Роль моноцитов-макрофагов в адаптивных реакциях кроветворной ткани при действии на организм экстремальных факторов
На правах рукописи
Улитко Мария Валерьевна РОЛЬ МОНОЦИТОВ-МАКРОФАГОВ В АДАПТИВНЫХ РЕАКЦИЯХ КРОВЕТВОРНОЙ ТКАНИ ПРИ ДЕЙСТВИИ НА ОРГАНИЗМ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ 03.00.13. – «Физиология»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Екатеринбург - 2008 2
Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Уральского госу дарственного университета им. А.М.Горького и в лаборатории иммунофизиологии института иммунологии и физиологии УрО РАН
Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Юшков Борис Германович
Официальные оппоненты: академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Захаров Юрий Михайлович доктор биологических наук Проценко Юрий Леонидович
Ведущая организация: ГУ Гематологический научный центр РАМН, г. Москва
Защита состоится « » июля 2008 года в часов на заседании диссертационного совета Д 004.027.01 в Институте иммунологии и физиологии УрО РАН по адресу:
620049, г. Екатеринбург, ул. Первомайская,
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке УрО РАН (620219, г. Екатеринбург, ул. С.Ковалевской / Академическая, 22/20), c авторефератом – на сайте Института иммунологии и физиологии УрО РАН – http://www. iip.uran.ru
Автореферат разослан « » 2008 года
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Тузанкина И. А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Проблема иммунологической регуляции гемо поэза в физиологических условиях и при экстремальных воздействиях на организм является актуальной в современной биологии и медицине. Важную роль в регуляции функциональной активности гемопоэтических клеток отводят системе мононукле арных фагоцитов [Ю.М. Захаров и А.Г. Рассохин, 2002, Y. Sadahira et al., 1999, T. Yo koyama et al., 2003]. Моноциты-макрофаги костного мозга, являясь центральной клеткой эритробластического островка, обладают высоким аффинитетом по отноше нию к эритроидным клеткам [M. Bessis et J. Breton-Gorius, 1961, M. Bessis, 1978, M.
Haspal, 1997, B.O. Fabriek, 2007], регулируют их пролиферацию и дифференцировку [Y.M. Zakharov, M. Prenant, 1982, E. Ingley et al., 2004], создают специфическое ге мопоэтическое микроокружение [Н.В. Тишевская, 2003], продуцируют биологически активные гуморальные факторы [И.С.Фрейдлин, 1995, I.N. Rich, 1988], обеспечивая адаптивные реакции кроветворной ткани при экстремальных воздейтвиях.
В настоящее время установлено, что эритропоэтические свойства центральных мак рофагов эритробластических островков зависят от функционального состояния системы мононуклеарных фагоцитов [Н.М. Новиков, 1982, Ю.М. Захаров, 1992], которое, в свою очередь, находится под контролем большого количества взаимосвязанных между собой факторов. Существенная роль в регуляции гемопоэтической функции макрофагов отводит ся межклеточному взаимодействию и влиянию нейроэндокринной системы [Е.Д. Гольд берг и соавт., 2000, А.М. Дыгай и соавт., 2004].
Вместе с тем, многие вопросы, касающиеся роли моноцитов-макрофагов кост ного мозга в адаптивных реакциях системы крови, еще далеки от своего решения.
Это касается, прежде всего, реакции системы мононуклеарных фагоцитов при воздействии на организм экстремальных факторов. Требуют дальнейшей расшиф ровки конкретные регуляторные механизмы эритропоэза, протекающие с участием макрофагов. Не полностью идентифицированы вырабатываемые макрофагами гу моральные факторы и механизмы регуляции функциональной активности макрофа гов костного мозга.
Не менее важным представляется вопрос о взаимосвязи макрофагальных ме ханизмов регуляции эритропоэза с другими регуляторными системами организма, в частности с нейроэндокринной системой. В современной литературе эта проблема освящена достаточно противоречиво [В.Э. Цейликман и соавт., 1991, Е.Д. Гольдберг и соавт, 1997, Е.Г. Скурихин и соавт., 2001, А.М. Дыгай и соавт., 2004, D.O.
Adams,1994].
Данные литературы свидетельствуют о реализации нейроэндокринных влия ний на функциональную активность моноцитов-макрофагов костного мозга через локальные клеточные взаимодействия [А.М. Дыгай и соавт., 1989, В.А. Клименко и соавт., 1991, Ю.М. Захаров и Н.В.Тишевская, 1997]. Однако исследованы далеко не все конкретные способы межклеточного взаимодействия центральных макрофагов эритробластических островков с другими компонентами гемопоэзиндуцирующего микроокружения. До конца не расшифрованы и механизмы межклеточной коопера ции макрофагов и Т-лимфоцитов [В.П.Шахов и соавт., 1999].
Попытки изменения функциональной активности мононуклеарных фагоцитов с помощью иммуномодуляторов [Р.М. Хаитов и соавт., 1995, 2003], ставят вопрос о поисках эффективных лекарственных препаратов, для целенаправленной модуля ции гемопоэтической функции макрофагов Таким образом, многие вопросы, касающиеся роли макрофагов в регуляции функциональной активности гемопоэтических клеток при воздействии на организм экстремальных факторов, расшифровка конкретных механизмов эритропоэза, про текающих с участием моноцитов-макрофагов костного мозга, а также изучение взаимосвязи макрофагальных механизмов регуляции эритропоэза с другими регу ляторными системами являются актуальной научной проблемой и требуют специ альных целенаправленных исследований.
Цель исследования: оценить роль моноцитов-макрофагов костного мозга в адаптивных реакциях кроветворной ткани при действии на организм экстремальных факторов.
Задачи исследования:
Охарактеризовать реакцию моноцитарного ростка кроветворения при действии 1.
на организм различных экстремальных факторов: кровопотери, гипоксии, фе нилгидразиновой анемии, иммобилизационного стресса, частичной гепатэк томии.
2. Проанализировать изменения эритропоэтической активности моноцитов макрофагов костного мозга при действии на организм экстремальных факто ров.
Оценить эритропоэтическую функцию моноцитов-макрофагов на фоне стиму 3.
ляции функциональной активности системы мононуклеарных фагоцитов та меритом.
Оценить эритропоэтическую функцию моноцитов-макрофагов при ингибиро 4.
вании функциональной активности системы мононуклеарных фагоцитов кар рагинаном.
5. Проанализировать некоторые механизмы регуляторного влияния надпочечни ков на эритропоэтическую функцию моноцитов-макрофагов.
Определить роль медиаторов вегетативной нервной системы - адреналина и 6.
ацетилхолина в макрофагальной регуляции эритропоэза.
Исследовать влияние продуктов секреции тучных клеток – гепарина и гиста 7.
мина на реакции моноцитов-макрофагов костного мозга.
Научная новизна исследования:
Проведен сравнительный анализ реакции моноцитов-макрофагов костного мозга при действии на организм экстремальных факторов. Показано, что активация моноцитопоэза является неспецифической реакцией моноцитарного ростка крове творения на экстремальные воздействия.
Доказано, что эритропоэтическая функция моноцитов-макрофагов костного мозга зависит от количества и функционального состояния клеток системы моно нуклеарных фагоцитов.
Установлено, что гормоны надпочечников, медиаторы вегетативной нервной сис темы и физиологически активные вещества, секретируемые тучными клетками, мо гут оказывать влияние на макрофагальную регуляцию эритропоэза, регулируя скорость и продолжительность развития адаптивных реакций в эритробластических островках.
Показана возможность целенаправленного воздействия на эритропоэтическую функцию макрофагов с помощью иммуномодуляторов, избирательно изменяющих функциональную активность моноцитарно-макрофагального звена.
Теоретическая значимость работы. Результаты исследования позволяют расширить современные представления о роли системы мононуклеарных фагоцитов в формировании адаптивных и компенсаторных реакций гемопоэтической ткани при действии на организм экстремальных факторов. Выявлено, что реакция моноцитов макрофагов костного мозга на экстремальные воздействия носит неспецифический характер и проявляется увеличением общего количества клеток моноцитарного ряда.
Результаты исследования позволяют раскрыть существенные моменты макро фагальной регуляции гемопоэза. Полученные данные доказывают, что для проявле ния эритропоэтической функции макрофагов эритробластических островков важ ным является функциональное состояние всей системы мононуклеарных фагоцитов.
Продемонстрировано, что реакция моноцитарного ростка кроветворения и эритропоэтическая функция макрофагов костного мозга контролируется нейроэн докринной системой и гемопоэзиндуцирующим микроокружением.
Проведенное исследование создает теоретическую основу для разработки но вых методов влияния на макрофагальную регуляцию гемопоэза путем воздейст вия на функциональное состояние системы мононуклеарных фагоцитов.
Практическая значимость работы. Теоретически обоснована возможность коррекции гемопоэтической функции макрофагов в клинической практике при гема тологических заболеваниях, связанных с активацией или угнетением эритропоэза, путем целенаправленного воздействия на функциональную активность моноцитар но-макрофагального звена с помощью иммунотропных лекарственных препаратов.
Положения, выносимые на защиту:
1. Реакция мононуклеарных фагоцитов костного мозга на экстремальные воздейст вия проявляется неспецифическим увеличением общего количества клеток моно цитарного ряда. Выраженность и характер реакции активации моноцитопоэза опре деляется природой экстремального фактора.
2. Активация моноцитопоэза сопровождается изменением эритропоэтической функции моноцитов-макрофагов костного мозга и развитием адаптивной реакции в эритроб ластических островках костного мозга.
3. На эритропоэтическуюя функцию моноцитов-макрофагов костного мозга оказы вают влияние количество и функциональное состояние клеток системы моно нуклеарных фагоцитов.
4. Регуляции моноцитопоэза и эритропоэтических свойств макрофагов осуществля ется с участием эндокринной и нервной систем, а также гемопоэзиндуцирующе го микроокружения.
Апробация работы. Работа апробирована на заседании ХI международного симпозиума «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (г. Москва, 2003 г.), на I Всероссийской конференции « Физиология иммунной системы» (г. Сочи, 2003 г.), на III конференции иммунологов Урала (г. Челябинск, 2003 г.), на XIX съезде фи зиологического общества им. И.П.Павлова (г. Екатеринбург, 2004 г.), на 2-ой Все российской научно-практической конференции «Компенсаторно-приспособитель ные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты» (г. Ново сибирск, 2004 г.), на Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регу ляции функции клетки» (г.Тюмень, 2005), на I съезде физиологов СНГ (г.Сочи, г.), на Межрегиональной научно-практической конференции с международным уча стием «Типовые патологические процессы» (г.Уфа, 2005 г.), на V конференции им мунологов Урала (г. Оренбург, 2006 г.), на III съезде физиологов Урала (г. Екате ринбург, 2006 г.), на Региональной научно-практической конференции «Вопросы интегративной физиологии» (г. Красноярск, 2007 г.). По материалам исследования опубликовано 15 научных работ, из них в изданиях, рекомендованных ВАК -3.
Внедрение. Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре физиологии человека и животных Уральского государственно го университета имени А.М. Горького, в научных разработках Института иммуноло гии и физиологии Уральского отделения Российской академии наук.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения и выводов. Работа изложена на 181 странице печатного текста, со держит 42 таблицы и 35 рисунков. Библиографический указатель включает 212 на званий (из них 162 отечественных).
СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Методические вопросы исследования. В экспериментах использовали 440 бе лых беспородных крыс. В качестве экстремальных факторов применяли кровопоте рю, гипоксическую гипоксию, фенилгидразиновую анемию, частичную гепатэкто мию, иммобилизационный стресс.
Постгеморрагическую анемию у крыс вызывали однократным кровопускани ем из хвостовой вены. Величина кровопотери составляла 2 % от массы тела живот ного. Исследование моноцитопоэза и параметров системы эритрона проводили че рез 6 часов, на 1-е, 3-и, 7-е, 10-е и 14-е сутки после воздействия.
Прерывистую гипоксическую гипоксию получали путём помещения живот ных в барокамеру с приточно-вытяжной вентиляцией с разряжением 40,98 кПа, на часов ежедневно в течение 7 суток. Показатели моноцитопоэза и эритропоэза оце нивали после 4-го и 7-го сеансов.
Для моделирования фенилгидразиновой анемии применяли однократное внут рибрюшинное введение фенилгидразина в дозе 15мг/кг массы тела. Оценку показателей моно цитопоэза и параметров системы эритрона проводили на 1-е, 3-и и 7-е сутки после воздействия.
Репаративную регенерацию печени индуцировали удалением 2/3 массы органа [G. M. Higgins, R. M. Anderson, 1931]. Исследование моноцитопоэза и параметров системы эритрона проводили через 4 и 17 часов после операции. Эти сроки соот ветствуют 2-м фазам регенерации пострезекционной печени: деструктивно реактивной и пролиферативной, каждая из которых характеризуется своими осо бенностями пролиферативных процессов и метаболических реакций.
В качестве стрессорного фактора применяли иммобилизацию крыс (с сохра ненными и удаленными надпочечниками) на операционном столике на спине в те чение 6 часов однократно. Активность моноцитопоэза и эритропоэза оценивали сразу после иммобилизации и через 2-е суток после воздействия.
С целью изменения функционального состояния макрофагов были использо ваны препараты с противоположным действием: стимулятор функциональной ак тивности макрофагов тамерит в дозе 2 мг/кг и ингибитор их функциональной актив ности каррагинан в дозе 10 мг / кг. Активность моноцитопоэза и эритропоэза оцени вали через 4 часа и 17 часов после воздействия.
Для исследования роли нейроэндокринной системы в регуляции моноцитопо эза и эритропоэтической функции моноцитов-макрофагов использовали методику адреналэктомии, введение гормонов надпочечников и медиаторов вегетативной нервной системы – преднизолона в дозе 12 мг/кг массы тела, адреналина в дозе 0. мг и ацетилхолина в дозе 125 мг/кг. Иммобилиацию животных проводили на 4-е сутки после двухсторонней адреналэктомии. Активность моноцитопоэза и эритро поэза оценивали сразу после иммобилизации и через 2-е суток после воздействия.
Для определения роли системы тучных клеток в регуляции моноцитопоэза и эритропоэтической функции моноцитов-макрофагов применяли введение гепарина в дозе 150 ед. и гистамина в дозе 450 мг/кг. Активность моноцитопоэза и эритропоэза оценивали на 1-е и 3-и сутки после воздействия.
Активность моноцитопоэза и распределение моноцитов в кроветворной ткани определяли путем подсчета общего количества клеток моноцитарного ряда в миело грамме, а также в мазках и срезах костного мозга. Для идентификации всех элемен тов системы мононуклеарных фагоцитов применяли методику цитохимического вы явления активности неспецифической эстеразы в клетках моноцитарно макрофагального ряда в модификации G.Gomori. Подсчет моноцитов проводили на светооптическом микроскопе «Micros 4000» с масляной иммерсией при увеличении ? 1000.
Для оценки эритропоэтической функции моноцитов-макрофагов исследовали показатели красной крови, количественный и качественный состав эритробластиче ских островков (ЭО), рассчитывали функциональные показатели эритропоэза в эритробластических островках, кроме того, оценивали «внеостровковый» эритро поэз. В данной работе под «внеостровковым» эритропоэом понимается число свобод ных эритроидных клеток, не связанных с короной эритробластического островка.
Этот показатель рассчитывали как разность между общим числом эритроидных кле ток, определенным по миелограмме и их количеством в эритробластических остров ках костного мозга крыс.
Периферическую кровь исследовали с помощью гематологического анализатора Micros 60 фирмы ABX diagnostic.
Выделение, количественная оценка и морфологическое исследование эрит робластических островков костного мозга проводились по методике, разработанной Ю.М. Захаровым, И.Ю.Мельниковым и А.Г. Рассохиным (1984). Изучение морфо логии и определение классов зрелости эритробластических островков осуществляли при увеличении ? 1000 с масляной иммерсией. На основании полученных данных об абсолютном количестве ЭО в костном мозге животных и их распределении по клас сам зрелости рассчитывали функциональные показатели, дополнительно характери зующие состояние эритропоэза: общее количество эритроцитарных колониеобра зующих единиц (КОЕэ), вступивших в дифференциацию, показатель интенсивности вовлечения КОЕэ в дифференциацию, показатель длительности созревания ЭО, пока затель повторного вовлечения макрофагов в эритропоэз.
Обработку результатов проводили на основе методов вариационной статисти ки, используя компьютерную программу «Microsoft Excel» и «Статистика». Вычис лялась средняя арифметическая величина, стандартное отклонение, ошибка средней арифметической величины. Для оценки значимости различий между группами ис пользовали критерии Стьюдента и Манна-Уитни.
Результаты исследования и их обсуждение.
Полученные данные свидетельствуют, что реакция моноцитарного ростка на различные экстремальные воздействия складывается из неспецифического и специ фического компонентов. Неспецифический проявляется увеличением общего коли чества клеток моноцитарного ряда в костном мозге при всех исследованных видах воздействий (рисунок 1). Выраженность и характер реакции активации моноцитопо эза можно рассматривать, как специфический компонент, определяемый природой экс тремального фактора.
* ** Моноциты-макрофаги, * 3000 * * * * * * * 2500 * * * * 1000 * тыс Интактные 3 сут 6 часов 1 сут 7 сут 1 сутки 6 часов 4 часа 3 сутки 7 суток 6 часов 17 часов 2 суток 7 сутки Интактные Кровопотеря Гипоксия Фенилгидразиновая анемия Иммобилизационный стресс Резекция печени Рисунок 1. Динамика общего количества моноцитов-макрофагов в костном мозге бедренной кости крыс при экстремальных воздействиях Примечание: *- достоверные отличия от группы интактных животных При гипоксических воздействиях проявление реакции моноцитарного ростка зависит от скорости и механизма развития тканевой гипоксии. В результате быстро го удаления из циркуляции эритроцитов и гемоглобина при кровопотере, или в свя зи с разрушением эритроцитов при фенилгидразиновой анемии активация моноци топоэза наиболее выражена уже в 1-е сутки после воздействия. При гипоксической гипоксии активация моноцитопоэа развивается постепенно, по мере увеличения числа сеансов и развития тканевой гипоксии. Возможно, данный эффект объясняет ся чувствительностью макрофагов к эритропоэтину, продукция которого при ткане вой гипоксии резко возрастает. Согласно литературным данным, эритропоэтин по вышает фагоцитарную активность макрофагов, стимулирует лизосомальные процес сы, а также, при взаимодействии с КСФ-ГМ и ИЛ-3, способствует пролиферации данных клеток [Е.Д. Громыхина и соавт.,1997, Ю.М. Захаров и соавт.,1997, В.А.
Козлов, 2003, I.N. Rich, 1991].
Иммобилизация активирует моноцитарный росток кроветворения в течение часов после воздействия. Этот эффект может быть обусловлен действием гормонов надпочечников, которые индуцируют секреторную функцию макрофагов [Д.Н. Ма янский, 1981, Е.Д. Гольдберг, 1991, Е.Л.,Насонов, 1999], блокируют синтез ФНО-, угнетающего моноцитопоэз, вызывают вазоконстрикцию и снижают проницаемость сосудов, замедляя миграцию моноцитов из костного мозга в кровь [Д.Н. Маянский, 1985, Е.Д. Гольдберг и соавт., 1990]. При стрессе может иметь значение усиление миграции в костный мозг Т-лимфоцитов, которые в кооперации с элементами гемо поэзиндуцирующего микроокружения усиливают пролиферацию и дифференциров ку кроветворных клеток-предшественников [А.М. Дыгай и соавт.,1989, В.П. Шахов и соавт., 1999].
Участие глюкокортикоидных гормонов в регуляции моноцитопоэза подтвер ждается в экспериментах с введением синтетического глюкокортикоидного препара та – преднизолона. Под влиянием преднизолона наблюдается более значительное, чем при иммобилизационном стрессе увеличение количества клеток моноцитарного ряда в костном мозге, не сопровождающееся моноцитозом в периферической крови (рисунок 2). Полученные результаты косвенно подтверждают предположение неко торых авторов о «сдерживающем» влиянии глюкокортикоидных гормонов на мигра цию клеток крови из костного мозга, предохраняющем пул стволовых клеток от «пе рерасхода» [Е.Е.Фомичева и соавт., 1981, В.А. Козлов и соавт., 1982].
Результаты данного исследования позволяют ожидать угнетения моноцитопо эза при удалении надпочечников. Однако эксперименты с иммобилизацией адрена лэктомированных крыс (рисунок 2), свидетельствуют об активации моноцитарного ростка после воздействия, сопровождающейся увеличением выхода зрелых моноци тов в циркуляцию.
Общее количество моноцитов, тыс * 7000 * 6000 * 6 ч ас ов 2 с уток * 4000 * * ия ия е ия ия н н тны ло ло м м за ц за ц кто кто изо изо та к ли ли алэ алэ е дн е дн би би Ин р ен р ен мо мо Пр Пр Им Им Ад Ад Рисунок 2. Динамика общего количества моноцитов-макрофагов в костном мозге бедренной кости адреналэктомированных крыс после иммобилизации и у крыс после введения преднизолона Примечание: *- достоверные отличия от группы интактных животных Характерный для стресса эффект активации моноцитопоэза у адреналэктоми рованных животных свидетельствует о наличии дублирующих механизмов регуля ции активности системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ). В качестве такого ме ханизма может выступать вегетативная нервная система. Введение адреналина и ацетилхолина вызывает быстрое, но кратковременное повышение общего количе ства моноцитов в костном мозге, а также активирует выход зрелых моноцитов в кровоток (рисунок.3). Активирующее влияние медиаторов нервной системы может реализовываться через -адрено- и холинорецепторы, обнаруженные на мембране мо ноцитов [А.С. Савина и соавт., 1980, Е.Д. Гольдберг и соавт.,1997, A.N. Grabowoi, 2002].
Сходство ранней реакции моноцитарного ростка при стрессе у адреналэкто мированных животных и у животных после введения адреналина и ацетилхолина, позволяет предположить, что именно вегетативная нервная система обеспечивает срочную регуляцию адаптивной реакции со стороны кроветворной ткани, на кото рую в реальных условиях накладывается влияние глюкокортикоидных гормонов и других факторов.
3 00 * Общее количество * моноцитов, тыс 2 50 * 2 00 1 50 1 00 50 И нт ак тн ы е 6ч 1 су т 3 сут 7 су т В ве д е н и е ад р е н а л и н а В в е д ен и е а ц ети лх о л ин а Рисунок 3. Динамика общего количества моноцитов-макрофагов в костном мозге бедренной кости крыс после введения адреналина и ацетилхолина Примечание: *- достоверные отличия от группы интактных животных В регуляции моноцитопоэза участвует и гемопоэзиндуцирующее окружение, в частности тучные клетки, выделяющие широкий спектр биологически активных ве ществ. При введении гепарина в костном мозге происходит быстрое, но кратковре менное увеличение числа моноцитов, сходное с реакцией моноцитарного ростка при иммобилизационном стрессе или введении медиаторов вегетативной нервной систе мы. Гистамин вызывает более позднюю и значительную гиперплазию моноцитарно го ростка кроветворения (рисунок 4).
Общее количество * моноцитов, тыс * И нтактны е 1 сутки 4 сутки В вед ен и е геп ари н а В ведение гистам и на Рисунок 4. Динамика общего количества моноцитов-макрофагов в костном мозге бедренной кости крысы после введения гепарина и гистамина Примечание: *- достоверные отличия от группы интактных животных Реакция моноцитарного ростка на действие экстремальных факторов зависит от функционального состояния клеток СМФ. Стимуляция функциональной активно сти макрофагов иммуномодулятором тамеритом значительно усиливает и удлиняет вре мя активации моноцитопоэза в ответ на кровопотерю и резекцию печени (рисунок 5).
При ингибировании функциональной активности макрофагов каррагинаном на фоне кровопотери, число моноцитов в костном мозге, начиная с 3-х суток, возраста ет. Введение каррагинана при снижении количества клеток СМФ существенно не влияет на реакцию моноцитарного ростка.
Кровопотеря Резекция печени * * Общее количество моноциов, тыс * * * * * ут ут а ут час ов 3с 7с 1с час е ы тн ак нт И Кровопотеря Резекция Тамерит Каррагинан Рисунок 5. Динамика общего количества моноцитов-макрофагов в костном мозге бедренной кости крысы после кровопотери и резекции печени при изме нении функциональной активности системы мононуклеарных фагоцитов Примечание: *- достоверные отличия от группы интактных животных Одно из проявлений адаптивной роли макрофагов – их участие в образовании эритробластических островков и в регуляции пролиферации и созревания эритроид ных клеток. Макрофаги эритробластических островков составляют лишь часть сис темы мононуклеарных фагоцитов костного мозга. Большая часть клеток моноци тарного ряда не участвует в формировании ЭО и составляет популяцию свободных моноцитов-макрофагов. Вместе с тем, роль макрофагов ЭО весьма существенна для адаптивной перестройки эритропоэза.
Все исследованные воздействия: кровопотеря, гипоксическая гипоксия, введе ние фенилгидразина, иммобилизация, изменяют эритропоэтическую функцию мак рофагов (рисунок.6). Изменения эритропоэза затрагивают также «внеостровковую» часть кроветворной ткани и протекают в две стадии. Ранняя реакция кроветворной ткани на действие экстремальных факторов является достаточно типичной и прояв ляется в ускорении созревания эритроидных клеток в ЭО. Полученные данные со гласуются с современными представлениями о запуске стресс-эритропоэза в ранние сроки после действия экстремального фактора [Захаров Ю.М. с соавт., 2002].
островков х 10 /бедро * * эритробластических * * * * * Количество * * 4 часа 17 часов 6часов 3 сут 7 сут 1 сут 7 сут 3 сут 2 сут 6 часов 1 сут 6 часов 7 суток Интактные Кровопотеря Гипоксия Фенилгидразиновая анемия Иммобилизационный стресс Резекция печени Рисунок 6. Содержание эритробластических островков в костном мозге крыс при экстремальных воздействиях Примечание: *- достоверные отличия от группы интактных животных Последующее изменение эритропоэза характеризуется специфичными для каждого вида воздействия особенностями, касающимися скорости и механизма раз вития этой реакции.
Восполнение потери эритроцитов при кровопотере обеспечивается компенса торным выходом эритроидных клеток из «внеостровковой» части костного мозга в периферическую кровь, процессами активного образования новых ЭО и повторного вовлечения макрофагов в эритропоэз. Фенилгидразиновая анемия также сопровож дается выходом «внеостровковых» эритроидных клеток в периферическую кровь и образования новых ЭО. При гипоксии основным фактором активации эритропоэза явля ется новообразование ЭО и происходит накопление эритроидных клеток в костном мозге.
Иммобилизационный стресс характеризуется образованием новых эритробла стических островков и повторным вовлечением макрофагов в этот процесс. Актива ция эритропоэза сопровождается интенсивным выходом «внеостровковых» эритро идных клеток из костного мозга.
На эритропоэтическую функцию макрофагов в ЭО влияют, как общее количест во клеток системы мононуклеарных фагоцитов, так и их функциональная активность.
При уменьшении в организме числа клеток СМФ, в результате частичной ре зекции печени, наблюдается сокращение общего количества ЭО (рисунок 6). Эри тропоэтическая функция обеспечивается повторным вовлечением макрофагов в эри тропоэз, тогда как включения новых моноцитов в образование ЭО и расширения плацдарма эритропоэза не происходит, что, вероятно, объясняется участием моноци тов-макрофагов в регенераторных процессах печени.
Стимуляция функциональной активности макрофагов тамеритом при кровопотере приводит к более активному образованию новых ЭО и усилению повторного вовлечения макрофагов в эритропоэз (таблица 1). Однако при повреждении печени тамерит не оказы вает стимулирующего влияния на эритропоэтическую функцию макрофагов (таблица 2), что свидетельствует о значении функционального состоянии всей СМФ в эритропоэзе.
Таблица Динамика абсолютного количества эритробластических островков (ЭО) раз ных классов зрелости в костном мозге крыс после кровопотери при изменении функциональной активности системы мононуклеарных фагоцитов (? 10? / бедро) Срок Абсолют- ЭО 1-го ЭО 2-го ЭО3-го Инволю- Реконструи после ное коли- класса класса класса цирующие рующиеся крово- чество ЭО ЭО ЭО потери Интакт- 118,8911,51 4,660,92 16,240,52 18,611,06 55,972,33 23,420, ные Тамерит 1 сут 100,28±9,36 22,74±1,63* 14,32±2,04 16,42±1,30* ** 35,85±2,85* 13,57±0,74* ** 3 сут 205,64±11,6 72,03±5,42* ** 44,23±1,2* ** 29,75±1,98* 34,41±2,63 26,13±4,73* ** 232,56±10,72 57,34±2,31* **42,54±3,95* ** ** * ** 7 сут 35,12±3,64 63,07±6,78 35,25±2,68* ** Каррагинан 1 сут 36,6±2,38* ** 8,04±0,13* ** 9,76±0,58* ** 7,85±0,51* ** 4,53±0,64* ** 6,95±0,75* ** 3 сут 28,1±3,67* ** 15,7±0,78* ** 5,85±0,22* ** 1,28±0,18* ** 2,83±0,12* ** 2,64±0,18* ** 7 сут 7,86±0,27* ** 2,87±0,18* ** 2,28±0,25* ** 1,73±0,35* ** 0,82±0,02* ** 0,74±0,04* ** Примечание: *- достоверные отличия от группы интактных животных ** - достоверные отличия от группы животных без введения препаратов Таблица Динамика абсолютного количества эритробластических островков (ЭО) раз ных классов зрелости в костном мозге крыс после резекции печени на фоне изменения функциональной активности клеток системы мононуклеарных фа гоцитов (? 10? / бедро) Срок после Интактные Тамерит Каррагинан воздействия животные 4 часа 17 часов 4 часа 17 часов Абсолютное количе- 9 0 ± 2, 3 5 133,33 6,08* ** 61,666,73* 79,34±5,51 58,33+8,37* ство ЭО ЭО 1-го класса 3,87 ± 0,41 25,83±1,80* 27,99 1,39* 25,91,55* 6,730,47* ** ЭО 2-го класса 12,87±1,54 21,33±1,49* 22,21 1,33* 12,630,76* 13,391, ЭО 3-го класса 10,44±0,83 15,7±1,25* ** 36,04 2,16* 6,830,4 * 16,761,17* ** Инволюцирующие 47,61±2,25 35,11 1,75* ** 11,410,79* ** 9,640,67* ** 13,390,97* ** ЭО Реконструирующиеся 15,39±1,37 11,70 0,58* 4,390,31* 6,080,43* ** 6,730,54* ЭО Примечание: *- достоверные отличия от группы интактных животных ** - достоверные отличия от группы животных без введения препаратов Блокада фагоцитарной активности макрофагов каррагинаном при кровопотере вызывает резкое сокращение образования новых эритробластических островков и повторного вовлечения макрофагов в эритропоэз. На фоне резекции печени угнете ние эритропоэтической функции моноцитов костного мозга, проявляется в меньшей степени.
В организме функциональная активность макрофагов, а, следовательно, и их эритропоэтические свойства регулируются тесно взаимосвязанными нервными, эн докринными и локальными механизмами.
Большое значение для поддержания эритропоэза в эритробластических остров ках имеют гормоны надпочечников [Захаров Ю.М. с соавт., 2002, Дыгай А.М. с со авт., 2004]. Активация эритропоэза в эритробластических островках у животных после иммобилизационного стресса проявляется усилением формирования новых эритробластических островков, увеличением реконструкции уже существующих эритробластических островков, ускорением созревания эритроидных клеток и раз витием ретикулоцитоза.
Эти процессы являются результатом взаимодействия гормонов коркового и мозгового вещества надпочечников. В результате целенаправленного воздействия на отдельные звенья надпочечниковой системы была предпринята попытка определить роль каждого компонента в регуляции эритропоэза.
После введения преднизолона в костном мозге происходит немедленная акти вация эритропоэза в эритробластических островках: повышается интенсивность во влечения КОЕэ в дифференцировку, повторное вовлечения макрофагов в образова ние эритробластических островков, скорость созревания эритроидных клеток (таб лица 3). В условия стресса эти изменения развиваются постепенно, ко 2-м суткам по сле начала воздействия. Подобный эффект, вероятно, обусловлен свойством глюко кортикоидных гормонов индуцировать секреторную функцию макрофагов, блокиро вать синтез цитокинов ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО -, угнетающих эритропоэз, и цитокино вых рецепторов. Доказано также, что глюкокортикоиды вызывают вторичную вазо констрикцию и снижают проницаемость сосудов [Насонов Е.Л., 1987].
Таблица Динамика абсолютного количества эритробластических островков (ЭО) раз ных классов зрелости в костном мозге крыс после иммобилизационного стрес са и после введения преднизолона (? 10? / бедро) Время Абсолютное ЭО 1-го ЭО 2-го ЭО 3-го Инволюци- Реконструи после количество класса классса классса рующие ЭО рующиеся воздей- ЭО ЭО ствия И н т а к т н ы е 135,266,46 5,260,87 18,351,08 20,592,02 63,955,33 26,311, Иммобилизация 6 час 76,64±10,16* 8, 1 3 ± 1, 3 * 2 0, 8 0 ± 3, 6 1 12,88±2,08*1 2, 7 3 ± 2, 1 *1 8, 8 8 ± 3, 2 сут 268,31±17,18* 58,78±6,8* 75,02± 6, 8*23,03± 3, 39 4 7, 0 2 ± 8, 7 5 1, 2 2 ± 6, 8 * Адреналэктомия +иммобилизация 6 часов 60,55±5,4* 9,81±2,18* 1 4, 4 4 ± 2, 8 6,02±0,82* ** 17,98± 4,7 *12,22±1,88* 2 сутки 142,65±27,23** 41,99±9,04* 42,91±11,9* ** 1 4, 0 9 ± 6, 2 19,26±7,3* ** 22,37±1,08** Преднизолон 6 часов 188,65±15,83* 44,37±5,48* 49,10±13,64* 18,73± 2,78 4 1, 1 ± 6, 7 * 552,17±8,52* 2 сутки 157,98±7,35 6 4, 0 3 ± 3, 7 * 44,21±3,17* 7, 4 ± 1, 0 5 * 13,52± 2,5 * 2 8, 5 6 ± 1, Примечание: *- достоверные отличия от группы интактных животных ** - достоверные отличия от группы животных без адреналэктомии Удаление надпочечников в целом не нарушает реализацию эритропоэтической функции моноцитов-макрофагов, но уменьшает выраженность адаптивной реакции эритроидной ткани на иммобилизацию. Так, у адреналэктомированных крыс наблю дается меньшая, по сравнению с неоперированными животными интенсивность об разования эритропоэтических островков, более медленное созревание эритроидных клеток, менее активное повторное вовлечение макрофагов в эритропоэз, замедлен ное восстановление внеостровковой части эритрона после компенсаторной реакции выхода ретикулоцитов в циркуляцию. Уровень эритропоэтической активности у ад реналэктомированных крыс практически не превышает физиологический, тогда как у здоровых животных иммобилиация приводит к напряжению эритропоэза (таблица 3).
Влияние медиаторов вегетативной нервной системы и физиологически ак тивных веществ, секретируемые тучными клетками на эритропоэтическую функцию моноцитов-макрофагов реализуется различными способами (таблица 4). Адрена лин способствует вовлечению новых макрофагов в эритропоэз, ацетилхолин и гис тамин увеличивают интенсивность повторного вовлечения макрофагов в эритропо эз. Введение этих веществ приводит к ускорению созревания и выхода эритроидных клееток из зрелых эритробластических островков и «внеостровковой» части костно го мозга. Под воздействием гепарина снижается интенсивность вовлечения КОЕэ в дифференцировку, замедляется скорость созревания и выход в кровь эритроидных кле ток.
Как медиаторы вегетативной нервной системы, так и физиологически актив ные вещества, секретируемые тучными клетками могут оказывать модулирующее влияние на костномозговое кроветворение через моноциты, изменяя их функцио нальное состояние моноцитов, например, фагоцитарную или секреторную актив ность Показано, что гистамин, действуя через Н1 - рецепторы способен усиливать активность - нафтилацетатэстеразы в моноцитах и стимулировать секреторную ак тивность мононуклеарных клеток Действие адреналина и ацетилолина может реа лизовываться через адрено- и холинорецепторы на мембране полипотентной стволо вой клетки крови и зрелых моноцитах [Е.Д. Гольдберг соавт., 1990].
Угнетающее воздействие гепарина на эритропоэз вероятно связано с описан ным в литературе отрицательным влиянием этого препарата на функциональную ак тивность моноцитов, в частности, блокадой ряда макрофагальных ферментов [А.М.
Дыгай с соавт.,1992].
Таблица Динамика абсолютного количества эритробластических островков (ЭО) разных классов зрелости в костном мозге крыс после введения препаратов (?10? бедро) / Время Абсолют- ЭО 1-го ЭО 2-го ЭО3-го Инволю- Реконструи после ное количе- класса класса класса цирующие рующиеся введения ство ЭО ЭО адрена- ЭО,х10?/ 118,8911,5 4,660,92 16,240,52 18,611,06 10?/бедро 23,420, Интактные 55,972, Адреналин 6 часов 88,14±9,69 21,02±4,72* 16,12±3,12 3,35±2,26* 23,54±3,3* 24,61±3, 1 сутки 72,83±5,77* 19,74±2,38* 14,68±0,05* 4,21±0,45* 17,04±1,79* 22,54±0, 3 сутки 281,78±23,31* 47,34±8,83* 46,68±4,32* 42,32±6,61* 82,55±9,57* 62,93±7,92* 7 сутки 97,61±13,39 6, 3 2 ± 1, 0 9 26,91±6,42 29,01±6,42 11,48±2,1* 2 3, 9 4 ± 3, Ацетилхолин 6 часов 86,90±10,11 8,76±2,28* 18,19±2,81 26,59±2,89 16,19±0,84* 16,66±2,13* 1 сутки 54,26±6,54* 16,27±3,39* 11,25±2,25 13,56±2,88 5,24±1,18* 7,96±1,72* 3 сутки 98,97±23,31 12,28±2,58* 30,2±7,65* 5,82±1,32* 21,46±2,2* 23,28±4, 7 сутки 97,61±11,48 36,26±5,28* 35,32±3,67* 18,04±3,68 16,58±5,44* 5,76±1,85* Гепарин 1 сутки 51,325,01* 1,790,64* 2,881,05* 8,731,30* 23,352,72* 14,541,03* 4 сутки 29,444,16* 2,430,67* 2,490,56* 4,390,70* 13,641,9 7,711,16* ** Гистамин 1 сутки 76,996,13* 26,042,65* 24,881,91 8,650,75* 10,511,34* 5,881,34* 4 сутки 265,3928,49* 46,185,13* 97,4510,06* 39,654,53* 27,923,41* 56,126,01* Примечание: *- достоверные отличия от группы интактных животных Таким образом, регуляции моноцитопоэза и эритропоэтических свойств мак рофагов осуществляется различными взаимосвязанными механизмами с участием эндокринной и нервной систем, а также гемопоэзиндуцирующего микроокружения.
ВЫВОДЫ 1. Типичной реакцией моноцитарного ростка кроветворения на различные экс тремальные воздействия является неспецифическая активация моноцитопоэза. Ско рость и продолжительность этой реакции определяются природой экстремального фактора.
2. Активация моноцитопоэза сопровождается изменением эритропоэтической функции моноцитов-макрофагов костного мозга и развитием адаптивной реакции в эритробластических островках и «внеостровковой» части костного мозга. Ранние сроки после действия экстремального фактора характеризуются ускорением созре вания и выхода эритроидных клеток из эритробластических островков. Дальнейшая активация эритропоэза определяется специфическими для каждого воздействия осо бенностями.
3. При острой кровопотере адаптивная реакция эритроидного ростка кроветво рения обеспечиваются компенсаторным выходом эритроидных клеток из «внеост ровковой» части костного мозга в периферическую кровь, а также процессами ак тивного образования новых эритробластических островков и повторного вовлечения макрофагов в эритропоэз.
4. Адаптивная реакция кроветворной ткани при фенилгидразиновой анемии про является новообразованием эритробластических островков и выходом «внеостров ковых» эритроидных клеток в периферическую кровь.
5. При гипоксической гипоксии активация эритропоэза разворачивается главным образом в эритробластических островках костного мозга. Основным фактором акти вации эритропоэза являются пролиферативные процессы во вновь образованных эритробластических островках, сопровождающиеся накоплением эритроидных кле ток в костном мозге.
6. Иммобилизационный стресс сопровождается образованием новых эритробла стических островков, повторным вовлечением макрофагов в этот процесс и выходом «внеостровковых» эритроидных клеток из костного мозга.
7. Эритропоэтическая функция макрофагов зависит как от количества клеток, так и от функционального состояния клеток системы мононуклеарных фагоцитов.
На удаление части клеток системы мононуклеарных фагоцитов костный мозг отве чает уменьшением числа эритробластических островков и активацией повторного вовлечения макрофагов в эритропоэз. Стимуляция функциональной активности мак рофагов тамеритом приводит к усилению эритропоэтической функции макрофагов ко стного мозга. Блокада фагоцитарной активности макрофагов каррагинаном угнетает эритропоэтическую функцию моноцитов костного мозга.
8. Эритропоэтическая функция моноцитов - макрофагов находится под контро лем эндокринной системы, регулирующей интенсивность развития адаптивных ре акций в эритробластических островках. Введение преднизолона сопровождается не медленной активацией эритропоэза в эритробластических островках. У адреналэк томированных животных наблюдается менее интенсивная активация эритропоэза.
9. Медиаторы вегетативной нервной системы адреналин и ацетилхолин активи руют эритропоэтическую функцию макрофагов и выход «внеостровковых» эритро идных клеток из костного мозга. Адреналин способствует расширению плацдарма эритропоэза за счет новообразования эритробластических островков. Ацетилхолин увеличивает интенсивность повторного вовлечения макрофагов в эритропоэз.
10. Регуляция эритропоэза в эритробластических островках осуществляется при взаимодействии макрофагов с тучными клетками. Под воздействием гистамина уве личивается интенсивность образования новых эритробластических островков, по вторного вовлечения макрофагов в эритропоэз, скорость созревания и выхода эрит роидных клеток из эритробластических островков. Гепарин снижает интенсивность образования эритробластических островков, замедляет скорость созревания и выход в кровь эритроидных клеток.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Улитко М.В., Юшков Б.Г. Особенности реакции костного мозга на гипо ксию // Иммунология Урала. – 2003. № 1 (3). С.68-69.
2. Улитко М.В. Особенности реакции моноцитарного ростка кроветворения на кровопотерю // Эколого-физиологические проблемы адаптации: материалы XI международного симпозиума. М., 2003. С.557-558.
3. Улитко М.В., Юшков Б.Г. Роль моноцитов-макрофагов в адаптивных реакциях кроветворной ткани при экстремальных воздействиях // International Journal on Immunorehabilitation. М., 2003. Т.5. №2. С.166.
4. Сумин М.Н., Данилова И.Г., Улитко М.В., Юшков Б.Г. Реакция системы эритрона белых крыс на резекцию печени // Российский физиологический журнал им. И.М.
Сеченова. 2004. Т. 90, № 8. – Прил., ч.2. С.149.
5. Улитко М.В., Юшков Б.Г. Роль моноцитов костного мозга в адаптивных реакциях кроветворной ткани при стимуляции эритропоэза // Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова. 2004. Т. 90, № 8. – Прил., ч.2. С.242-243.
6. Улитко М.В., Юшков Б.Г. Участие моноцитов-макрофагов в компенсаторно приспособительных реакциях кроветворной ткани // Компенсаторно приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты: материалы второй Всероссийской научно-практической конференции. Новосибирск, 2004. С.79.
7. Абидов М.Т, Юшков Б.Г., Данилова И.Г., Сумин М.Н., Улитко М.В., Старовой тенко Ю.Л. Изменение эритропоэза в процессе регенерации печени после час тичной гепатэктомии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.
2005. Т. 139. №5. С.507-513.
8. Юшков Б.Г., Абидов М.Т., Данилова И.Г., Сумин М.Н., Улитко М.В. Роль отдель ных звеньев иммунной системы в формировании реакций красной крови после частичной гепатэктомии // Молекулярные механизмы регуляции функции клетки:
международный симпозиум. – Тюмень, 2005. С.106-107.
9. Улитко М.В., Юшков Б.Г., Ослина Д.С. Влияние медиаторов вегетативной нерв ной системы на макрофагальную регуляцию эритропоэза // Научные труды I съезда физиологов СНГ. М., 2005.Т. 2. С.94.
10. Юшков Б.Г., Данилова И.Г., Улитко М.В., Чиши М.А., Игнатенко И.Н.. Особен ности эритропоэза в эритробластических островках костного мозга в процессе регенерации печени после частичной гепатэктомии // Здравоохранение Башкор тостана. 2005. № 7. С.221-224.
11. Улитко М.В., Быкова М.Ю., Юшков Б.Г. Роль гормонов надпочечников в макро фагальной регуляции эритропоэза // Иммунология Урала. 2006. № 1(5).
С.29-30.
12. Улитко М.В., Шутова С.А., Юшков Б.Г. Влияние гепарина и гистамина на эри тропоэтическую функцию моноцитов-макрофагов костного мозга // Иммуноло гия Урала. 2006. № 1(5). С.30-31.
13. Юшков Б.Г., Улитко М.В., Быкова М.Ю., Шутова С.В. Надпочечниковая регуля ция эритропоэтической функции макрофагов // Вестник Уральской медицин ской академической науки. – 2006. № 2-3 (15). – С.48.
14. Улитко М.В., Кореняк Д.А., Изменения в центральном звене эритропоэза в усло виях адоптивного переноса лимфоцитов // Материалы региональной научно практической конференции. – Красноярск, 2007. – С.165-167.
15. Данилова И.Г., Юшков Б.Г., Абидов М.Т., Чиши М.А., Тюменцева Н.В., Гетте И.Ф., Улитко М.В. Влияние макрофагального звена иммунной системы на вос становительный рост тканей // Сибирский консилиум: медико-фармацевтический журнал. – 2007. – № 7 (62). – С.33.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ КОЕэ - колониеобразующая единица эритроцитарная ЭО - эритробластический островок СМФ - система мононуклеарных фагоцитов КСФ-ГМ - колониестимулирующий фактор гранулоцитарно-моноцитарный ИЛ - интерлейкин ФНО - фактор некроза опухоли