Изменения структуры плазматических мембран лимфоцитов и эритроцитов при персистентных вирусных инфекциях
На правах рукописи
ТОКАРЕВА Наталья Валентиновна ИЗМЕНЕНИЯ СТРУКТУРЫ ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН ЛИМФОЦИТОВ И ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ПЕРСИСТЕНТНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЯХ 14.00.16 – патологическая физиология 03.00.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Томск-2004 2
Работа выполнена в ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздрава России, ГУ НИИ биохимии СО РАМН Научные руководители:
доктор медицинских наук Рязанцева Наталья Владимировна доктор медицинских наук, Панин профессор, академик РАМН Лев Евгеньевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, Дыгай профессор, академик РАМН Александр Михайлович доктор медицинских наук, Канская профессор Наталья Викторовна
Ведущая организация:
ГОУ ВПО Красноярская государственная медицинская академия Мин здрава России
Защита состоится «9» декабря 2004 г. в 1200 часов на заседании диссерта ционного совета Д 208.096.01 при Сибирском государственном медицинском университете (634050, Томск, ул. Московский тракт, 2)
С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета (634050, Томск, пр.
Ленина, 107)
Автореферат разослан «_»_2004 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Суханова Г.А.
Актуальность исследования. В последние десятилетия вирусные ин фекции приобрели характер серьезной медико-социальной проблемы вследст вие их широкого распространения и крайне неблагоприятного влияния на уро вень здоровья и воспроизводства населения [Злобин В.И., 2000;
Антонов П.В., 2001].
При рассмотрении патогенетических основ возникновения и развития ви русных инфекций в последние годы привлекает своей актуальностью явление длительной персистенции вирусов. Вирусная персистенция играет важную роль в распространении вирусной инфекции, поскольку вирусы могут передаваться при переливании крови и ее препаратов, медицинских манипуляциях, половых контактах [Маянский А.Н., 1998;
Кузьмин Г.В. и соавт., 2000].
Несмотря на субклиническое, инапарантное течение ряда вирусных ин фекций, в основе механизмов формирования вирусоносительства лежит репли кация вируса со сборкой и размножением вириона или, по крайней мере, синтез отдельных вирусных компонентов в тканях инфицированного организма, что во многом обусловлено интеграцией вируса в клеточный геном. Кроме того, ис следованиями последних лет удалось показать, что длительное развитие и ста новление хронической вирусной инфекции, а также "бессимптомное" вирусо носительство сопровождается постепенным изменением генотипа возбудителя, накоплением стабильных мутантных форм вирусов [Uchida T. et. al., 1994;
Val liammai T. et. al., 1995;
Тотолян А.А., 1999;
Хаитов Р.М., 2000]. С другой сторо ны, при рассмотрении патогенеза вирусоносительства нельзя пренебрегать по зицией взаимной «адаптации» в системе «вирус-макроорганизм», не исклю чающей биологическую целесообразность длительного сохранения вируса в ор ганизме [Антонов Т.В., 1999;
Holub M., 2002].
В изучении патогенеза вирусных инфекций особое место занимает про блема взаимодействия вируса с "клеткой-хозяином" [Исаева М.П. и соавт., 1998;
Маянский А.Н., 1999;
Ройт А., 2000, Хаитов Р.М., 2000]. Точное знание молекулярных механизмов взаимодействия вирусов с чувствительными клет ками, которые вследствие цитопатического действия вируса часто гибнут, мо жет позволить найти новые подходы к созданию антивирусных средств, блоки рующих репликацию вирусов на ранних этапах их проникновения в клетку [Букринская А.Г., 1991;
Протопопова Е.В. и соавт., 1998;
Покровский В.И., 2000].
Патология, обусловленная длительной персистенцией вирусов, чрезвы чайно разнообразна, характеризуется широким спектром функциональных из менений не только клеток, тропных к действию вирусов, но и клеточных сис тем, которые не явились непосредственной мишенью действия патогена [Маян ский А.Н., 2000;
Крыжановский Г.Н., 2001].
Среди структурно-функциональных систем клетки важную роль играет плазматическая мембрана, обеспечивающая барьер клетки, ионный транспорт, электрическую возбудимость, межклеточную коммуникацию, внутриклеточ ную передачу информации. Нарушение любого из этих свойств клетки может приводить к изменению ее жизнедеятельности или даже гибели [Болдырев А.А., 1990;
Watala C., 1995;
Геннис Р., 1997;
Горошинская И.А. и соавт., 2000].
В частности, участие иммунокомпетентных клеток в процессах распознавания возбудителя и формирования иммунного ответа определяется метаболизмом клетки, структурными и функциональными свойствами плазматической мем браны [Булыгин Г.В. и соавт., 1992;
Хаитов Р.М., 2000;
Takakuwa Y., 2001]. В связи с этим при рассмотрении патогенетических основ формирования перси стенции вирусной инфекции вполне закономерен интерес исследователей к вы явлению структурно-функциональных особенностей плазматических мембран, оценке мембранодестабилизирующих процессов [Львов Д.К. и соавт., 2000;
Но вицкий В.В. и соавт., 2000;
Sok M., 2002].
Изучение особенностей структуры, метаболизма и функционального со стояния клеточных мембран клеток крови, играющих важную роль в обеспече нии гомеостаза, при хронических вирусных инфекциях, несомненно, расширит имеющиеся представления о патогенезе этого состояния и, возможно, послужит основой для разработки эффективных методов диагностики и коррекции сис темных нарушений при данной патологии [Svetina S., 2001;
Фаллер Д.М., 2003].
В связи с вышесказанным целью предпринятого исследования явилось выявление общих закономерностей и особенностей изменения структуры плаз матической мембраны лимфоцитов и эритроцитов при длительной персистен ции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Дать комплексную характеристику структурного состояния плазматической мембраны лимфоцитов и эритроцитов при длительной персистенции виру сов гепатита В и С, клещевого энцефалита.
2. Выявить особенности структурной организации плазматической мембраны лимфоцитов и эритроцитов у больных клещевым энцефалитом и хрониче ским вирусным гепатитом в зависимости от вида возбудителя, длительности и активности патологического процесса.
3. Выявить общие закономерности и особенности структурных изменений клеточных мембран лимфоцитов и эритроцитов при длительной персистен ции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита.
4. Оценить роль влияния дифенсиновых белков в механизмах модификации плазматических мембран лимфоцитов и эритроцитов при инфекционном процессе.
Положения, выносимые на защиту 1. При длительной персистенции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефа лита имеет место модификация структуры плазматических мембран клеток лимфоидной (лимфоциты) и нелимфоидной (эритроциты) природы.
2. Изменения структурных особенностей лимфоцитарных и эритроцитарных мембран при персистентных вирусных инфекциях (вирусный гепатит В и С, клещевой энцефалит) являются неспецифическими и носят однонаправлен ный характер. Выраженность изменений структуры плазматических мем бран лимфоцитов и эритроцитов при персистентных вирусных инфекциях не зависит от таксономической принадлежности возбудителя, длительности и активности патологического процесса.
3. Механизмы нарушений структуры плазматических мембран клеток крови при вирусных инфекциях сопряжены с мембраномодифицирующим дейст вием дифенсиновых белков (на модели аполипопротеина А-I).
Научная новизна. Впервые проведено сравнительное исследование структуры плазматических мембран лимфоцитов и эритроцитов при хрониче ских персистентных вирусных инфекциях (вирусы гепатита В и С, клещевого энцефалита). Показано, что изменения структурной организации плазматиче ских мембран клеток крови (лимфоциты, эритроциты) при хронической перси стенции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита однотипны и носят не специфический характер. Впервые выявлено, что характер изменений структу ры плазматических мембран клеток крови (лимфоциты, эритроциты) при пер систенции вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита не зависит от таксо номической принадлежности вирусов, длительности и активности патологиче ского процесса. Впервые рассмотрен вопрос о роли дифенсиновых белков (на модели аполипопротеина А-I) в механизмах модификации плазматических мем бран при вирусной инфекции.
Теоретическая и практическая значимость. В результате исследования получены новые данные фундаментального характера о состоянии плазматиче ских мембран лимфоцитов и эритроцитов при длительной персистенции виру сов гепатита В и С, клещевого энцефалита. Выявленные однотипные измене ния структуры плазматических мембран клеток лимфоидной (лимфоциты) и нелимфоидной (эритроциты) природы при длительной вирусной персистенции являются фактическим подтверждением генерализованного характера повреж дения и неспецифичности модификации плазматических мембран разных кле точных систем.
Полученные по итогам работы данные фундаментального характера мо гут быть использованы для разработки целенаправленной патогенетически обоснованной мембранотропной методологии коррекции системных наруше ний при хронических вирусных инфекциях.
Реализация и апробация работы. Результаты исследования использу ются в курсе лекций по патологической физиологии (раздел «Патофизиология клетки», «Патофизиология инфекционного процесса», «Патофизиология им мунной системы») на лечебном и педиатрическом факультетах Сибирского го сударственного медицинского университета.
Результаты исследования доложены и обсуждены на Пироговской науч ной конференции (г. Москва, 2003), Межрегиональной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С.П. Карпова (г. Томск, 2003), VI Российском съезде «Врачей инфекционистов» (г. Санкт Петербург, 2003), Второй международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (г. Москва, 2004), Межгородской конференции моло дых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (г. Санкт-Петербург, 2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, 9 из них раз мещены в центральных рецензируемых журналах.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы, включающего 320 источников, из которых 208 отечественных и 112 иностранных. Диссертация иллюстрирована 25 таблицами, 2 рисунками.
Характеристика клинического материала и методы исследования В основу настоящей работы положены результаты комплексного клини ко-лабораторного исследования структурно-функционального статуса мембра ны эритроцитов и особенностей структурной организации лимфоцитарной мембраны у 173 пациентов (100 мужчин, 73 женщины в возрасте от 18 до лет, средний возраст - 30±3 лет) с персистенцией вирусов клещевого энцефали та, гепатитов В и С, проводившегося на базе инфекционных отделений клиник ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет Минздрава России», медико-санитарной части «Строитель», городской больницы № 3 г.
Томска и отделения гастроэнтерологии Томской областной клинической боль ницы. Набор клинического материала проводился под руководством зав. ка федрой инфекционных болезней СибГМУ МЗ РФ д.м.н., профессора А.В. Ле пехина и зав. кафедрой терапии ФПК и ППС д.м.н., профессора Э.И. Белоборо довой, за что автор приносит им свою глубокую признательность.
Клинически и анамнестически у всех обследованных лиц были исключе ны инфекционные заболевания другой этиологии, обострение хронических воспалительных процессов, наследственные и психические болезни, а также злоупотребление алкоголем и наркотическими средствами.
Контрольную группу составили 40 практически здоровых доноров с ана логичными характеристиками по полу и возрасту.
Первую группу обследованных составили 68 пациентов с длительной персистенцией антигена вируса клещевого энцефалита (более 6 мес с момента инфицирования). Верификацию диагноза вируса клещевого энцефалита прово дили на основании данных эпидемиологического анамнеза (факт присасывания клеща, пребывание в эпидемическом очаге и др.), результатов лабораторного исследования (определение уровня специфических антител к антигену вируса клещевого энцефалита с помощью иммуноферментного анализа, реакции не прямой гемагглютинации, обнаружение вирусной РНК методом полимеразной цепной реакции), а также оценки неврологического статуса.
Были выделены 2 группы обследованных: пациенты с хроническим носи тельством вируса клещевого энцефалита без клинических проявлений нейро инфекции (39 человек) и пациенты с хроническим носительством вируса кле щевого энцефалита с минимальными клиническими проявлениями заболевания (29 человек). Клиническая картина нейроинфекции у таких больных включала цереброгенную астению (снижение работоспособности, утренние головные бо ли, повышенная утомляемость, снижение памяти) и остаточную неврологиче скую симптоматику (анизорефлексия, мигрирующая невралгия, миалгия, ло кальное снижение болевой чувствительности). Из вегетативных расстройств обращали на себя внимание лабильность артериального давления, неустойчи вость настроения, гипергидроз, стойкий красный дермографизм, нарушение сна.
Диагноз хронического вирусного гепатита устанавливался в соответствии с классификацией, принятой Всемирным конгрессом гастроэнтерологов в Лос Анджелесе [1994], и основывался на наличии клинико-инструментальных сим птомов (гепато-, спленомегалия) и клинико-лабораторных синдромов (холеста за, цитолиза, мезенхимально-воспалительного синдрома). Этиологическая ве рификация диагноза проводилась на основании выявления в сыворотке крови ДНК HBV, РНК HCV (молекулярно-генетическим методом ПЦР), серологиче ских маркеров HBV (HbeAg, HBsAg, анти-HBc IgM, анти-Hbcor) и HCV (анти HCV IgG к core, С - протеину, неструктурным белкам (NS3, NS4, NS5, анти HCV IgM). По выраженности некроза паренхимы и воспалительной клеточной инфильтрации (некротически-воспалительная активность) в биоптатах печени определяли степень активности хронического гепатита, оценивая выраженность гистологических признаков в баллах в соответствии с «Индексом гистологиче ской активности» по R.J. Knodell и соавт. [1981].
Среди обследованных с персистенцией вирусов гепатита В и С у 11 боль ных определялся хронический гепатит В умеренной степени активности, у 23 – хронический гепатит С умеренной степени активности, у 11 – хронический ге патит В+С умеренной степени активности;
28 больным был поставлен диагноз – хронический гепатит В слабовыраженной степени активности, 25 – хрониче ский гепатит С слабовыраженной степени активности, 7 – хронический гепатит В+С слабовыраженной степени активности (табл. 1).
Материалом исследования являлась венозная кровь обследованных лиц, взятая утром натощак. Кровь стабилизировали гепарином (25 Ед/мл).
Мембраны эритроцитов выделяли методом, предложенным J. T. Dodge et.
al. [1963]. Микробиуретовым методом определяли содержание белка в мембра не.
Определение спектральных характеристик взаимодействия мембраны эритроцитов с флуорофорами проводили на спектрофлуориметре «Hitachi MPF-4» (Япония). Выбор флуоресцентных зондов осуществлялся, исходя из возможности одновременного сканирования глубинных и поверхностных слоев мембраны. В качестве флуорофоров были выбраны следующие соединения:
пирен, 1-анилинонафталин-8-сульфонат (АНС), фенил-1-нафтиламин (ФНА) («Sigma», США) [Владимиров Ю. А., 1980].
Для оценки микровязкостных свойств липидной фазы мембраны эритро цитов рассчитывали коэффициенты эксимеризации пирена (I470/I370 и I470/I390), равные отношению максимумов интенсивностей флуоресценции эксимерной формы зонда к мономерной при длинах волн возбуждающего света 285 и нм. Процент индуктивно-резонансного переноса энергии с триптофана на пи рен, позволяющий судить о белково-липидных взаимодействиях в Таблица Распределение здоровых доноров и больных с персистенцией вирусов гепатита и клещевого энцефалита в соответствии с использованными методами исследования плазматических мембран эритроцитов и лимфоцитов Группы обследованных Пациенты с длительной Пациенты с хроническим вирус персистенцией вируса ным гепатитом Здо- энцефалита клещевого № ро Методы исследования слабовыражен- умеренной без клини вые с клинически ной степени степени ческих до- ми проявле активности активности проявлений норы ниями нейро нейроин В+ В+ инфекции В С В С фекции С С 1 Флуоресцентное зонди рование мембраны 40 22 17 7 11 21 10 16 эритроцитов зондом пирен 2 Флуоресцентное зонди рование мембраны 23 19 15 7 7 16 7 16 эритроцитов зондом фенилнафтиламин 3 Флуоресцентное зонди рование мембраны 23 19 15 7 7 7 7 16 эритроцитов зондом анилинонафталин-8 сульфонат 4 Определение активно сти Na+,K+-АТФазы в 31 22 15 7 9 20 9 14 мембране эритроцитов 5 Исследование структу ры плазматической мембраны лимфоцитов 39 22 17 7 11 21 10 16 с использованием флуоресцентного зонда пирен 7 Изучение содержания липидов в мембране 16 7 6 3 5 7 2 9 эритроцитов 8 Изучение содержания липидов в плазматиче 16 7 6 3 5 7 2 7 ской мембране лимфо цитов мембране, рассчитывали по формуле: R=(1-I*340/I340)·100%, где I340 - интенсив ность собственной флуоресценции мембраны эритроцитов при возбуждении светом с длиной волны 285 нм в отсутствии пирена, I*340 - интенсивность соб ственной флуоресценции мембраны эритроцитов при возбуждении светом с длиной волны 285 нм при добавлении пирена. Результаты выражали в услов ных единицах.
Для расчета поляризации флуоресценции зонда ФНА использовали фор мулу: Р=(F - F(/)F + F,)где F и F -интенсивности флуоресценции, измеряемые при прохождении света флуоресценции через поляроид, ориентированный параллельно и перпендикулярно направлению вектора поляризации возбуждающего света. Величину степени поляризации флуоресценции зонда ФНА выражали в условных единицах.
Для изучения структурных особенностей поверхностных слоев мембраны эритроцитов проводили флуоресцентное зондирование отрицательно заряжен ным зондом АНС. Определение константы связывания и числа мест связывания зонда АНС было рассчитано графическим методом двойных обратных коорди нат. Полученные величины выражали в условных единицах.
Определение активности Na+,K+-АТФазы в мембране эритроцитов прово дили методом, разработанным А. М. Казенновым и соавт. [1984]. Уровень Pi определяли по методу P. S. Chen et al. [1956].
Проводили исследование структуры плазматической мембраны лимфоци тов с помощью флуоресцентного зондирования зондом пирен [Добрецов Г. Е., 1989]. Для этого выделяли суспензию лимфоцитов по методу Дж. Б. Натвиг и соавт. [1980], подсчитывали их количество.
Липиды плазматических мембран эритроцитов и лимфоцитов экстрагиро вали хлороформ-метаноловой смесью по методу J. Folch et. al. [1957]. Определя ли их абсолютное содержание по методу И.А. Тарановой [1987].
В рамках диссертационной работы был выполнен экспериментальный блок, связанный с исследованием структурной организации плазматических мембран клеток крови у больных с персистенцией вирусов гепатита и клещево го энцефалита, а также у здоровых доноров в условиях инкубации мембранной эритроцитарной взвеси и лимфоцитов с аполипопротеином А-I (апоА-I) in vitro (табл. 2).
Был использован метод выделения липопротеинов плазмы, основанный на различиях в размерах, плотности частиц и скорости флотации [Laemli U.K., 1970;
Климов А.Н., 1999].
Экспериментальное исследование проводили в два этапа. Вначале реги стрировали спектральные характеристики взаимодействия флуорофора пирен с интактной взвесью мембран эритроцитов и цельными лимфоцитарными клет ками, полученными у здоровых лиц и больных с вирусными инфекциями, вы числяли указанные выше параметры, а также определяли активность Na+,K+ АТФазы. На втором этапе – проводили исследование структуры мембраны эритроцитов и лимфоцитов после их инкубации in vitro с аполипопротеином А-I.
Полученные в ходе исследования данные обрабатывали с использованием Таблица Распределение здоровых доноров и больных с персистенцией вирусов гепатита и клещевого энцефалита в соответствии с использованными экспериментальными методами исследования плазматических мембран эритроцитов и лимфоцитов при их инкубации с аполипопротеином А-I (апо А-I) in vitro Группы обследованных Пациенты с дли Пациенты с № тельной перси Методы исследования Здоровые хроническим стенцией вируса доноры вирусным ге клещевого энце патитом фалита 6 Исследование структуры мембра ны эритроцитов с использованием флуоресцентного зонда пирен при 16 22 инкубации мембранной взвеси с апоА-I Определение активности Na+,K+ АТФазы в мембране эритроцитов 8 21 при инкубации мембранной взве си с апо А-I 8 Исследование структуры мембра ны лимфоцитов с использованием 16 22 флуоресцентного зонда пирен при инкубации лимфоцитов с апо А-I стандартного пакета программ «Statistica for Windows» (2000, версия 6.0) фир мы «Statsoft Inc.». Нормальность распределения количественных показателей была проверена с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Затем проверяли статистические гипотезы о равенстве средних значений и дисперсий для от дельных групп пациентов: гипотеза о равенстве средних проверялась с помо щью t-критерия Стьюдента, гипотеза о равенстве дисперсий – с помощью от ношения дисперсий Фишера. Для сравнения признаков, не отвечающих требо ваниям нормального распределения, использовали непараметрический тест Манна-Уитни (U-тест). Различия считались достоверными при уровне значимо сти p0,05 [Лакин А.В., 1989].
Результаты исследования и их обсуждение Клинический облик многих вирусных персистентных инфекций опреде ляется длительным пребыванием возбудителя в организме, в основе которого лежит способность вирусов закрепляться в клеточных популяциях, используя для этого разнообразные приемы - от «замораживания» собственных генов в хромосомах клетки-хозяина до агрессивного вмешательства в систему индук торов и эффекторов иммунитета [Жданов В.М., 1984;
Букринская А.Г., 1991;
Маянский А.Н., 1999;
Хаитов Р.М., 2000].
Феномен персистенции вирусов затрагивает различные звенья иммунной системы. Известно, что цитопатические процессы при действии инфекционных возбудителей определяются не только свойствами самого инфекционного аген та, но и непосредственным участием в этом процессе иммунокомпетентных клеток периферической крови [Ярилин А.А., 1999;
Решетняк В.И., 2002;
Фал лер Д.М., 2003].
В связи с этим в последние годы возрос интерес исследователей к вопро су о роли лимфоцитов в механизмах возникновения и развития инфекционного процесса, обусловленного длительной персистенцией вирусов в организме [Маянский А.Н. и соавт., 1998;
Хаитов Р.М. соавт., 2000;
Наследникова И.О., 2002;
Уразова О.И., 2002].
Показано, что при инфицировании вирусными агентами лимфоцит не столько подвергается гибели, сколько утрачивает свою функциональную актив ность [Серов В.В., Апросина З.Г., 1995;
Ющук Н.Л. и соавт., 2000;
Серов В.В., 2001;
Игнатова Т.М., 2001;
Лакина Е.И., 2002;
Фридлянд И.Ф. и соавт., 2002].
Очевидно, что судьба инфицированных иммунокомпетентных клеток во многом определяется структурным и функциональным состоянием плазматиче ской мембраны. Лимфоциты несут на своей мембране множество разных ре цепторов, взаимодействие с которыми является сигналом к активации [Уман ский Ю.А., 1981;
Игнатьева Г.А., 1997;
Фрейдлин И.С., 1998;
Тотолян А.А., 1999;
Фрейдлин И.С., 1999;
Хаитов Р.М., 2000].
Одной из важных причин первичных событий после связывания лиганда с рецептором является индуцированное им изменение физико-химического со стояния липидной фазы мембраны, которое обеспечивает оптимальные условия для реализации последующих пострецепторных стадий трансмембранной пере дачи сигнала [Fujisawa T., 1997;
Игнатьева Г.А., 1998;
Сидорова И.С., 1998;
Ивашкин В.Т., 2000;
Хаитов Р.М., 2000;
Собчак Д.М., 2004]. Известна модули рующая роль микровязкости мембраны в латеральной подвижности рецептор ных молекул в плоскости мембраны, от которой зависит сближение рецептор ных субъединиц [Comfurius P., 1992;
Catania A., 1992;
Wustner D. et al., 1998;
Corver J., 2000].
Однако данные относительно характера структурной дезорганизации плазматической мембраны лимфоцитов при вирусных инфекциях носят весьма фрагментарный, несистематизированный характер и не позволяют однозначно оценить направленность и динамику патологических сдвигов при инфекцион ном процессе.
В настоящее время неопровержимым считается тот факт, что нормальное функционирование плазматической мембраны зависит от ее микровязкостных свойств [Владимирова, 1980, Конев С.В., 1987;
Болдырев, 1990, Gudi S.R.P., 1990;
Celedon G., 1992;
Catania A., 1992;
Геннис P., 1997;
Dumas D., 1997;
Wust ner D. et al., 1998;
Corver J., 2000;
Kamp D., 2001]. Поддержание текучести мем браны на физиологическом оптимальном уровне необходимо для осуществле ния латеральной диффузии белковых и липидных молекул, трансмембранного флип-флоп-переноса липидов [Конев С.В., 1987;
Catania A., 1992;
Celedon G., 1992;
Dumas D., 1997;
Corver J., 2000].
В связи с этим в проведенном в нашей лаборатории исследовании основ ное внимание было сконцентрировано на оценке микровязкостных свойств плазматической мембраны лимфоцитов у больных с хроническим вирусным ге патитом и длительной персистенцией вируса клещевого энцефалита, проведен ной с использованием флуоресцентного зондирования. В предпринятом нами исследовании микровязкостных свойств плазматической мембраны лимфоци тов использовали флуоресцентный зонд пирен - неполярный, липотропный, диффундирующий в углеводородной области мембраны [Владимиров Ю.А., 1980, Болдырев А.А., 1990;
Dave B.J., 1993;
Геннис Р., 1997].
В частности, проведенное нами исследование структуры плазматической мембраны лимфоцитов позволило установить, что у больных хроническим ви русным гепатитом имело место достоверное по сравнению с аналогичными по казателями у здоровых доноров уменьшение параметров флуоресценции I470/I и I470/I390 при длине волны возбуждающего света 285 нм независимо от таксо номической принадлежности возбудителя (В, С и микст- инфекция В+С) и ак тивности патологического процесса (табл. 3). Отмеченное нами у больных хро ническим вирусным гепатитом снижение указанных параметров свидетельству ет о повышении микровязкости и/или снижении гидрофобного объема зоны бе лок-липидных контактов [Добрецов Г.Е., 1980, Дунаева А.Н., 1990]. Исследова ние спектральных характеристик взаимодействия липотропного зонда пирен с плазматической мембраной лимфоцитов у пациентов с длительной персистен цией вируса клещевого энцефалита без клинических проявлений и с клиниче ской симптоматикой нейроинфекции выявило аналогичный характер измене ний параметров флуоресценции зонда, что и при обследовании больных с хро ническим вирусным гепатитом (табл. 3).
Повышение микровязкости липидной фазы плазматической мембраны лимфоцитов приводит к дисфункции мембраносвязанных ферментов, тормозит связывание рецепторов с вторичными мессенжерами и лигандами, выполнение иммунных функций. Предполагается, что именно повышение ригидности ли пидного бислоя мембраны лимфоцитов является одной из причин нарушения процессов распознавания вирусных агентов при инфекционном процессе [Du mas D., 1997;
Wustner D. et al., 1998;
Corver J., 2000;
Kamp D., 2001].
Однако, как показало проведенное исследование, изменения микровязко стных свойств плазматической мембраны лимфоцитов при вирусных инфекци ях не являются специфичными для иммунокомпетентных клеток. Аналогичные изменения структурных свойств плазматической мембраны были выявлены в нашей лаборатории при исследовании эритроцитарной мембраны, не являю щейся мишенью для вирусов у больных с хроническим гепатитом и пациентов с длительным носительством вируса клещевого энцефалита.
Сегодня можно с убедительностью говорить о том, что такая высокоспе циализированная клетка как эритроцит вовлекается в патологический процесс не только при гематологических заболеваниях, но и претерпевает серьезные изменения структуры и функции при болезнях разного генеза. Повышенный интерес исследователей к эритроциту при патологии обусловлен его участием в процессах, связанных с поддержанием гомеостаза на уровне целого организма.
Эритроцитарной мембране присущи общие принципы молекулярной организа ции и функционирования плазматических мембран, позволяющие в определен ной степени экстраполировать закономерности ее модификации на иные кле точные системы. Помимо этого, видимая простота организации эритроцита да ет возможность изучать функциональные свойства плазматической мембраны без помех, накладываемых внутриклеточными мембранными образованиями [Постнов В.Ю., 1987].
Важным свойством эритроцитарной мембраны, определяемой, главным образом, состоянием ее липидной фазы, является текучесть [Марри Р., 1993;
Muzulu S.I. et al., 1995;
Геннис Р., 1997;
Sein K.K., Aikawa M., 1998]. Учитывая важную роль микровязкостных свойств липидной компоненты эритроцитарной мембраны в регуляции функциональных свойств клеток, нами было проведено исследование структуры мембраны эритроцитов периферической крови у боль ных с хроническими вирусными инфекциями методом флуоресцентного зонди рования.
Изучение структурных особенностей мембраны красных кровяных клеток неполярным зондом пирен, диффундирующим в гидрофобном компартменте мембраны, позволило выявить у пациентов, страдающих хроническим вирус ным гепатитом, отчетливое снижение коэффициентов эксимеризации пирена I470/I370 и I470/I390 при длинах волн возбуждающего света, равных 285 и 340 нм по сравнению с аналогичными показателями у здоровых лиц (табл. 4). Поскольку величина эксимеризации пирена обратно пропорциональна вязкости липидной фазы, обнаруженное нами достоверное снижение изученных показателей ука зывало на повышение упорядоченности молекул как интегрального липидного бислоя, оцениваемой при В=340 нм, так и анулярной липидной фракции (при В=285 нм). Возрастание микровязкости липидного бислоя мембраны эритро цитов у больных хроническим вирусным гепатитом было подтверждено в на шей лаборатории при проведении флуоресцентного зондирования эритроци тарной мембраны зондом ФНА (табл. 5). Наиболее часто местом локализации данного зонда в мембране являются области глицеринового скелета и карбо нильных групп фосфолипидов [Добрецов Г.Е., 1989;
McMinn P.C., 1997].
При исследовании структурных особенностей наружного отдела эритро цитарной мембраны посредством зонда АНС, локализующегося благодаря присутствию отрицательно заряженной сульфонильной группы в молекуле зонда на поверхности мембраны, было установлено, что мембрана эритро цитов у больных хроническим вирусным гепатитом имело в несколько раз больше центров сорбции АНС, чем эритроцитарная мембрана здоровых доно ров, что прежде всего указывало на изменение характера заряда полярных го ловок фосфолипидов (табл. 5).
Следует отметить, что характер и степень разупорядоченности липидной фазы плазматической мембраны лимфоцитов периферической крови у больных хроническим вирусным гепатитом не зависели от длительности (до 5 лет, 5- лет, более 10 лет) патологического процесса.
В нашей лаборатории было проведено исследование структуры мембраны эрит роцитов у пациентов с клещевым энцефалитом. Полученные с использованием флуоресцентных зондов пирен, ФНА и АНС фактические данные указывали на наличие у больных с длительной персистенцией вируса клещевого энцефа лита изменений структуры эритроцитарной мембраны как при клини чески выраженной форме инфекции, так и у пациентов с бессимптомным носи тельством антигена вируса клещевого энцефалита (табл. 4, 5).
Примечательно, что длительность носительства вируса клещевого энце фалита (до 1 года, 1-3 лет, более 3 лет) не явилась определяющим фактором в индуцированной структурной модификации плазматических мембран эритро цитов.
Таблица Результаты флуоресцентного зондирования плазматической мембраны лимфоцитов флуорофором пирен у пациентов с персистенцией вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита (Х±m ) Параметры флуоресценции, усл. ед. Величина миграции Группы обследованных энергии с триптофа I470/I370, I470/I390, на на пирен, R % B=285 нм B=285 нм Здоровые доноры 1,373±0,019 1,400±0,012 59,48±3, Больные хроническим ви- 1,145±0,011 1,327±0,013 50,11±2, русным гепатитом В p10,001 p10,05 p10, 1,143±0,011 1,213±0,015 48,18±2, Больные хроническим ви p10,001 p10,01 p10, русным гепатитом С p20,05 p20,05 p20, 1,112±0,011 1,157±0,017 34,05±1, Больные хроническим ви- p10,001 p10,001 p10, русным гепатитом В+С p20,05 p20,05 p20, p30,05 p30,05 p30, Пациенты с хроническим носительством вируса кле 1,124±0,018 1,131±0,017 37,36±2, щевого энцефалита p10,001 p10,001 p10, без клинических проявлений заболевания Пациенты с хроническим носительством вируса кле- 1,206±0,016 1,237±0,014 39,75±1, щевого энцефалита p10,001 p10,001 p10, с клиническими проявле- p4 0,05 p4 0,05 p4 0, ниями заболевания Примечание: здесь и в табл. 4, 5 p1 – достоверность различий показателей по сравне нию с их значениями у здоровых доноров;
p2 – достоверность различий по сравнению со зна чениями показателей у больных хроническим вирусным гепатитом В;
p3 – достоверность различий по сравнению со значениями показателей у больных хроническим вирусным гепа титом С;
p4 – достоверность различий показателей по сравнению с таковыми у больных хро ническим носительством вируса клещевого энцефалита без клинических проявлений заболе вания.
Важнейшими компонентами плазматической мембраны являются белки.
Они обеспечивают транспорт молекул внутрь клетки и из нее, катализируют в качестве ферментов ассоциированные с мембранной реакции, служат в каче стве рецепторов для получения и преобразования химических сигналов из ок ружающей среды, а также определяют морфологические и механические свой ства клетки [Конев С.В., 1987;
Сторожок С.А., Санников А.Г., 1996].
Как показало проведенное нами исследование, в мембране эритроцитов у больных хроническим вирусным гепатитом и у пациентов с длительным Таблица Результаты флуоресцентного зондирования мембраны эритроцитов флуорофорами фенил-1-нафтиламин (ФНА) и 1-анилинонафталин-8 сульфонат (АНС) у пациентов с персистенцией вирусов гепатита В и С, клещевого энцефалита (Х±m ) Степень поляри Константа связы- Число мест свя зации флуорес Группы обследованных вания АНС, зывания АНС, ценции ФНА, усл.ед. усл.ед.
усл.ед.
Здоровые доноры 0,158±0,017 0,257±0,013 0,808±0, Больные хроническим ви- 0,180±0,014 0,239±0,023 1,133±0, русным гепатитом В p10,05 p10,05 p10, 0,232±0,017 0,193±0,026 1,028±0, Больные хроническим ви p10,01 p10,01 p10, русным гепатитом С p20,01 p20,05 p20, 0,208±0,026 0,275±0,019 0,881±0, Больные хроническим ви- p10,001 p10,05 p10, русным гепатитом В+С p20,05 p20,05 p20, p3 0,05 p3 0,05 p3 0, Пациенты с хроническим носительством вируса кле 0,233±0,011 0,640±0,027 1,067±0, щевого энцефалита без кли p10,001 p10,001 p10, нических проявлений забо левания Пациенты с хроническим носительством вируса кле- 0,198±0,012 0,465±0,023 1,158±0, щевого энцефалита с клини- p10,05 p10,001 p10, ческими проявлениями забо- p40,05 p40,01 p40, левания носительством антигена вируса клещевого энцефалита имело место отчетливое угнетение активности Na+,K+-ATФазы. Так, у больных хроническим вирусным гепатитом уровень активности Na+,K+-ATФазы в плазматической мембране красных кровяных клеток составил 0,031±0,009 мкмоль Pi/ час·мг белка, что было 2, раза ниже аналогичного показателя уздоровых лиц (0,082±0,008 мкмоль Pi/час·мг белка, p0,001). У пациентов с хроническим носительством вируса клещевого энцефалита активность Na+, K+-ATФазы снижалась до 0,044±0, мкмоль Pi/ час·мг белка (p0,001), что было в 1,8 раза ниже аналогичного показателя у здоровых доноров. Не исключено, что ингибирова ние активности Na+,K+-ATФазы является результатом выявленной структурной модификации липидного матрикса мембраны эритроцитов. Общепринятой яв ляется точка зрения о том, что регулирующая роль липид-белковых взаимодей ствий для Na+,K+-ATФазы сводится к обеспечению ее каталитических функции и переходов между различными конформационными состояниями посредством поддержания определенной микровязкости мембраны, а также за счет взаимо действия заряженных боковых цепей этих ферментов с полярными головками мембранных липидов [Грибанов Г.А., 1991;
Foley T.D., 1994;
Glaser T., 1994;
McMinn P.C., 1997;
Успенская Ю.А., 2002].
Таким образом, у больных хроническим вирусным гепатитом и пациен тов с длительным носительством вируса клещевого энцефалита выявлялись от четливые признаки возрастания микровязкости липидной фазы плазматических мембран лимфоцитов и эритроцитов, затрагивающие как область жирнокислот ных цепей фосфолипидов, так и поверхностные слои мембран, увеличение микровязкости их липидного бислоя в целом, в том числе и в области липид белковых контактов, а также ингибирование активности катион ++ транспортирующего энзима Na,K -ATФазы [Lin S., 1994;
Mal'dov D.G, 1997].
Однако, вероятно, нельзя говорить о том, что отмеченные при хрониче ской вирусной инфекции (в частности, гепатит В, С и микст инфекция В+С, клещевой энцефалит) молекулярные изменения мембраны эритроцитов и плаз матической мембраны лимфоцитов являются сугубо специфическими для ука занных инфекций. Впрочем, сам диапазон гипотетических молекулярных меха низмов дизрегуляции плазматической мембраны весьма универсален (рис.).
Однако запуску типовых механизмов повреждения предшествуют специ фические повреждающие процессы, которые запускаются под действием тех или иных этиологических факторов. Исходя из этих позиций, мы проследили гипотетически возможную цепь повреждающего действия плазматических мембран в условиях инфекционного процесса путем взаимодействия с белками, обладающими дифенсиновыми свойствами. Эти низкомолекулярные белки со держатся в цитоплазматических гранулах нейтрофилов. Под влиянием различ ных стимулов, в том числе, бактерий и вирусов, дифенсины попадают в кровь, где оказывают бактерицидное действие. Они содержат много цистеина и арги нина и относятся к группе катионных белков. Присутствие в молекуле большо го количества полярных и неполярных участков придает им свойство поверх ностно-активных соединений. Именно поэтому дифенсины взаимодействуют с биологическими мембранами, нарушая их структуру и функцию. Они повреж дают бактерии и вирусы, разрушают опухолевые клетки и, конечно, оказывают влияние на плазматические мембраны клеток крови. К группе дифенсиновых белков относят протамины, гистоны и многие аполипопротеины [Поляков Л.М., Панин Л.Е., 2000]. Для оценки системных изменений плазматических мембран клеток периферической крови под влиянием дифенсиновых белков нами был использован аполипопротеин А-I.
При спектрофлуориметрическом исследовании плазматических мембран доноров было выявлено, что при инкубации плазматических мембран с аполи попротеином А-I in vitro клеточные мембраны повреждались в большей степе ни у здоровых доноров, чем у обследованных больных.
Так, при исследовании спектральных характеристик взаимодействия ли потропного зонда пирен с взвесью мембран эритроцитов, полученных у здоро вых доноров, коэффициенты эксимеризации I 470 /I 370 и I 470 /I 390 до инку бации с аполипопротеином А-I составили 0,400±0,018 и 0,410±0,015 усл. ед.
соответственно. Однако эти же показатели после инкубации мембранной взве си с аполипопротеином А-I у здоровых доноров были статистически зна чимо снижены и составили 0,290±0,013 и 0,320±0,016 усл. ед. (p0,001) соот ветственно. Процент индуктивно-резонансного переноса энергии с триптофана на пирен, позволяющий судить о белково-липидных взаимодействиях в мем бране, до инкубации с аполипопротеином А-I составил 56,31±2,46 %, после ин кубации - 44,12±2,86 % (p0,01).
Изучение структурных особенностей плазматических мембран эритроци тов и лимфоцитов у больных хроническим вирусным гепатитом и пациентов с длительным носительством вируса клещевого энцефалита после инкубации in vitro с аполипопротеином А-I с исследование неполярного зонда пирен, позволило выявить изменения коэффициентов эксимеризации пирена I470/I370 и I470/I390 при длинах волн возбуждающего света 285 и 340 нм. Степень выраженности моди фикации плазматических мембран клеток была сопоставима с таковыми у об следованных больных без инкубации с аполипопротеином А-I.
Учитывая важную роль плазматической мембраны в поддержании внут риклеточного и внеклеточного гомеостаза, а также принимая во внимание ли дирующую роль структурных перестроек мембраны в возникновении и разви тии патологических процессов разного генеза, становится очевидным, что дальнейшее углубленное изучение особенностей структурно-метаболической и функциональной организации клеточных мембран целесообразно для расшире ния представлений о характере и механизмах патологических изменений при инфекционном процессе.
Выводы 1. При длительной вирусной персистенции (вирусы гепатита В и С, клеще вого энцефалита) развиваются системные изменения плазматических мембран клеток как лимфоидной (лимфоциты), так и нелимфоидной природы (эритроциты).
2. Изменения структурной организации плазматических мембран эритро цитов и лимфоцитов при длительной персистенции вирусов клещевого энцефалита, гепатита В и С однотипны и носят неспецифический харак тер.
3. У больных хроническим вирусным гепатитом В и С в плазматической мембране лимфоцитов снижена текучесть анулярной липидной фракции, нарушены межмолекулярные белок-липидные взаимодействия.
4. При персистенции вирусов гепатита В и С имеет место структурная мо дификация мембраны эритроцитов, характеризующаяся возрастанием микровязкости липидной фазы в ее гидрофобном компартменте, дезор ганизацией поверхностных слоев мембраны и угнетением активности Na+,K+-ATФазы.
5. Выраженность изменений структуры плазматических мембран лимфоци тов и эритроцитов у больных хроническим вирусным гепатитом (В, С и микст-инфекция В+С) не зависит от таксономической принадлежности возбудителя, длительности и активности патологического процесса.
6. Длительное носительство вируса клещевого энцефалита с клиническими проявлениями заболевания и без таковых сопровождается структурной дезорганизацией липидной фазы плазматической мембраны лимфоцитов в гидрофобном компартменте мембраны в области белок-липидных кон тактов. Характер и степень выраженности нарушений в плазматической мембране лимфоцитов не зависит от длительности патологического про цесса.
7. Изменения структурных характеристик мембраны эритроцитов при дли тельном носительстве антигена вируса клещевого энцефалита с клиниче скими проявлениями и без клинической манифестации нейроинфекции характеризуются возрастанием микровязкости как в области интеграль ной липидной фазы, так и в области анулярных липидов, угнетением ак тивности Na+,K+-ATФазы.
8. Нарушения структурных свойств плазматических мембран эритроцитов и лимфоцитов у здоровых доноров под влиянием аполипопротеина А-I, обладающего свойствами дифенсиновых белков, имеют ту же направ ленность, что и у больных с персистенцией вирусов клещевого энцефа лита и гепатита В и С. Модифицирующее действие аполипопротеина А-I на клеточные мембраны здоровых людей (доноров) более выражено, чем на клеточные мембраны больных.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Некоторые структурные особенности плазматической мембраны лимфо цитов периферической крови при длительной персистенции вируса клеще вого энцефалита // Материалы Международного симпозиума «Успехи со временного естествознания», г. Сочи, 8-10 октября 2002. - Москва, 2002. – С. 119 (в соавт. с Новицким В.В., Рязанцевой Н.В., Жуковой О.Б. и др.).
2. Структурные и функциональные особенности лимфоцитов у пациентов с хроническим носительством антигена вируса клещевого энцефалита // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2002. – Т. 134, № 11. – С. 547-550 (в соавт. с Рязанцевой Н.В., Жуковой О.Б., Новицким В.В.
и др.).
3. Активность ДНК-репарационной системы лимфоцитов периферической крови у пациентов с хронической вирусной персистенцией // Эпидемиоло гия и вакцинопрофилактика. – 2003. – Т. 13, № 6. – С. 27-29 (в соавт. с Ря занцевой Н.В., Жуковой О.Б., Новицким В.В. и др.).
4. Биофизические особенности мембраны эритроцитов при хроническом но сительстве вируса клещевого энцефалита // Вестник Российского государ ственного медицинского университета - 2003. – Т. 28, №2. - Специальный выпуск: «Материалы Пироговской студенческой научной конференции» Москва, 2003. – С. 227-228 (в соавт. с Рязанцевой Н.В., Новицким В.В., Жуковой О.Б. и др.).
5. «Гематологические маски» хронического вирусного гепатита // Терапев тический архив. – 2003. – Т. 75, № 11. – С. 28-31 (в соавт. с Рязанцевой Н.В., Белобородовой Э.И., Новицким В.В. и др.).
6. Изменение микровязкости плазматической мембраны лимфоцитов при ви русном гепатите В // Успехи современного естествознания. – 2003. - №11.
– С. 89 (в соавт. с Рязанцевой Н.В., Новицким В.В., Наследниковой И.О. и др.).
7. Плазматическая мембрана лимфоцитов как структурно-функциональное звено иммунной системы при развитии вирусной инфекции // Материалы Межрегиональной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С.П. Карпова, г. Томск, 7-10 октября 2003. – Томск, 2003. – С. 103 (в соавт. с Рязанцевой Н.В., Новицким В.В., Жуковой О.Б. и др.).
8. Роль иммунофенотипических и цитогенетических изменений лимфоцитов крови в механизмах хронизации вирусной инфекции // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. – 2003. – Т. 13, № 6. – С. 23-27 (в соавт. с Рязанце вой Н.В., Жуковой О.Б., Новицким В.В. и др.).
9. Структурно-функциональные особенности плазматической мембраны лимфоцитов и эритроцитов при вирусных инфекциях // Сибирский медицинский журнал. – 2003. – Т. 18, № 3. – С. 34-38 (в соавт. с Рязанцевой Н.В., Паниным Л.Е., Наследниковой И.О. и др.).
10. Флуоресцентное зондирование плазматической мембраны лимфоцитов и эритроцитов при персистенции вируса клещевого энцефалита: монитори рование структурных изменений // Бюллетень экспериментальной биоло гии и медицины. - 2003. – Т. 136, № 8. – С.213-216 (в соавт. с Паниным Л.Е., Рязанцевой Н.В., Новицким В.В. и др.).
11. Хронический вирусный гепатит С: структурно-метаболический и цитоге нетический статус лимфоцитов // VI Российский съезд «Врачей инфекцио нистов», г. Санкт-Петербург, 29-31 октября 2003. - Санкт-Петербург, 2003. – С. 268 (в соавт. с Наследниковой И.О., Рязанцевой Н.В., Жуковой О. Б. и др.).
12. Хронический гепатит В: структура, метаболизм и цитогенетические осо бенности лимфоцитов // Экспериментальная и клиническая медицина. – 2003. - № 2. – С. 64-67 (в соавт. с Новицким В.В., Рязанцевой Н.В., На следниковой И.О. и др.).
13. Цитогенетика лимфоцитов периферической крови у пациентов с перси стенцией вируса клещевого энцефалита // Бюллетень СО РАМН. – 2003. – Т. 110, №4. – С. 66-69 (в соавт. с Новицким В.В., Жуковой О.Б., Рязанце вой Н.В.).
14. Изменение цитогенетического статуса лимфоцитов периферической кро ви при хронических HBV- и HCV – инфекциях // Российский журнал гаст роэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. – 2004. – Т. 14, № 1. – С.
37-40 (в соавт. с Рязанцевой Н.В., Жуковой О.Б., Белобородовой Э.И. и др.).
15. Патофизиология иммунных нарушений при хронических вирусных гепа титах // Вторая международная конференция «Патофизиология и совре менная медицина», г. Москва, 23-24 апреля, 2004. – Москва, 2004. – С.
154-155 (в соавт. с Жуковой О.Б., Рязанцевой Н.В., Новицким В.В. и др.).
16. Функционально-метаболический статус лимфоцитов периферической кро ви у больных с длительной персистенцией вирусов // Материалы Межго родской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофи зиологии», Санкт-Петербург, 15-16 апреля, 2004 г. – СПб, 2004. – С.48- (в соавт. с Наследниковой И.О., Белоконь В.В., Рязанцевой Н.В. и др.).