Роль y хромосомы и митохондриального генома в нарушении сперматогенеза
На правах рукописи
ИСЛАМОВА АЙСЫЛУ АЙРАТОВНА РОЛЬ Y ХРОМОСОМЫ И МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА В НАРУШЕНИИ СПЕРМАТОГЕНЕЗА 03.00.15 – генетика
АВТОРЕФЕРАТ
на соискание ученой степени кандидата биологических наук
УФА – 2007
Работа выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Хуснутдинова Эльза Камилевна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Курило Любовь Федоровна доктор медицинских наук, профессор Викторова Татьяна Викторовна
Ведущая организация: Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова Российской академии наук, г. Москва.
Защита диссертации состоится 31 мая 2007 г. в 1200 часов на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.133.01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г.
Уфа, просп. Октября, 71.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН
Автореферат разослан 27 апреля 2007 г.
Ученый секретарь Регионального диссертационного совета, к.б.н. Бикбулатова С.М.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Бесплодием страдает около 15% супружеских пар, при этом, в 45-50% случаев оно связано с «мужским фактором». Приблизительно у 5% мужчин репродуктивного возраста имеются различные отклонения количественных или качественных показателей спермы. Около 1/3 случаев мужского бесплодия относят к так называемому идиопатическому бесплодию, большинство случаев которого может быть обусловлено генетическими факторами, такими как различные нарушения хромосом или мутации в ответственных за сперматогенез генах [Tiepolo L.et al., 1976;
Krausz C., et al. 2001].
Тотальное ухудшение качества спермы отразилось в изменении эталонных норм показателей сперматогенеза. Если в 1921 году нормальной считалась концентрация 100 млн. сперматозоидов/мл, пограничной млн./мл, то через 30 лет эта цифра достигла 40 млн./мл, а, согласно Руководству ВОЗ, в 1992 году нижней границей нормальной концентрации сперматозоидов стали считать 20 млн./мл [World Health Organization, 1992].
Поэтому особое значение приобретает выявление факторов мужского бесплодия, диагностика и лечение, особенно, у молодых людей. Причиной генетически обусловленного мужского бесплодия, связанного с нарушением сперматогенеза, в 10-15% случаев являются структурные нарушения Y хромосомы [Chandley A.C. et al., 1994;
Vogt H. et al., 1996]. Роль Y хромосомы в репродуктивной медицине неоспорима, так как на ней расположен основной детерминирующий пол человека ген SRY (sex determining region Y) и множество генов, экспрессирующихся при сперматогенезе. Помимо хромосомных аномалий наиболее частой генетической причиной нарушения репродуктивной функции у мужчин являются делеции AZF (Azoospermia Factor - фактор азооспермии) региона длинного плеча мужской половой хромосомы [Vogt et al., 1996]. AZF – микроделеции являются причиной нарушения сперматогенеза в 10-15% случаев при азооспермии и в 5-10% при олигозооспермии тяжелой степени.
В последние десятилетия стали придавать большое значение роли мутаций митохондриального генома в развитии заболеваний человека, в том числе и в нарушении сперматогенеза.
Хотя есть и значительные достижения в области исследования генетических причин нарушения сперматогенеза, остается много невыясненных вопросов, касающихся гено-фенотипических корреляций, а также неясно, существуют ли популяционные различия в частоте и распространенности мутаций Y хромосомы и митохондриальной ДНК у мужчин с бесплодием различной этнической и географической принадлежности.
В последние годы, в связи с развитием и внедрением в медицину современных молекулярно-генетических и цитогенетических методов, удалось установить генетическую природу ряда форм мужского бесплодия.
Продолжение исследований генетических причин нарушения сперматогенеза позволят расширить возможности в понимании этиопатогенеза данного заболевания, а также будут способствовать проведению более глубокого генетического обследования. Выявление причин бесплодия необходимо для определения прогноза и выбора наиболее эффективного метода лечения.
Целью исследования являлось изучение AZF региона Y хромосомы, анализ гаплогрупп митохондриальной ДНК и Y хромосомы у больных с нарушением сперматогенеза.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:
1. Определить спектр и частоты микроделеций AZF региона Y хромосомы у больных с нарушением сперматогенеза и в контрольной группе фертильных мужчин.
2. Провести анализ гено-фенотипических корреляций у больных с разной степенью тяжести нарушения сперматогенеза.
3. Исследовать gr/gr и b2/b3 частичные делеции AZFc субрегиона у больных с нарушением сперматогенеза и в группе контроля.
4. Провести анализ распределения частот гаплогрупп Y хромосомы у больных с нарушением сперматогенеза и в контрольной группе.
5. Провести анализ распределения частот гаплогрупп мтДНК у больных с нарушением сперматогенеза и в контрольной группе.
Научная новизна. Впервые проведен анализ спектра и частот микроделеций AZF региона Y хромосомы у больных с нарушением сперматогенеза татарской, русской и башкирской этнической принадлежности. Впервые выявлена ассоциация частичной gr/gr делеции AZFc субрегиона с кластером N Y хромосомы у мужчин русской, татарской и башкирской этнической принадлежности. Впервые выявлено, что гаплогруппа R1b3 Y хромосомы является маркером пониженного риска нарушения сперматогенеза у мужчин башкирской этнической принадлежности. Впервые выявлена ассоциация гаплогруппы С мтДНК с нарушением сперматогенеза у башкир. Впервые обнаружено, что гаплогруппа Т мтДНК у лиц башкирской этнической принадлежности и гаплогруппа V мтДНК у мужчин татарской этнической группы являются факторами пониженного риска нарушения сперматогенеза.
Научно-практическая значимость. Полученные данные позволяют расширить представление о молекулярно-генетических механизмах развития нарушения сперматогенеза. Исследование микроделеций AZF региона Y хромосомы может быть использовано в практике урологов и андрологов для выявления генетически обусловленного бесплодия. Анализ гаплогрупп Y хромосомы и мтДНК может применяться для определения лиц с повышенным или пониженным риском развития нарушения сперматогенеза и проведения досимптоматической профилактики заболевания. Результаты исследования могут быть использованы при чтении курсов медицинской генетики на биологических факультетах университетов, в медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников.
Положения, выносимые на защиту:
1. Частота и спектр микроделеций AZF региона Y хромосомы у больных с нарушением сперматогенеза.
2. Частота и спектр микроделеций AZF региона Y хромосомы у больных с олигозооспермией тяжелой степени, с азооспермией и у больных с другими формами патозооспермии.
3. Ассоциация gr/gr делеции AZFc субрегиона с N гаплогруппой Y хромосомы у мужчин татарской, русской и башкирской этнической принадлежности 4. Пониженный риск нарушения сперматогенеза у башкир - носителей гаплогруппы R1b3Y хромосомы.
5. Ассоциация гаплогруппы С митохондриальной ДНК с нарушением сперматогенеза у башкир.
6. Пониженный риск нарушения сперматогенеза у лиц башкирской этнической принадлежности с гаплогруппой Т мтДНК и у мужчин татарской этнической группы с гаплогруппа V мтДНК.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на 10-й Пущинской Школе - Конференции молодых ученых, посвященной 50 летию Пущинского научного центра РАН «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006), Девятой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт Петербург, 2006), на Ежегодных конференциях Европейского общества генетиков человека (Амстердам, 2006;
Ницца, 2007), на 31-ом Конгрессе Федерального Европейского общества биохимиков «FEBS» (Стамбул, 2006), Школе молодых ученых им. Вавилова «Актуальные проблемы современной генетики» (Москва, 2006), XVI международной конференции РАРЧ.
"Вспомогательные репродуктивные технологии сегодня и завтра. 20 лет ЭКО в России" (Ростов-на-Дону, 2006), Международном конгрессе андрологов (Сочи, Дагомыс, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 176 страницах машинописного текста, содержит 32 таблицы и 47 рисунков. Список литературы включает источников.
Материал исследования. В качестве материала для молекулярно генетического анализа были использованы образцы ДНК, полученные от неродственных больных с нарушением сперматогенеза из разных регионов России (Республики Башкортостан, Чеченской республики, Северной Осетии – Алании) и Казахстана. Подавляющую часть созданного банка ДНК (62%) составляет ДНК пациентов, обратившихся в Центр планирования семьи и репродукции с медико-генетическим консультированием при Республиканском перинатальном центре (г. Уфа), с диагнозом первичное бесплодие. Критерием отбора больных явились показатели спермиологического анализа, учитывающие количество, морфологию и подвижность сперматозоидов. Спермиологический анализ эякулята был выполнен по стандартной методике, рекомендованной ВОЗ (WHO, 1992;
1999). Контрольная группа состояла из 304 здоровых (фертильных) мужчин, имеющих потомство. В ее состав вошли 102 человека татарской этнической принадлежности, 101 - русской этнической группы, 101 - башкирской этнической принадлежности.
Методы исследования. Выделение ДНК проводили методом последовательной фенольно-хлороформной экстракции из цельной венозной крови (Mathew, 1984). Для обнаружения микроделеций применяли мультиплексную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) согласно руководству, предложенному Simoni и соавт. [Simoni et al., 1999]. В работе были использованы 9 пар праймеров, позволявших исследовать следующие Y-специфичных маркеров для AZF-локуса (по Simoni соавт. (1999), оптимизированные Черных и соавт. (2002): для субрегиона AZFa: sY 86, sY 84, sY 615;
субрегиона AZFb: sY 127, sY 134;
для субрегиона AZFc: sY (DAZ), sY 255 (DAZ). Кроме того, в качестве “внутреннего” контроля на присутствие в геномной ДНК фрагментов короткого плеча Y –хромосомы использовали два маркера SRY и ZFY – что позволяло выявить наличие даных локусов и определить сответствие фенотипического пола генотипическому. В качестве “внешнего положительного” контроля использовали ДНК фертильного мужчины. Исследование gr/gr делеций длинного плеча Y хромосомы проводилось с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с использованием трех пар праймеров, две из которых были Y-специфичными маркерами sY 1191 и sY 1291 [Repping S. et al., 2002], третья Fbn 63 - служила внутренним контролем. Анализ диаллельных маркеров нерекомбинирующей области Y-хромосомы проводился по следующим 18 локусам: M9, M89, YAP (M1), M35, M130, 12f2, M172, M170, M231, Tat(M46), P43, M20, M175, 92R7, M207, M306, SRY1532, M269 методом ПЦР-ПДРФ анализа с помощью праймеров, предложенных рядом исследователей (Hammer M.F. and Horai S. 1995;
Whitfield L.S. et al., 1995;
Underhill P.A. et al., 1997;
Bergen A.W. et al., 1999;
Shen P. et al., 2000;
Cruciani F. et al., 2002;
“The Y chromosome consortium” (YCC), 2002]. Анализ мутаций в кодирующем регионе мтДНК, ассоциированных с гаплогруппами проводился методом ПЦР-ПДРФ анализа с использованием следующих сайтов, специфичных для большинства европейских и азиатских популяций: + HaeIII, -13259 HincII, -5176 AluI, +4732 RsaI, -7025 AluI, -4529 HaeII, + NlaIII, -13704 BstNI, +12308 HinfI, -4577 NlaIII, +7933 MboI, -9052 HaeII.
Статистическая обработка полученных результатов.
Математическую обработку результатов исследования проводили с помощью пакета программ статистического анализа Statistica ver. 6.0 (StatSoft, Inc., 2003) и Microsoft Excel 2003. Вычисление показателей отношения шансов (Odds Ratio) проводили с использованием интерактивной таблицы сопряженности 22 с вычислением статистик связи, а также их доверительных интервалов (с поправкой Иэйтса на непрерывность), разработанной В. П. Леоновым (http://www.biometrica.tomsk.ru/). В случае, когда ожидаемое число наблюдений в одной из ячеек было меньше пяти, использовали точный двухсторонний критерий Фишера (Гланц,1999).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ Анализ микроделеций AZF региона Y хромосомы.
Одной из наиболее частых генетических причин тяжелой степени олигозооспермии и азооспермии являются микроделеции Y хромосомы.
Такие микроделеции, ассоциированные с бесплодием, происходят в специфическом регионе длинного плеча Y хромосомы, который был назван регионом «фактора азооспермии» (AZF) и было выделено три неперекрывающихся субрегиона, получившие названия AZFa, AZFb и AZFc.
У всех пациентов с нарушением сперматогенеза был проведен анализ AZF локуса длинного плеча Y хромосомы. У 15 из 140 больных были обнаружены различные типы микроделеций, т.е. частота их оказалась равна 10,7%. Результаты, полученные в нашем исследовании, сходны с данными по частоте микроделеций в среднем в азиатских популяциях - 11,7% [Kim S.W.
et al., 1999;
Fujisawa et al., 2001;
Carvalho et al., 2004]. Подавляющее большинство делеций (93%) было выявлено в татарской, русской, башкирской и казахской этнических группах, составляющих 81% от общей выборки больных (рис.1). В группе больных с нарушением сперматогенеза татарской этнической принадлежности частота делеций AZF локуса составила 8,7%, что соответствует средней частоте микроделеций в европейских популяциях [Qureshi et al.. 1996;
Peterlin B. et al., 1997;
Dohle et al., 2002]. У лиц, принадлежащих к русской этнической группе, это значение оказалось равно 6,7% и сходно с таковыми у больных с бесплодием из Нидерландов, Испании, Словении, но ниже, чем у больных из Москвы, что, видимо, связано с этнической неоднородностью выборки (рис.2) [Черных В.Б. и др., 2003;
Kremer J.A. et al., 1997;
Peterlin B. et al., 1997;
2002;
Oliva R.
et al., 1998;
Martinez et al., 2000;
Dohle et al., 2002].
казахи башкиры русские татары 0% 20% 40% 60% 80% 100% с микроделециями без микроделеций Рис.1. Частота микроделеций AZF региона Y хромосомы в четырех этнических группах больных с нарушением сперматогенеза.
Гораздо более высокими были частоты в башкирской и казахской группах - 17,4% и 25%, соответственно, т.е. близкими к частотам микроделеций у больных с нарушением сперматогенеза из Японии, Израиля, Кореи [Nagafuchi et al., 1993;
Kobayashi K. et al., 1994;
Nakohori t al., 1996;
Shirakawa et al., 1997;
Kim S.W. et al., 1999;
Fujisawa et al., 2001;
Carvalho et al., 2004].
Полученные нами данные являются закономерными как по антропологическим характеристикам этих популяций, так и подтверждаются ранее проведенными нами исследованиям ядерного и митохондриального геномов, где было обнаружено, что популяции татар и русских более европеоидны по сравнению с популяциями башкир и казахов [Хуснутдинова Э.К. и др., 1999а;
1999б].
25% 20% 15% 10% 5% 0% США я ия а п ур й Аз ия ия ик а ци я а) ци я И ран ения я я я па да я ния илия иль ды ия ания ия рали Кита а н ди Коре Дани И нди оскв Турц И та л Евр о Кана Япо н итан рлан Амер Фра н Шве И спа И зр а Син г Слов Браз Г ерм Авст Шо тл ия (М к обр Ниде Ро сс Ве ли Рис. 2. Частоты микроделеций AZF региона Y хромосомы у мужчин с бесплодием в различных странах мира При сравнении частот микроделеций AZF региона Y хромосомы в разных этнических группах достоверных различий обнаружено не было, т.к.
уровень значимости во всех случаях не достигал порогового значения (Р0,05). Но, наши результаты показали, что частота микроделеций в два с половиной раза выше у больных башкирской этнической принадлежности по сравнению с группой больных русской этнической принадлежности и в два раза выше - по сравнению с соответствующей группой татарской этнической принадлежности. Частота микроделеций AZF локуса у больных казахской этнической принадлежности выше более чем в три раза по сравнению с таковой у больных татарской и русской этнических групп, и близко к таковому у больных башкирской этнической принадлежности, что, возможно, связано с общим этногенезом этих народов [Кузеев и др., 1975].
Таким образом, полученные нами результаты о частоте микроделеций AZF региона Y хромосомы у больных с нарушением сперматогенеза различной этнической принадлежности не исключают вероятности существования популяционных различий, связанных с географическими, либо с этногенетическими особенностями больных с бесплодием.
В общей выборке больных были выявлены несколько типов микроделеций локуса AZF длинного плеча Y хромосомы. Наиболее распространенным типом оказалась делеция AZFc субрегиона, ее частота составила 66,7% среди числа обнаруженных делеций или 7,14% среди всех больных с нарушением сперматогенеза. Следующей по распространенности в нашей работе явилась частичная делеция всех субрегинов AZF локуса AZFa+b+c (13,2%), или 1,42% для общей выборки. Остальные типы делеций AZFa+c, AZFb+c, AZFb имели одинаковую частоту - 6,7%, для выборки больных в целом - 0,71%. (табл. 1).
Таблица Спектр микроделеций AZF региона длинного плеча Y хромосомы у больных с нарушениями сперматогенеза Характер нарушения Количество (%) Общее количество делеций AZF локуса 15 Микроделеции AZFa+b+c - субрегионов 2 13, Микроделеции AZFa+c - субрегионов 1 6, Микроделеции AZFb+c - субрегионов 1 6, Микроделеции AZFb - субрегиона 1 6, Микроделеции AZFc - субрегиона 10 66, Спектр делеций, полученный в результате нашего исследования, в целом сходен с мировой картиной распространения делеций отдельных субрегионов, а также делеций, захватывающих два или три субрегиона Y хромосомы.
При разделении общей выборки больных по степени тяжести нарушения сперматогенеза нами было выделено три группы. В первой группе пациентов с азооспермией (I группа) делеции были найдены у девятерых из 80 человек, частота их составила 11,6% (рис.3), что согласуется с литературными данными и близко к таковым у больных с азооспермией из Москвы [Черных В.Б. и др., 2003]. Наиболее частой среди них оказалась микроделеция AZFc субрегиона (9,1%), микроделеции субрегионов AZFa+c и AZFb встретились с одинаковой частотой (1,3%). Частота делеции AZFa+c у разных авторов описывается как очень низкая, такой тип делеции встречается даже реже микроделеций AZFa субрегиона [Krausz C. et al., 2003]. В нашей работе, напротив, не было обнаружено ни одного случая делеции только AZFa региона. Во второй группе больных с олигозооспермией тяжелой степени делеции были обнаружены у шестерых из 49 пациентов, здесь частота также оказалась равна 12%, что несколько выше среднемирового уровня и близко к частоте микроделеций у больных с олигозооспермией тяжелой степени из Японии и Италии [Nagafuchi et al.,1993;
Kobayashi et al., 1994;
Nakahori et al., 1996;
Stuppia L. et al.,1996;
Grimaldi P. et al., 1998;
Foresta C. et al., 1999;
Krausz С. et al., 2003]. В этой группе наиболее распространенными оказались микроделеции AZFc субрегиона (6,3%). Чуть реже обнаружились делеции AZFa+b+c субрегионов (4,2%). По литературным данным, при частичных микроделециях всех трех субрегионов AZF локуса, в 100 % случаев у пациентов наблюдалась азооспермия [Vogt P., 1996;
Krausz C. 2000., 2000;
Foresta C. et al., 2001]. В нашем исследовании такие микроделеции были обнаружены у пациентов с олигозооспермией тяжелой степени. Это можно объяснить либо неточностью спермиологического анализа, либо существованием гонадного мозаицизма.
Также в группе с олигозооспермией была выявлена микроделеция AZFb+c субрегионов, ее частота составила 2,1%.
10% 9% 8% 7% 6% 5% 4% 3% 2% 1% 0% азооспермия олигозооспермия AZFa+c AZFc AZFb AZFb+c AZFa+b+c Рис. 3. Спектр микроделеций AZF региона Y хромосомы у мужчин с бесплодием в зависимости от степени нарушения сперматогенеза.
В третьей группе больных, куда вошли больные с числом сперматозоидов, превышающим 5 млн./мл. эякулята, но имеющие патологию морфологических или количественных признаков, микроделеций обнаружено не было. По литературным данным, у больных с другими формами патозооспермии микроделеции выявляются с частотой от 0 до 2%, что подтверждается нашими исследованиями [Foresta et al., 2001;
Krausz C. et al., 2000;
2003]. В группе контроля фертильных мужчин, состоящей из человек, микроделеции не были выявлены.
Подводя итог, можно сказать, что частота микроделеций в исследованной нами выборке больных с нарушением сперматогенеза незначительно отличается от распространенности данной мутации в среднем в популяциях мира, где это значение составляет 7,5%. Распространенность делеций в башкирской (17,4%) и казахской (25%) этнических группах значительно выше частот микроделеций в татарской (8,7%) и русской (6,7%) этнических группах, но статистической значимости эти различия не достигают. Частоты делеций в группах с азооспермией и олигозооспермией тяжелой степени сходны со среднемировыми частотами.
Анализ частичных делеций AZFc субрегиона длинного плеча Y хромосомы у больных с нарушением сперматогенеза и в контрольной группе AZFc субрегион Y хромосомы является крайне нестабильным участком. В связи с его особенностью для него характерны несколько видов частичных делеций. Наиболее распространенными являются gr/gr, b2/b3 и b1/b3 делеции. Gr/gr делеция, по данным некоторых авторов, ассоциирована с мужским бесплодием [Giachini et al., 2005]. При этом виде делеции теряются несколько копий многокопийных генов, экспрессирующихся исключительно в тестикулярной ткани. Отсюда следует предположение о потенциально возможном угнетении репродуктивной функции у мужчин в результате уменьшения дозы генов AZFc субрегиона.
Нами был проведен анализ частот частичных делеций AZFc субрегиона длинного плеча Y хромосомы. Пациентов с обнаруженными микроделециями AZF локуса мы исключили из данного анализа. В результате чего, общая выборка больных с нарушениями сперматогенеза для анализа частичных делеций составила 125 человек. В группе контроля было исследовано человека башкирской, татарской и русской этнической принадлежности.
Среди проанализированных 429 человек мы обнаружили два типа частичных делеций AZFc субрегиона - это gr/gr и b2/b3 делеции. Частота gr/gr в общей изученной группе составила 0,17 (74/429), а частота b2/b делеции - 0,007 (3/429). Оба типа частичных делеций были обнаружены и среди больных с нарушением сперматогенеза, и среди фертильных мужчин.
При сравнении частот gr/gr делеции в группе больных она составила 0,19, в группе контроля - 0,17 (р 0,05). Частота b2/b3 делеции в группе больных была равна 0,02, в контрольной группе - 0,003 (р 0,05). Таким образом, различия между общей выборкой больных с бесплодием и контрольной группой оказались статистически не достоверными.
Попарное сравнение групп больных с нарушением сперматогенеза башкирской, русской и татарской этнической принадлежности с соответствующими группами контроля не выявило статистически значимых различий в распространении частот gr/gr делеций (рис.4).
30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% татары башкиры русские больные контроль Рис. 4. Частота gr/gr делеций AZFc субрегиона Y хромосомы у больных с нарушением сперматогенеза и в контрольной группе фертильных мужчин в трех этнических группах.
Частота делеций в группе больных с азооспермией составила 20%, у больных с олигозооспермией тяжелой степени - 16% (рис.5). В группе больных с нарушением сперматогенеза и количеством половых клеток млн./мл. не было обнаружено ни gr/gr, ни b2/b3 делеций. В контрольной группе фертильных мужчин частота gr/gr делеций составила 17%. При сравнительном анализе частот делеций в группах больных, дифференцированных по степени тяжести нарушения сперматогенеза, с группой контроля, статистически достоверных различий обнаружено не было (р 0,05).
др.формы патозооспермии олигозооспермия тяжелой степени азооспермия 0% 20% 40% 60% 80% 100% gr/gr делеции без делеций Рис.5. Распределение частот gr/gr делеций AZFc субрегиона Y хромосомы у больных с разными типами нарушения сперматогенеза Таким образом, не выявлены ассоциации gr/gr делеций с тяжелыми формами нарушения сперматогенеза. Возможно, частичные делеции AZFc субрегиона длинного плеча Y хромосомы приводят к более легким формам нарушения сперматогенеза, не сопровождающимися инфертильностью. Так как понятие «фертильность» не является синонимом нормозооспермии, можно предположить, что у фертильных мужчин из группы контроля с gr/gr делециями количество половых клеток было ниже нормы, но достаточно для оплодотворения.
Анализ гаплогрупп Y хромосомы у больных с нарушением сперматогенеза Хотя микроделеции Y хромосомы являются наиболее частыми генетическими причинами олигозооспермии и азооспермии, у значительного количества пациентов с идиопатическим бесплодием Y хромосома имеет полноценные размеры. Существует предположение, что такие индивиды могут быть носителями перестроек нуклеотидной последовательности, не обнаруженных микроделеций или вариантов последовательности нерекомбинирующей области Y хромосомы, ассоциированных с нарушением сперматогенеза. В последнее время появились исследования, где были выявлены ассоциации между гаплогруппами Y хромосомы и нарушением сперматогенеза различной степени тяжести [Previdere C. et al., 1999;
Kuroki Y. et al., 1999;
Krausz C. et al., 2001;
Paracchini S. et al., 2002]. Как известно, распределение гаплогрупп Y хромосомы специфично для каждой популяции мира, вследствие чего не уместно ожидать, что фенотип, в нашем случае нарушение сперматогенеза, ассоциированный с определенной гаплогруппой Y хромосомы в одной популяции, будет ассоциироваться с той же гаплогруппой в другой популяции мира. И, наоборот, отсутствие ассоциаций в одной популяции не является доказательством отсутствия такового в какой либо другой популяции [McElreavey K. et al., 2006].
Нами был проведен анализ гаплогрупп Y хромосомы у мужчин с бесплодием и в контрольной группе. Гаплогруппы были определены у человек с нарушением сперматогенеза и 303 фертильных мужчин.
Определение гаплогрупп проводилось путем анализа медленно мутирующих бинарных маркеров MSY региона. У двоих пациентов с бесплодием гаплогруппы не были определены, т.к. в результате обширных микроделеций были делетированы бинарные маркеры, используемые для идентификации гаплогрупп.
У больных с нарушением сперматогенеза, как и в контрольной группе фертильных мужчин было выявлено 13 гаплогрупп и 3 кластера Y хромосомы. С наиболее высокой частотой и в группе контроля, и больных с нарушением сперматогенеза была обнаружена гаплогруппа R1a.
У лиц татарской этнической принадлежности наиболее часто встречались гаплогруппы R1a (25%), R1b3 (15%), I (12%), тогда как у индивидов башкирской этнической группы значительно преобладала гаплогруппа R1b3 (43%) и R1a (24%). В контрольной группе фертильных мужчин русской этнической принадлежности с наиболее высокой частотой обнаружена гаплогруппа R1a (42%), второй по частоте была гаплогруппа N (21%).
Статистически значимые различия выявлены при сравнении групп контроля башкирской и русской этнической принадлежности для пяти гаплогрупп (R1a, R1b, R1b3, I, N3). Группы контроля татарской и русской этнической принадлежности достоверно различались по распределению частот гаплогрупп R1a и R1b3. Индивиды из групп контроля башкирской и татарской этнической принадлежности достоверно отличались друг от друга только по частоте гаплогруппы R1b3 Y хромосомы (рис.6).
p=0,0005 p=0, p=0, p=0,02 p=0,03 p=0,037 p=0, 45% 45% 40% 40% 35% 35% 30% 30% 25% 25% 20% 20% 15% 15% 10% 10% 5% 5% 0% 0% R1a R1b3 R1b* I N3 R1a R1b3 R1b* I N татары русские башкиры русские p=0, 45% 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% R1a R1b3 R1b* I N татары башкиры Рис.6. Распределение частот гаплогрупп Y хромосомы в группах контроля, дифференциированных по этническому признаку В результате исследования обнаружено, что гаплогруппа R1b3 является маркером пониженного риска нарушения сперматогенеза у индивидов башкирской этнической принадлежности (рис.7).
OR=0, 95%CI 0,12-0, 45% 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% татары башкиры русские контроль больные Рис. 7. Распределение частоты R1b3 гаплогруппы Y хромосомы среди групп больных с нарушением сперматогенеза и контроля.
Анализ частот гаплогрупп Y хромосомы у больных с нарушением сперматогенеза и в контрольной группе, несущих частичные делеции AZFc субрегиона длинного плеча Y хромосомы Проведен анализ гаплогрупп Y хромосомы у носителей gr/gr делеций AZFc субрегиона Y хромосомы как у больных с нарушением сперматогенеза, так и в контрольной группе. С подавляющей частотой в обеих исследуемых группах обнаружен кластер N, при сравнении которого со всеми остальными гаплогруппами в сумме в группе больных (2 =24,38;
df=1;
р=0,0005,) и в группе контроля (2=43,62;
df=1;
p=0,0005,) различия явились статистически достоверными (рис. 8).
R1a P* E3b C K* N* N N 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% больные контроль Рис. 8. Распределение частот гаплогрупп Y хромосомы у носителей gr/gr делеций в группе больных с нарушением сперматогенеза и в контроле Возможно, полученный нами результат относительно gr/gr делеции, можно объяснить существованием компенсаторной мутации, ассоциированной с кластером N, при которой сокращается, но не нейтрализуется полностью вредное воздействие gr/gr делеции.
Анализ частот гаплогрупп Y хромосомы у больных с нарушением сперматогенеза, несущих микроделеции AZF региона Проведен анализ гаплогрупп Y хромосомы у пациентов с микроделециями AZF локуса. Гаплогруппы были определены в двенадцати случаях из пятнадцати, т.к. у трех пациентов с обширными делециями AZF региона были делетированы маркерные локусы, используемые при анализе гаплогрупп (рис.9).
F*;
7% гапл не опред;
R1a;
33% 20% K*;
7% C;
13% N3;
20% Рис. 9. Распределение частот гаплогрупп Y хромосомы у больных с микроделециями AZF локуса С наиболее высокой частотой (33%) среди больных с обнаруженными микроделециями AZF региона длинного плеча Y хромосомы вне зависимости от этнической принадлежности была определена гаплогруппа Y хромосомы R1a.
В результате нашего исследования ассоциаций гаплогрупп Y хромосомы с микроделециями AZF региона не выявлено.
Анализ частот гаплогрупп мтДНК у больных с нарушением сперматогенеза и в контрольной группе.
Вопрос о влиянии митохондриального генома на мужскую фертильность начал изучаться недавно. При исследовании ассоциаций гаплогрупп мтДНК с некоторыми формами нарушения сперматогенеза выявлен повышенный риск развития астенозооспермии или олигозооспермии у носителей гаплогруппы Т [Ruis-Pesini et al., 2000].
В своей работе мы провели анализ гаплогрупп мтДНК у больных с разной степенью нарушения сперматогенеза и у фертильных мужчин.
Гаплогруппы мтДНК были определены у 373 человек, среди которых было 114 мужчин с бесплодием и 259 человек с нормальным статусом фертильности.
У больных с нарушением сперматогенеза, как и в группе контроля было выявлено 10 гаплогрупп и 1 кластер митохондриальной ДНК. С наиболее высокой частотой и в группе контроля, и больных с нарушением сперматогенеза была обнаружена гаплогруппа H и кластер UK. С высокой частотой среди больных с нарушением сперматогенеза была выявлена гаплогруппа С мтДНК у пациентов башкирской этнической принадлежности (28%). При сравнении полученного значения с частотой в башкирской группе контроля мы получили статистически достоверные различия (2 =5,82;
df=1;
p=0,02;
OR=6,15, 95%CI 1,3-29,59) (рис.10).
татары башкиры OR=6, 35% 35% 30% 30% 25% 25% 20% 20% 15% 15% 10% 10% 5% 5% 0% 0% H UK A C D F I J T V H UK A C D F I J T V Y русские 40% больные 35% 30% контроль 25% 20% 15% 10% 5% 0% H UK A C D F I J T V Рис. 10. Распределение частот гаплогрупп мтДНК у больных с нарушением сперматогенеза и в контроле.
У больных татарской и русской этнической принадлежности частота данной гаплогруппы не превышала пяти процентов и незначительно отличалась от распространения гаплогруппы С в соответствующей группе контроля.
Высокого значения достигла частота гаплогруппы V мтДНК в группе контроля татарской этнической принадлежности (12%). В общей популяции татар данная гаплогруппа была обнаружена с частотой 3,9%, полученные нами данные превысили это значение более чем в три раза [Bermisheva M., 2002]. При сравнительном анализе частоты гаплогруппы V в группе контроля татарской этнической принадлежности и популяционных данных различия достигли статистически значимых значений (2=5,2;
df=1;
p=0,02;
OR=0,31, 95%CI 0,11-0,87) (рис.11).
башкиры татары OR=0,31 OR=0, 35% 35% 30% 30% 25% 25% 20% 20% 15% 15% 10% 10% 5% 5% 0% 0% H UK A C D F I J T V H UK A C D F I J T V русские 45% 40% 35% популяция 30% 25% 20% контроль 15% 10% 5% 0% H UK A C D F I J T V Рис. 11. Распределение частот гаплогрупп мтДНК у фертильных мужчин башкирской, татарской, русской этнических групп и в соответствующих популяциях.
На основании полученных результатов можно сделать вывод, что гаплогруппа V у индивидов татарской этнической принадлежности является фактором пониженного риска нарушения сперматогенеза. У лиц русской этнической принадлежности частота данной гаплогруппы составила всего 3%, что согласуется с литературными данными (2%) [Морозова, 2007;
Malyarchuk et al., 2001;
2004]. В башкирской этнической группе контроля данная гаплогруппа не была обнаружена.
Гаплогруппа Т в группе контроля башкирской этнической принадлежности, по сравнению с популяцией, обнаружена в три раза чаще (2 =9,92;
df=1;
p=0,003, OR=0,37, 95%CI 0,16 - 0,89) (рис.11). Вследствие чего, можно сделать вывод, что гаплогруппа Т является фактором пониженного риска нарушения сперматогенеза у индивидов башкирской этнической принадлежности. Частоты гаплогруппы Т в группах контроля татарской и русской этнической принадлежности от популяционных данных отличались незначительно.
Таким образом, в результате сравнительного анализа частот гаплогрупп мтДНК у больных с нарушением сперматогенеза и фертильных мужчин башкирской, русской и татарской этнических групп показано, что у индивидов башкирской этнической принадлежности с гаплогруппой С увеличен риск развития нарушения сперматогенеза по сравнению с контрольной группой фертильных мужчин. Гаплогруппа Т мтДНК у лиц башкирской этнической принадлежности и гаплогруппа V мтДНК у мужчин татарской этнической группы являются факторами пониженного риска нарушения сперматогенеза. Предположение о существовании ассоциации нарушения сперматогенеза с гаплогруппой T, выдвинутое Ruis-Pesini и соавт., в нашем исследовании не подтверждается.
ВЫВОДЫ.
1. Частота микроделеций AZF региона Y хромосомы у больных с нарушением сперматогенеза составила 10,7%. У больных татарской и русской этнической принадлежности их частоты (8,7% и 6,7%) сходны с таковыми в европейских популяциях, у башкир и казахов (17,4% и 25%) близки к азиатским популяциям.
2. У больных с олигозооспермией тяжелой степени частота микроделеций AZF региона Y хромосомы составила 12,2%, у больных с азооспермией 11,2%. Микроделеции не обнаружены у больных с другими формами патозооспермии.
3. Частота микроделеций AZFc субрегиона составила 66,7%, AZFa+b+c 13,2%, AZFb, AZFa+c, AZFb+c - по 6,7% среди всех обнаруженных микроделеций.
4. У мужчин татарской, русской и башкирской этнической принадлежности обнаружена ассоциация gr/gr делеции AZFc субрегиона с N кластером Y хромосомы и не обнаружена ассоциация с нарушением сперматогенеза.
5. Генетическим маркером пониженного риска нарушения сперматогенеза у башкир является R1b3 гаплогруппа Y хромосомы.
6. Гаплогруппа С мтДНК ассоциирована с нарушением сперматогенеза у башкир. Гаплогруппа Т мтДНК у лиц башкирской этнической принадлежности и гаплогруппа V мтДНК у мужчин татарской этнической группы являются факторами пониженного риска нарушения сперматогенеза.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1.Islamova A.A., Khusainova R.I., Akhmetov R. F., Shimkov O.S., Muslimova A.R., Khusnutdinova E.K. Analysis of AZF microdeletions in infertility males. //Abstracts of European Human Genetics Conference.
Amsterdam. 2006. European Journal of Human Genetics. -V.14.- P.313.
2. Islamova A.A., Khusainova R.I., Khusnutdinova E.K. AZF region microdeletions of Y chromosome are one the most frequent causes of spermatogenesis abnormality. //Abstracts of European Human Genetics Conference. Nice 2007. European Journal of Human Genetics. -V. 15. -P. 3. А.А Исламова, Р.И. Хусаинова, Р.Ф. Ахметов, О.С. Шимков, Э.К.
Хуснутдинова. Скрининг микроделеций AZF локуса Y хромосомы у мужчин с нарушением сперматогенеза. //Сб. научн. работ «Естествознание и гуманизм» - Томск,2005.- Т.2, №4. - с.51- 4. Исламова А. А., Хусаинова Р. И., Ахметов Р. Ф, Шимков О. С., Муслимова А. Р., Хуснутдинова Э. К. Анализ микроделеций AZF локуса Y хромосомы у мужчин с нарушением сперматогенеза. // Сборник научных трудов Международной научно-практической конференции "Биологические науки в XXI веке. Проблемы и тенденции развития ", часть 1, ISBN 5-86607 253-X - Бирск, 2005. - с.4- 5. Исламова А. А., Хусаинова Р. И., Ахметов Р. Ф, Шимков О. С., Муслимова А. Р., Хуснутдинова Э. К. Анализ микроделеций AZF локуса Y хромосомы у мужчин с бесплодием //Тезисы докладов 10 Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 2006. - с. 141.
6. Исламова А. А., Кутуев И. А. Анализ ассоциации нарушения сперматогенеза с гаплогруппами Y хромосомы //Тезисы докладов научно практической конференции «Человек и его здоровье». - Санкт-Петербург, 2006.- с. 131-132.
7. Исламова А.А., Хусаинова Р.И., Кутуев И.А., Хуснутдинова Э.К.
Исследование гаплогрупп Y хромосомы у пациентов с нарушением сперматогенеза //Тезисы докладов на Школе молодых ученых им. Вавилова «Актуальные проблемы современной генетики». - Москва, 2006.- с. 79.
8. Исламова А.А., Хусаинова Р.И., Ахметов Р.Ф., Шимков О.С.,Муслимова А.Р., Хуснутдинова Э.К. Анализ AZF локуса Y хромосомы у мужчин с азооспермией и олигозооспермией тяжелой степени // Тезисы XVI международной конференции РАРЧ. "Вспомогательные репродуктивные технологии сегодня и завтра. 20 лет ЭКО в России". - Ростов-на-Дону, 2006. с. 51-52.
9. Исламова А. А., Хусаинова Р.И., Ахметов Р.Ф., Шимков О.С., Муслимова А.Р., Хуснутдинова Э.К. Анализ маркеров Y хромосомы у мужчин с нарушением сперматогенеза. // Материалы Международного конгресса андрологов. - Сочи, Дагомыс, 2007. - с. 10. Исламова А.А., Хусаинова Р.И., Хуснутдинова Э.К. Роль Y хромосомы и митохондриального генома в нарушении сперматогенеза. // Молекулярная медицина. - 2007. - №3 – с. 29-38.
Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность заведующей Центра планирования семьи и репродукции с медико-генетическим консультированием при Республиканском перинатальном центре Муслимовой А.Р., врачам - андрологам Ахметову Р.Ф. и Шимкову О.С., врачу-лаборанту Хабировой З.Х., а также д.м.н., проф., руководителю лаборатории медицинской генетики РГКП «РНИЦ охраны здоровья матери и ребенка», г. Алматы, Казахстан Святовой Г.С. за помощь, оказанную при проведении исследований.