Влияние экспрессии гена мембранной + н -пирофосфатазы rhodospirillum rubrum на уровень солеустойчивости растений табака
На правах рукописи
ДЬЯКОВА Елена Владимировна ВЛИЯНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА МЕМБРАННОЙ + Н -ПИРОФОСФАТАЗЫ RHODOSPIRILLUM RUBRUM НА УРОВЕНЬ СОЛЕУСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ ТАБАКА 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.01.03 – молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
МОСКВА - 2012
Работа выполнена в лаборатории генетической инженерии в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Центре «Биоинженерия» Российской академии наук Научные руководители: кандидат биологических наук Камионская Анастасия Михайловна доктор биологических наук Равин Николай Викторович
Официальные оппоненты:
Балнокин Юрий Владимирович, доктор биологических наук, профессор, ФГБУН Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, заведующий лабораторией солевого обмена и солеустойчивости Долгов Сергей Владимирович, доктор биологических наук, Филиал учреждения РАН института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (ФИБХ), руководитель станции искусственного климата "Биотрон"
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт Цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук
Защита диссертации состоится “ 25 ” апреля 2012 года в 16-30 часов на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 при Российском государственном аграрном университете – МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д. 49;
тел./факс (499) 976-24-92.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.
Автореферат разослан « 23 » марта 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Л.С. Большакова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы Большинство сельскохозяйственных растений чувствительны к засолению и засухе, что вызывает существенные потери урожая вследствие действия этих факторов. По данным программы ООН «По защите окружающей среды» приблизительно 70% земель сельскохозяйственного назначения в мире подвержены засолению [Flowers and Yeo, 1995]. На территории Российской Федерации общая площадь засоленных земель составляет 38,4 млн. га т.е.
около 20% площадей сельхозугодий. Наибольшее распространение -засоленные почвы получили в Поволжье и Западной Сибири, где их площади составляют 11,6 и 10,2 млн. га, соответственно. В условиях солевого стресса растения, во первых, испытывают недостаток воды вследствие осмотического шока, и, во вторых, наблюдаются биохимические изменения в клетках вследствие повышенной аккумуляции ионов (например, Na+) в цитоплазме (токсический эффект).
Долгое время одним из основных направлений повышения устойчивости культурных растений к засолению являлось использование природных генетических механизмов, а именно отбор и дальнейшая селекция наиболее солеустойчивых видов растений. Так, например, известна стратегия отбора солеустойчивых растений путем повторной селекции у перекрестно-опыляемых видов [Dewey, 1962], для самоопыляемых видов предлагается использование линий с мужской стерильностью [Ramage, 1980];
селекция in vitro, широко распространенная в 1980-х годах, однако, не дала каких-либо значимых результатов [Yamaguchi et al., 2005]. Также были предприняты попытки межвидовой гибридизации некоторых важных сельскохозяйственных культур (томат, картофель, пшеница, голубиный горох и т.д.) с дикими солеустойчивыми видами [Yoshida, 2002]. Однако работы в данном направлении не позволили стабильно получать сорта культурных растений, обладающих повышенным уровнем солеустойчивости, которые нашли бы достаточно широкое применение в современном сельскохозяйственном производстве.
Для направленной модификации свойств растений наряду с традиционными методами селекции используются и методы генетической инженерии. В ряде работ было продемонстрировано повышение солеустойчивости растений за счет повышенной экспрессии ключевых ферментов биосинтеза осмолитов, ферментов, нейтрализующих активные формы кислорода. Другой подход основан на стимуляции выведения ионов натрия из цитоплазмы. Активный транспорт ионов определяется градиентом концентрации Н+, создаваемым протонными «насосами» и осуществляется за счет последующего обмена ионов, например, по механизму Na+/Н+ антипортера. Так было показано, что повышенная экспрессия различных протонных насосов, создающих электрохимический градиент на мембранах, увеличивает доступность протонов для Na+/H+-антипортера и усиливает процесс активного выведения токсичных ионов Na+ из цитоплазмы тем самым, повышая солеустойчивости растений [Sze et al., 1999;
Zhang et al., 2001;
Apse et al., 1999;
Gaxiola et al., 2001]. Так, суперпродукция гена AVP1, кодирующего вакуолярную пирофосфатазу Arabidopsis thaliana, приводила к повышению засухо- и солеустойчивости трансгенных растений арабидопсиса за счет повышенной аккумуляции ионов Na+ в вакуолях.
Однако следует отметить, что исследования, проводимые в этом направлении, предполагали экспрессию в трансгенном растении либо его собственного гена, либо гена с той же функцией из другого растения.
Альтернативой является использование для создания трансгенных растений, обладающих повышенной солеустойчивостью, функционально бактериальных мембранных Н+ аналогичных растительным ферментам пирофосфатаз, примером которой является пирофосфатаза из фотосинтезирующей бактерии Rhodospirillum rubrum.
Цель и задачи исследования Целью работы являлось изучение влияния экспрессии гена мембранной + Н -пирофосфатазы из бактерии Rhodospirillum rubrum на уровень солеустойчивости трансгенных растений табака.
Для этого в работе решались следующие задачи:
1. Конструирование бинарного вектора, обеспечивающего экспрессию гена мембранной H+-пирофосфотазы R. rubrum в растениях.
2. Получение и молекулярно-биологический анализ трансгенных растений Nicotiana tabacum, экспрессирующих ген H+-пирофосфотазы R. rubrum.
3. Исследование уровня солеустойчивости полученных трансгенных растении, экспрессирующих ген H+-пирофосфотазы R. rubrum.
4. Изучение влияния экспрессии гена H+-пирофосфотазы R. rubrum на морфофизиологические характеристики растений табака.
Научная новизна и практическая значимость работы Впервые предложен способ повышения солеустойчивости и улучшения некоторых хозяйственно-ценных признаков растений путем включения в геном H+-пирофосфатазы растения гена мембранной прокариотического происхождения.
Результатом работы стало получение трансгенных растений, экспрессирующих ген мембранной Н+-пирофосфатазы R. rubrum, которые обладают повышенной солеустойчивостью. При этом показано, что у полученных трансгенных растений наблюдаются и другие позитивные изменения хозяйственно-ценных признаков, а именно: ускорение роста растений, увеличение длины и массы корневой системы и массы листьев, а также повышение уровня хлорофилла в листьях и биологической продуктивности растений.
В отличие от описанных в других работах способов повышения солеустойчивости, основанных на экспрессии генов вакуолярных пирофосфатаз растений, предложенный нами способ позволяет не просто обратимо локализовать ионы натрия в вакуолях, но понизить общее содержания натрия в растении за счет его выведения из клетки наружу.
Предложенный способ может быть использован для получения солеустойчивых сортов культурных растений обладающих улучшенными хозяйственно-ценными признаками, такими как ускорение роста, увеличение длины и массы корневой системы и массы листьев, а также повышенной биологической продуктивностью и более высоким уровнем содержания хлорофилла в листьях. Такие культурные растения могут широко применяться в сельскохозяйственном производстве для выращивания на почвах, в настоящее время непригодных из-за засоления.
Апробация работы Полученные в диссертации результаты были представлены на следующих международных и российских конференциях: The Second International conference on integrated approaches to sustain and improve plant production under drought stress «InterDrought-II» (Италия, 2005), 9-ой и 11-ой Международных Пущинских школах – конференциях молодых ученых (Пущино, 2005, 2007), Четвертом съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Пущино, 2006), Четвертом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), IX международной конференции «Биология клеток in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008).
Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Публикации По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе статья в научном журнале, входящем в перечень ВАК, получен патент РФ на изобретение.
Структура и объем работы Диссертация включает: введение;
обзор литературы;
описание материалов и методов исследования;
результаты и их обсуждение;
выводы;
список литературы.
Работа изложена на 123 странице машинописного текста, содержит таблицы, 29 рисунков и 174 библиографических ссылок.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Конструирование бинарного вектора, обеспечивающего экспрессию гена Н+-пирофосфатазы Rhodospirillum rubrum Для получения рекомбинантного бинарного вектора, обеспечивающего экспрессию гена Н+-пирофосфатазы Rhodospirillum rubrum была использована плазмида pBIBar. На первом этапе работы ген BAR с nosT терминатором из плазмиды pBIBar был перенесен в вектор pUC19. Для этого плазмиды pUC19 и pBIBar расщепляли с помощью рестриктаз BamHI и EcoRI. После выделения необходимых фрагментов ДНК из агарозного геля, лигирования и трансформации штамма E. coli DH10B с отбором трансформантов по устойчивости к ампициллину получена плазмида pUC19-BAR-T (рисунок 1А).
В составе плазмиды pUC19 сконструирована кассета nosP-BAR-nosT. Для была проведена ПЦР – амплификации nosP промотора. Затем фрагмент ДНК, содержащий nosP (размером 361 п.н.) выделяли из агарозного геля, обрабатывали эндонуклеазами HindIII и BglII и лигировали с вектором pUC19 BAR-T, расщепленным ферментами HindIII и BamHI. Полученной лигированной смесью трансформировали штамм DH10B с отбором трансформантов по устойчивости к ампициллину. В результате была отобрана плазмида pUC-P-BAR-T, содержащая кассету экспрессии nosP-BAR-nosT (рисунок 1Б).
A Б Рисунок 1. (А) Схема переноса гена bar из плазмиды pBIBar в pUC19;
(Б) ПЦР амплификация Рnos промотера и создание в pUC19 кассеты nosP-bar-nos.
Кассета nosP-BAR-nosT была клонирована в составе вектора pBIBar. Для этого плазмиду pUC-P-BAR-T обрабатывали эндонуклеазами PmeI и NdeI.
После выделения из агарозного геля, необходимый фрагмент ДНК лигировали с плазмидой pBIBar, обработанной PmeI и VspI. Полученным продуктом трансформировали штамм E.coli DH10B, с отбором трансформантов по устойчивости к канамицину. В результате рестрикционного анализа плазмидной ДНК, выделенной из клонов трансформантов, была отобрана плазмида pNR (рисунок 2А).
На заключительном этапе клонировали ген H+-пирофосфатазы R.rubrum (RPP) из плазмиды pET22RPP (предоставлена проф. А.А. Байковым, НИИФХБ МГУ) в полученный вектор pNR. ДНК плазмиды pET-RPP обрабатывали с помощью эндонуклеазы XhoI и застраивали липкие концы с помощью фрагмента Кленова. Полученный препарат обрабатывали рестриктазой XbaI.
Фрагмент ДНК, содержащий ген RPP выделяли из агарозного геля и лигировали с вектором pBI-NR, обработанным Ecl136II и XbaI. Полученной лигазной смесью трансформировали штамм E.coli DH10B с отбором трансформантов по устойчивости к ампициллину. В результате рестрикционного анализа плазмидной ДНК трансформантов отобрана плазмида pNR-RPP, содержащая ген Н+-пирофосфатазы R. rubrum. (рисунок 2Б).
Корректность процедуры клонирования пирофосфатазы R. rubrum в составе вектора pBI-NR подтверждена с помощью секвенирования вставки.
Б А Рисунок 2. (А) Схема замены кассеты nosP-nptII-nosT на nosP-bar-nosT в векторе pBIBar;
(Б) Схема клонирования гена H+-пирофосфатазы R.rubrum из плазмиды pET22RPP в полученный вектор pNR.
В результате был получен бинарный вектор pNRRPP (рисунок 3), обеспечивающий экспрессию гена Н+-пирофосфатазы R. rubrum под контролем 35S-промотора и Tnos-терминатора, а также содержащий ген BAR (устойчивость к гербицидам на основе L-фосфинотрицина) в качестве селективного маркера для отбора трансформированных растений. Полученный вектор перенесли в штамм Agrobacterium tumefaciens GV 3101.
Рисунок 3. Схематическое изображение вектора pNRRPP Получение и молекулярно-биологический анализ трансгенных растений табака, экспрессирующих ген мембранной Н+-пирофосфатазы R. rubrum Для трансформации растений табака Nicotiana tabacum cv. Samsun NN.
использовали штамм Agrobacterium tumefaciens GV3101, содержащий бинарный вектор pNRRPP. В ходе экспериментов по агробактериальной трансформации растений табака было получено 120 первичных трансформантов, прошедших отбор на среде, содержавшей селективный агент фосфинотрицин (5 мг/л).
ПЦР-анализ полученных трансформантов Для подтверждения трансгенной природы отобранных первичных трансформантов был проведен ПЦР-анализ их генома на наличие фрагмента гена BAR. Данные электрофоретического анализа продуктов ПЦР амплификации отобранных на среде с фосфинотрицином трансформантов показали наличие фрагмента гена BAR размером 350 п.о. у 32 из первичных трансформантов (рисунок 4). По результатам ПЦР анализа данные растения отобрали для дальнейшей работы.
м -к 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 + к Рисунок 4. Результаты электрофоретического анализа продуктов ПЦР-амплификации на наличие участка гена BAR. (м) - маркер;
(-к) – ПЦР на ДНК исходного сорта;
(+к) – ПЦР на плазмидной ДНК;
(0) – проба без матрицы (контроль реакционной смеси);
(1) – линия табака, не содержащая в геноме фрагмента гена BAR;
(2 – 12) - линии табака, содержащие в геноме фрагмент гена BAR размером 350 п.о.
Проведен дальнейший ПЦР-анализ генома отобранных 32 растений на наличие частей гена RPP с использованием подобранных двух пар праймеров.
Одна из которых (Sb1 и RPP11) позволила амплифицировать участок т-ДНК, содержавший часть 35S-промотора и 5’-участок гена RPP длиной около 300 п.о.
(рисунок 5А).
А м -к 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 +к Б м -к 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 +к Рисунок 5. Результаты электрофоретического анализа продуктов ПЦР-амплификации на наличие гена RPP. А – использованы праймеры SB1 и RPP11, Б – использованы праймеры NOSR, RPP12. (м) - маркер;
(-к) – ПЦР на ДНК исходного сорта;
(+к) – ПЦР на плазмидной ДНК;
(0) – проба без матрицы (контроль реакционной смеси);
(1) – линия табака, не содержащая в геноме фрагмента гена RPP;
(2 – 12) - линии табака, содержащие в геноме ген RPP Вторая пара праймеров (NOSR и RPP12) позволила амплифицировать фрагмент, содержавший 3’-участок гена RPP и часть терминатора Tnos, длиной около 490 п.о. (рисунок 5Б). Оба продукта амплификации получены для 25 из 32 трансформантов, отобранных после ПЦР-анализа на наличие гена Bar, что свидетельствовало о присутствии гена RPP в их геномах. Данные трансформанты были отобраны для определения уровня экспрессии гена Н+ пирофосфатазы R. rubrum.
Вестерн-блот анализ полученных трансгенных растений В результате проведенного Вестерн-блот анализа 3 трансформанта из 25, отобранных нами по результатам ПЦР-анализа, не экспрессировали ген RPP, у оставшихся было выявлено значительное различие в уровне экспрессии гена.
На рисунке 6 в качестве примера приведены результаты Вестерн-блот анализа четырех отобранных для дальнейшей работы линии табака с различным уровнем экспрессии гена RPP. Так, среди проанализированных образцов линия 08 (дорожка 2) обладает наибольшей экспрессией гена RPP, тогда как линия (дорожка 5) имеет самый низкий уровень экспрессии гена. Линии 12 (дорожка 3) и 04 (дорожка 4) обладают, примерно одинаковым, средним, уровнем экспрессии, по сравнению с линиями 08 и 06. Линия 03 (дорожка 1) не экспрессирует RPP.
К 1 2 3 4 Рисунок 6. Вестерн–блот анализ контрольных и трансгенных растений табака: (к) – контpольное растение табака (исходный сорт);
(1) - трансгенное растение табака, не экспрессирующее ген RPP - линия 03;
(2 – 5) – трансгенные растения табака, экспрессирующие ген RPP линии - 08, 12, 04, 06 соответственно.
Адаптация растений к условиям in vivo и получение семенного материала Трансгенные растения табака (линии 08, 12, 04, 06) были размножены в культуре in vitro, адаптированы к почвенным условиям с помощью гидропонной установки «Минивит-2» и высажены в теплицу. Растения культивировали в условиях in vivo и использовали для получения семенного материала (Т1), оценки солеустойчивости и различных морфо-физиологических параметров.
Определение всхожести семян контрольных и трансгенных растений, экспрессирующих ген Н+-пирофосфатазы R rubrum на средах с различным содержанием хлорида натрия Для изучения влияния экспрессии целевого гена RPP на уровень солеустойчивости полученных трансгенных растений семена контрольного растения и трансгенных линий 06, 12, 04, 08 (поколение Т1) проращивали на питательной среде с различным содержанием NaCl в диапазоне от 0 до 250 мM (шаг 25мМ). Опыт проводили в трех повторностях, каждая из которых представляла собой три чашки Петри по 25 семян каждая. Полученные в результате эксперимента данные отображены в таблице 1, в таблице представлена их статистическая обработка.
Так при прорастании семян на средах с содержанием NaCl от 0 до 75мМ существенных различий во всхожести не наблюдалось (рисунок 7А). По мере увеличения концентрации NaCl в среде всхожесть семенного материала снижалась во всех случаях. Так, на среде с содержанием NaCl 100мM всхожесть семян в контроле составила 38,9%, тогда как в опытных вариантах варьировала от 86,1% до 92,2%. Значительное снижение всхожести семенного материала контрольных растений табака наблюдалось на среде с содержанием 125 мМ NaCl, при этом значительная часть проростков имела плохо развитые семядольные листья и в дальнейшем показывала значительное отставание в росте и развитии по сравнению с трансгенной линией (рисунок 7Б).
А – 25мМ NaCl Б – 125мМ NaCl Рисунок 7. Всхожесть семенного материала контрольной (левая чашка) и трансгенной (правая чашка) линии-04 табака на MS-среде с содержанием NaCl При концентрации NaCl 150 мM, всхожесть семян контрольных растений составляла лишь 3,7%, в то время как у трансгенных семян она составляла более 50%. Дальнейшее повышение концентрации соли (до 250 мM) в среде приводило к снижению всхожести и энергии прорастания трансгенных семян, при этом всхожесть контрольных растений была практически нулевой.
Таблица 1. Всхожесть семенного материала (%) контрольной и четырех трансгенных линий табака на среде, содержащей различные концентрации хлорида натрия NaCl, мM Контроль Линия 06 Линия 04 Линия 12 Линия 0 100 100 100 100 25 97,91 99,57 100 99,57 99, 50 86,68 99,13 99,57 99,57 99, 75 74,94 96,03 97,13 98,67 99, 100 38,89 86,1 90,9 92,23 92, 125 15,88 63,8 65,8 68,23 87, 150 3,65 58,9 61,57 63,33 68, 175 0,6 11,77 13,77 16,43 200 0 0,87 8,9 11,77 13, 250 0 0 1,53 2,83 2, Таблица 2. Результаты статистической обработки данных опыта по определению всхожести семенного материала контрольных и трансгенных растений табака NaCl (мМ) 25 50 75 100 125 150 175 200 5,09 6,23 2,41 2,92 2,45 2,00 3,11 3,41 0, НСР d (Л04-К) 8,20 19,20 20,33 33,83 30,77 40,63 18,10 17,33 7, d (Л06-К) 6,00 17,00 18,60 29,57 29,53 39,07 16,37 4,40 0, d (Л12-К) 6,00 19,20 23,53 35,20 32,27 41,67 20,20 20,07 9, d (Л08-К) 6,60 19,20 24,63 35,20 45,80 44,70 35,53 21,80 8, d (Л04-Л08) 1,60 0,00 -4,30 -1,37 -15,03 -4,07 -17,43 -4,47 -1, d (Л06-Л08) -0,60 -2,20 -6,03 -5,63 -16,27 -5,63 -19,17 -17,40 -8, d (Л12-Л08) -0,60 0 -1,10 0,00 -13,53 -3,03 -15,33 -1,73 0, d (Л04-Л12) 2,20 0 -3,20 -1,37 -1,50 -1,03 -2,10 -2,73 -2, d (Л06-Л12) 0,00 -2,2 -4,93 -5,63 -2,73 -2,60 -3,83 -15,67 -9, d (Л04-Л06) 2,20 2,2 1,73 4,27 1,23 1,57 1,73 12,93 7, Статистический анализ полученных данных (таблица 2) подтвердил существенные различия во всхожести семенного материала контрольной и трансгенных линий табака, а также то, что процент всхожести семян трансгенных растений на средах с добавлением NaCl находился в прямой зависимости от относительного уровня экспрессии гена RPP, определенного Вестерн-блот анализом. Так наибольший процент всхожести наблюдался для семян линии-08, имевшей наивысший уровень экспрессии RPP, а наименьший процент для линии-06 c самым низким уровнем экспрессии RPP.
Несмотря на то, что данный эксперимент проводили с семенным материалом трансгенных линий поколения Т1, полученные результаты можно считать объективными, так как выборка была достаточной: эксперимент проводили в трех повторностях, каждая из которых составляла по 150 семян контрольных и 150 семян трансгенных растений. Так как популяция семенного материала смешанная, и если исключить из выборки нетрансгенную гомозиготу, которая при классическом расщеплении составляет, то полученная разница во всхожести контрольных и трансгенных линий станет еще более заметной.
Определение влияния различных концентраций NaCl на рост и развитие контрольных и трансгенных растений в условиях in vitro Для оценки влияния различных концентраций хлорида натрия на рост и развитие растений проводили сравнение ряда морфо-физиологических параметров контрольных растений и трансгенной линии-04 (поколение Т1).
Трансгенные растения поколение Т1 линия-04 получены при проращивании семенного материала линии-04 на среде с селективным агентом – фосфинотрицином (5 мг/л). Наличие гена RPP в геноме этих растений подтверждено с помощью ПЦР-анализа.
Проведенный эксперимент показал, что различия по морфологическим признакам между контрольными и трансгенными растениями практически не проявлялись на концентрациях от 25 мМ до 100 мM NaCl. Значительное различие в росте, в развитии корневой системы и интенсивности окраски листьев между контрольными и трансгенными растениями наблюдалось на среде с содержанием NaCl от 125мM и выше (рисунок 8). У ряда трансгенных растений проявились слабые признаки некротического поражения тканей листа.
При концентрации NaCl 175мМ у контрольных растений табака было отмечено более сильное ингибирование роста как наземной части растения, так и корневой системы. Листья имели бледно-зеленую, в отдельных случаях желтую окраску, корневая система приобретала темную окраску, частично ослизнялась.
Признаки токсичного действия хлорида натрия у трансгенных растений были менее заметны и выражались в незначительном отставании в росте и развитии надземной части.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 125мМ NaCl 250мМ NaCl Рисунок 8. Влияние NaCl на рост и развитие контрольных (1-3) и трансгенных (4-10) растений табака При дальнейшем повышении концентрации NaCl в среде признаки токсичного воздействия соли были более выражены как у трансгенных, так и у контрольных растений. Концентрация хлорида натрия 250мM в среде привела к полной гибели контрольных растений, у трансгенных растений наблюдалось значительное подавление развития, как надземной части, так и корневой системы (рисунок 9). Побеги трансгенных растений укорачивались и быстро прекращали рост, листья приобретали светло-зеленую окраску, однако изменение окраски (потемнение) корневой системы не наблюдалось. В таблице 3 приведены результаты эксперимента и их статистический анализ.
Таблица 3. Влияние засоления на рост растений табака в условиях in vitro Высота растений, см NaCl, мM НСР05 d контрольные трансгенные (линия-04) 0 14,03 14,03 0,02 0, 25 13,73 13,77 0,04 0, 50 13,20 13,23 0,06 0, 75 12,10 12,13 0,06 0, 100 11,10 11,13 0,06 0, 125 5,90 10,73 0,03 4, 150 4,07 8,40 0,05 4, 175 3,33 6,50 0,05 3, 200 1,47 4,27 0,07 2, 250 гибель растений 2,10 - Полученные результаты свидетельствуют о том, что трансгенные растения табака, экспрессирующие ген Н+-пирофосфатазы R. rubrum могут расти на средах с более высоким содержанием хлорида натрия по сравнению с контрольными растениями.
Определения уровня накопления натрия и калия в тканях контрольных и трансгенных растений табака, экспрессирующих ген Н+-пирофосфатазы R.
rubrum Содержание натрия и калия в растительных тканях определяли с помощью плазменного фотометра. Для анализа использовали образцы тканей листьев контрольных и трансгенных растений, выращенных на питательной среде с различной концентрацией хлорида натрия (cм. предыдущий эксперимент).
Анализ образцов показал (рисунок 9А), что уровень накопления Na+ в листьях трансгенных растений существенно не отличался от уровня накопления Na+ в контрольных растениях, выращенных на средах с содержанием NaCl от 0мM до 125мM. При концентрации 200мM NaCl, когда наблюдалось практически полное угнетение роста контрольных растений, концентрация натрия в листьях контрольных растений возрастает в 1,6 раза по сравнению с трансгенными растениями. На среде с NaCl 250мМ содержание натрия в листьях трансгенных растений составило 2,9045 мг/г сухого вещества, тогда как контрольные растения полностью погибали на данной среде.
В растительной клетке из-за повышенного содержания ионов натрия в среде поступление ионов калия часто бывает затруднено, поэтому нами проведен анализ уровня накопления ионов калия в клетках растений.
На основании анализа и статистической обработки полученных результатов (рисунок 9Б) не было выявлено существенных различий в уровне накопления калия у контрольных и трансгенных растений табака, выращенных на среде с содержанием NaCl от 0мM до 100мM. Существенные различия проявлялись при содержании в среде 100мM NaCl, при этом уровень накопления калия в листьях контрольных растений в 1,25 раз ниже по сравнению с трансгенными, а при 200мM NaCl - 1,4 раза.
А Б + + Рисунок 9. Уровень накопления (А) - Na ;
(Б) - К в листьях контрольной и трансгенной линии 04 табака.
Сравнивая результаты эксперимента можно отметить, что динамика снижения уровня накопления калия в листьях контрольных и трансгенных растений соответствует динамике повышения содержания натрия в листьях этих растений.
Полученные нами результаты позволяют сделать заключение, что в трансгенных растениях табака, экспрессирующих ген H+-пирофосфатазы (RPP) более интенсивно идет процесс выведения ионов Na+ из цитоплазмы клетки во внешнюю среду, что снижает токсическое воздействие этих ионов и увеличивает сопротивляемость растений высоким концентрациям соли.
В растительной клетке мембранная Н+- пирофосфатаза Rhodospirillum rubrum может быть локализована на вакуолярной или на цитоплазматической мембране (рисунок 10).
Рисунок 10. Возможная локализация Н+-пирофосфатазы R. rubrum в растительной клетке.
В случае локализации Н+-пирофосфатазы на цитоплазматической мембране растительной клетки ионы Na+ должны более интенсивно выводиться из цитоплазмы в межклеточное пространство, вследствие чего можно ожидать более низкий уровень накопления натрия в трансгенных растениях по сравнению с контрольными. Такой эффект наблюдался и у полученных нами трансгенных растений, что может свидетельствовать в пользу предположения о возможной локализации Н+-пирофосфатазы на цитоплазматической мембране растительной клетки.
Изучение влияния экспрессии гена мембранной Н+-пирофосфатазы R.
rubrum на рост и развитие растений в грунте Для изучения влияния экспрессии гена RPP на рост и развитие растений табака проводили сравнение 10 контрольных и 10 трансгенных (линия 04, поколение Т1) растений табака выращенных в теплице. Как видно из таблицы 4, в которой приведены результаты проведенного эксперимента и их статистическая обработка, трансгенные растения превышают контрольные того же возраста по длине корневой системы в 2 раза, по массе корневой системы в 2,9 раза, по массе листьев в 2 раза. Количество листьев у трансгенных растений в 1,3 раза больше, чем у контрольных, расстояние между междоузлиями у трансгенных растений уменьшается ближе к соцветию по сравнению с контрольными;
начало фазы цветения у трансгенных растений наступает на 7- дней раньше, чем у контрольных.
Таблица 4. Сравнение развития листьев, корневой системы и биологической продуктивности контрольных (К) и трансгенных (Т) растений табака Среднее значение по Признак Растение эксперименту К 74,80±15, L - длина корня, мм Т 150,20±17, К 11,20±4, Мк - масса корня, мг Т 32,60±12, К 203,30±60, Мл - масса листьев, мг Т 409,30±104, К 0,056±0, Мк/Мл Т 0,077±0, К 39± Кол-во семенных коробочек, шт Т 76± К 1640± Кол-во семян в 1-й коробочке, шт Т 2140± К 81400± Кол-во семян с растения, шт Т 125000± К 6,79±1, Масса семян, г Т 4,36±0, Результаты оценки биологической продуктивности растений табака (таблица 4) показали, что среднее количество семенных коробочек собранных с трансгенных растений 1,9 раз больше, чем собранных с контрольных растений, а среднее количество и масса семенного материла трансгенных растений больше в 1,5 раза, чем у контрольных растений.
Содержание хлорофилла в контрольных и трансгенных растениях В результате наблюдения за контрольными и трансгенными (линия 04, поколение Т1) растениями, выращиваемыми в грунте, было замечено, что трансгенные растения имели более интенсивное зеленое окрашивание листьев по сравнению с контрольными растениями табака. Измерение уровня суммарного хлорофилла (таблица 5) показало, что его содержание в листьях трансгенных растений в среднем составляет 2,08 мг/г – это в 1,8 раза выше, чем в листьях контрольных растений, содержащих в среднем 1,18 мг/г.
Таблица 5. Содержание хлорофилла в листьях контрольных и трансгенных растений табака Контрольные растения Трансгенные растения Содержание хлорофилла, 1,18±0,41 2,08±0, мг/г (среднее значение) Результаты экспериментов по изучению влияния экспрессии гена Н+ пирофосфатазы на рост и развитие растений табака показали, что при одинаковых благоприятных условиях выращивания и при отсутствии воздействия стрессовых факторов, трансгенные растения опережают контрольные в росте, развитии побегов и корневой системы, также больше и количество собранного с трансгенных растений семенного материала.
Анализ литературных данных и полученные нами результаты позволяют предположить следующий механизм влияния экспрессии гена Н+ пирофосфатазы R.rubrum. на роста и развитие растений табака. Основываясь на высказанном нами предположении о локализации Н+-ПФазы на цитоплазматической мембране растительной клетке, более интенсивно будет идти процесс активного выведения Н+ в межклеточное пространство за счет работы Н+-помпы, понижается рН апопласта, (увеличивая количество протонированной ИУК) и усиливается транспорт фитогормона через растительную клетку (рисунок 11).
Рисунок 11. Модель возможного влияния экспрессии гена RPP H+-ПФазы R. rubrum на транспорт ИУК в клетках N. tabacum Можно также предположить, что наблюдаемые в нашей работе явления, такие как ускорение роста, увеличение количества и массы листьев, ускоренное созревание семян, повышение уровня хлорофилла связанны и с аттрагирующим эффектом самого ауксина, т.е. клетки меристемы «привлекают» к себе питательные вещества. Данный механизм не установлен, но наиболее вероятным считается, что способность клетки к поглощению зависит от µН+ на мембране. Сахароза проникает в клетку в симпорте с Н+ и чем больше µН+, тем выше поглотительная способность. Кроме сахарозы, клетки апикальной меристемы аттрагируют аминокислоты, нуклеотиды, неорганические ионы, воду и др. Вывод токсичных ионов, таких как Na+ из цитоплазмы в межклеточное пространство в рамках этой модели может осуществляться за счет действия Na+/H+-антипортера.
ВЫВОДЫ 1. Получены трансгенные растения табака, экспрессирующие ген мембранной H+-пирофосфатазы из бактерии Rhodospirillum rubrum.
2. Всхожесть семян трансгенных растений выше всхожести семян контрольных растений табака при проращивании на среде, содержащей NaCl в концентрациях от 125мМ до 250мМ, причем всхожесть положительно коррелирует с уровнем экспрессии гена Н+-пирофосфатазы.
3. Экспрессия гена Н+- пирофосфатазы R. rubrum повышает уровень солеустойчивости растений табака. Трансгенные растения табака обгоняют в росте контрольные растения при выращивании in vitro на среде с содержанием NaCl от 125мM и выше. Трансгенные растения могут расти на среде с содержанием 250мМ NaCl, тогда как у контрольных растений наблюдается полное угнетение роста.
4. Экспрессия гена Н+- пирофосфатазы R. rubrum ускоряет рост растений табака при выращивании в грунте в отсутствие засоления. Трансгенные растения, экспрессирующие ген Н+-пирофосфатазы R. rubrum, превышают контрольные по длине корневой системы в 2 раза, по массе корневой системы в 2,9 раза и по массе листьев в 2 раза. Количество и масса семенного материала, собранная с трансгенных растений, в 1,5 раз превышает количество и массу семенного материала, собранного с контрольных растений табака. Уровень хлорофилла в листьях трансгенных растений табака в 1,77 раза выше, чем в листьях контрольных растений.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Дьякова Е.В., Ракитин А.Л., Камионская А.М., Байков А.А., Lahti R., Равин Н.В., Скрябин К.Г. Изучение влияния экспрессии гена мембранной H+ пирофосфатазы Rhodospirillum rubrum на уровень солеустойчивости трансгенных растений табака // Доклады Академии Наук. – 2006 - Т. 409 - № 6 C.844-846.
2. Дьякова Е.В., Ракиин А.Л., Байков А.А., Камионская А.М., Равин Н.В., Скрябин К.Г. Использование гена мембранной Н+-пирофосфатазы бактерии Rhodospirillum rubrum для изменения свойств растений // Патент РФ на изобретение №2378379 от 10.01.2010г.
3. Дьякова Е.В., Ракитин А.Л., Стародубцева А.М., Равин Н.В., Скрябин К.Г. Получение трансгенных растений табака, экспрессирующих ген Н+ пирофосфатазы Rhodospirillum rubrum // Второй Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 2003.
Сборник тезисов - Т.1. С.193.
4. Ракитин А.Л, Дьякова Е.В., Стародубцева А.М., Равин Н.В., Скрябин К.Г. Повышение засухо- и солеустойчивости картофеля за счет экспрессии гена Н+-пирофосфатазы Rhodospirillum rubrum // Конференция «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития». Москва, 2004. Сборник тезисов - Т.1. С.479.
5. Дьякова Е.В., Ракитин А.Л., Камионская А.М., Равин Н.В., Скрябин К.Г.
Изучение влияния экспрессии гена Н+-пирофосфатазы Rhodospirillum rubrum на уровень солеустойчивости трансгенных растений табака // 9 Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития».
Москва, 2005. Сборник тезисов - Т.1. С.245.
6. Дьякова Е.В., Ракитин А.Л., Камионская А.М., Равин Н.В., Скрябин К.Г.
Получение трансгенных солеустойчивых растений за счет введения и экспрессии в них гена Н+-пирофосфатазы Rhodospirillum rubrum // 9-ая Международная Пущинская школа – конференция молодых ученых. Пущино, 2005. Сборник тезисов - С.345.
7. Rakitin A.L., Dyakova E.V., Kamionskaya A.M., Ravin N.V., Skryabin K.G.
Drought and salt- tolerant plants result from expression of H+-pyrophosphatase gene from Rhodospirillum rubrum // The 2nd International сonference on integrated approaches to sustain and improve plant production under drought stress «InterDrought-II». Italy, Rome, 2005. Р. 8.38.
8. Зорина А.В., Дьякова Е.В. Определение всхожести трансгенных линий табака, экспрессирующих ген Н+-пирофосфатазы R. rubrum на различных концентрациях хлорида натрия // Международная школа – конференция молодых ученых «Системная биология и биоинженерия». Москва, 2005.
Сборник тезисов - С.178.
9. Rakitin A.L., Dyakova E.V., Kamionskaya A.M., Ravin N.V., Skryabin K.G.
Expression of H+-pyrophosphatase from Rhodospirillum rubrum increases the salt tolerance of Nicotiana tabacum plants // The First international conference on the theory and practices in biological water saving. Beijing, China, 2006. P.38.
10. Дьякова Е.В., Ракитин А.Л., Камионская А.М., Равин Н.В. Экспрессия гена мембранной пирофосфатазы бактерии Rhodospirillum rubrum повышает уровень солеустойчивости и ускоряет рост растений // IV Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития».
Москва, 2007. Сборник тезисов - Ч.1. С.232.
11. Дьякова Е.В., Ракитин А.Л., Камионская А.М., Равин Н.В., Скрябин К.Г.
Повышение устойчивости растений к засолению путем направленной регуляции процессов внутриклеточного транспорта ионов натрия // Материалы Всероссийской научной конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды», Иркутск, 2007. Сборник тезисов С.78-81.
12. Дьякова Е.В., Ракитин А.Л. Влияние экспрессии гена мембранной Н+ пирофосфатазы Rhodospirillum rubrum на устойчивость растений к солевому стрессу и их биологическую продуктивность // IX Международная конференция «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». Звенигород, 2008. Сборник тезисов - С.116.
БЛАГОДАРНОСТЬ Автор выражает благодарность д.х.н., проф. А.А. Байкову за любезно предоставленный для исследовательской работы ген H+-пирофосфатазы Rhodospirillum rubrum и помощь в проведении настоящей работы.
Автор выражает глубокую благодарность и признательность академику РАН К.Г. Скрябину и своим научным руководителям к.б.н. А.М. Камионской и д.б.н. Н.В. Равину за предоставленную возможность и помощь в проведении интересной научно-исследовательской работы, моему постоянному соавтору к.
б.н. А.Л. Ракитину за обучение методам молекулярой биологии и совместную творческую работу, а также всему коллективу лаборатории генетической инженерии Центра «Биоинженерия» РАН за поддержку и доброжелательное отношение.