Влияние нефтяного загрязнения почв на морфологические и генетические характеристики растений и на формирование растительного покрова
На правах рукописи
СУСЛОНОВ АЛЕКСАНДР ВЛАДИМИРОВИЧ ВЛИЯНИЕ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ПОЧВ НА МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ РАСТЕНИЙ И НА ФОРМИРОВАНИЕ РАСТИТЕЛЬНОГО ПОКРОВА 03.02.08 – экология (биологические наук
и)
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа – 2010
Работа выполнена в Естественнонаучном институте Государственного Образовательного учреждения Высшего Профессионального Образования «Пермский государственный университет»
Научный консультант: кандидат биологических наук, доцент Назаров Алексей Владимирович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, доцент Федоров Николай Иванович доктор биологических наук, профессор Кавеленова Людмила Михайловна Ведущее учреждение: Институт биологии Коми НЦ УрО РАН
Защита состоится «»_2010 г. в «_ » часов «» мин.
на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.136.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054 г. Уфа, Проспект Октября, 69.
факс: +7 (347) 2356247;
e-mail:[email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН и на сайте Института биологии Уфимского научного центра http://ib.anrb.ru/sovet.html Автореферат разослан «»2010г.
Ученый секретарь диссертационного совета, Р.В. Уразгильдин кандидат биологических наук, доцент
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Среди современных проблем человечества в последние десятилетия особое внимание уделяется состоянию окружающей среды. Значительную роль в загрязнении биосферы играют нефть и нефтепродукты, поэтому изучению различных аспектов проблемы нефтяного загрязнения уделяется большое внимание (Киреева и др., 2004). Загрязнение почв нефтью вызывает нарушения динамического равновесия в экосистеме вследствие изменения структуры почвенного покрова, геохимических свойств почв, а также токсического действия на живые организмы (Пиковский и др., 2003). Опасность нефтяного загрязнения связана с высокой чувствительностью к нему высших растений, притом, что они занимают ключевое положение практически во всех наземных экосистемах, определяя существование и состав остальных биологических компонентов биогеоценозов. Попадая в почву, нефть из-за медленной скорости деструкции тяжелых нефтяных фракций оказывает на растения длительное воздействие, достигающее в случае сильного загрязнения 10-20 лет и более (Шилова, 1977;
Демиденко, Демурджан, 1988;
Габбасова и др., 2002). Однако основное количество работ посвящено изучению влияния на растения нефтяных загрязнений с небольшим, не превышающим 3-5 лет, сроком. Данные о растениях, произрастающих на почвах с более длительными сроками загрязнения нефтью, очень немногочисленны. В условиях длительного нефтяного загрязнения остаются не изученными морфологические особенности растений и уровень их генетического разнообразия, который является основой устойчивости воспроизводства природных экосистем.
Цель исследования – экспериментальная оценка влияния нефтяного загрязнения разной давности на растительный покров, морфологические особенности и уровень генетического разнообразия доминирующих в луговых сообществах травянистых видов растений в условиях подзоны южной тайги Пермского Предуралья.
Для достижения цели были поставлены следующие основные задачи:
Провести мониторинг формирования растительного покрова 1.
нефтезагрязненных площадок с разным сроком внесения нефти в почву.
2. Исследовать влияние нефтяного загрязнения почв на морфологические особенности луговых растений Poa prаtensis L. через шесть и девять лет и Trifolium pratense L. через шесть, девять и двадцать лет после загрязнения.
3. Выявить эффективные морфологические показатели для оценки влияния нефтяного загрязнения почв на растения на примере P. prаtensis и T. pratense.
4. Изучить генетическое разнообразие P. prаtensis на нефтезагрязненных площадках через шесть и девять лет после начала эксперимента.
5. Дать комплексную оценку формирования растительного покрова, морфологических и генетических характеристик P. prаtensis и T. pratense в условиях разных сроков загрязнения почв нефтью.
Положения, выносимые на защиту 1. Нефтяное загрязнение почв приводит к снижению общего проективного покрытия и общей наземной биомассы растений, которые не восстанавливаются полностью в течение 20-ти лет, замедляет восстановление растительного покрова на нефтезагрязненных площадках в условиях подзоны южной тайги Пермского Предуралья.
2. В условиях загрязнения в разные сроки почв нефтью у доминирующих в луговых сообществах видов растений P. prаtensis и T. pratense снижены значения морфологических показателей, такие как длина центральных метамеров и длина побега.
3. Уровень флуктуирующей асимметрии длины боковых листочков тройчато сложного листа T. pratense является эффективным при изучении стабильности развития растений на изученной почве при нефтяном загрязнении шестилетней давности.
4. Длительное нефтяное загрязнение почв приводит к снижению генетического разнообразия доминирующего в растительных сообществах вида P. pratensis.
Научная новизна полученных результатов Впервые в условиях нефтяного загрязнения почв изучен механизм восстановления растительного покрова на площадках разных сроков загрязнения (от 1-го до 20-ти лет). Впервые для выявления влияния загрязнения почв нефтью на растения использован анализ флуктуирующей асимметрии тройчато сложного листа модельного вида T. pratense из семейства Fabaceae. На площадках разных сроков загрязнения определены основные морфологические параметры доминирующих в луговых сообществах видов растений. Впервые на примере модельного вида растений, доминирующего в травянистом ярусе P. pratensis из семейства Poaceae, показано, что длительное нефтяное загрязнение приводит к снижению генетического разнообразия. Впервые анализ формирования растительного покрова нефтезагрязненных площадок проведен в комплексе с определением морфологических особенностей и генетического разнообразия доминирующих в луговых сообществах видов растений.
Практическая значимость и реализация результатов исследований Результаты исследования вносят существенный вклад в изучение влияния нефтяных загрязнений на растительные сообщества. Научные выводы работы и рекомендации могут быть использованы для мониторинга нефтезагрязненных экосистем. Анализ флуктуирующей асимметрии рекомендуется для оценки стабильности развития растений при антропогенных воздействиях. Молекулярно генетический анализ может быть использован для выявления генетической компоненты биоразнообразия, механизмов функционирования и поддержания устойчивости экосистем. Разработанная и апробированная методика комплексной оценки формирования растительного покрова, морфологических особенностей и генетического разнообразия растений на нефтезагрязненных площадках рекомендуется в дальнейшем для выявления влияния на растения нефтяных загрязнений разной длительности и в разных регионах страны. Результаты исследований используются при преподавании учебных дисциплин и специальных курсов студентам на кафедре почвоведения ГОУ ВПО «Владимирский государственный университет» и на кафедре экологии ГОУ ВПО «Челябинский государственный университет», что подтверждено актами внедрения результатов исследований в учебный процесс.
Связь работы с научными программами Диссертационная работа выполнялась в ходе подготовки и реализации ПГУ приоритетного инновационного национального проекта «Образование».
Исследования проводились в связи с тематикой гранта РФФИр_урал_а № 07-04 96016 «Влияние нефтяных загрязнений почв на популяции микроорганизмов и растений Пермского края» (2007-2009 гг.), а также гранта РФФИр_урал_а № 07 04-96032 «Динамика генетического разнообразия и структуры популяционных систем ресурсных растений Пермского края при антропогенных воздействиях» (2007-2009 гг.).
Личный вклад автора состоит в выборе объектов, разработке программы, проведении полевых и лабораторных исследований, а также в обработке, анализе и обобщении результатов, подготовке публикаций. Автор лично провел геоботанические описания, определение морфометрических показателей растений, их молекулярно-генетический анализ, дал комплексную оценку формирования растительного покрова, морфологических и генетических особенностей растений на нефтезагрязненных и контрольных площадках, а также написал и оформил текст диссертации и автореферата.
Апробация работы Материалы исследований представлены на Всероссийском молодежном научном симпозиуме «Безопасность биосферы – 2005» (Екатеринбург, 2005), на Первой Всероссийской научно-технической Интернет-конференции «Современные проблемы экологии и безопасности» (Тула, 2005), на Шестой международной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых (Пермь, 2007), на Первой Международной телеконференции «Фундаментальные медико-биологические науки и практическое здравоохранение» (Томск, 2010), на Общероссийской научной конференции «Актуальные проблемы науки и образования» (Красноярск, 2010), на III Всероссийской научно-практической конференции «Биологические системы:
устойчивость, принципы и механизмы функционирования» (Нижний Тагил, 2010).
Публикации Диссертантом по теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в их числе три статьи в ведущих рецензируемых журналах из перечня ВАК, три статьи в материалах сборников и четыре научных работы в материалах конференций.
Структура и объем работы Диссертационная работа состоит из введения, шести глав – обзор проблемы, материалы и методы исследований, четырех глав результатов и их обсуждения, выводов. Список литературы включает 148 источника, в том числе 105 публикация отечественных авторов и 43 публикации иностранных авторов. Диссертационная работа изложена на 118 машинописных страницах, из которых 98 страниц основного текста и 20 страниц приложений, содержит 25 таблиц, 17 рисунков, приложения.
Благодарности Автор выражает искреннюю благодарность и признательность научному руководителю к.б.н., с.н.с. Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, доценту ПГУ Назарову А.В.;
зав. НИЛ «Молекулярной биологии и генетики» ЕНИ ПГУ д.б.н., проф. ПГУ Боронниковой С.В.;
д.б.н., проф. ПГУ Мандрице С.А., н.с. НИЛ «Молекулярной биологии и генетики» ЕНИ ПГУ Светлаковой Т.Н. и всем соавторам по публикациям.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы Изучение влияния нефтяного загрязнения на растения проводилось в условиях подзоны южной тайги Пермского Предуралья на опытном стационаре института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (г. Пермь) в д. Ключи Добрянского района в 2005-2009 гг. Экспериментальные площадки размером 1м были заложены в злаково-разнотравном лугу на дерново-подзолистой среднесуглинистой почве (гумус 2.86 %, рН водный – 6.3, рН солевой – 5.6, N общий – 0.123%). Площадки размером 1 м2 закладывались для микробиологических исследований в 1985, 1996, 1997, 1998 и 1999, 2002, 2003 и 2004 гг. Всего было заложено 240 нефтезагрязненных и 240 контрольных площадок. Длительность нефтяного загрязнения рассчитана от 2005 года.
Формирование растительного покрова и характеристики растений изучали для 20 ти, 9-ти, 8-ми, 7-ми, 6-ти, 3-х, 2-х и 1-го лет загрязнения. Площадки были перекопаны с уборкой растительности. На каждую площадку вносили 24 л/м нефти. Для загрязнения использовали нефть Ярино-Каменноложского месторождения (содержание парафинов – 5.4%, серы – 0.51-0.79%, плотность – 0.816-0.838 г/см3). Контрольные площадки были также перекопаны с уборкой растительности, но без загрязнения нефтью. В 2005 году для комплексных исследований случайным образом были избраны по 10 площадок с каждого года загрязнения и по 10 контрольных площадок для каждого года загрязнения. Таким образом, было обследовано 80 площадок, загрязненных нефтью в разные сроки, и 80 контрольных площадок. Определение битумоидов в почве осуществляли в соответствии с «Методическим руководством по люминесцентно битумологическим и спектральным методам исследования…» (1979).
Агрохимические свойства почвы определяли с использованием общепринятых методик (Практикум по агрохимии…, 2001). Геоботанические описания растительных сообществ указанных участков и определение общей биомассы были проведены в 2005 году по общепринятым методикам (Шенников, 1961).
Общее проективное покрытие растений определяли по методике Л.Г. Раменского (1956). При учете обилия отдельных видов растений пользовались шкалой Drude (Быков, 1957).
Для исследования морфологических особенностей растений в условиях длительного нефтяного загрязнения были отобраны два вида, доминирующих в растительных сообществах: Poa prаtensis L. (Poaceaе) и Trifolium pratensе L.
(Fabaceae). Эти виды были в достаточном количестве представлены как на площадках разных лет загрязнения, так и на контрольных площадках. Для анализа морфологических особенностей на площадках 9-ти и 6-ти летней давности загрязнения были отобраны по 30 растений обоих видов. Общее число проанализированных растений составило 180 для T. рrаtense и 120 для P. рrаtensis.
Изучение морфологических параметров проведено в соответствии с рекомендациями Ю.А. Злобина (1989). Для изучения флуктуирующей асимметрии листья исследованных растений T. prаtense были отсканированы при помощи планшетного сканера Mustec 1200 UB Plus. Дальнейшее измерение проводилось в программе Image J. Статистический анализ флуктуирующей асимметрии боковых листочков тройчато сложного листа T. pratense проведен по методике А. Палмера и С. Стробека (Palmer, Strobeck, 2003) и Д.Б. Гелашвили (2004).
Анализ молекулярно-генетического полиморфизма ДНК проведен в научно исследовательской лаборатории «Молекулярной биологии и генетики» ЕНИ ПГУ с использованием ISSR- (Inter Simple Sequence Repeats, Zietkiewicz et al., 1994) метода с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) на примере доминирующего в растительных сообществах вида P. pratensis. Для выделения ДНК использовали методику A.M. Торрес (Torres et al., 1993). Листья были собраны с растений на площадках 9-ти и 6-ти летней давности загрязнения.
Концентрация всех проб ДНК была в пределах 5 нг/мкл. Амплификация ДНК была выполнена в термоциклерах MJ Mini-Cycler («Bio-Rad», USA) и Терцик («ДНК Технология», Москва) по типичной для ISSR-метода программе (Молекулярная генетика, 2007). Для проверки достоверности полученных спектров ДНК опыт повторяли не менее трех раз. Амплифицированные продукты были подвергнуты электрофорезу в 1.7% агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Гели были отсканированы в системе гель-документации Gel-Doc XR («Bio-Rad», USA).
Для определения длины фрагментов ДНК использовали маркер молекулярной массы 100 bp +1.5 + 3 Кb DNA Ladder («ООО-СибЭнзим-М», Москва) и программу Quantity One («Bio-Rad», USA). Проведен анализ полиморфизма ISSR-маркеров у 450 проб ДНК P. prаtensis. Компьютерный анализ молекулярно генетического полиморфизма ДНК проведен с помощью программы POPGENE 1.31 (Yeh et al., 1999) и специализированного макроса GenAlEx6 (Peakall, Smouse, 2006) для MS Excel с определением доли полиморфных локусов (Williams et al., 1990) при, общего числа аллелей ( n a ), эффективного числа аллелей ( ne ) Р (Kimura еt al., 1964), ожидаемой гетерозиготности ( Н Е ) (Nei, 1987). Объемы использованных выборок в среднем составляли 30 растений. Статистические анализы выполнены при помощи программ STATISTICA 6.0 (версия 6.0.), SPSS 11.5 и MS Excel с использованием стандартных для биологических исследований методов (Животовский, 1983, 1990;
Лакин, 1990).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Формирование растительного покрова на нефтезагрязненных площадках В первый год общее проективное покрытие растений на площадках без загрязнения нефтью составляло 30%, на площадках с нефтезагрязненной почвой – 1% (рис. 1).
Проективное покрытие,% 1 2 3 6 7 8 9 Срок после начала опыта,годы без загрязнения с загрязнением Рис. 1. Общее проективное покрытие растений на экспериментальных площадках Общая биомасса растений на площадках без загрязнения равнялась 211, г/м2, на участках с загрязнением – 13,5 г/м 2 (рис. 2).
но-сухой вес наземной биомассы, г/м Воздуш 1 2 3 6 7 8 9 Срок после начала опыта, годы без загрязнения с загрязнением Рис. 2. Общая биомасса надземной части растений на экспериментальных площадках На нефтезагрязненной почве отмечено существенное снижение видового разнообразия (27 видов) по сравнению с вариантом опыта без загрязнения (41 вид) (рис. 3).
Количество видов 1 2 3 6 7 8 9 без загрязнения Срок после начала опыта, годы с загрязнением Рис. 3. Видовая насыщенность экспериментальных площадок Наиболее обильными на нефтезагрязненных и контрольных площадках были сорные однолетние виды. На почве без загрязнения это Chenopodium album L., на нефтезагрязненной почве – Chenopodium album L., Erysimum cheiranthoides L. Из многолетников более десяти растений на 1м 2 имели в первом случае Elytrigia repens (L.) Nevski., Achillea millefolium L., во втором – Achillea millefolium L., Elytrigia repens (L.) Nevski., Tanacetum vulgare L. Однолетние сорные растения на загрязненных нефтью участках были сильно угнетены.
Во второй год общее проективное покрытие растений на участках с почвой без загрязнения составляло 50%, на площадках с нефтезагрязненной почвой – 5% (рис. 1), общая биомасса растений – 269,2 и 63,4 г/м 2 (рис. 2), видовая насыщенность – 37 и 34 видов соответственно (рис. 3). На незагрязненных участках преобладали многолетние злаки, в первую очередь Elytrigia repens (L.) Nevski. и Bromopsis inermis (Leys.) Holub. Отмечено исчезновение ряда однолетних сорных видов. На нефтезагрязненных площадках не отмечено резкое увеличение численности многолетних злаков. Относительно обильными видами являлись Elytrigia repens (L.) Nevski., Bromopsis inermis (Leys.) Holub., Achillea millefolium L., Trifolium repens L. Численность однолетних сорных видов растений уменьшилась, за исключением Crepis tectorum L.
В третий год общее проективное покрытие растений на площадках без загрязнения составляло 60%, с нефтезагрязнением – 10% (рис. 1). Общая биомасса растений на площадках без загрязнения – 234,8 г/м 2, на участках с загрязнением – 84,5 г/м2 (рис. 2). Количество видов на экспериментальных площадках в вариантах без загрязнения и с загрязнением – 39 и 36 соответственно (рис. 3).
Через шесть, семь, и девять лет общее проективное покрытие растений на площадках без загрязнения достигало 50%, на участках с восьмилетним сроком эксперимента – 60%. Общая биомасса растений варьировала от 207,8 г/м 2 до 284, г/м2. Количество видов растений изменялось от 35 до 38. На нефтезагрязненных площадках через шесть и семь лет общее проективное покрытие растений составляло 10%, общая биомасса растений на данных участках – 75,8 и 81,0 г/м 2, а видовая насыщенность – 28 и 33 вида соответственно. С увеличением времени, прошедшего после загрязнения, возрастает общее проективное покрытие растений, через восемь и девять лет оно достигает 30%, повышается общая биомасса растений до 154,8 и 155,1 г/м 2 соответственно. Количество видов на площадках – 27 и 31 соответственно.
Через двадцать лет общее проективное покрытие растений на участках с почвой без загрязнения составляло 50%, на площадках с нефтезагрязненной почвой – 30%. Общая биомасса растений на площадках без загрязнения равна 218,1 г/м2, на участках с загрязнением – 94,9 г/м 2. Видовая насыщенность в обоих вариантах эксперимента равна 36 видам.
Таким образом, исследованное нефтяное загрязнение почв оказывает длительное негативное воздействие на проективное покрытие, общую биомассу растений и видовое разнообразие растительного покрова.
2. Анализ влияния нефтяного загрязнения почв на морфологические особенности растений 2.1. Влияние нефтяного загрязнения почв на морфологические особенности Poa pratensis L.
У P. prаtensis все морфологические показатели, кроме числа листьев, ниже у растений, произрастающих на нефтезагрязненных площадках (табл. 1), чем у растений с контрольных площадок (Суслонов и др., 2010).
При оценке метамерного строения растений P. рrаtensis (рис. 4) количество узлов и междоузлий совпало у подавляющего большинства изученных растений P. рrаtensis как на контрольных, так и на нефтезагрязненных площадках.
Таблица 1.
Средние значения морфологических показателей P. рrаtensis Варианты опыта Показатель (лет после загрязнения нефтью) 9-й (1996г) 6-й (1999г) Контроль 1.Длина побега, см 49,52±1,14 45,34±1,22 53,91±1, 2.Длина стебля, см 49,52±1,14 45,34±1,22 53,91±1, 3.Число листьев, шт 3,84±0,15 3,51±0,16 3,23±0, 4.Длина соцветия, см 8,11±0,25 7,94±0,29 8,81±0, 5.Число колосков в соцветии, шт 16,85±0,82 17,63±0,69 22,14±0, 6.Число зерен в колоске, шт 5,84±0,15 5,41±0,31 6,31±0, Установлены достоверные отличия в длинах третьего и четвертого метамеров у P. рrаtensis, произрастающих на нефтезагрязненных площадках, по сравнению с растениями с контрольных площадок.
Рис. 4. Метамерное строение P. рrаtensis.
Примечание: м – длина междоузлий, ДлМ – длина соцветия;
узлы пронумерованы снизу вверх Таким образом, в условиях нефтяного загрязнения почв достоверно ниже длина побега у P. prаtensis на 15,90% через шесть лет и на 8,14% через девять лет после загрязнения, а также достоверно ниже длина центральных метамеров:
третьего метамера P. prаtensis –на 25,58% через шесть лет и на 15,05% через девять лет после загрязнения, четвертого метамера P. prаtensis – на 23,81% и 28,67% соответственно.
2.2. Влияние нефтяного загрязнения почв на морфологические особенности Trifolium prаtense L.
Длина побега T. рratense достоверно ниже у растений с площадок 20-ти, 9-ти и 6-ти лет загрязнения нефтью по сравнению с контрольной выборкой (табл. 2).
Таблица 2.
Показатели метамерности T. рratense Морфометрический 20 лет 9 лет 6 лет контроль показатель (1985г) (1996г) (1999г) Длина первого междоузлия, см 2,14±0,15 3,03±0,47 2,86±0,73 2,23±0, Длина второго междоузлия, см 5,39±0,37 7,33±0,55 6,94±0,69 6,56±0, Длина третьего междоузлия, см 7,73±0,46 7,82±0,40 7,45±0,53 9,12±0, Длина четвертого междоузлия, см 8,04±0,41 7,93±0,50 8,69±0,73 10,57±0, Длина пятого междоузлия, см 7,87±0,55 6,76±0,84 8,69±0,69 9,24±0, Длина шестого междоузлия, см 5,35±0,52 4,54±0,72 6,03±0,98 8,43±0, Длина седьмого междоузлия, см 3,93±0,77 3,81±0,82 3,25±0,75 4,81±0, Длина восьмого междоузлия, см 2,90±0,74 3,03±0,53 3,11±0,34 3,64±0, Длина девятого междоузлия, см 1,88±0,50 3,80±0,60 - 1,50±0, Длина побега, см 34,16±2,51 42,41±2,94 41,06±2,38 48,13±1, Примечание: 6, 9 и 20 лет – срок загрязнения Таким образом, в условиях нефтяного загрязнения почв достоверно ниже длина побега у T. prаtense на 14,69% через 6-ть лет и 11,88% через 9-ть лет после загрязнения, а также длина центральных метамеров: третьего метамера T. prаtense – на 18,31% через 6 лет и 15,24% через 20 лет, четвертого метамера T. prаtense – на 17,79% через 6 лет, 24,98% через 9 лет, 23,94% через 20 лет.
Проведена оценка уровня флуктуирующей асимметрии длины боковых листочков тройчато сложного листа растений T. рrаtense, произрастающих в условиях нефтяного загрязнения (Светлакова и др., 2010;
Суслонов, 2010). В результате статистического анализа показателей флуктуирующей асимметрии растений T. рrаtense, были обнаружены достоверные отличия в интегральных значениях асимметрии растений, произрастающих на нефтезагрязненных площадках 6-ти летней давности от растений, произрастающих на контрольных площадках. Нефтяные загрязнения 9-ти и 20-ти летней давности не оказали влияние на уровень этого показателя.
3. Генетическое разнообразие растений на нефтезагрязненных площадках на примере P. pratensis Для выявления полиморфизма длин амплифицированных фрагментов ДНК, получаемых в результате полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью ISSR метода, из 25 ISSR-праймеров выбраны и апробированы 5 наиболее эффективных праймеров (табл. 3).
Таблица 3.
Характеристика амплифицированных ISSR-фрагментов P. pratensis Доля полиморфных Нуклеотид- Число фрагментов Размеры фрагментов ДНК (P95) ная последо- ДНК Прай фрагментов мер вательность 9 6 конт- конт ДНК, пн 9 лет 6 лет (5'-3') лет лет роль роль М1 (AC)8CG 260 – 1340 18 17 15 0,833 0,824 0, М2 (AC)8CC 290 – 1270 20 19 20 0,800 0,842 0, М9 (GAC)4AC 270 – 1220 19 19 20 0,790 0,737 0, Х9 (ACC)6G 230 – 930 16 16 14 0,813 0,813 0, Х11 (AGC)6G 240 – 1020 17 15 16 0,824 0,867 0, всего 90 86 85 0,811 0,814 0, Примечание: 6 и 9 лет – срок загрязнения Установлено, что с помощью одного ISSR-праймера, в среднем, было амплифицировано 17 фрагментов ДНК (рис. 5). Доля полиморфных фрагментов у P. prаtensis, растущих на почве после шести (P95=0,814) и девяти (P95=0,811) лет загрязнения нефтью, достоверно ниже, чем у растений с контрольных площадок (P95=0,918).
Рис. 5. ISSR-спектр P. prаtensis с праймером М1, произрастающих на площадках, загрязненных нефтью в 1996 году. Буквами обозначены номера проб, М – маркер молекулярного веса. Стрелками указаны некоторые полиморфные фрагменты Значения ожидаемой гетерозиготности также ниже у растений, произрастающие на площадках после шести (He=0,287) и девяти (He=0,290) лет внесения нефти в почву по сравнению с растениями, произрастающими на контрольных площадках (He=0,302). Соответственно, эффективное число аллелей на локус, как производный от ожидаемой гетерозиготности показатель, тоже ниже у растений, произрастающих на площадках с загрязнением 6-летней (n е=1,449) и 9 летней давности (nе=1,467) по сравнению с контролем (n е=1,497). Показатель внутрипопуляционного разнообразия растений нефтезагрязненных площадок достоверно ниже (=1,786 после 6 лет, =1,765 после 9-ти лет внесения нефти в почву), чем у растений, произрастающих на контрольных площадках (=1,816). В условиях нефтяного загрязнения почв проведен анализ полиморфизма ДНК с использованием разных тандемных повторов генома P. prаtensis (Девятова и др., 2010;
Боронникова и др., 2010).
Таким образом, у доминантного в луговом сообществе вида P. pratensis уровень генетического разнообразия ниже на площадках шести и девятилетней давности загрязнения почв нефтью по сравнению с контролем.
4. Комплексная оценка влияния нефтяного загрязнения на растения Нефтяное загрязнение оказало сильное негативное воздействие на общее проективное покрытие, которое через год после внесения нефти на загрязненных площадках было в 30 раз меньше, чем на незагрязненных, а через 20-ть лет различие между ними составляло в 1,7 раза. С увеличением срока после загрязнения и уменьшения концентрации загрязнителя также уменьшается различие между загрязненными и незагрязненными участками по величине общей биомассы растений от 15,6 раз через год после начала эксперимента до 1,8 раза через 9-ть лет. Через 20-ть лет после внесения нефти в почву загрязненные и незагрязненные площадки отличались между собой по величине общей биомассы растений в 2,2 раза. При этом концентрация битумоидов в загрязненной почве через 20-ть лет после внесения нефти была в 4,8 раза больше, чем в незагрязненной. Следовательно, полного восстановления почвы не произошло даже за этот длительный срок (Назаров, Суслонов, 2010).
Внесение нефти в почву оказало отрицательное влияние и на формирование растительного сообщества в условиях загрязнения. Во-первых, это проявлялось в удлинении стадий зарастания загрязненных площадок растениями. Если однолетние сорные растения на незагрязненной почве доминировали в течение одного года, то при загрязнении почвы они преобладали в течение двух лет. Во вторых, негативное влияние нефти на формирование травянистого яруса проявлялось в уменьшении видов растений, заселяющих загрязненные почвы. В целом, на нефтезагрязненных площадках произрастало меньшее количество видов растений, за исключением площадок, загрязненных 20 лет назад, где количество видов не отличалось от такового на контрольных площадках без загрязнения.
Максимальное отличие в данном показателе между площадками с загрязнением и без внесения нефти наблюдалось через год после начала опыта.
При изучении морфологических особенностей достоверная разница, между растениями, произрастающими на нефтезагрязненных площадках, с растениями, произрастающими на контрольных площадках, обнаружена у P. prаtensis по длине побега, длине соцветия, числе колосков в соцветии и длине центральных метамеров;
а у T. prаtense – по длине побега и длине центральных метамеров.
Показано, что уровень флуктуирующей асимметрии длины боковых листочков тройчато сложного листа T. prаtense как показатель нестабильного развития растения при влиянии негативных факторов, применим при изучении стабильности развития растений при нефтяном загрязнении.
В условиях нефтяного загрязнения P. рratensis характеризуются меньшим генетическим разнообразием, так как доля полиморфных локусов (P95), ожидаемая гетерозиготность (He), эффективное число аллелей (n е) и показатель внутрипопуляционного разнообразия (), достоверно ниже у растений, произрастающих на нефтезагрязненных площадках. Снижение генетического разнообразия потенциально может быть особенно опасно, так как именно оно определяет адаптивный потенциал живых организмов в условиях изменяющейся среды.
Внесение нефти в почву привело к увеличению количества в ней растворимого натрия. С увеличением времени, прошедшего после загрязнения концентрация ионов натрия в почве уменьшается. Так, через год после начала опыта, его концентрация в загрязненной почве была в 19,6 раза больше, чем в почве без загрязнения, через два года – в 7,0 раза, через девять – в 2,5 раза. Через двадцать лет содержание растворимого натрия в загрязненных почвах не имело достоверных отличий от такового в почвах без загрязнения. Результаты эксперимента согласуются с данными, полученными ранее, так как известно, что в условиях гумидного климата при промывном режиме почвы происходит достаточно быстрое вымывание из нее солей пластовых вод, которое препятствует засолению почвы при нефтязагрязнении (Иларионов, 2006). На основании полученных результатов рекомендован список видов высших растений для фиторемедиации нефтезагрязненных почв.
Таким образом, при комплексном анализе установлено отрицательное влияние нефтяного загрязнения разной длительности на формирование растительного покрова, продуктивность растительного сообщества, а также на морфологические показатели, стабильность развития растений и уровень генетического разнообразия растений нефтезагрязненных площадок. Нами на основании полученных результатов рекомендован список видов высших растений для восстановления нефтезагрязненных почв.
ВЫВОДЫ 1. Установлено, что нефтяное загрязнение почв 20-ти летней давности приводит к изменению флористического состава и снижению общей надземной биомассы растений в 2,2 раза, общего проективного покрытия – в 1,7 раза.
2. Установлено, что у изученных видов растений в условиях нефтяного загрязнения почв по сравнению с контролем достоверно меньше длина побега у P. prаtensis на 15,90% через шесть лет и на 8,14% через девять лет после загрязнения, у T. prаtense – на 14,69% и 11,88% соответственно.
3. Нефтяное загрязнение привело к уменьшению длины центральных метамеров изученных видов растений: третьего метамера P. prаtensis на 25,58% через шесть лет и на 15,05% через девять лет после загрязнения, четвертого метамера P. prаtensis – на 23,81% и 28,67% соответственно;
третьего метамера T. prаtense – на 18,31% через 6 лет и 15,24% через 20 лет, четвертого метамера T. prаtense – на 17,79% через 6 лет, 24,98% через 9 лет, 23,94% через 20 лет.
4. Установлены достоверные отличия в интегральных значениях асимметрии листочков тройчато сложного листа T. pratense, произрастающих на площадках после шести лет загрязнения нефтью по сравнению с растениями с контрольных площадок. Показано, что уровень флуктуирующей асимметрии боковых листочков тройчато сложного листа T. pratense является эффективным показателем оценки влияния нефтяного загрязнения почв на стабильность развития растений.
5. На примере модельного вида Poa prаtensis L. показано, что генетическое разнообразие достоверно ниже у растений, произрастающих на площадках после шести (P95=0,814;
He=0,287;
=1,786) и после девяти (P95=0,811;
He=0,290;
=1,765) лет загрязнения нефтью по сравнению с растениями, произрастающими на контрольных площадках (P95=0,918;
He=0,302;
=1,816).
6. Комплексный анализ показал, что нефтяное загрязнение почв оказывает длительное отрицательное воздействие на морфологические особенности и уровень генетического разнообразия растений, а также на формирование растительного покрова, при котором общее проективное покрытие и общая биомасса растений не восстанавливаются даже через 20 лет после загрязнения почв нефтью.
СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ 1. Светлакова Т.Н., Мандрица С.А., Боронникова С.В., Суслонов А.В. Оценка изменчивости морфологических признаков Trifolium pratense L. в условиях нефтяного загрязнения почв // Вопросы современной науки и практики.
Университет им. В.И. Вернадского. 2010. №1-3 (28). С.16–22.
2. Боронникова С.В. Мандрица С.А., Светлакова Т.Н., Назаров А.В., Суслонов А.В. Изучение генетического разнообразия растений, произрастающих в условиях нефтяного загрязнения почв, c использованием ISSR-маркеров и на примере Poa pratensis L. // Экологическая генетика. 2010. Т.8, №1. С. 59–63.
3. Девятова Н.М., Бельтюкова Н.Н., Назаров А.В., Суслонов А.В., Светлакова Т.Н.
Анализ генетического разнообразия Poa pratensis L. в условиях нефтяного загрязнения почв с использованием IRAP-маркеров // Аграрный вестник Урала.
2010. №2.(68) С.43–45.
Публикации в других изданиях 4. Боронникова С.В., Мандрица С.А., Кокаева З.Г., Суслонов А.В., Шибанова Н.Л., Тихомирова Н.Н., Дрибноходова О.П. Динамика генетического разнообразия и структуры популяционных систем ресурсных растений Пермского края при антропогенных воздействиях // Региональный конкурс РФФИ-Урал: Результаты научных исследований, полученные в 2007 г. Ч.2. Пермь, Екатеринбург, 2008.
С.60–63.
5. Боронникова С.В., Бельтюкова Н.Н., Суслонов А.В., Светлакова Т.Н., Динамичность генома растений // В мире научных открытий. №2 (08). Ч. 1. 2010.
С. 258.
6. Суслонов А.В. Влияние нефтяного загрязнения почв на морфологическую изменчивость Trifolium pratense L. // Сборник научных работ с материалами трудов 1-ой Международной телеконференции «Фундаментальные медико биологические науки и практическое здравоохранение». Томск, 2010. С. 38–40.
7. Назаров А.В., Суслонов А.В. Мониторинг формирования растительного покрова на экспериментальных нефтезагрязненных площадках // В мире научных открытий. №3 (09). Ч. 3. Материалы Общероссийской научной конференции «Актуальные вопросы науки и образования». Красноярск, 2010. С. 34–37.
8. Суслонов А.В., Светлакова Т.В., Боронникова С.В. Морфологическая изменчивость Poa pratensis L. при нефтяном загрязнении // Материалы III Всероссийской научно-практической конференции «Биологические системы:
устойчивость, принципы и механизмы функционирования». Нижний Тагил, 2010.
С. 229–231.
9. Суслонов А.В., Назаров А.В., Светлакова Т.Н., Боронникова С.В. Разработка новых подходов оценки морфологической и генетической изменчивости растений при нефтяном загрязнении почв // Сборник материалов Второй Международная конференция «Наука и бизнес: пути развития». Тамбов, 2010. С. 8–11.
10. Боронникова С.В., Мандрица С.А., Кокаева З.Г., Суслонов А.В., Михеева О.В., Тихомирова (Бельтюкова) Н.Н., Дрибноходова О.П., Светлакова Т.Н., Козьминых Т.В. Динамика генетического разнообразия и структуры популяционных систем ресурсных растений Пермского края при антропогенных воздействиях // Региональный конкурс РФФИ-Урал: Результаты научных исследований, полученные за 2007-2009 гг. Сборник статей Ч.2. Пермь, Екатеринбург, 2010.
С.63–66.