Особенности кальциевой сигнализации в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах линии с2с12 мыши
На правах рукописи
КРАСНЫЙ Алексей Михайлович ОСОБЕННОСТИ КАЛЬЦИЕВОЙ СИГНАЛИЗАЦИИ В ПРОЛИФЕРИРУЮЩИХ И ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИХСЯ МИОБЛАСТАХ ЛИНИИ С2С12 МЫШИ 03.00.04 - Клеточная биология, гистология, цитология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2011
Работа выполнена в лаборатории биофизики развития Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.
доктор биологических наук, профессор
Научный консультант:
Озернюк Николай Дмитриевич доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты:
Авдонин Павел Владимирович доктор биологических наук Романов Юрий Аскольдович МГУ имени М.В. Ломоносова, биологический
Ведущая организация:
факультет, кафедра клеточной биологии и гистологии
Защита диссертации состоится «30» ноября 2011 г. в 1500 часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу:
119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26.
Сайт: http://idbras.comcor.ru e-mail: [email protected].
С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К.
Кольцова РАН.
Автореферат разослан «_»2011 года.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.Б. Абрамова e-mail: [email protected]
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Одним из важнейших этапов развития различных тканей и органов является переход клеток от пролиферации к дифференцировке. В этот период начинается экспрессия многих специфических генов и синтез соответствующих белков, определяющих фенотип дифференцирующихся клеток. Существенным компонентом регуляции внутриклеточных процессов служит кальциевая Са2+ сигнализация. Концентрация в цитоплазме регулируется путем высвобождения запасов данных ионов из внутриклеточных депо, однако стадия формирования этого механизма в ходе дифференцировки клеток неизвестна.
Для понимания формирования механизмов кальциевой сигнализации большое значение имеет изучение закономерностей строения и регуляции функционирования специфических ионных каналов, осуществляющих поступление Са2+ в цитоплазму пролиферирующих и дифференцирующихся клеток (на модели миобластов). Молекулярная структура и экспрессия отдельных субъединиц кальциевых каналов установлена для многих типов клеток (Berridgt, Irvine, 1989;
Авдонин, Ткачук, 1994;
MacLennan, 2002;
Зинченко, Долгачева, 2003;
Rockman et al., 2002;
Болдырев и др. 2006), однако для миобластов подобный анализ не проводился. Поэтому для понимания механизмов кальциевой сигнализации в миобластах установление структуры кальциевых каналов, а также регуляции их функционирования, предпринятое в нашей работе, является актуальной проблемой.
Существенную роль в процессах развития и восстановления мышечных тканей играют адренергические рецепторы (Hinkle et al., 2002;
Beitzel et al., 2004;
Lynch et al., 2007;
Pearen et al., 2009;
Duranti et al., 2011), однако данные о характере их регулирующего влияния противоречивы. В связи с этим особый интерес представляет сравнительное изучение роли адренергических Са2+ рецепторов в регулировании концентрации в цитоплазме пролиферирующих и дифференцирующихся миобластов.
Цель и задачи работы. Целью работы было изучение механизмов кальциевой сигнализации в миобластах при их переходе от пролиферации к дифференцировке.
В работе были поставлены следующие задачи:
1. Изучить особенности регуляции внутриклеточной кальциевой сигнализации, вызывающей высвобождения ионов Са2+ внутриклеточных депо, в пролиферирующих и в дифференцирующихся (в течение 24 час) миобластах.
2. Выяснить механизмы регуляции кальциевой сигнализации в пролиферирующих миобластах: выявить активатор поступления Са2+ в цитоплазму этих клеток, а также рецепторы, на которые он воздействует;
охарактеризовать каналы, через которые Са2+ поступает в цитоплазму клеток, а также исследовать механизм передачи сигнала от рецептора к каналу.
3. Установить особенности внутриклеточной кальциевой сигнализации, связанные с адренергическими рецепторами в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах.
4. Для установления специфичности потенциалзависимых кальциевых каналов в миобластах определить уровень экспрессии генов Cacna1s, Cacna1d, Cacna1c и Cacna1f, кодирующих синтез каналообразующих субъединиц Са2+ каналов L-типа.
Научная новизна и практическая ценность работы Впервые описаны особенности внутриклеточной кальциевой сигнализации в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах.
Показано, что в пролиферирующих миобластах система, регулирующая концентрацию Са2+ в цитоплазме путем высвобождения этих ионов из внутриклеточных депо, практически не функционирует, а ее формирование происходит в течение первых нескольких часов дифференцировки.
Установлено, что поступление Са2+ в делящихся миобластах осуществляется через потенциалзависимые Са2+-каналы L-типа. Эти каналы играют ключевую роль в регуляции концентрации Са2+ в цитоплазме пролиферирующих миобластов. Механизм регуляции поступления Са2+ включает в себя активацию 2-адренергических рецепторов, участие аденилатциклазы и поступление Са2+ через потенциалзависимые Са2+-каналы L-типа. Показано, что после перехода клеток в состояние дифференцировки основным механизмом в регуляции концентрации Са2+ в цитоплазме является высвобождение внутриклеточных запасов этих ионов. Впервые описано изменение уровней экспрессии отдельных субъединиц потенциалзависимых Са2+-каналов L-типа в миобластах в процессе их дифференцировки. Обнаружена нейрональная форма Са2+-канала L-типа Cav1.3 в пролиферирующих миобластах.
Результаты работы могут быть использованы при чтении курсов лекций по клеточной биологии и биологии развития, а также учитываться в биомедицинских исследованиях при решении задач, связанных с патологиями, которые вызваны нарушениями кальциевой сигнализации и клеточной пролиферации.
Личное участие автора. Работа выполнена непосредственно автором.
Поставленные задачи были решены с применением современных методов клеточной биологии, физиологии и молекулярной генетики. Выводы сформулированы на основе собственных оригинальных данных.
Апробация диссертации. Результаты исследования были представлены на XV школе "Актуальные проблемы биологии развития" (Звенигород, 2008), конференции молодых ученых ИБР РАН (Москва, 2009, 2010), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009, 2011), Всероссийском конкурсе научно-исследовательских работ в области биологических наук (Ульяновск, 2011) Публикации. По материал диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на страницах. Работа состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследований, обсуждение, выводы и список литературы;
иллюстрирована 18 рисунками и 2 таблицами. Список литературы включает 74 источника, из них 7 отечественных и 67 иностранных.
ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Работа проводилась на культуре миобластов линии С2С12 мыши, полученной из коллекции клеточных культур Института цитологии РАН (Санкт-Петербург).
В качестве ростовой среды использовали DMEM (Sigma, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (БиоЛот, Россия), 2 мМ L-глютамина (Sigma, США). Антибиотики в среду не добавляли. Процедуру пересева клеток проводили, используя 0.25% трипсин и 0.02% версен в отношении 1 : 3. Кратность рассева составляла 1:3 - 1:6, оптимальная плотность соответствовала 2.0-4.0х104 клеток/см2. Пересев клеток проводили каждые 3- суток. В качестве среды дифференцировки использовали DMEM с добавлением 2% эмбриональной лошадиной сыворотки. Культивировали клетки в CO2 инкубаторе при 370С с 5% CO2.
Рис. 1. Миобласты линии С2С12 мыши. Конфокальная микроскопия.
Изменение концентрации Са2+ в цитоплазме оценивали на единичных клетках на конфокальном микроскопе LEICA SP 5;
объектив 20х;
одновременно можно было оценить 20-40 клеток (рис. 1).
Клетки рассаживали в специальные чашки Петри (SPL, Канада) и добавляли к ним чувствительный к изменению концентрации Са2+ в цитоплазме флуоресцентный краситель FLUO-3/АМ фирмы Biotium (Канада).
Флуоресцентный анализ и окрашивание проводили в специальных средах. К пролиферирующим миобластам добавляли раствор Хенкса с 5mM буфера HEPES, pH 7.4 при 370С. К дифференцирующимся клеткам добавляли физиологический раствор (PSS), содержащий 145 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 10 мМ глюкозу, 5 мМ HEPES, pH 7.4 при 370С. В этих же средах растворяли краситель. Для лучшего проникновения в клетку FLOU 3/АМ экспериментально был подобран оптимальный режим. На 1 мл среды добавляли 6 мкг FLOU 3/АМ, 0,8 мкл 5% Pluronic F-127 (Biotium, Канада);
окрашивание проводили в течение 20 мин при 370С;
далее миобласты три раза отмывали и выдерживали 1 час при 370С. В ряде экспериментов использовали также бескальциевую среду (PSS, где Са2+ был заменен на 1 мМ ЭГТА).
Для оценки внутриклеточных запасов Са2+ в миобластах в бескальциевую среду добавляли 50 мкМ АТФ (Sigma, США). АТФ, как известно, не только участвует в передаче энергии в клетке, но и способен взаимодействовать с различными пуринорецепторами на поверхности мембраны. Миобласты линии С2С12 обладают метаботропными (P2Y) и ионотропными (P2X) пуринорецепторами (Banachewicz et al., 2005). Ионотропные рецепторы являются неселективными и пропускают Са2+ в цитоплазму. Метаботропные рецепторы сопряжены с G белком, который активирует фосфолипазу С, что, в свою очередь, приводит к опустошению ретикулярных запасов.
В конце каждого эксперимента в качестве контроля добавляли 100 мкМ иономицина (Sigma, США), который, являясь ионофором, в данной концентрации приводил к заполнению цитоплазмы этими ионами более активно, чем их выведение клеточными системами;
при этом интенсивность флуоресценции принималась за 1.
Для анализа экспрессии генов, кодирующих субъединицы кальциевых каналов, выделяли тотРНК из пролиферирующих и дифференцирующихся одноядерных миобластов, используя Tri reagent (Sigma). Фракцию мРНК получали из тотРНК с помощью набора Gene-elute-mRNA (Sigma). Синтез кДНК проводили с использованием обратной транскриптазы M-MLV и олиго д(Т)18 праймеров (Силекс, Россия). ПЦР-анализ экспрессии изучаемых генов проводили на амплификаторе Eppendorf (Германия) по следующей программе:
предварительная денатурация – 94°С, 5 мин;
отжиг праймеров – 58°С, 45 с;
удлинение цепи – 72°С, 45 с;
денатурация – 94°С, 45 с, 40 циклов;
завершающее удлинение цепи – 72°С, 5 мин. Специфические праймеры были сконструированы при помощи программы Primerselect (таблица).
Таблица.
Структура праймеров, использованных для ПЦР-анализа экспрессии генов, кодирующих каналообразующие субъединицы потенциалзависимых Са2+-каналов L типа.
Ген Структура праймера Размер фрагмента н. п.
Пр. 5'-AGGGTACTGCCAATGCTCGGA-3' RPL Обр. 5'-CCTTGGACAGAGTCTTGATGATC-3' Пр. 5'-AAGAGGAATGCAGGGGCTACTACT-3' Cacna1s Обр. 5'-ATGAAGAAGGCAATGAGGATGATG-3' Пр. 5'-TCTAAACAGACGGAGGCAGAATG-3' Cacna1c Обр. 5'-CTGGAAGGTGACAATGACGAA-3' Пр. 5'-GACCCCATCCGTAGCCACTCAT-3' Cacna1d Обр. 5'-GCCGCAAGACCCTCAAAACC-3' Пр. 5'-TGCACTGATGAGGCCAAACACA-3' Cacna1f Обр. 5'-TGATGATAACAAAGCCCACAAAGA-3' Предварительная нормировка кДНК, полученной из пролиферирующих и дифференцирующихся миобластов, осуществлена по гену рибосомального белка RPL 19. Секвенирование ПЦР-продуктов проводили на оборудовании Applied Biosystems (США) в ЗАО “Синтол” (Москва).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Внутриклеточные запасы Са2+ в пролиферирующих миобластах.
Запасы Са2+ внутриклеточных депо, как известно, играют основную роль в Ca2+ регуляции концентрации в цитоплазме во всех типах клеток млекопитающих кроме эритроцитов. Чтобы оценить эти запасы, в пролиферирующих миобластах было исследовано изменение концентрации Са2+ в цитоплазме при добавлении АТФ в бескальциевой среде с последующим добавлением ионов кальция. Использование бескальциевой среды позволяет исключить вклад ионотропных рецепторов.
На рис. 2 показан типичный ответ одиночной клетки, находящейся в состоянии пролиферации. В цитоплазме миобластов АТФ вызывает небольшое повышение флуоресценции (примерно 5% от максимального значения флуоресценции, полученного в результате добавления иономицина). Всего было оценено 20 клеточных ответов из трех различных экспериментов;
среднее значение флуоресценции составило 4.8±0.3% от максимального, т.е близко к фоновым колебаниям концентрации Са2+.
0, флуоресценция Fluo 3, отн. ед 0,45 ATФ 50 мкМ 0, 2+ Ca 1.3 мМ 0, 0, 0, 0, 0 50 100 150 200 250 время, с Рис. 2. Изменение концентрации Ca2+ в цитоплазме пролиферирующих миобластов при добавлении АТФ и Ca2+в бескальциевой среде. Интенсивность флуоресценции после добавления 100 мкМ иономицина принята за 1.
Таким образом, в пролиферирующих миобластах линии С2С12 мыши система кальциевой сигнализации, регулирующая концентрацию Са2+ в цитоплазме путем опустошения внутриклеточных депо, практически не функционирует. Поскольку при добавлении Са2+ в среду концентрация этих ионов в цитоплазме не меняется, можно сделать вывод, что отсутствует поступление внеклеточного Са2+ в цитоплазму миобластов, вызываемое опустошением внутриклеточных запасов.
Са2+ 2. Внутриклеточные запасы в дифференцирующихся миобластах. Было оценено поступление Са2+ из внутриклеточных депо в цитоплазму дифференцирующихся миобластов. Добавление АТФ к клеткам, помещенным в бескальциевую среду, вызвало значительную флуоресценцию красителя Fluo-3 в цитоплазме. При этом в части клеток наблюдался одиночный ответ. На рис. 3 приведен типичный ответ клеток на данное воздействие. Значение флуоресценции составляет 85% от максимального, вызванного добавлением иономицина. Следует отметить, что ответ на внесение АТФ проявлялся с некоторой задержкой во времени. Всего было оценено клеточных ответов из трех различных экспериментов;
среднее значение флуоресценции составило 84.8±5.2% от максимального.
В части клеток после добавления АТФ наблюдались кальциевые волны, состоящие из двух или более выбросов Са2+ (рис. 4). Значения максимальной флуоресценции при выбросе Са2+ были ниже, чем при одиночных ответах и наблюдался значительных разброс данных (значение максимального ответа составило 78%, минимальное - 31% от максимальной флуоресценции). При этом происходило, по-видимому, неполное опустошение ретикулума. В дальнейших наших исследованиях использовались данные о флуоресценции клеток с одиночным кальциевым ответом.
Са2+ вход Вызываемый добавлением этих ионов через каналы, регулируемые опустошением эндоплазматического ретикулума (SOC - store operate channel), составил примерно 14% от максимального значения флуоресценции.
0, флуоресценция Fluo 3, отн. ед 0, ATФ 50 мкМ 2+ Ca 1.3 мМ 0, 0, 0 300 время, с Рис. 3. Изменение концентрации Ca2+ в цитоплазме дифференцирующихся миобластов при добавлении АТФ и Ca2+в бескальциевой среде. Интенсивность флуоресценции после добавления 100 мкМ иономицина принята за 1.
0, флуоресценция Fluo 3, отн. ед ATФ 50 мкМ 0,4 2+ Ca 1.3 мМ 0, 0, 0 300 время, с Рис. 4. Изменения концентрации Ca2+ в цитоплазме дифференцирующихся миобластов при добавлении АТФ и Ca2+ в бескальциевой среде. Интенсивность флуоресценции после добавления 100 мкМ иономицина принята за 1.
Ca2+ 3. Механизмы активации поступления в цитоплазму пролиферирующих миобластов. Для выяснения особенностей кальциевой сигнализации в делящихся миобластах необходимо было установить механизм активации входа этих ионов в клетку. Мы предположили, что поступление Ca2+ в миобластах регулируется адренергическими рецепторами. Чтобы проверить это предположение, к клеткам, нагруженным кальциевым флуоресцентным красителем, был добавлен адреналин, что вызывало поступление Са2+ в цитоплазму клеток (рис. 5). В данном эксперименте флуоресценция составила 92% от максимальной. Повторное добавление адреналина через 2 мин не оказывало влияние на поступление Са2+. В качестве контроля был добавлен ионофор иономицин, который вызывал накопление Са2+ в цитоплазме миобластов. На основании полученных результатов, можно заключить, что в данном случае поступление Са2+ в пролиферирующих миобластах регулируется адренергическими рецепторами.
1,0 адреналин 5 мкМ флуоресценция Fluo 3, отн. ед.
иономицин 100 мкМ 0, 0, адреналин 5 мкМ 0, 0, 0, 0 50 100 150 200 время, с Рис. 5. Активация адреналином поступления Са2+ в цитоплазму пролиферирующих миобластов. Интенсивность флуоресценции после добавления мкМ иономицина принята за 1.
Следует отметить, что участие адренергических рецепторов в регуляции концентрации Са2+ в цитоплазме миобластов обнаружено впервые. Ранее было известно, что адренергические рецепторы участвуют в гликогенолизе, а также в регуляции сокращения скелетных мышц.
Далее, предстояло выяснить тип адренергических рецепторов, участвующих в регуляции поступления Са2+ в цитоплазму пролиферирующих миобластов. В начале было показано, что норадреналин - активатор 1-, 2- и 1-адренергических рецепторов не вызывает поступления Са2+ в цитоплазму этих клеток. Однако, при замене адреналина на фенотерол (специфический активатор 2 -адренорецепторов) было обнаружено, что он вызывает вход Са2+ в цитоплазму пролиферирующих миобластов (рис. 6).
а б Рис. 6. Повышение концентрации Са2+, вызванное фенотеролом, в пролиферирующих миобластах, нагруженных флуоресцентным красителем Fluo-3. а) клетки в состоянии покоя, б) клетки после добавления фенотерола.
Представленные данные свидетельствует о том, что в поступлении Са2+ в цитоплазму этих клеток участвуют 2-адренергические рецепторы, тогда как 1-, 2- и 1-адренорецепторы в данном процессе не принимают участия.
Следует отметить, что раннее обращали внимание на особую роль 2 адренергических рецепторов в пролиферирующих миобластах: их активатор рактопамин усиливал пролиферацию клеток, не оказывая влияния на миотубы.
(Shappell et al., 2000).
4. Выявление каналов, проводящих Ca2+ в цитоплазму клетку. Для выяснения особенностей кальциевой сигнализации в делящихся миобластах необходимо было установить тип каналов, проводящих Са2+. Один из подходов для решения этой задачи состоит в использовании специфических ингибиторов.
Чтобы определить тип каналов, проводящих ионы Са2+, в наших экспериментах применялся верапамил - специфический ингибитор потенциалзавасимых кальциевых каналов L-типа. Было обнаружено, что добавление верапамила приводит к полному ингибированию поступления Са2+, активируемого адреналином. Следует отметить, что существует точка зрения, согласно которой Са2+-каналы L-типа присутствуют только в многоядерных миотубах (Zheng et al., 2002;
Bidaud et al., 2006). Однако полученные нами результаты ингибиторного анализа свидетельствуют о том, что Са2+-каналы в делящихся миобластах относятся к потенциалзависимым каналам L-типа.
5. Передача сигнала от адренергических рецепторов к потенциалзависимым Са2+-каналам L-типа. Предполагалось, что активация потенциалзавасимых Са2+ каналов L-типа в миобластах происходит по цАМФ зависимому пути. Для проверки этого предположения был использован форсколин - специфический активатор аденилатциклазы (Seamon, Daly, 1981).
Как видно из рис. 7, форсколин активирует поступление Са2+ в цитоплазму миобластов, что подтверждает предположение об активации входа этих ионов в клетку аденилатциклазой. Следующее добавление адреналина не вызывает поступление Са2+ в цитоплазму делящихся миобластов, как это было показано выше (рис. 5). Также этот вход полностью блокируется верапамилом.
Из этих данных следует, что аденилатциклаза в пролиферирующих миобластах регулирует поступление Са2+, вызванное 2-адренергическими рецепторами.
иономицин 100 мкМ форсколин 10 мкМ 1, флуоресценция Fluo 3, отн, ед.
0, 0, адреналин 50 мкМ 0, среда 0, 0, -50 0 50 100 150 200 250 300 350 время, с Рис. 7. Поступление Са2+ в цитоплазму делящихся миобластов, вызванное активацией аденилатциклазы форсколином. Интенсивность флуоресценции после добавления 100 мкМ иономицина принята за 1.
6.Оценка поступления Ca2+ в цитоплазму дифференцирующихся миобластов при активации адренергических рецепторов адреналином. При активации адренергической системы в дифференцирующихся миобластах добавлением адреналина величина флуоресценции составила 68% от максимального значения флуоресценции, вызванного добавлением 100 мкМ иономицина (рис. 8). Всего было оценено 12 клеточных ответов из двух различных экспериментов, среднее значение флуоресценции составило 65±4.4% от максимального. Это существенно ниже, чем в пролиферирующих миобластах. Далее, в этом эксперименте после добавления бескальциевой среды и АТФ флуоресценция составила 94% от максимальной величины.
ATФ 50 мкМ 1, флуоресценция Fluo 3, отн. ед.
адреналин 5 мкМ 2+ Ca 1.3 мМ 2+ pss/б Ca 0, 0, 200 время, с Рис. 8. Активация адреналином входа Са2+ в цитоплазму дифференцирующихся миобластов. Интенсивность флуоресценции после добавления 100 мкМ иономицина принята за 1.
Таким образом, в процессе дифференцировки роль адренергических рецепторов в регулировании концентрации Са2+ в миобластах существенно снижается. При этом значительное повышение флуоресценции после добавления АТФ демонстрирует, что механизм, регулирующий опустошение запасов Са2+ из внутриклеточных депо, полностью сформирован.
7. Экспрессия генов каналообразующих субъединиц Са2+-каналов потенциалзависимых L-типа в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах. Как отмечалось выше (раздел 4), при помощи ингибиторного анализа было установлено, что пролиферирующие Са2+-каналами миобласты обладают потенциалзависимыми L-типа.
Поступление Са2+ через данные каналы регулируется адреналином. Для Са2+ понимания механизмов транспорта в миобластах существенным представляется исследование экспрессии генов потенциалзависимых Са2+ каналов L-типа, поскольку ингибиторный анализ, использованный для их выявления, не позволяет судить о виде Са2+-канала L-типа. Кроме того, данные, свидетельствующие о наличии потенциалзависимых Са2+-каналов L-типа в одноядерных миобластах, не согласуются с существующей точкой зрения, согласно которой Са2+-каналы L-типа присутствуют только в многоядерных миотубах (Zheng et аl., 2002;
Bidaud et al., 2006).
Для анализа потенциалзависимых Са2+-каналов L-типа была исследована экспрессия генов, которые кодируют синтез каналообразующих субъединиц всех известных Са2+-каналов L-типа в мышиных миобластах линии С2С12 на стадиях пролиферации и начала дифференцировки. При помощи ПЦР-анализа определен уровень экспрессии генов Cacna1s, Cacna1c, Cacna1d, Cacna1f, которые кодируют субъединицы: 1S, 1C, 1D 1F, соответственно.
Обнаружено, что экспрессия гена Cacna1s, который кодирует синтез специфической для скелетных мышц каналообразующей субъединицы, в пролиферирующих миобластах находится на низком уровне, тогда как в дифференцирующихся миобластах она многократно увеличивается (рис. 9).
Стадия развития Дифференциров- Размер ПЦР культуры Пролиферация ка 24 часа фрагмента Ген н. п.
Cacna1s Cacna1d RPL19 Рис. 9. ПЦР-анализ уровня экспрессии генов, кодирующих субъединицы Са2+ канала L-типа, в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах. RPL19 – рибосомальный белок, по которому нормированы кДНК.
В миобластах впервые была обнаружена экспрессия гена Cacna1d, кодирующего синтез субъединицы 1D. В делящихся миобластах уровень экспрессии этого гена значительно выше, чем в дифференцирующихся клетках (рис. 9). Экспрессия генов Cacna1c и Cacna1f в миобластах не выявлена.
Таким образом, в одноядерных миобластах линии С2С12 впервые обнаружены два вида потенциалзависимых Са2+-каналов L-типа: Cav1.1 и Cav1.3, синтез которых меняется в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах (рис. 9). Было показано, что экспрессия гена Cacna1s, кодирующего синтез специфической для скелетных мышц субъединицы 1S (канал Cav1.1), активируется только в дифференцирующихся одноядерных миобластах. Вместе с тем, транскрипция известных изоформ этого гена ранее была обнаружена только в многоядерных миобластах (Zheng et al., 2002;
Bidaud et al., 2006). Это позволяет предположить, что нами обнаружена новая, экспрессирующаяся на более ранних этапах изоформа мРНК Cacna1s.
В пролиферирующих миобластах обнаружен высокий уровень экспрессии гена Cacna1d, кодирующего синтез субъединицы 1D (канал Cav1.3). Это дает основание предполагать, что в пролиферирующих миобластах регуляция внутриклеточной концентрации Са2+ осуществляется через каналы Cav1.3.
Уменьшение уровня экспрессии гена Cacna1d в дифференцирующихся миобластах свидетельствует о снижении роли каналов Cav1.3 в кальциевой сигнализации.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
Установлено, что формирование внутриклеточной системы кальциевой сигнализации, регулирующей опустошение запасов кальциевых депо, происходит на начальных этапах дифференцировки миобластов. В пролиферирующих миобластах мыши данная система кальциевой сигнализации практически не функционирует.
Показано также, что поступление Са2+ в цитоплазму пролиферирующих миобластов осуществляется через кальциевые каналы L-типа, которые играют ключевую роль в регуляции концентрации Са2+. Механизм регуляции поступления Са2+ включает в себя активацию 2-адренергических рецепторов и участие аденилатциклазы. После перехода миобластов к дифференцировке основным механизмом повышения концентрации Са2+ в цитоплазме становится высвобождение ретикулярных запасов этих ионов.
В одноядерных миобластах впервые обнаружены два вида потенциалзависимых Са2+-каналов L-типа: Cav1.1 и Cav1.3. Было показано, что экспрессия гена Cacna1s, кодирующего синтез специфической для скелетных мышц субъединицы 1S (канал Cav1.1), активируется только в дифференцирующихся одноядерных миобластах. Вместе с тем, транскрипция известных изоформ этого гена ранее была обнаружена только в многоядерных миобластах (Zheng et al., 2002;
Bidaud et al., 2006). Это позволяет предположить, что нами найдена новая, экспрессирующаяся на более ранних этапах дифференцировки изоформа мРНК гена Cacna1s.
В пролиферирующих миобластах обнаружен высокий уровень экспрессии гена Cacna1d, кодирующего синтез субъединицы 1D (канал Cav1.3). Это дает основание предполагать, что в пролиферирующих миобластах регуляция внутриклеточной концентрации Са2+ происходит через каналы Cav1.3.
Уменьшение уровня экспрессии гена Cacna1d в дифференцирующихся миобластах свидетельствует о снижении роли каналов Cav1.3 в кальциевой сигнализации.
Таким образом, нами обнаружены существенные различия в механизмах внутриклеточной сигнализации в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах. В перспективе, это может служить основой для разработки новых подходов к селективному воздействию на клетки, находящиеся на разных стадиях развития, с целью регуляции пролиферации и перехода клеток к дифференцировке.
ВЫВОДЫ 1. В пролиферирующих миобластах линии С2С12 мыши система кальциевой сигнализации, регулирующая концентрацию Са2+ в цитоплазме путем опустошения внутриклеточных депо этих ионов, практически не функционирует. Регулируемые АТФ запасы Са2+ в этих клетках незначительны.
2. В пролиферирующих миобластах поступление Са2+ в цитоплазму регулируется адреналином через 2-адренергические рецепторы и происходит через потенциалзависимые кальциевые каналы L-типа Cav1.3.
3. Передача сигнала внутриклеточной кальциевой сигнализации от 2 адренергических рецепторов к кальциевым каналам L-типа происходит по цАМФ-зависимому пути.
4. Формирование системы кальциевой сигнализации, регулирующей концентрацию Са2+ в цитоплазме путем опустошения запасов внутриклеточных депо, происходит на начальных этапах дифференцировки миобластов.
5. В дифференцирующихся миобластах поступление Са2+ при активации адренергической системы существенно ниже по сравнению с пролиферирующими клетками.
6. В процессе дифференцировки миобластов значительно возрастает уровень экспрессии гена Cacna1s, который кодирует синтез специфической субъединицы 1S кальциевых каналов L-типа Cav1.1, тогда как уровень экспрессии каналообразующей субъединицы Cacna1d, кодирующей синтез субъединицы 1D кальциевых каналов Cav1.3, заметно снижается.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Красный А. М., Озернюк Н. Д. Различия в Са2+-сигнализации в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах мыши // Биофизика.
2010. Т. 4. С. 640-644.
2. Красный А. М., Сефиханов Т. Г., Озернюк Н. Д. Регуляция входа Са2+ в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах мыши с участием Са2+-каналов L-типа // Биофизика. 2011. Т. 1. С. 74-78.
3. Красный А. М., Озернюк Н. Д. Экспрессия генов, кодирующих субъединицы потенциалзависимых Са2+-каналов L-типа в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах линии С2С12 мыши // Известия РАН. Серия биол. 2011. Т. 3. С. 1-5.
4. Красный А. М., Озернюк Н. Д. Сравнение механизмов Са2+ сигнализации в делящихся и дифференцирующихся миобластах мыши // Сборник статей. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». 2009. Т. 1. С. 283-287.
5. Красный А. М., Озернюк Н. Д. Механиз регулции внутриклеточной Са2+-сигнализации в пролиферирующих миобластах // Сборник статей.
Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация».
2011. Т. 1. С. 357-361.
6. Красный А. М. Озернюк Н. Д. Экспрессия генов потенциалзависимых Са2+-каналов L-типа в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах С2С12 мыши // Сборник статей. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». 2011. Т. 1. С. 361-364.