второго фактора инициации трансляции в регуляции трансляции не определена, но показано, что Ser48 в aIF2 фосфорилируется эукариотической дцРНК-зависимой киназой PKR, активируемой при вирусной инфекции, а также е архейным гомологом, обозначенным как Ph0512p [Tahara et al., 2004]. Благодаря тому, что первый и второй домены -субъединицы свободно вращаются на угол 180° относительно ее третьего домена, смещение участка фосфорилирования может достигать 90. Пока неизвестно, имеет ли такая подвижность сайта фосфорилирования -субъединицы функциональное значение.
Районы aIF2, контактирующие с aIF2 в структуре гетеродимера aIF2 и двух структурах гетеротримера (неполноразмерного и интактного aIF2), накладывались друг на друга, чтобы найти соответствующие позиции aIF2.
Оказалось, что только N-концевая -спираль aIF2 (остатки 7 – 16) сохраняет свои позиции в трех структурах. Конформации центральной части и цинк-связывающего домена aIF2 отличаются во всех рассмотренных структурах.
Таким образом, по нашим данным фактор инициации трансляции 2 можно рассматривать как молекулу, состоящую из конформационно-стабильной центральной части и двух подвижных «крыльев». Центральная часть включает в себя -субъединицу, третий домен -субъединицы и N-концевую -спираль субъединицы, а «крылья» – первый и второй домены -субъединицы, с одной стороны, и центральный и С-концевой домены -субъединицы, с другой стороны.
По-видимому, такая высокая внутримолекулярная подвижность фактора инициации трансляции 2 необходима для его функционирования. Другими словами, такая гибкость молекулы позволяет белку менять свое сродство к лигандам и обеспечивает переход белка из одного состояния в другое.
3. Кристаллизация и исследования структуры и свойств -субъединицы SsoIF Кристаллизация и исследования структуры -субъединицы SsoIF Помимо полноразмерного гетеротримера SsoIF2, нами были получены также кристаллы изолированной -субъединицы этого фактора. Мы кристаллизовали субъединицу как в свободной (рис. 5А), так и в нуклеотид-связанной (рис. 5Б) формах. Кристаллы -субъединицы SsoIF2 в комплексе с нуклеотидами были получены сокристаллизацией белка с десятикратным избытком коммерческого препарата нерасщепляемого аналога ГТФ – GDPNP. Мы ожидали увидеть в нуклеотид-связывающем кармане белка именно этот нуклеотид, однако, к своему удивлению обнаружили там ГДФ. Проверка качества использовавшегося нами коммерческого препарата GDPNP показала, что он содержал до 30% примеси ГДФ.
Кристаллы свободной и нуклеотид-связанной -субъединицы SsoIF2 были получены в одних и тех же условиях, используя малонат натрия, pH 4.5, и хлорид кадмия в качестве добавки. Добавление в кристаллизационный раствор хлорида кадмия позволяло увеличить размеры и улучшить качество кристаллов.
Рис. 5. А – Кристаллы свободной от нуклеотида SsoIF2. Б – SsoIF2, сокристаллизованная со смесью GDPNP/GDP. Кристаллы -субъединицы в обоих функциональных состояниях появлялись через 2 дня и росли до размеров 450100100 мкм.
Сбор дифракционных данных с кристаллов производили на синхротроне в Гамбурге (линия X12 станции DESY, Германия). Кристаллы свободной и сокристаллизованной со смесью GDPNP/GDP SsoIF2 принадлежат к разным пространственным группам Р3121 (a = b = 94.84, c = 166.43, = = 90°, = 120°) и Р31 (a = b = 95.06, c = 165.67, = = 90°, = 120°), соответственно.
Ассиметричная часть элементарной ячейки кристалла SsoIF2 содержит одну молекулу белка, тогда как в кристалле нуклеотид-связанной SsoIF2 – две молекулы белка в асимметричной части элементарной ячейки, связанные между собой осью симметрии второго порядка. Структуры свободной и нуклеотид-связанной SsoIF были определены методом молекулярного замещения с разрешением 2.9 и 2.65, соответственно. В качестве модели использовали структуру -субъединицы в составе гетеродимера SsoIF2•GDPNP-Mg2+ (PDB код 2aho), определенную ранее французской группой [Yatime et al., 2006]. Несмотря на то, что кристаллизация SsoIF2 со смесью нуклеотидов GDPNP/GDP проводилась в присутствии хлорида магния, тем не менее, ион магния вблизи места связывания фосфатного остатка нуклеотида в определенной нами структуре не обнаружен. Атом цинка в цинк связывающих участках белка также не был найден. Ассиметричная часть элементарной ячейки содержит две молекулы белка, на каждую из которых приходится по одной молекуле ГДФ и по три молекулы пирофосфата. В одной из молекул белка был обнаружен также и аналог ГТФ – GDPNP (рис. 6), поэтому мы можем обозначать данную структуру как SsoIF2•GDPNP/GDP. Координаты атомов обоих моделей SsoIF2 и SsoIF2•GDPNP/GDP занесены в банк белковых структур (PDB код 2plf и 2pmd, соответственно).
e/aIF2 является рибосомозависимой ГТФазой и по своей структуре относится к семейству белков eEF1А (EF-Tu). Общая доменная организация SsoIF2 и SsoIF2•GDPNP/GDP схожа с таковой в опубликованных ранее структурах субъединицы, а также с доменной организацией фактора элонгации EF-Tu в его ГТФ-связанной форме. Все домены G, II и III пространственно сближены, что соответствует «закрытой» ГТФ-связанной активной форме EF-Tu. Структуры SsoIF2 и SsoIF2•GDPNP/GDP хорошо совпадают между собой, за исключением локальных конформационных изменений вокруг нуклеотид-связывающего кармана и switch участков.
Рис. 6. Иллюстрация трехмерной структуры Римскими цифрами SsoIF2•GDPNP/GDP.
обозначены домены.
Несмотря на то, что к тому времени, как нами была определена структура субъединицы SsoIF2, уже было известно несколько структур этой субъединицы из различных организмов, анализ нашей структуры SsoIF2 привел к интересным и неожиданным результатам. Во-первых, исходя из литературных биохимических данных об одинаковом сродстве архейной -субъединицы фактора инициации трансляции 2 к ГДФ и ГТФ [Pedulla et al., 2005], можно было ожидать, что в нуклеотид-связывающем кармане белка свяжется аналог ГТФ, концентрация которого в использовавшемся для сокристаллизации препарате была вдвое выше, чем концентрация ГДФ. Однако в нуклеотид-связывающем кармане в обеих молекулах SsoIF2 в ассиметричной части ячейки кристалла был обнаружен ГДФ.
Это прямое свидетельство в пользу большего сродства -субъединицы aIF2 к ГДФ, чем к ГТФ или, по крайней мере, к нерасщепляемому аналогу ГТФ – GDPNP.
Известно, что при переходе из ГТФ- в ГДФ-связанное состояние в структуре EF-Tu происходит существенный сдвиг доменов 2 и 3 относительно домена 1, и одновременно с этим происходят скоординированные конформационные изменения в петлях-переключателях switch1 и switch2. При этом участки switch1 и switch переходят из конформации «ON» в «OFF», а «тело» самого белка EF-Tu из активной «закрытой» конформации в «открытую» неактивную. Основываясь на сходстве структур -субъединицы с фактором элонгации EF-Tu, можно было ожидать, что происходят значительные конформационные изменения при переходе e/aIF2 из ГТФ- в ГДФ-связанную форму. Оказалось, однако, что -субъединица aIF2 во всех трех состояниях: свободном, ГТФ-связанном и ГДФ-связанном, принимает конформацию аналогичную «закрытой» ГТФ-связанной конформации EF-Tu, когда все три домена сближены друг с другом. Что касается зависимости конформации switch районов -субъединицы aIF2 от природы связанного нуклеотида, то такой четкой картины как в EF-Tu здесь не наблюдается, хотя некоторые изменения в конформации этих районов и просматриваются.
Гипотетическая модель взаимодействия инициаторной метионил-тРНК с фактором инициации трансляции В структуре SsoIF2•GDPNP/GDP, помимо ГДФ, были найдены также три молекулы пирофосфата. Один из этих пирофосфатов находится в щели между доменами II и III (рис. 6). Этот участок, при внимательном рассмотрении, оказался очень удобным стерически для расположения в нем акцепторного черешка тРНК.
Докинг к этому участку Met-тРНКi, взятой из структуры 70S рибосомы Thermus thermophilus [Selmer et al., 2006], привел к оригинальной модели (рис. 7Б) комплекса -димера aIF2 с инициаторной метионил-тРНК [Nikonov et al., 2007].
Рис. 7. Гипотетические модели комплексов тРНК•aIF2•ГТФ. А – EF-Tu подобная модель [Yatime et al., 2006]. Б – Модель, предложенная О.С. Никоновым, на основе наших структурных данных [Nikonov et al., 2007].
Эта модель принципиально отличается от ранее опубликованной модели данного комплекса [Yatime et al., 2006], которая, в сущности, повторяла известную структуру комплекса Phe-tRNAPhe•EF-Tu•GDPNP (PDB код 1ttt). Основываясь на структурной гомологии -субъединицы аIF2 с фактором элонгации EF-Tu, авторы вышеупомянутой модели провели наложение структуры тройственного комплекса Phe-tRNAPhe•EF-Tu•GDPNP на структуру -субъединицы в кристаллографической модели SsoIF2•GDPNP (рис. 7А). Данная модель не отвечает на два важных вопроса. Во-первых, каким образом отсутствие прямого контакта между субъединицей и тРНК может объяснить тот факт, что только в присутствии субъединицы, а именно ее третьего домена, инициаторная Met-тРНК образует стабильный комплекс с -субъединицей. Во-вторых, открытым остается вопрос, почему фактор инициации трансляции 2 специфически связывает только инициаторную Met-тРНК и не может взаимодействовать с элонгаторными тРНК.
Авторы предположили, что -субъединица опосредованно влияет на процесс связывания Met-тРНКi с -субъединицей aIF2, помогая каким-то образом субъединице, связанной с ГТФ, приобретать такие конформации в районах switch1 и switch2, при которых -субъединица становится способна образовывать стабильный комплекс с Met-тРНКi. Однако при сравнении конформаций switch1 и switch2 в структурах -субъединицы в свободном и нуклеотид-связанном состояниях в изолированном виде и в составе димеров с - и -субъединицами из S. solfataricus никаких специфических конформационных изменений в этих участках обнаружено не было.
В оригинальной модели, предложенной в нашей работе, ориентация акцепторного черешка тРНК перпендикулярна по отношению к таковой в модели, предложенной французской группой. В такой ориентации тРНК должна образовывать обширную зону контакта с -субъединицей, что объясняет стабилизацию тройственного комплекса. Более того, предложенная модель демонстрирует каким образом может осуществляться специфическое связывание тРНК: уникальный выступ на поверхности инициаторной тРНК, образованный двумя выпяченными нуклеотидами, стерически подходит к участку с вогнутой поверхностью на -субъединице. Конечно, хотя предложенная модель и удовлетворяет известным экспериментальным фактам, она является гипотетической и может быть подтверждена или опровергнута только при экспериментальном определении структуры тройственного комплекса. Кристаллы такого комплекса, пригодные к структурным исследованиям, были нами недавно получены (см. пункт 4).
Дополнительный сайт связывания ГТФ на -субъединице aIF Сравнение карт электронной плотности для свободной от нуклеотида и сокристаллизованной со смесью GDP/GDPNP -субъединицы привели к неожиданному обнаружению молекулы GDPNP на поверхности одной из двух молекул -субъединицы, содержащихся в асимметричной части элементарной ячейки кристалла. Оказалось, что наряду с ГДФ, расположенном в каноническом нуклеотид-связывающем кармане белка, одна из молекул -субъединицы содержит GDPNP в районе домена II (рис. 6). Это место, назовем его неканоническим нуклеотид-связывающим карманом, расположено между доменами I(G) и II и образовано тяжами 7, 8, 11, 14, петлей 11–12 и остатками 40 – 45 петли switch1. Молекула GDPNP завязывает водородные связи с Asp222 и Arg280 домена II и Glu40 петли switch1. Во второй молекуле -субъединицы указанный неканонический ГТФ-связывающий сайт претерпел конформационные изменения, которые не позволили связаться нуклеотиду. Аминокислотный остаток Met закрывает этот сайт, формируя водородную связь с Lys225 и гидрофобное «пятно» вместе с Phe221, Val223, Val237.
Связывание GDPNP в дополнительном месте на -субъединице можно было бы расценить как артефакт, обусловленный кристаллизацией и особенностями данного нерасщепляемого аналога, содержащего перед ()-фосфатом NH группу, которая образует водородную связь с кислородом Asp222 в главной цепи белка.
Поэтому для подтверждения существования на -субъединице второго сайта связывания ГТФ были получены кристаллы и определена структура SsoIF2 в комплексе с другим нерасщепляемым аналогом ГТФ – GDPCP, который не содержит NH группу перед ()-фосфатом, и следовательно, не способен образовать дополнительную водородную связь (структура определена с разрешением 2.5, PDB код 3i1f).
Как и в структуре, полученной сокристализацией SsoIF2 со смесью GDPNP/GDP, в структуре комплекса SsoIF2•GDPCP неканонический нуклеотид связывающий сайт сформирован -листом домена II ( 7, 8, 12, 13) и мобильным участком switch1 G домена (остатки 41 – 44). Сравнение аминокислотных последовательностей белков семейства eEF1А показало, что участок структуры, формирующий неканонический сайт связывания нуклеотида на поверхности субъединицы, образован консервативными и высоко консервативными аминокислотными остатками, часть из которых образует сеть водородных связей с нерасщепляемым аналогом ГТФ. Это также говорит в пользу существования второго сайта связывания ГТФ в -субъединице aIF2.
Влияние гуаниновых нуклеотидов на связывание SsoIF2 с мРНК.
Гипотетический сайт связывания 5'-конца мРНК на поверхности -субъединицы Имеет ли второй сайт связывания ГТФ на -субъединице aIF2 функциональное значение? Ранее нашими австрийскими коллегами была установлена дополнительная функция -субъединицы SsoIF2 похожая на ту, которую выполняет кэп-связывающий фактор eIF4E у эукариот [Hasenohrl et al., 2008]. Они обнаружили, что свободная от нуклеотида SsoIF2 связывает мРНК и защищает их от 5'3' направленной нуклеолитической деградации. Причем в качестве субстрата может выступать любая мРНК, на 5'-конце которой находится трифосфат (моно- и дефосфорилированные по 5'-концу мРНК не связываются с -субъединицей aIF2). В работе наших коллег были использованы мРНК, полученные исключительно транскрипцией in vitro с использованием Т7-РНК-полимеразы. Известно, что характерной чертой подавляющего большинства промоторов фаговых РНК полимераз является использование ГТФ в качестве первого нуклеозид-трифосфата при синтезе РНК. Более того, 5'-концевыми нуклеозидами в природных мРНК чаще всего являются пуриновые нуклеозиды (G или А). Мы предположили, что сайтом для узнавания является не просто трифосфат, а гуанозин-5-трифосфат на 5'-конце мРНК и обнаруженный неканонический участок связывания GDPNP в нашей структуре SsoIF2 есть то самое место, с которым взаимодействует 5'-конец мРНК.
В таком случае, добавление ГТФ или его негидролизуемых аналогов к субъединице должно было бы ингибировать ее связывание с мРНК.
Чтобы проверить это предположение, была проведена серия экспериментов по взаимодействию aIF2 и его субъединиц с 5'-концевыми фрагментами мРНК в присутствии различных нуклеотидов. В работе были использованы три фрагмента мРНК, полученных транскрипцией in vitro: SsoACATмРНК-30, MvaL1мРНК-36 и (Структуры двух последних фрагментов мРНК, MjaL1мРНК-49.
закристаллизованных в комплексе с архейным рибосомным белком L1, были ранее определены в нашей лаборатории). В первой серии опытов мы исследовали влияние гуаниновых нуклеотидов на связывание изолированной -субъединицы с мРНК, смешивая компоненты в эквимолярных соотношениях и в разной последовательности. В первом варианте, мРНК добавляли к -субъединице, преинкубированной с одним из нуклеотидов ГДФ, ГТФ, GDPNP, GDPCP, а во втором – нуклеотид смешивали с -субъединицей, преинкубированной с мРНК.
Наличие в реакционной смеси РНК-белковых комплексов регистрировалось с помощью электрофореза в неденатурирующих условиях (методом гель-шифта).
Из результатов экспериментов, приведенных на рис. 8А, видно, что в случае предварительной инкубации -субъединицы с ГТФ или его аналогами комплексообразование между мРНК и белком подавляется, тогда как ГДФ подобного эффекта не оказывает и во всех случаях комплекс -субъединицы с мРНК образовывается. В то же время, добавление ГТФ, GDPNP или GDPCP к ранее образованному мРНК-белковому комплексу не приводит к его разрушению. Для остальных выбранных нами фрагментов мРНК были получены идентичные результаты. Следует отметить, что в присутствии АТФ, УТФ или ЦТФ образование комплекса между мРНК и -субъединицей не ингибировалось ни одним из использованных нуклеотидов (данные не представлены).
Рис. 8. А, Б – Электрофоретический анализ взаимодействия -субъединицы SsoIF2 с MjaL1мРНК 49 в присутствии гуаниновых нуклеотидов (в 3%-ном агарозном геле в неденатурирующих условиях).
1А – мРНК;
2А – SsoIF2•мРНК;
3А – [SsoIF2•ГТФ]+мРНК;
4А – [SsoIF2•мРНК]+ГТФ;
5А – [SsoIF2•ГДФ]+мРНК;
6А – [SsoIF2•мРНК]+ГДФ;
7А – [SsoIF2•GDPCP]+мРНК;
8А – [SsoIF2•мРНК] +GDPCP;
9А – [SsoIF2•GDPNP]+мРНК;
10А – [SsoIF2•мРНК]+GDPNP;
1Б – мРНК;
2Б – [SsoIF2•ГДФ (1:10)] + мРНК;
3Б – [SsoIF2•мРНК] + десятикратный избыток ГДФ;
4Б – SsoIF2 + смесь [мРНК + ГТФ];
5Б – [SsoIF2•ГДФ (1:10)] + смесь [мРНК + ГТФ];
6Б – [[SsoIF2•ГДФ (1:10)] + ГТФ] + мРНК;
7Б – [[SsoIF2•ГДФ (1:10)] + мРНК] + ГТФ.
За исключением десятикратного избытка ГДФ в дорожках 2Б, 3Б, 5Б, 6Б, 7Б, во всех остальных случаях в реакционной смеси использовали эквимолярные количества нуклеотида, мРНК и белка.
Из полученных данных следует, что связывание ГТФ и мРНК с субъединицей есть взаимоисключающее событие: связывание того или другого субстрата зависит от порядка их прибавления к белку. Это в свою очередь указывает на то, что оба субстрата реагируют с идентичным местом на -субъединице.
Причем, ГТФ избирательно связывается с -субъединицей и не может быть заменен ни другими нуклеозид-трифосфатами, ни гуанозин-5-дифосфатом. Однако он может быть заменен негидролизуемыми аналогами ГТФ – GDPNP или GDPCP. Это значит, что мы имеем дело с неканоническим нуклеотид-связывающим сайтом, с которым ГДФ не взаимодействует, а избирательно связывается гуанозин-5-трифосфат на 5' конце мРНК.
Для дополнительного подтверждения данного утверждения, вышеописанные опыты были повторены с SsoIF2, преинкубированной с десятикратным избытком ГДФ (рис. 8Б). При такой постановке эксперимента канонический нуклеотид связывающий сайт на -субъединице должен быть занят ГДФ, что позволяет проверить конкуренцию между мРНК и ГТФ за связывание со вторым – неканоническим нуклеотид-связывающим сайтом. Из рисунка 8Б видно, что ГДФ не подавляет образования комплекса между мРНК и белком даже при десятикратном избытке (дорожки 2, 3). В то же время, в присутствии в реакционной смеси десятикратного избытка ГДФ эквимолярное по отношению к белку количество ГТФ ингибирует образование мРНК-белкового комплекса (дорожка 6). Эти эксперименты показывают также, что мРНК и ГТФ взаимодействуют с SsoIF2 с одинаковым сродством и ни мРНК, ни ГТФ не в состоянии вытеснить друг друга из комплекса с -субъединицей (дорожки 4, 5, 7). Рисунок 8Б (дорожка 4) показывает, что одновременное прибавление к белку ГТФ и мРНК приводит к связыванию обоих субстратов в равной пропорции, причем, присутствие десятикратного избытка ГДФ не влияет на результат (дорожка 5). Анализ структуры позволяет предположить, что связавшийся с неканоническим сайтом ГТФ запирается изменившим свою конформацию участком switch1. Этот участок switch1 может работать как «замок», который не позволяет ни одному из субстратов вытеснить конкурентную молекулу, связанную в неканоническом сайте. Таким образом, эксперименты по конкурентному связыванию позволяют сделать вывод, что трифосфат на 5'-конце мРНК узнается неканоническим нуклеотид-связывающим сайтом, расположенным между доменами I и II aIF2.
Во второй серии опытов мы решили проверить действие ГТФ на мРНК связывающие свойства гетеродимеров и и и целого гетеротримерного фактора SsoIF2 и получили интересные результаты. Для этого в эквимолярных соотношениях гетеротример или гетеродимеры предварительно инкубировали с ГТФ, а потом смешивали с мРНК. Заведомо известно, что РНК-белковые комплексы несут отрицательный заряд на своей поверхности. Комплекс SsoIF2•мРНК является исключением из правил и заряжен положительно, по-видимому, в силу более основной природы SsoIF2 (pI 9.2) по сравнению с остальными субъединицами.
Поэтому в работе с полным фактором SsoIF2 использовали горизонтально расположенные пластины геля, позволяющие визуализировать РНК-белковые комплексы, миграция которых происходит к катоду. Из рисунка 9 видно, что по сравнению с изолированной -субъединицей, добавление ГТФ к SsoIF2 не приводит к полному ингибированию его связывания с мРНК. Димер в присутствии ГТФ перестает ассоциировать с мРНК, тогда как -димер, подобно целому фактору SsoIF2, частично сохраняет связывание с мРНК. В то же время, делеция двух подвижных доменов -субъединицы в -димере исключает связывание его с мРНК при наличии ГТФ. Однако сама по себе -субъединица не взаимодействует с мРНК, даже в условиях двадцатикратного избытка.
Рис. 9. Электрофоретический анализ взаимодействия SsoIF2, его димеров и субъединиц с в MjaL1мРНК- присутствии ГТФ (в 3%-ном агарозном геле в неденатурирующих условиях).
Третий домен -субъединицы обозначен как D3. Двадцатикратный избыток субъединицы отмечен звездочкой.
Справа схематично показано направление движения РНК-белковых комплексов к катоду (-) или аноду (+).
Из полученных данных можно сделать несколько заключений. Во-первых, субъединица, а именно ее подвижные первый и второй домены, вносят вклад в ассоциацию SsoIF2 с мРНК, которую, главным образом промотирует -субъединица.
Во-вторых, несмотря на то, что изолированная -субъединица не обладает выраженными мРНК-связывающими свойствами, не исключено, что -субъединица непосредственно контактирует с мРНК в составе фактора. Согласно литературным данным первый домен -субъединицы обладает общими РНК-связывающими свойствами [Yatime et al., 2004]. В-третьих, наличие -субъединицы дает возможность SsoIF2 в присутствии в окружающей среде ГТФ связывать мРНК. Это наводит на мысль, что в клетке, где концентрация ГТФ на порядок превышает концентрацию ГДФ, должен существовать механизм, позволяющий второму фактору инициации трансляции взаимодействовать с мРНК. По-видимому, субъединица занимает далеко не последнее место в реализации такого механизма.
4. Получение и кристаллизация тройственного комплекса Met тРНКf•SsoIF2D3•GDPNP Параллельно с кристаллизацией и исследованиями структуры -субъединицы и гетеротримерного фактора нами в течение четырех лет велась работа по получению и кристаллизации тройственного комплекса Met-тРНКi•SsoIF2•ГТФ. Для получения тройственного комплекса, в первую очередь, необходимо было наладить выделение биологически активных инициаторных тРНК в препаративных количествах.
Получение биологически активных инициаторных тРНК Согласно опубликованным биохимическим данным архейный фактор инициации трансляции 2, практически, с одинаковым сродством взаимодействует как с архейной инициаторной Met-тРНКi, так и с бактериальной Met-тРНКf. [Yatime et al., 2004;
2006]. Поэтому для кристаллизации решено было получить обе РНК:
архейную тРНКi S. solfataricus и бактериальную тРНКf E. coli. Эта работа проводилась совместно с Н.В. Зелинской и Е.А. Шепелем. Для суперпродукции бактериальной тРНКf достаточно было встроить в вектор геномный фрагмент, содержащий ген предшественника тРНК, ограниченный собственными природными промотором и терминатором. В результате процессинга в клетках образуется зрелая тРНКf с уникальными 5'- и 3'-концами и необходимыми модификациями. Сложнее обстоит дело с продукцией в клетках E. coli чужеродной тРНК, т.к. природный промотор транскриптона архейной тРНКi не может использоваться РНК полимеразой E. coli. В таких ситуациях прибегают к методу получения синтетического гена тРНК [Meinnel et al., 1988]. В вектор встраивается кассета, содержащая синтетический липопротеиновый промотор lpp, ген зрелой инициаторной тРНК S. solfataricus и терминатор rrnC оперона E. coli.
Суперпродукцию обеих инициаторных тРНК проводили в специальном штамме E.
coli – MRE600, не содержащим РНКазы I. Уровень синтеза рекомбинантных инициаторных тРНК оценивали по степени их аминоацилирования меченым метионином, для чего использовали препараты суммарной тРНК из штаммов суперпродуцентов. Получение препаратов суммарной тРНК проводили по классической методике (1962) с небольшими изменениями.
Zubay Аминоацилирование метионином проводили с помощью каталитического домена метионил-тРНК-синтетазы E. coli, выделенного из клеток штамма-суперпродуцента E. coli BL21(DE3)/pET28(+)-MetRS5476His [Alexander and Schimmel, 1999]. Из рисунка 10 видно, что в штаммах-суперпродуцентах для тРНКi S. solfataricus и тРНКf E. coli содержание инициаторной тРНК в 5 раз и в 40 раз, соответственно, больше, чем в исходном штамме. Поскольку продукция бактериальной тРНКf оказалась значительно выше, чем продукция ее архейного гомолога, мы предпочли нарабатывать для кристаллизации инициаторную тРНК E. сoli. Для получения очищенной инициаторной тРНК препарат суммарной тРНК фракционировали на колонке с ионообменной смолой MonoQ в линейном градиенте концентрации хлорида натрия. Эта методика позволяет с 1 литра культуры штамма-продуцента получать до 3 мг гомогенной тРНКf E. coli.
Рис. 10. Содержание рекомбинантных инициаторных тРНК в препаратах суммарной тРНК, полученных из штаммов-суперпродуцентов. Контроль – исходный штамм MRE600;
MRE 600(Eco) – штамм-суперпродуцент для тРНКf E. coli;
MRE 600(Sso) – штамм суперпродуцент для тРНКi S.
solfataricus.
Реконструкция тройственного комплекса Met-тРНКf•SsoIF2D3•GDPNP и его кристаллизация Сборку тройственного комплекса Met-тРНКf•SsoIF2•ГТФ проводили из очищенных индивидуальных компонентов. Чтобы увеличить шансы на успех в получении кристаллов, решено было использовать для кристаллизации конформационно-стабильную сердцевинную часть фактора SsoIF2, состоящую из субъединицы и третьего домена -субъединицы (SsoIF2D3). Следует отметить, что SsoIF2D3 связывает инициаторную Met-тРНК с той же аффиностью, что и целый фактор [Yatime et al., 2004, 2006]. Делецию двух подвижных доменов SsoIF проводили с помощью генно-инженерных методов, заменив кодон Glu174 на инициирующий ATG кодон. Выделение третьего домена SsoIF2 проводили по той же методике, что и выделение целой -субъединицы. Смешивая очищенные - и D3-субъединицы и применяя гель-фильтрацию, мы получали гомогенный препарат D3-гетеродимера.
Известно, что использование вместо ГТФ его негидролизуемых аналогов приводит к образованию более стабильного и долгоживущего тройственного комплекса, что крайне важно для кристаллизации. Мы использовали препарат GDPNP фирмы Sigma, который очищали от примеси ГДФ ионообменной хроматографией на MonoQ, а также препарат GDPCP фирмы Jena Bioscience, который не содержал примесей и не требовал дополнительной очистки. При кристаллизации комплекса и с тем и с другим аналогом были получены одинаковые результаты. Окончательно для кристаллизации был выбран комплекс с GDPNP.
Met-тРНКi в свободном состоянии спонтанно деаминоацилируется за короткое время. Поэтому все операции производили умерено быстро и на холоду. После реакции аминоацилирования Met-тРНКf депротеинизовали фенолом и осаждали этанолом. Осадок Met-тРНКf под спиртом можно хранить при – 70°С до месяца без потери активности. Обессоливание препарата Met-тРНКf проводили гель фильтрацией на сефадексе G25. Полученный водный раствор Met-тРНКf смешивали с SsoIF2D3, который предварительно инкубировали с одним из негидролизуемых аналогов ГТФ в молярном соотношении белок:нуклеотид равном 1:4. В свою очередь, молярное соотношение РНК:белок в реакционной смеси составляло 1.5:1.
Избыточное количество Met-тРНКf над белком брали из расчета, что не вся инициаторная тРНК находится в аминоацилированном состоянии. После 20-ти минутной инкубации препарат реконструированного тройственного комплекса наносили на колонку с супердексом-75, чтобы очистить тройственный комплекс от избытка свободной тРНКf и нуклеотида. Фракции, содержавшие по данным гель электрофореза комплекс Met-tRNAf•SsoIF2D3•GDPNP, объединяли, и тройственный комплекс осаждали добавлением сульфата аммония.
Рис. 11. Кристаллы тройственного комплекса Met-tRNAf•SsoIF2D3•GDPNP.
Первая форма (А);
вторая форма кристаллов (Б).
Подбор условий кристаллизации методом диффузии паров в висящей капле вели при 12°C в присутствии сульфата аммония, используя коммерческий набор растворов Natrix для кристаллизации РНК-белковых комплексов. Были получены две формы кристаллов Met-tRNAf•SsoIF2D3•GDPNP. На рис. 11А представлены кристаллы, образующиеся из раствора тройственного комплекса с концентрацией 3 – 4 мг/мл в смешанном буфере Hepes-KOH c MES, рН 7.0, содержащем сульфат аммония в концентрации 28% насыщения, 7 мМ MgCl2, 0.5 мМ ДТТ, 0.2 мМ GDPNP. Размер кристаллов составлял 7050180 мкм. Вторая форма кристаллов (рис. 11Б) тройственного комплекса размером 60020040 мкм была получена из раствора комплекса с концентрацией 23 – 25 мг/мл в буфере какодилат-Na, pH 6.0, содержащем 0.68 М сульфата аммония, 6 мM ацетата магния, 7 – 10 мМ MgCl2, мМ GDPNP и 1 – 1.2 мМ CdCl2. Как видно из рисунка 11 во вторых условиях были получены значительно более крупные кристаллы Met-tRNAf•SsoIF2D3•GDPNP, но менее упорядоченные и на внешний вид слоистые. Предварительные кристаллографические исследования показали, что данные кристаллы отражают рентгеновские лучи с низким разрешением (до 7 – 8 ) и имеют высокую мозаичность, тогда как кристаллы, полученные в первых условиях, давали дифракционную картину с разрешением до 3.2. Кристаллы первой формы были использованы для сбора дифракционных данных на синхротроне в Берлине (линия BL2 станции BESSY II, Германия). В настоящее время совместно с группой С.В.
Никонова (ИБ РАН, Пущино) ведется работа по определению структуры тройственного комплекса Met-tRNAf•SsoIF2D3•GDPNP.
ВЫВОДЫ В настоящей диссертационной работе получены следующие основные результаты:
Получены штаммы-суперпродуценты E. coli для всех субъединиц белка aIF2 S.
1.
solfataricus и инициаторных тРНК E. coli и S. solfataricus. Разработаны процедуры выделения данных макромолекул, а также гетеротримера SsoIF2 в препаративных количествах.
Получены кристаллы изолированной -субъединицы SsoIF2 в свободной 2.
форме и в комплексе с ГДФ и негидролизуемыми аналогами ГТФ, что позволило определить пространственные структуры этого белка в нескольких состояниях.
Показано, что нуклеотид-связывающий карман, расположенный на G-домене 3.
-субъединицы, обладает более высоким сродством к ГДФ, чем к негидролизуемому аналогу ГТФ.
Впервые обнаружен дополнительный сайт связывания ГТФ на -субъединице 4.
aIF2. Проверено предположение, что этот сайт может являться местом для взаимодействия 5-концевого гуанозин-трифосфата мРНК с -субъединицей:
показано, что добавление ГТФ или его негидролизуемых аналогов к -субъединице ингибирует ее связывание с мРНК, тогда как ГДФ подобного действия не оказывает.
Получены кристаллы интактного гетеротримерного SsoIF2, что позволило 5.
впервые определить и проанализировать полную структуру этого фактора.
Показано, что фактор aIF2 состоит из конформационно-стабильной сердцевинной части (-субъединица и 3 домен -субъединицы) и двух подвижных «крыльев» (1 и домены -субъединицы, центральная и С-концевая части -субъединицы).
Разработана методика реконструкции in vitro тройственного комплекса Met 6.
tRNAf•SsoIF2D3•GDPNP. Выращены крупные кристаллы этого комплекса, с которых собраны дифракционные данные с разрешением до 3.2.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Столбоушкина E.A., Никонов O.С., Гарбер M.Б. (2009) Выделение и кристаллизация гетеротримерного фактора инициации трансляции 2 из Sulfolobus solfataricus. Биохимия 74(1), 70-77.
2. Stolboushkina E., Nikonov S., Nikulin A., Blsi U., Manstein D.J., Fedorov R., Garber M., Nikonov O. (2008) The crystal structure of the trimeric archaeal translation initiation factor 2 reveals very high conformational flexibility of the - and -subunits. J. Mol. Biol., 382, 680-691.
3. Nikonov O.S., Stolboushkina E.A., Nikulin A.D., Hasenhrl D., Blsi U., Manstein D.J., Fedorov R.V., Nikonov S.V., Garber M.B. (2008) New insights into the interactions of the translation initiation factor 2 from archaea with guanine nucleotides and initiator tRNA.
Abstract
book of the HHMI Meeting of International Research Scholars, Lisbon, Portugal, 19-22 June, 28.
4. Столбоушкина E.A., Никонов O.С., Никулин A.Д., Никонов С.В., Блэзи У., Гарбер M.Б. (2008) Кристаллизация и РНК-связывающие свойства архейного фактора инициации трансляции 2 (aIF2). Сборник тезисов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, Россия, 11-15 Май, 88.
5. Nikonov O., Stolboushkina E., Nikulin A., Hasenhrl D., Blsi U., Manstein D.J., Fedorov R., Garber M., Nikonov S. (2007) New insights into the interactions of the translation initiation factor 2 from archaea with guanine nucleotides and initiator tRNA. J.
Mol. Biol., 373, 328-336.
6. Stolboushkina E.A., Nikonov O.S., Nikulin A.D., Nikonov S.V., Garber M.B., Blsi U.
(2007) Crystallization of the heterotrimeric archaeal translation initiation factor aIF2. 40th Anniversary of the Institute of Protein Research Russian Academy of Sciences. Abstract book of the International Conference on «Protein Biosynthesis, Structure and function».
Pushchino, Russia, 9-13 June, 23.
7. Stolboushkina E., Zelinskaya N., Shepel E., Nikulin A., Nikonov O., Nikonov S., Garber M., Hasenhrl D., Blsi U. (2006) Translation initiation factor aIF2 from the archaeon Sulfolobus solfataricus. Abstract book of the FEBS Advanced Course «Advanced methods in macromolecular crystallization II». Nove Hrady, Czech Republic, 6- October, 212.
8. Столбоушкина E.A., Гуськов A.И., Никулин A.Д., Никонов С.В., Гарбер M.Б.
(2006) Пространственная структура -субъединицы гетеротримерного фактора инициации трансляции aIF2 из археи Sulfolobus solfataricus. Сборник тезисов 10-ой международной пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века». Пущино, Россия, 17-21 Апрель, 51.