Новые функции белков семейства noggin: ингибирование сигнальных каскадов activin/nodal и wnt в эмбриональном развитии.

На правах рукописи

Ерошкин Федор Михайлович Новые функции белков семейства Noggin: ингибирование сигнальных каскадов Activin/Nodal и Wnt в эмбриональном развитии.

Специальность – 03.01.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2012

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ эмбриогенеза института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН (ИБХ РАН)

Научный консультант:

доктор биологических наук, руководитель лаборатории молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ РАН, профессор Зарайский Андрей Георгиевич

Официальные оппоненты:

Академик РАН, доктор биологических наук, руководитель лаборатории молекулярных технологий и инновационного центра «технопарк ИБХ» ИБХ РАН Лукьянов Сергей Анатольевич кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной эмбриологии института биологии развития им. Н.К.Кольцова (ИБР) РАН, ведущий научный сотрудник лаборатории лаборатории молекулярной генетики гидробионтов всероссийского научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии (ВНИРО) Мюге Николай Сергеевич

Ведущая организация:

Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, Биологический факультет

Защита состоится «16» мая 2012 года в 10 часов на заседании специализированного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им.

академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан «13» апреля 2012 г.

Учёный секретарь Специализированного совета, Доктор физико-математических наук Олейников В.А.

Актуальность проблемы Одной из важнейших задач современной биологии развития является поиск и изучение факторов, обеспечивающих индукционные взаимодействия клеток и тканей в ходе эмбриогенеза.

Секретируемый белок Noggin (Noggin1) является первым идентифицированным белковым фактором, участвующим в первичной эмбриональной индукции. Он был открыт Ричардом Харландом в 1992 г. у шпорцевой лягушки Xenopus как нейральный индуктор, продуцируемый шпемановским организатором. Noggin1 способен связывать белки одной из субгрупп цитокинов TGF-, а именно Bone Morphogenetic Proteins (BMP) (Smith and Harland, 1992). Действуя вне клетки, BMP индуцирует ассоциацию специфических рецепторных серин-треониновых киназ I и II типа, что приводит к внутриклеточному фосфорилированию цитоплазматических белков Smad1/5/8, которые в паре со Smad4 мигрируют в ядро и регулируют ранскрипцию специфических генов-мишеней (Shi and Massague, 2003). Так как Noggin препятствует связыванию BMP с рецепторами (Groppe et al., 2002), то это приводит к ингибированию сигнального пути, опосредованного Smad1/5/8. Благодаря этой функции, Noggin1, будучи эктопически экспрессирован в вентральной части эмбриона Xenopus, способен индуцировать вторичные оси, лишенные голов. В нормальном развитии Noggin1 играет ключевую роль в различных процессах, включая индукцию нервной ткани и скелетной мускулатуры в раннем эмбриогенезе (Smith and Harland, 1992), развитие хрящей (Botchkarev et al., 1999) и дифференцировку волосяных фолликулов (Brunet et al., 1998;

Botchkarev et al., 1999;

Shi and Massague, 2003). Во многих экспериментальных системах, например, при изучении стволовых или раковых клеток, Noggin используется в качестве искусственного ингибитора BMP-каскада. Считается общепризнанным, что Noggin1 не является антагонистом для другой субгруппы лигандов TGF-, Activin/Nodal/TGFbeta, которые связываются с другими серин-треонин киназными рецепторами и регулируют транскрипцию другого набора генов-мишеней через внутриклеточный белок посредник Smad2/3 (Branford and Yost, 2002). Известно, что ингибирование этого сигнального пути необходимо для правильной разметки мезодермы при гаструляции (Piccolo et al., 1999), развития переднего мозга (Meno et al., 2001) и установления право-левой ассимметрии (Grande and Patel, 2009).

Помимо “классического” Noggin1, у позвоночных были найдены две других группы белков семейства Noggin, Noggin2 и Noggin4 (Furthauer et al., 1999;

Fletcher et al., 2004;

Eroshkin et al., 2006). Биологическая функция была показана в экспериментах только для Noggin2, который экспрессируется специфически в зачатке конечного мозга эмбрионов Xenopus и Danio, на основании которых было предположено, что Noggin2 может, по большей части, дублировать BMP-антагонистическую функцию Noggin1 (Furthauer et al., 1999). Однако, по нашему предположению, значительные различия в первичной структуре белков Noggin, которые принадлежат к разным белковым подсемействам (Eroshkin et al., 2006), и различающиеся паттерны их экспрессии указывают на возможные различия в репертуаре связываемых ими белков и предполагают различную биологическую функцию.

В связи с этим, задача настоящей работы – изучение механизмов функционирования данных белков и их роли в ранней тканевой дифференцировке – представляется весьма актуальной, как с точки зрения получения новых фундаментальных знаний, так и ввиду необходимости создания новых генно-инженерных продуктов для специфичного управления процессами жизнедеятельности и дифференцировки клеток.

.

Особенностью данной работы является использование в качестве основной экспериментальной модели эмбрионов шпорцевой лягушки Xenopus. Данная модель признается одной из наиболее перспективных для изучения механизмов реализации генетической информации в раннем эмбриогенезе и, кроме этого, представляет собой удобную тест-систему, позволяющую исследовать процессы in vivo.

Цель и задачи работы Целью данной работы было изучение свойств белков семейства Noggin и их функций в раннем развитии шпорцевой лягушки. В рамках поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ нуклеотидной и белковой последовательностей белков семейства Noggin.

2. Изучить временную и пространственную динамику экспрессии генов Noggin в раннем развитии шпорцевой лягушки.

3. Изучить влияние оверэкспрессии белков Noggin1 и Noggin2 на развитие эмбрионов шпорцевой лягушки.

4. Для изучения роли белков Noggin1 и Noggin2 в нормальном развитии шпорцевой лягушки идентифицировать белковые секретируемые факторы, связывающиеся с белками Noggin1 и Noggin2 и установить влияние их связывания на соответствующие сигнальные каскады.

Научная новизна и практическая ценность.

В ходе работы впервые был идентифицированы ранее не известные гомологи белков семейства Noggin. Клонированы полные последовательности кДНК и проведен структурный и сравнительный анализ аминокислотной последовательности.

Впервые изучен пространственно-временной паттерн экспрессии гена Noggin2 и Noggin Xenopus в ходе эмбриогенеза.

Впервые показана, на примере Noggin2, способность белков семейства Noggin связывать in vitro, помимо BMP, ряд белков Activin/Nodal- и Wnt каскадов – ActivinB, Xnr2, Xnr4 и Wnt8 – и ингибировать эти каскады in vivo. При этом механизм связывания отличается от механизма связывания белков BMP. Обнаружено, что ранее изученный белок Noggin1 обладает сходными свойствами, что и Noggin2.

Установлено, что искусственное блокирование трансляции мРНК Noggin2 вызывает редукцию переднего мозга. Впервые показано, что необходимым условием нормального развития этого отдела мозга является продолжительная изоляция его клеток от активности BMP-, Activin- и Wnt-сигнальных каскадов. В эмбриогенезе шпорцевой лягушки эта функция осуществляется белком Noggin2.

Обнаруженные новые свойства белков семейства Noggin открывают возможности их применения для регуляции BMP-, Activin/Nodal- и Wnt-сигнальных каскадов в различных биологических системах.

.

Апробация диссертации и публикации Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на международном конгрессе 16th International Society of Developmental Biologists Congress (Эдинбург, Великобритания, 2009) и симпозиуме "Белки и пептиды" (Петрозаводск, Россия, 2011). По теме диссертации опубликовано 8 работ в рецензируемых журналах, в т.ч. в 6 иностранных, оформлено 4 патентных заявки РФ.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения и выводов, изложена на страницах машинописного текста, содержит рисунков. Список литературы включает _ наименования.

Основное содержание работы

Клонирование и анализ последовательностей новых белков семейства Noggin До недавнего времени считалось, что в геноме позвоночных, так же как и у их близких родственников, асцидий, содержится единственный ген Noggin (далее называемый Noggin1).

Единственное исключение – костистые рыбы, у которых было обнаружено три различных гена Noggin (Noggin1, -2, -3), возникших, предположительно, в результате специфических геномных дупликаций в их эволюционной линии. Нами был проведен скрининг генов-мишеней транскрипционного фактора Xanf1, ранее клонированного в нашей лаборатории, методом вычитающей гибридизации (Eroshkin et al., 2006). Для этого ранние зародыши были Xenopus микроинъецированы морфолиновыми олигонуклеотидами (далее МО) против Xanf1 и контрольными МО, затем из эксплантатов передней нейроэктодермы была выделена мРНК, которая была подвергнута вычитающей гибридизации. Среди 19 независимых дифференциально экспрессирующихся клонов нами были идентифицированы два новых гена, гомологичных гену Noggin1. Один из кодируемых ими белков обнаружил высокую степень гомологии с белком Noggin2, ранее найденным у рыбы Danio rerio (67% идентичности), и поэтому был назван Noggin2. Другой ген обнаружил только 30% идентичности с белками Noggin1 и Noggin2 и был назван Noggin4, как следующий после ранее идентифицированного у Danio Noggin3. Следует отметить, что Noggin3 Danio является близким гомологом Noggin1 (62% идентичности), т.к. их гены, по всей видимости, произошли от общего предка в результате недавней дупликации, специфичной для эволюционной ветви Danio.

Для выявления возможных гомологов Noggin2 и Noggin4 у других организмов, мы провели соответствующий компьютерный поиск в доступных геномных базах данных (GenBank). В результате нами были обнаружены прямые гомологи этих генов у рыбы фугу и курицы. Прямых гомологов Noggin4 у Danio не было обнаружено, но был найден еще один ген, эволюционно равноудаленный от остальных генов, который был назван Noggin5. У млекопитающих был обнаружен единственный ранее охарактеризованный ген, Noggin1. У человека нами был обнаружен псевдоген Noggin4 в составе 22 хромосомы, который содержит 3 мутации сдвига рамки считывания и три стоп-кодона, нарушающие предполагаемую кодирующую область. Тем не.

менее, он без сомнения может быть отнесен к подгруппе Noggin4, т.к. его восстановленная аминокислотная последовательность обнаруживает гораздо более высокую степень гомологии с членами подгруппы Noggin4 (35-43%), нежели с остальными белками Noggin (20-28%) (рис.1 А).

Помимо большего отличия Noggin4 от других Noggin, в его первичной структуре нами было отмечено две важные особенности. Во-первых, он несет аминокислотные замены в положениях, критичных для связывания белков BMP (Groppe et al., 2002). Это предполагает более низкую способность связывать BMP или отсутствие такой способности вообще. Во-вторых в Noggin4 отсутствует гепарин-связывающий участок, удерживающий другие белки Noggin у клеточной поверхности (Paine-Saunders S et al., 2002). Нами предположено, что скорость диффузии Noggin4 в эмбриональных тканях может быть выше, чем других Noggin, несущих гепарин связывающий участок (рис.1 А).

На основании полученных данных нами было построено филогенетическое древо белков Noggin позвоночных животных (рис.1 Б).

Кроме того, гены семейства Noggin были обнаружены у некоторых беспозвоночных – губки Suberites domuncula, трихоплакса Trichoplax adhaerens, пресноводной гидры Hydra magnipapillata, асцидии Ciona intestinalis, что свидетельствует о древнем эволюционном происхождении данных генов.

Позже другими авторами были обнаружены гомологи Noggin у некоторых других беспозвоночных животных. Так, у планарии Schmidtea mediterranea были охарактеризованы 2 гена Noggin, Smed-nog1 and Smed-nog2, а также 8 Noggin-подобных генов, Smed-nlg1 – Smed-nlg8 (от Noggin-Like Gene), видимо, произошедшие от общего предка в результате дупликации(й) в эволюционной ветви планарий (Molina et al., 2009). У морского анемона Nematostella vectensis также были идентифицированы два гомолога Noggin, NvNoggin1 и NvNoggin2 (Matus et al., 2006).

Изучение локализации экспрессии генов Noggin в раннем развитии шпорцевой лягушки.

Временная динамика экспрессии генов Noggin2 и Noggin4 в раннем развитии шпорцевой лягушки была изучена с помощью метода обратной трансцрипции и ПЦР (ОТ-ПЦР) с праймерами, специфичными для генов Noggin1, -2 и -4. Для контроля общего количества кДНК в образцах были использованы праймеры к кодирующей части одного из генов домашнего хозяйства, орнитин-декарбоксилазы (ODC). Слабый, но превышающий фоновый уровень сигнал транскрипта Noggin2 был впервые отмечен на стадии поздней гаструлы (ст. 12.5). На последующих стадиях развития уровень сигнала постепенно повышался (рис.2 А).

В отличие от Noggin2, присутствие транскриптов Noggin4 выявлялось уже на стадии бластулы (ст. 8). С началом гаструляции (ст. 10.5) их концентрация резко повышалась и оставался в дальнейшем на примерно одинаковом уровне, что в целом напоминает динамику транскрипции гена Noggin1 (Smith and Harland, 1992) (рис.2 А).

Пространственный характер распределения транскриптов изучаемых генов был исследован методом гибридизации in situ на целых эмбрионах с помощью антисмысловых РНК-зондов.

.

Рис.1 (А) Выравнивание аминокислотных последовательностей белков семейства Noggin Xenopus laevis, Xenopus tropicalis (X.t.), Fugu rubripes (F.r.) and Gallus gallus (G.g.), Danio rerio (D.r.). Черным помечены аминокислотные остатки, консервативные для всех белков. Аминокислотные остатки, консервативные для каждого типа белков, выделены разными цветами. Ножницами указан сайт протеолитического отщепления лидерного пептида. Цифрами отмечены консервативные остатки цистеина. Стрелками обозначены аминокислоты, критичные для связывания с BMP. Горизонтальным пунктиров отмечен гепарин-связывающий регион. (Б) филогенетическое древо белков Noggin позвоночных и асцидии. C.i., Ciona intestinalis, D.r., Danio rerio, F.r., Fugu rubripes, G.g., Gallus gallus, H.s., Homo sapiens. X.l., Xenopus laevis, X.t., Xenopus tropicalis.

.

Рис.2. Экспрессия генов Noggin на стадиях 10,5 – 18. (А) Результаты ОТ-ПЦР тотальной РНК разных стадий развития с праймерами на noggin1 (N1), noggin2 (N2), noggin4 (N4) и EF-1-alpha (EF) (внутренний контроль). (Б-О) результаты гибридизации in situ. Вид с дорсальной стороны (Б, К, Н), спереди, дорсальная сторона сверху (В, Г, П), с вегетативной стороны, дорсальная сторона сверху (Е, Ж), с правой стороны, дорсальная сторона сверху (Л, О), саггитальный разрез, передняя часть справа (Д, М). Сокращения: Бл, бластопор;

Гц, гастроцель;

ДГ, дорсальная губа бластопора;

Ках, крыша архентерона;

НВ, нервные валики;

НГ, презумптивный нервный гребень;

НХ презумптивный нотохорд;

ПК, передний край нервной пластинки;

ПНП, передняя нервная пластинка;

Пэм, передняя эндомезодерма;

Сом, презумптивные сомиты;

Э, эпидермис.

Рис.3. Экспрессия генов Noggin на стадиях 24 и 26. (А–Е) результаты гибридизации in situ. Вид с правой стороны, дорсальная сторона сверху, передняя часть справа. (Г1–Е4) гистологические срезы эмбрионов, изображенных на (Г) и (Е), линии среза указаны красным пунктиром. (Г1, Е2 и Е2), дорсальная сторона сверху;

(Г2, Е3 и Е4), передняя сторона справа. Сокращения: Г, глаз;

ЖД, жаберные дуги;

ЗМ, задний мозг;

НГ, нервный гребень;

НТ, нервная трубка;

ПМ, передний мозг;

Пр, присоска;

ПЭ, презумптивный пигментный эпителий;

С- сердце;

Сом, сомиты;

Ст., стадия;

Стч, сетчатка;

УП, ушные пузыри;

Х, нотохорд;

Э, презумптивный эпидермис;

Mes, mesencephalon.

.

В течение гаструляции транскрипция Noggin2 на уровне, отличном от фонового, не была обнаружена. Начало экспрессии гена Noggin2 было обнаружено на стадии средней нейрулы (ст.

14) в тонкой полоске, соответствующей проспективному переднему нервному валику. В течение второй половины нейруляции, интенсивность окраски этой полоски возрастала (рис.2 Б-Г). Как известно, Noggin1 также экспресируется в области переднего края нервной пластинки и, кроме того, в клетках хорды и средней лини нервной пластинки (Fletcher et al., 2004).

Для более точного изучения локализации транскриптов изучаемых генов были изготовлены серийные гистологические срезы эмбрионов, прошедших процедуру гибридизации in situ. На саггитальных срезах этих эмбрионов видно, что экспрессия как Noggin1, так и Noggin2 на стадии 15 (средняя нейрула) ограничена треугольным доменом, соответствующем наиболее антериорной части внутреннего (сенсорного) слоя нервной пластинки. (рис.2 Д). На стадии хвостовой почки (ст. 24) экспрессия Noggin2 ограничена зоной презумптивного переднего мозга. На стадии более слабая экспрессия была также детектирована в дорсальной части заднего мозга, дорсальной части сомитов и в зачатке сердца (рис.3 А-В). В отличие от Noggin1, Noggin2 не экспрессируется в присоске, хорде и туловищной части нервной трубки (рис.3 А-В).

В начале гаструляции Noggin4 диффузно экспрессируется в анимальной полусфере, с локальным максимумом в проспективном зачатке передней нейроэктодермы(рис.2 Е, З). На срезах окрашенных эмбрионов видно, что экспрессия Noggin4 на этой стадии локализуется исключительно в эктодермальных клетках (рис.2 М). Даже в дорсальной краевой зоне экспрессия Noggin4 обнаруживается только в двух внешних слоях клеток, но не в клетках более внутренних слоев, соответствующих презумптивной дорсальной мезодерме. Noggin1, наоборот, на данных стадиях экспрессируется исключительно во внутренних слоях дорсальной губы бластопора, в презумптивных мезодермальных клетках, т.е. комплементарно зоне экспрессии Noggin4 (рис.2 И).

В течение гаструляции Noggin4 продолжает экспрессироваться только в эктодерме, с максимумом в зоне презумпивной передней нервной пластинки. На стадии средней и поздней гаструлы максимум экспрессии Noggin4 приходится на передний нервный валик. В отличие от Noggin1, на стадии средней нейрулы Noggin4 обнаруживает крайне низкий уровень экспрессии в средней линии нервной пластинки. Как видно на фронтальных срезах эмбрионов на стадии поздней нейрулы, экспрессия Noggin4 локализована в клетках нервной пластинки и нервных валиков, включая клетки презумптивного нервного гребня. Небольшой уровень экспрессии также отмечен в эпидермальных клетках. В то же время, транскрипты Noggin4 не были обнаружены в передней мезодерме и в подстилающих клетках крыши архентерона (рис.2 О). На стадии 24 и далее, Noggin экспрессируется преимущественно в головной и дорсальной части эмбриона. Зона экспрессии включает в себя головной эпидермис, дорсальную часть нервной трубки, включая переднемозговую область, ушные плакоды, присоску и производые нервного гребня, включая жаберные дуги (рис.3 Г-Е). В зачатке глаза Noggin4 экспрессируется в презумптивной сетчатке, но не в клетках презумптивного пигментного эпителия. Единственными мезодермальными производными, в которых была обнаружена экспрессия Noggin4, являются узкие полоски клеток вдоль средней линии сомитов (рис.3 Г-Е).

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о наличии у позвоночных как минимум трех генов Noggin на гаплоидный геном. Два из них – Noggin1 и Noggin2 - имеют частично перекрывающиеся зоны экспрессии, тогда как третий ген – Noggin4 – демонстрирует резко отличающийся экспрессионный паттерн. Исходя из различий как в первичной структуре белков Noggin, так и в паттернах экспрессии их генов, можно предположить, что они выполняют различные функции в раннем эмбриогенезе шпорцевой лягушки. В дальнейшей работе мы.

ограничили область исследований сравнительным анализом молекулярных и физиологических функций генов Noggin1 и -2.

Изучение эффектов эктопической экспрессии генов Noggin1 и -2 в раннем развитии шпорцевой лягушки.

Из литературных данных известно, что эктопическая экспрессия гена Noggin1 в вентральных клетках ранних эмбрионов шпорцевой лягушки приводит к индукции дополнительных туловищных отделов осей тела вследствие ингибирования BMP-каскада. Чтобы выявить возможные различия в функциях между Noggin1 и Noggin2, мы прежде всего сравнили способность генов Noggin индуцировать вторичные оси. Для этого мы микроинъецировали в вентральные клетки эмбрионов на стадии 4-8 бластомеров полноразмерную мРНК Noggin1 или ее производную 5, у которой отсутствует большая часть 5’ -нетранслируемой области (далее НТО) (Smith and Harland, 1992) в дозах от 20 до 400 пикограм на бластомер (далее пг/бл). В результате таких микроинъекций, в соответствии с литературными данными, были индуцированы вторичные оси тела, в которых отсутствовали головные структуры (рис.4 А).

Когда были произведены микроинъекции мРНК Noggin2, у которой отсутствовала, аналогично 5 мРНК Noggin1, большая часть 5’-НТО, индукция вторичных осей не наблюдалась.

Вместо этого нормальное развитие эмбрионов останавливалось на стадии ранней нейрулы (рис. Б). Дальнейший анализ таких эмбрионов с помошью гибридизации in situ с зондами на различные гены-маркеры выявил сильнейшую нейрализацию эктодермы, выявляемую по характеру экспрессии пан-нейрального маркера NCAM, и сопровождающуюся распространением экспрессии маркера рострального переднего мозга Xanf1 (рис.4 В,Г). При этом экспрессия эпидермального (keratin) и мышечного (muscle actin) маркеров была сильно подавлена (рис.4 Д, Е). Это указывает на то, что Noggin2 способен к нейрализации эмбрионов за счет эктодермальных и мезодермальных производных, и специализирует нервную ткань по переднемозговому типу.

Чтобы проверить, могут ли более низкие концентрации мРНК Noggin2 позволить эмбрионам пройти стадию нейруляции и индуцировать нормально сформированные вторичные структуры, мы понизили количество микроинъецированной мРНК до 3-5 пг/бл. В результате у 35% инъецированных эмбрионов происходило развитие вторичных голов с циклопическими глазами и другими структурами переднего мозга, маркированными экспрессией генов Pax6 и Bf (рис.4 Ж-И). В дальнейшем влияние мРНК Noggin2 было исследовано с помощью эмбрионов трансгенной линии, в которой ген репортерного флуоресцентного белка RFP находится под контролем промотора мышечного актина (Shcherbo et al., 2007). Микроинъекции мРНК Noggin2 в концентрации 3-5 пг/бл в такие эмбрионы приводили, в отличие от мРНК Noggin1, к сильной редукции мышечной ткани или даже к ее полному исчезновению во вторичных осях (рис.4 И-И'').

Таким образом, в отличие от Noggin1, который вызывает усиление развития мышечной ткани в главной оси тела, Noggin2 вызывает ее редукцию.

Изучение эффективности трансляции мРНК генов Noggin1 и -2 в эмбрионах шпорцевой лягушки.

Способность мРНК Noggin2 индуцировать вторичные головы напоминает свойства известного головного индуктора – секретируемого белка Cerberus, который способен одновременно подавлять BMP-, Nodal- и Wnt- каскады за счет внеклеточного связывания.

Рис.4. Микроинъекции мРНК Noggin2 дикого типа вызывает эффекты, отличные от вызванных мРНК Noggin1 дикого типа. Название и количество микроинъецированной мРНК приведено на каждом фото снизу, название гибридизационного зонда - сверху. (А-Е, вид с дорсальной стороны;

Ж-И, вид сбоку;

К-Л, эмбрионы на ст.10.5, вид с вегетативного полюса) Вентральная микроинъекция мРНК Noggin15 (А) индуцирует вторичные оси, тогда как аналогичная микроинъекция мРНК Noggin2 (Б) вызывает образование грибоподобных тел. (В-Е) гибридизация in situ контрольных (слева на каждом фото) и микроинъецированных Noggin2 эмбрионами с различными маркерными генами. (Ж) Вентральная микроинъекция мРНК Noggin2 индуцирует образование вторичных голов с циклопическими глазами. (З) экспрессия переднемозгового маркера XBF1 в таких головах, выявляемая гибридизацией in situ. (И) при аналогичных микроинъекциях в трансгенные эмбрионы, несущие ген флуоресцентного белка под контролем мышечного промотора наблюдается редукция осевой мускулатуры. (И) фото в дневном свете, (И’, И”) – наложение фото в дневном свете, красной и зеленой флуоресценции. (К-Л) мРНК Noggin2, но не мРНК Noggin1 ингибирует экспрессию гена XBra в краевой зоне бластопора.

.

соответствующих лигандов (Piccolo et al., 1999). Исходя из этого, мы решили изучить способность белка Noggin2 связываться с различными лигандами методом коиммунопреципитации. Однако, так как в литературе предполагается, что 5’-НТО может снижать эффективность трансляции мРНК Noggin1 (Smith and Harland, 1992), мы сначала решили сравнить эффективность трансляции синтетических мРНК Noggin1 и Noggin2, несущих разные 5’-НТО, в клетках эмбрионов шпорцевой лягушки. Для этого нами были сконструированы производные Noggin1 и Noggin2, меченные специфической антигенной детерминантой myc на N-конце зрелого полипептида (рис. А). Соответствующие мРНК были микроинъецированы в эмбрионы в разных концентрациях на стадии двух бластомеров, эмбрионы развивались до стадии средней гаструлы и подвергались лизису, после чего сравнительное количество белка в лизатах эмбрионов определялось методом иммуноблоттинга со специфическими анти-myc антителами. В результате было установлено, что мРНК Noggin1, несущая полноразмерную 5’-НТО, так же как и ее производная 5, у которой отсутствует большая часть 5’-НТО, транслируются по меньшей мере в 200 менее эффективно, чем мРНК Noggin2, несущая полноразмерную 5’-НТО (рис. 5 Б).. В то же время, не было отмечено существенной разницы в эффективности трансляции мРНК Noggin2 с полноразмерной 5’-НТО дикого типа в сравнении с короткой синтетической 5’-НТО, несущей консенсусную последовательность Kozak (рис. 5 В).

Важно, что столь существенная разница в эффективности трансляции мРНК Noggin1 и Noggin2 не компенсируется противоположной разницей в концентрациях их мРНК в нормальном развитии. Нами было установлено с помощью метода ОТ-ПЦР, что мРНК обоих генов присутствует в эмбрионах приблизительно в равных количествах (рис.5 Г). Это означает, что эндогенный белок Noggin2 должен присутствовать в эмбрионах в гораздо больших количествах, чем белок Noggin1. Чтобы подтвердить это напрямую, мы сравнили количества эндогенных белков Noggin1 и Noggin2 в эксплантатах переднего нервного валика, используя антитела, полученные против специфических олигопептидов. Хотя нам не удалось детектировать сигнал, специфический для Noggin1, низкий, но четко отличимый от фонового уровня сигнал был получен с антителами на Noggin2 (рис. 5 Д). Так как аффинность обоих использованных антител была равной, что было показано с помощью экзогенных белков (рис. 5 Е), меченных myc олигопептидом, то можно заключить, что в нормальном развитии концентрация эндогенного белка Noggin2 сильно превышает таковую Noggin1.

Учитывая такую разницу в эфффективности трансляции указанных мРНК, в дальнейших опытах мы использовали myc-меченные варианты Noggin1 и -2, с короткой синтетической 5’-НТО, несущей консенсусную последовательность Kozak. Правомерность использования myc-меченых белков Noggin1 и -2 в дальнейших экспериментах по коиммунопреципитации белков была подтверждена тем, что мРНК таких варантов, будучи микроинъецированной в эмбрионы в различных функциональных тестах, вызывала такие же эффекты, как и мРНК Noggin1 и -2 без myc-метки.

.

Рис.5. Белки Noggin1 и Noggin2 могут связывать TGF-- и Wnt-лиганды. (А) Основные мРНК и белки, использованные в экспериментах. (Б, В) Сравнение способности к трансляции MycNoggin15 и MycNoggin методом иммуноблоттинга с антителами против myc-пептида. (Г) Количество мРНК Noggin1 и Noggin2 в области передней нервной пластинки, оцененное методом ОТ-ПЦР, примерно одинаково. (Д, Е) Количество белка Noggin2 в эмбрионах, оцененное методом иммуноблоттинга с антителами против этих белков, значительно превышает количество Noggin1 (на (Д) нанесены эндогенные белки, на (Е) – оверэкспрессированные). (Ж-И) Способность белков Noggin1 и Noggin2 и их -клип мутантов связывать ADMP, BMP, ActivinB, Wnt8, Xnr2, Xnr4 и Wnt8, выявленная методом коиммунопреципитации. Zyxin приведен в качестве отрицательного контроля.

Изучение лиганд-связывающих свойств белков Noggin1 и -2.

Для изучения возможного влияния Noggin1 и -2 на BMP-, Activin/Nodal- и Wnt-каскады, участвующие в раннем эмбриогенезе, методом коиммунопреципитации нами была исследована способность белков Noggin1 и -2 связываться с соответствующими лигандами. Для этого нами были сконструированы плазмиды, кодирующие производные различных белков, меченные специфической антигенной детерминантой flag на N- или C-конце зрелого полипептида, а именно.

ADMP, BMP4 (BMP-каскад);

ActivinB, Xnr2, Xnr4 (Activin/Nodal каскад) и Wnt8 (канонический Wnt каскад). Каждый из этих белков был отдельно транслирован в эмбрионах, после чего грубые лизаты белков смешивали, белковые комплексы осаждали с помощью анти-myc антител, иммобилизованных на протеин-G сефарозе и изучали методом иммуноблоттинга с анти-flag антителами.

В результате нами было установлено, что оба белка, Noggin1 и Noggin2, связываются, помимо BMP4, со всеми вышеперечисленными белками (рис. 5 Ж-И). В качестве отрицательного контроля нами был выбран внутриклеточный цистеин-богатый белок Zyxin. Когда нами была использована низкотранслируемая мРНК Noggin1 с 5’-НТО дикого типа, коиммунопреципитация Noggin1 наблюдалась только с BMP4 (рис. 5 Ж, З). Этот результат подтверждает наше предположение о том, что белок Noggin1, из-за низкой концентрации в эмбрионах, в нормальном развитии способен ингибировать только BMP-лиганды в силу намного более высокой аффинности к ним, нежели к другим TGF-- и Wnt-лигандам. Кроме того, это согласуется с представлением, что Noggin1 функционирует в эмбриональном развитии только как ингибитор BMP. Необходимо заметить, что нами не было обнаружено разницы между Noggin1 и Noggin2 в связывании BMP даже когда концентрация белков, взятых на коиммунопреципитацию, была снижена в 20 раз. Все эти данные говорят о том, что аффинность к TGF-- и Wnt-лигандам у обоих белков Noggin приблизительно одинакова.

Из литературных данных известно, что N-концевой, т.н. клип-домен Noggin1 критически важен для связывания с BMP (Groppe et al., 2002). Чтобы установить, играет ли этот домен важную роль для связывания Noggin1 с другими TGF--лигандам и Wnt8, нами была проверена способность делеционных мутантов Noggin1 и Noggin2, лишенных 28 N-концевых а/к остатков зрелого полипептида (формирующих клип-домен) связываться с соответствующими лигандами (-клип-Noggin1 и -2). В результате нами было установлено, что удаление клип-домена резко снижает, вплоть до фонового уровня, способность Noggin1 и Noggin2 связываться с BMP4 (рис. Ж). Однако -клип-Noggin1 и -2 продолжают связываться с остальными TGF--лигандами, хотя и несколько слабее, чем полноразмерные белки (рис. 5 И). Удаление клип-домена никак не сказалось на способности Nogginов связываться с Wnt8 (рис. 5 И).

В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что не клип-домен, а другие регионы молекул Noggin ответственны за связывание с TGF-- (кроме BMP) и Wnt-лигандами.

Noggin1 и Noggin2 способны ингибировать активность Activin/Nodal иWnt- каскадов в живых эмбрионах.

Для исследования влияния белков Noggin и их делеционных производных на активность TGF-- и Wnt-сигнальных каскадов, в первую очередь мы изучили их способность ингибировать экспрессию специфических люциферазных репортерных конструкций в эмбрионах Xenopus. Для этого нами были использованы плазмиды, несущие ген люциферазы под контролем Smad2 связывающих (pARE-Luc) (Activin/Nodal-каскад) и -Catenin (pTOPflash) (Wnt-каскад) цис регуляторных элементов. Было показано, что люциферазная активность и pARE-Luc, индуцированная в эктодермальных эксплантатах мРНК ActivinB и Xnr2, и pTOPflash, индуцированная в эксплантатах вентральной краевой зоны мРНК Wnt8, подавляется мРНК Noggin1 и -2, так же как и мРНК -clip-Noggin1 и -2, взятой в избытке по отношению к мРНК ActivinB, Xnr2 и Wnt8. В данных условиях оба белка, как и их делеционные мутанты, оказались примерно одинаково эффективны при подавлении ActivinB и Wnt8, тогда как в случае Xnr2 и.

Рис.6. Белки Noggin способны подавлять активность ActivinB, Xnr2 и XWnt8. (А-В) белки Noggin, транслированные с синтетической (SynNoggin) мРНК, ингибируют в эмбрионах активность специфических люциферазных репортеров.

Над каждой диаграммой приведены изучаемый каскад и соответствующий ему репортер, снизу – тип и количество мРНК (в пикограммах на эмбрион), добавленнных в смесь для микроинъекции. По вертикали приведена нормализованная люциферазная активность, уровень контроля принят за 1. мРНК RFP в наибольшей концентрации выбрана в качестве отрицательного контроля. Черточками показано стандартное отклонение. (А’-В’) относительный уровень экспрессии генов-мишеней изучаемых каскадов, измеренная методом количественной ОТ-ПЦР, уровень контроля принят за 1;

условия экспериментов такие же, как в А-В. Черточками обозначено стандартное отклонение.

(Г-Ж) Сравнение ингибиторной активности Noggin1 и Noggin2 с активностью известных ингибиторов, определяемой по количеству их мРНК, необходимом для снижения люциферазной активности в 2 раза при данных условиях эксперимента. Количество микроинъецированной мРНК лигандов – как в А-В. мРНК Zyxin выбрана в качестве отрицательного контроля. Черточками обозначено стандартное отклонение.

.

Noggin2, и -clip-Noggin2 подавляли репортерную активность намного сильнее, чем Noggin1 и clip-Noggiт1 (рис. 6 А-В).

Способность Noggin и их делеционных мутантов подавлять ActivinB, Xnr2 и Wnt была подтверждена анализом экспрессии генов-мишеней соответствующих сигнальных каскадов в эмбриональных эксплантатах с помощью метода ОТ-ПЦР. Так, нами наблюдалось подавление транскрипции гена Xbra (непосредственная мишень Activin/Nodal-каскада) и Xnr (непосредственная мишень Wnt-каскада) (рис. 6 А'-В').

Важно, что Noggin и их делеционные мутанты оказались не способными подавить активность данных каскадов в случае активации не секретируемыми лигандами, а внутриклеточными посредниками (Smad2 и -Catenin соответственно) (рис. 6 А-В), что подтверждает внеклеточный механизм действия белков Noggin. Кроме того, оверэкспрессия Smad2, так же как и Smad1, не повлияла на подавление Wnt-каскада белками Noggin, равно как и коэкспрессия -Catenin или Smad1 не повлияла на ингибирующие свойства Noggin. Это подтверждает предположение, что ингибиторная активность Noggin обусловлена их блокированием внеклеточных лигандов, а не опосредованным взаимным влиянием различных сигнальных каскадов.

Нами не было выявлено ингибирования данных сигнальных каскадов в случае использования мРНК Noggin1 дикого типа даже при повышении ее концентрации до 500 пг/бл.

Для примерной количественной оценки ингибиторной активности Noggin1 и -2, мы сравнили их влияние на активность данных каскадов с влиянием известных белков – Cerberus (ингибитор Nodal и Wnt) и Follistatin (ингибитор Activin) и между собой. Для этого нами была определена концентрация мРНК этих четырех ингибиторов, необходимая для подавления люциферазной активности в 2 раза. Предварительно методом вестерн-блоттинга была определена концентрация мРНК каждого лиганда (ActivinB, Xnr2 и Wnt8), приводящая к синтезу одинакового количества белка в эмбрионах, для чего были использованы flag-меченные производные этих лигандов. В результате было установлено, что Noggin2 ингибирует ActivinB в 10 раз слабее, чем Follistatin, а Xnr2 и Wnt8 – в 3 раза слабее, чем Cerberus (рис. 6 Г-Е). В то же время, Noggin ингибирует Wnt8 примерно так же, как и Noggin2, а ActivinB и Xnr2 – в 4 раза слабее, чем Noggin (рис. 6 Г-Е). Для сравнения ингибирования BMP белками Noggin мы использовали люциферазный репортер TCFm-Luc, в которм ген люциферазы находится под контролем Smad1-связывающих цис-регуляторных элементов. При этом не было отмечено значимой разницы между Noggin1 и Noggin2 в подавлении BMP-каскада в эктодермальных эксплантатах (рис. 6 Ж).

Noggin1 и Noggin2 способны влиять на онтогенетические процессы, контролируемые Activin/Nodal и Wnt- каскадами в эмбрионах.

На основании способности белков Noggin связывать и ингибировать TGF- и Wnt-лиганды, можно предсказать, что белки Noggin, будучи экспрессированы в достаточных количествах, способны влиять на физиологические процессы, контролируемые Activin/Nodal- и Wnt- каскадами в развивающихся эмбрионах.

Для изучения влияния Noggin1 и Noggin2 на Smad2-зависимые процессы, с помощью метода гибридизации in situ мы проанализировали эффекты влияния Noggin1 и -2 на два гена, XBra and goosecoid, напрямую регулируемые Smad2. Для этого нами были использованы высокотранслируемые варианты мРНК Noggin1 и Noggin2. Из литературы известно, что.

ингибиторы BMP, как, например, транслированный с мРНК дикого типа Noggin1, способны индуцировать экспрессию goosecoid, в вентральной части краевой зоны, но не способны ингибировать экспрессию Xbra. В то же время, белковые факторы, способные подавлять и Smad1-, и Smad2-опосредуемые каскады (такие как Cerberus) способны ингибировать экспрессию Xbra, но не способны индуцировать экспрессию goosecoid (Bouwmeester et al., 1996;

Eimon and Harland, 1999).

При микроинъекциях мРНК Noggin2 нами наблюдалась сильное ингибирование XBra в экваториальной зоне (90%, n=65) (рис. 7 А), что согласуется со способностью Noggin2 связывать и ингибировать белки Xnr. В то же время, микроинъекции мРНК Noggin1 приводила к меньшему проценту эмбрионов, у которых наблюдалось подавление экспресии мРНК Xbra (42%, n=70) (рис.

7 А), что объясняется более низкой ингибиторной активностью в отношении Xnr, и, соответственно, Smad2-каскада. Согласно с результатами коиммунопреципитации, -clip-Noggin и -2 также ингибировали эндогенную экспрессию Xbra. Активация экспрессии goosecoid при этом не наблюдалась (рис. 7 В, Г).

Вентральная микронъекция 3-5 пг/бл мРНК Noggin2 дикого типа на стадии 4-8 бластомеров достаточна для индукции вторичных голов, так как данный процесс требует одновременного подавления BMP, Nodal и Wnt. Однако микронъекция даже 500 пг/бл низкотранслируемой мРНК Noggin1 дикого типа приводит лишь к индукции безголовых вторичных осей, что указывает на подавление только BMP. Чтобы выяснить, способны ли более высокие концентрации белка Noggin1 индуцировать вторичные оси с головами, что согласовалось бы со способностью Noggin подавлять Nodal- и Wnt-каскады, мы микроинъецировали высокотранслируемую мРНК Noggin1.

Действительно, в этом случае нами наблюдалось образование вторичных голов с передним мозгом и циклопическими глазами (рис. 7 Д). Однако процент эмбрионов с вторичными головами был ниже, чем в случае микроинъекции Noggin2 (соответственно 15%, n=126 и 35%, n=120). Кроме того, все вторичные оси с головами, индуцированные Noggin1, также включали в себя хорошо развитые туловища с рядами сомитов. Вторичные же оси, индуцированные Noggin2, сомитов не содержали. Это различие может объясняться более сильным ингибирующим влиянием Noggin2 на Nodal/Xnr, чем Noggin1. В этом отношении Noggin2 напоминает Cerberus, который способен индуцировать эктопические головные, но не туловищные структуры вследствие способности эффективно подавлять Nodal- и Wnt-каскады.

При снижении количества микроинъецируемой мРНК Noggin2 в 10 раз, с 3 до 0.3 пг/бл, мы наблюдали формирование исключительно безголовых вторичных осей, которые напоминали оси, индуцированные под действием низкотранслируемой мРНК Noggin1 дикого типа (не показано).

Такие оси несли хорошо развитые ряды сомитов. Это означает, что Wnt- и Nodal-связывающие функции Noggin2 практически полностью исчезают при значительном снижении концентрации, тогда как эффекты, обусловленные его BMP-связывающей функцией, сохраняются в силу большего сродства к BMP, чем к Wnt или к Nodal. Микроинъеции мРНК Noggin2 в низкой концентрации (0.3 пг/бл) приводит к примерно такому же проценту вторичных осей, что и мРНК Noggin1 дикого типа в количестве 50 пг/бл (соответственно 35%, n=118 и 31%, n=117). Это хорошо согласуется с предыдущими результатами, свидетельствующими о разнице транслируемости этих мРНК примерно в 200 раз.

При микроинъекции высокотранслируемой мРНК Noggin1 и Noggin2 в дорсальные анимальные бластомеры в количестве 2-5 пг/бл нами наблюдалось увеличение переднего мозга, включая глаза (рис. 7 К). Кроме того, в эмбрионах, инъецированных в медиальную область, наблюдался циклопический фенотип на стадии головастиков (рис. 7 З, И,). В этих экспериментах.

Noggin2 оказался более сильным агентом, вызывая более выраженную циклопию и увеличение зачатка переднего мозга. Это не может быть объяснено различным влиянием Noggin1 и Noggin2 на BMP- and Wnt-каскады, так как оба белка, экспрессированные с высокотранслируемых мРНК, ингибировали эти два каскада одинаково эффективно. Такое различие является, более вероятно, результатом более сильной ингибиторной активностью Noggin2 по отношению к Nodal/Xnr каскаду. Это предположение хорошо согласуется с тем фактом, что именно Nodal/Xnr-каскад необходим для разделения исходно единого глазного поля на два зачатка билатерально расположенных глаз у позвоночных, и ингибирование этого каскада приводит к циклопии (Schier et al., 1996). Похожий циклопический фенотип наблюдается в результате микроинъекции мРНК Cerberus или CerberusS, также способных ингибировать Nodal/Xnr-каскад (Bouwmeester et al., 1996;

Piccolo et al., 1999).

Так как клип-мутанты Noggin1 и -2 не способны связывать BMP, но сохраняют способность связывать Xnr и Wnt, то можно предположить, что эти мутанты могут влиять на биологические процессы, регулируемые Xnr и Wnt. Действительно, микроинъекции clipNoggin и clipNoggin2 в дорсальные бластомеры приводят к увеличению переднего мозга и глаз, сопровождаемое циклопией, как и в случае с полноразмерными Noggin (рис. 7 Л, М). В соответствии с неспособностью связывать BMP, клип-мутанты Noggin1 и -2 не индуцируют вторичные оси тела при инъекции в вентральные бластомеры даже при инъекции больших количеств мРНК (100 пг/бл) (не показано).

Далее, нами была изучена способность подавлять возникновение вторичных осей тела, индуцированных эктопической экспрессией Wnt8 в вентральной части эмбрионов на стадии средней бластулы. Такие оси возникают в результате возникновения вторичного ньюкуповского центра под действием Wnt8. Все известные антагонисты Wnt-каскада, включая Cerberus и Dkk, подавляют формирование вторичных осей, когда их мРНК коинъецируется вместе с мРНК Wnt8.

Сходным образом, когда вместе с мРНК Wnt8 нами была инъецирована мРНК clipNoggin1 или clipNoggin2, нами наблюдалось резкое уменьшение числа эмбрионов с двойными осями тела (не показано).

Оверэкспрессия Wnt в проспективном головном регионе эмбрионов на стадии гаструлы приводит к микроцефалии. Этот эффект Wnt может быть нейтрализован ко-инъекцией мРНК Cerberus или Dkk (Glinka et al., 1997;

Glinka et al., 1998;

Piccolo et al., 1999). Чтобы проверить, способны ли мутанты клипNoggin повлиять на активность Wnt в таких опытах, мы микроинъецировали эмбрионы плазмидой pCSKA-Wnt8, которая начинает экспрессировать Wnt после начала гаструляции, что вызывает микроцефалию, включая редукцию глаз. Действительно, когда мы ко-инъецировали pCSKA-Wnt8 с мРНК clipNoggin1 или clipNoggin2 на стадии 8 клеток в дорсальные анимальные бластомеры, которые в норме дают начало передней нервной пластинке, мы наблюдали восстановление нормального развития головы. Таким образом, эти эксперименты также подтверждают способность Noggin влиять на активность Wnt каскада(не показано).

И, наконец, нами была изучена способность мутантов clipNoggin подавлять Wnt- и Nodal/Xnr- каскады, для чего мы проверили способность этих мутантов комплементировать (дополнять) “чистые” антагонисты BMP, как это было показано для Dkk и доминантно негативного рецептора tBR при индукции головы (Glinka et al., 1998;

Glinka et al., 1997). Нами было использовано два вида ингибиторов BMP – tBR и низкотранслируемый вариант Noggin15.

Когда какой-либо из этих ингибиторов BMP был экспрессирован в зародышах, нами наблюдалась индукция безголовых вторичных осей тела). В результате их ко-инъекции с мРНК clipNoggin образовывались вторичные оси, которые содержали головы в 10% случаев (n=75 и 64). Однако,.

развитие осей с головами не наблюдалось в случает коинъекции с clipNoggin1. Это может быть объяснено боле низкой способностью clipNoggin1 ингибировать Nodal/Xnr- каскад по сравнению с clipNoggin1 (не показано).

В целом, данные результаты полностью подтверждают с открытую нами способность обоих белков Noggin к подавлению Wnt- и Nodal/Xnr- каскадов.

Активность Noggin2, но не Noggin1, необходима для нормального эмбрионального развития Xenopus.

Для выяснения роли Noggin1 и Noggin2 в развитии переднего мозга, в зачатке которого они экспрессируются, в ходе нормального эмбриогенеза, нами была осуществлена серия экспериментов по блокированию функций этих генов. Для этого в эмбрионы на стадии 8 клеток в сооответствующие бластомеры нами были микроинъецированы специфические антисмысловые морфолиновые олигонуклеотиды (далее МО), селективно блокирующие трансляцию. В соответствии с литературными данными (Kuroda et al., 2004), нами не было отмечено существенных аномалий при микроинъекции МО к Noggin1 (не показано). Этот результат, указывающий на малое значение Noggin1 для развития передней нервной складки, косвенно подтверждает наше заключение, что эндогенный белок Noggin1, экспрессирующийся с низко транслируемой мРНК, присутствует в эмбрионах в крайне малых количествах и не способен подавить Activin/Nodal и Wnt- каскады.

У эмбрионов, микроинъецированных в переднюю область МО к Noggin2, наоборот, на стадии головастиков наблюдалась редукция конечного мозга, глаз и назальных плакод (90%, n=116) (рис. 8 А). Соответствено, эти эффекты сопровождались понижением уровня экспрессии маркеров конечного мозга (XBf1) и глаз (Pax6) (рис. 8 В, Д). В то же время, у эмбрионов, инъецированные МО к Noggin2 в туловищную область, видимых аномалий не наблюдалось (не показано). Также аномалий не было отмечено в случае использования контрольного МО, несущего 7 некомплементарных мРНК Noggin2 нуклеотидов (рис. 8 Б, Г, Е).

Для дальнейшего изучения специфичности эффектов, вызванных МО к Noggin2, мы микроинъецировали эмбрионы, помимо МО, мРНК Noggin2 или clipNoggin2, не несущих участка связывания МО. В результате мы наблюдали гипер-реверсию эффектов МО в случае мРНК Noggin2 и неполную, но значительную реверсию в случае clipNoggin2 (рис. 8 Ж-И). Помимо специфичности действия МО, эти результаты показывают, что для правильного развития передней нервной пластинки необходима как клип-домен-зависимая, так и клип-домен-независимая активность Noggin2.

Ингибирование Activin-каскада посредством Noggin2 необходимо для развития переднемозговых структур.

Необходимость Noggin2 как ингибитора отличных от BMP сигнальных каскадов может быть объяснена его способностью подавлять Wnt-каскад. Это подавление Wnt-каскада в течение нейруляции необходимо для развития переднего мозга (Kiecker and Niehrs, 2001;

Lagutin et al., 2003;

Onai et al., 2004). Кроме того, потенциально возможно влияние Noggin2 на Smad2 опосредуемый каскад. Насколько известно из литературных данных, единственным лигандом, активирующим этот каскад, и экспрессирующимся в течение нейруляции вблизи переднего края нервной пластинки, является ActivinB (Dohrmann et al., 1993).

.

Чтобы выяснить, играет ли Noggin2 существенную роль в ингибировании ActivinB в зачатке переднего мозга, мы в первую очередь сравнили методом гибридизации in situ паттерны экспрессии ActivinB и Noggin2 в эмбрионах, разделенных пополам (по средней линии) перед гибридизацией. Одна половина была гибридизована с зондом на ActivinB, а другая – с зондом на Noggin2. До нейруляции ActivinB экспрессируется на очень низком уровне (не показано), но уровень его экспрессии начинает существенно возрастать, вместе с уровнем экспрессии Noggin2, в начале нейруляции. Важно, что оба гена экспрессируются комплементарным образом (рис. 9 А В'). Экспрессия Noggin2 наблюдается в клетках внутреннего слоя переднего нервного валика, в области, соответствующей презумптивному конечому мозгу, маркируемой экспрессией гена Bf1.

ActivinB экспрессируется постериорно относительно Noggin2 (рис. 9 Г). После нейруляции экспрессия Noggin2 продолжается в зачатке конечного мозга, находящегося на дорсальной и латеральных сторонах передней части закрытой нервной трубки, тогда как ActivinB экспрессируется вне этой зоны, в вентральной части презумптивного промежуточного мозга и в глазных зачатках (рис. 9 Д-Е). Такой взаимоисключающий паттерн экспрессии указывает на возможное ингибиторное влияние Noggin2 на ActivinB.

Чтобы выяснить, насколько важен низкий уровень экспрессии ActivinB в зоне экспрессии Noggin2 (на переднем крае нервной пластинки) для развития зачатка конечного мозга, мы искусственно расширили зону экспрессии ActivinB с помощью трансгенной технологии. Для этого мы использовали двух-кассетный вектор, несущий кДНК ActivinB под контролем промотора гомеобоксного гена Xanf1, и кДНК Kate RFP под контролем промотора сердечного актина (Martynova et al., 2004;

Shcherbo et al., 2007) (рис. 9 Ж). Использование промотора гомеобоксного гена Xanf1 позволило ограничить зону эктопической экспрессии ActivinB передним краем нервной пластинки. Принципиально важно, что поскольку промотор Xanf1 активируется только в конце гаструляции, то эффекты, наблюдаемые в данном эксперименте, обусловлены исключительно экспрессией ActivinB на постгаструляционных стадиях.

Нами наблюдалась редукция головы, включая глаза, во всех эмбрионах, несущих двухкассетный вектор, в то время как эмбрионы, несущие контрольный однокассетный CardAct mKate2 вектор, развивались нормально (n=18) (рис. 9 З-З''). Кроме того, сходные аномалии были выявлены в другой серии экспериментов, при микроинъекции мРНК ActivinB в анимальную пару клеток на стадии 16-32 бластомеров в концентрации 0.1 пг/бл (рис. 9 И). Более высокие концентрации мРНК ActivinB вызывают массированное образование колбовидных клеток в анимальной полусфере, что блокирует нормальное развитие. В то же время, нами наблюдалось частичное восстановление переднемозговых структур при ко-инъекции мРНК Noggin2, но не Noggin1, вместе с мРНК ActivinB (рис.9 К, Л). В целом, данные результаты подтверждают исключительную роль Noggin2 в подавлении ActivinB в клетках презумптивного переднего мозга.

Поскольку Noggin2 способен одновременно ингибировать сразу три различных каскада (Activin/Nodal, BMP и Wnt), важно определить роль каждого из этих процессов ингибирования в нормальном развитии. Для этого нами были выполнены эксперименты по индивидуальному восстановлению ингибирования каждого из трех сигнальных каскадов, в эмбрионах с подавленной функцией Noggin2. Такое подавление функции Noggin2 достигалось инъекцией в эмбрионы анти Noggin2 морфолиновых антисмысловых олигонуклеотидов к мРНК Noggin2 (антиNoggin2 МО).

Соответственно, нами были использованы кДНК следующих ингибиторов данных сигнальных каскадов: Dkk1 (естественный ингибитор Wnt), tBR (доминантно-негативный BMP рецептор I-ого типа), tALK4 (доминантно-негативный активиновый рецептор I-ого типа) (Chang et al., 1997;

Glinka et al., 1998;

Graff et al., 1994;

Kondo et al., 1996).

.

Рис.7. Белки Noggin, транслированные с синтетической мРНК, влияют на физиологические процессы, контролируемые Nodal/Xnr и Wnt. (А-Г) Влияние вентральных микроинъекций мРНК Noggin на экспрессию генов Xbra (А, Б) и goosecoid (В, Г) (отмечено стрелками). (А'-Г') Флуоресценция FLD, выявляющая распределение микроинъецированного материала. (Д) Индукция эктопических головных структур, вызванная вентральной микроинъекцией мРНК Noggin1. (Е, Е') Расширение зачатка конечного мозга, вызванное дорсальной микроинъекцией мРНК Noggin1 и -2, выявляемое гибридизацией in situ с зондом против соответствующего маркера XBF1. (Ж-М) Микроинъекции мРНК Noggin1 и -2 и их -клип мутантов вызывают увеличение глаз (К) и циклопию (З, И, Л, М).

Для обеспечения экспрессии данных ингибиторов только в клетках, в норме экспрессирующих Noggin2, нами были сконструированы плазмидные конструкции, несущие гены этих ингибиторов под контролем фрагмента промотора Noggin2 в 4172 п.н. (рис.10 А). В предварительных экспериментах мы показали, что этот фрагмент достаточен для обеспечения “правильного” паттерна экспрессии, т.к. зона экспрессии GFP под контролем этого фрагмента совпадает с зоной экспрессии эндогенного Noggin2 (рис. 10 Б-В'). Далее, мы микроинъецировали эмбрионы на стадии 8 бластомеров смесью анти-Noggin2 МО и вышеописанных плазмид ( нг/мкл) в различных комбинациях. Эмбрионы развивались до стадии 26, после чего были подвергнуты гибридизации in situ с зондом на маркер конечного мозга – транскрипт гена XBF1.

После окрашивания мы измеряли интегральную интенсивность окраски. При коинъекции анти Noggin2 МО с tALK4- или Dkk1-экспрессирующими плазмидами, в обоих случаях нами наблюдался статистически значимый эффект частичного восстановления фенотипа (P0.001) (рис.10 Г-Е). В тоже время, восстановления фенотипа не наблюдалось в случае ко-инъкции tBR.

экспрессирующей плазмиды. При этом повышение концентрации плазмид в 3 раза не приводило к полному восстановлению фенотипа, или даже уменьшало интенсивнось экспрессии XBF (P0.001). В то же время, при микроинъекции всех трех плазмид (вместе с анти-Noggin2 МО) нами наблюдалось (статистически значимое) практически полное восстановления фенотипа (P0.001) (рис. 10 Г-Ж).

Таким образом, данные результаты свидетельствуют о том, что для нормального развития переднего мозга необходимы все три активности белка Noggin2.

Рис.8. Эффекты, вызываемые нарушением трансляции мРНК Noggin2 с помощью антисмысловых МО. (А, А') Микроинъекции анти- Noggin2 МО вызывают редукцию глаз, назальных плакод и конечного мозга. (В-Е) Микроинъекции анти- Noggin2 МО подавляют экспрессию маркера конечного мозга XBF1 (В, В') и маркера глаз Pax (Д, Д'). (Г, Е) отрицательный контроль. (Ж-И) Восстановление фенотипа с помощью ко-инъекции мРНК Noggin2 и клип Noggin2. Скобками отмечен размер головной области, от железы вылупления до присоски.

.

Обсуждение результатов TGF- лиганды (помимо BMP) и Wnt являются мишенями белков семейства Noggin.

Нами впервые показано, что секретируемые белки Noggin1 и Noggin2 могут связывать, помимо BMP, некоторые другие лиганды суперсемейства TGF-, а также Wnt8, и ингибировать сигнальные каскады, активируемые данными лигандами. Тот факт, что удаление N-концевого клип-домена, необходимого для связывания с BMP (Groppe et al., 2002), не приводит к потере способности белков Noggin связываться с другими лигандами, указывает на другой, нежели в случае с BMP, механизм белок-белковых взаимодействий. Изучение этих механизмов является перспективным направлением дальнейших исследований.

Хотя нам не удалось обнаружить разницу между Noggin1 и Noggin2 по эффективности связывания белков ActivinB и Xnr, нами наблюдалась существенная разница в эффективности подавления данного сигнального каскада: Noggin2 блокировал сигнальную активность белков ActivinB и Xnr значительно эффективнее, чем Noggin1. Это может указывать на неконкурентный характер ингибирования, в отличие от прямой конкуренции между Noggin1 и BMP-рецептором за BMP, описанной (Groppe et al., 2002).

По сравнению с ингибированием BMP, ингибиторный эффект Noggin1 и Noggin2 в отношении других лигандов суперсемейства TGF- и Wnt проявляется слабее, и не выявляется в экспериментах с использованием мРНК Noggin1 дикого типа, имеющей 5’-НТО, которая сильно снижает эффективность трансляции. Эта структурная особенность мРНК Noggin1 дикого типа, позволяющая выявить только анти-BMP активность Noggin1, объясняет тот факт, что остальные активности этого белка не были открыты ранее.

На молекулярном уровне, ингибирование Activin/Nodal и Wnt белками семейства Noggin подтверждается их способностью ингибировать синтетические репортеры SMAD2- и -catenin каскадов. Кроме того, это подверждается способностью белков Noggin подавлять экспрессию эндогенных генетических маркеров, индуцированных ActivinB/Xnr2 и Wnt8.

На функциональном уровне, белки Noggin и их -клип мутанты также удовлетворяют критериям ингибиторов Activin/Nodal и Wnt: способность подавлять Wnt-индуцированные эффекты, способность к комплементации “чистых” ингибиторов BMP при индукции головы, способность ингибировать образование мезодермы и способность индуцировать циклопический фенотип.

Ингибирование Activin-, BMP- и Wnt-каскадов посредством Noggin2 необходимо для развития переднемозговых структур.

Нами впервые показано, что ингибирование трех сигнальных путей, Activin, BMP и Wnt, осуществляемое Noggin2 в клетках переднего края нервной пластинки, необходимо для нормального развития переднего мозга. Важность ингибирования BMP- и Wnt-каскадов в ростральной части нервного зачатка в постгаструляционный период была ранее показана в экспериментах (Kiecker and Niehrs, 2001;

Lagutin et al., 2003;

Onai et al., 2004). В настоящей работе мы показали, что доминантно-негативный рецептор BMP не способен восстанавливать эффекты, вызванные подавлением трансляции мРНК Noggin2 с помощью МО. Это свидетельствует о том,.

что ингибирование только BMP-каскада не достаточно для правильного формирования переднего мозга.

Как известно, функционирование Activin/Nodal-каскада в предгаструляционный период необходимо для индукции мезодермы. Однако при развитии передних структур эмбриона данный сигнальный каскад должен быть ингибирован, вместе с BMP- и Wnt-каскадами, что позволяет развиваться головным структурам, включая конечный мозг и глаза (Niehrs, 1999;

Piccolo et al., 1999). Полученные нами данные демонстрируют, что изоляция клеток презумптивного переднего мозга от действия ActivinB (экспрессирующегося рядом с передним краем нервной пластинки) критически важна и в постгаструляционный период развития. У Xenopus эту функцию выполняет Noggin2.

Поскольку Noggin2 не обнаружен у млекопитающих, возникает вопрос, какой белок может замещать у них физиологическую функцию Noggin2. Можно предположить, что таким белком может быть Noggin1, единственный представитель семейства Noggin у млекопитающих. Однако в экспериментах по генетичекому нокауту гена Noggin1 мыши не было обнаружено аномалий развития переднего мозга (McMahon et al., 1998). Следовательно, функция Noggin2 у млекопитающих, вероятно, осуществляется какими-то другими ингибиторами Activin/Nodal- и Wnt-каскадов. Другим возможным объяснением отсутствие аномалий развития мозга при нокауте Noggin1 могут быть какие-то глубокие изменения механизмов развития переднего мозга в процессе эволюции предшественников млекопитающих, которые позволили им обходиться без ингибирования сигнальных каскадов каскадов Activin/Nodal, BMP и Wnt) в период нейруляции.

Дальнейшие эксперименты по изучению механизмов формирования переднего мозга позволят ответить на эти вопросы.

Выводы 1. Идентифицированы 8 новых гомологов белков семейства Noggin. Клонированы полные последовательности кДНК и проведен структурный и сравнительный анализ аминокислотной последовательности Noggin2 и Noggin4 Xenopus.

2. Изучен пространственно-временной паттерн экспрессии генов Noggin2 и Noggin4 в ходе эмбриогенеза Xenopus.

3. Показано, что белки Noggin1 и Noggin2 способны связывать in vitro, помимо BMP, ряд белков Activin/Nodal- и Wnt- каскадов – ActivinB, Xnr2, Xnr4 и Wnt8. Механизм связывания белков Activin/Nodal- и Wnt- каскадов отличен от механизма связывания BMP.

4. Показано, что белки Noggin1 и Noggin2 способны ингибировать BMP-, Activin/Nodal- и Wnt-каскады in vivo и способны подавлять эффекты, вызванные эктопической экспрессией в эмбрионах ActivinB, Xnr2 и Wnt8.

5. Показано, что необходимым условием нормального развития переднего мозга является продолжительная изоляция его клеток от активности BMP-, Activin- и Wnt-сигнальных каскадов, что эмбриогенезе шпорцевой лягушки осуществляется белком Noggin2.

.

Рис.9. Ингибирование Activin в передней части нервной пластинки необходимо для нормального развития переднего мозга. (Обозначения: tel – проспективный конечный мозг (telencephalon);

н.п. – нервная пластинка). (А) На стадии средней нейрулы Noggin2 экспрессируется в клетках переднего нервного валика. Гибридизация in situ, вид спереди.

(Б) Схема зон гибридизации, приведенных на В-Д. Красной звездочкой отмечена передняя граница нервной пластинки. (В) Экспрессия ActivinB и Noggin2 в половинках эмбрионов на стадии средней нейулы. ActivinB не экспрессируется в зоне экспрессии Noggin2, отмеченной красным пунктиром. (В') Те же эмбрионы, вид спереди. (Г) Экспрессия маркера конечного мозга XBF1 и Noggin2 в клетках переднего нервного валика. (Д) Экспрессия ActivinB и Noggin2 в половинках эмбрионов на стадии хвостовой почки. В отличие от Noggin2, ActivinB не экспрессируется в зачатке конечного мозга. (Д') Те же эмбрионы, срезы на указанном уровне. (Е) Схема экспрессии ActivinB, XBF1 и Noggin2 на стадии средней нейрулы, вид спереди. (Ж) Двухкассетный вектор, использованный для направленной экспрессии ActivinB под контролем промотора Xanf1 в клетках зачатка переднего мозга. (З-З'') В отличие от контрольных трансгенных эмбрионов (верхний ряд), в трансгенных эмбрионах, несущих конструкцию XanfActB CardKate (нижний ряд), наблюдается редукция глаз и конечного мозга, выявляемая по экспрессии XBF1. (И) Редукция глаз у эмбрионов, микроинъецированных мРНК ActivinB (0.5 пг/бл). (К) Восстановление фенотипа таких эмбрионов с помощью ко-инъекции мРНК Noggin2. (Л) Статистический анализ размеров глаз микроинъецированных эмбрионов. Обозначения: tel – проспективный конечный мозг (telencephalon);

н.п. – нервная пластинка.

.

Рис.10. Восстановление фенотипа, вызванного микроинъекциями МО к Noggin2 с помошью специфических ингибиторов сигнальных каскадов. (А) Плазмиды, экспрессирующие EGFP, Dkk1, tBR и tALK4 под контролем промотора Noggin2. (Б) Анализ экспрессии pNog2-EGFP в эмбрионах Xenopus методом ОТ-ПЦР с праймерами на EGFP. Значение приведены в относительных единицах, черточками показано стандартное отклонение. (В, В') Типичный эмбрион на стадии 26, экспрессирующий EGFP в области переднего мозга, вид спереди. (Г-Е') Область экспрессии XBF1 (обозначена желтым пунктиром на Г) в эмбрионах на стадии 26, инъецированных смесью МО к Noggin2 с указанными плазмидами и FLD. Интегральная плотность гибридизационного сигнала была измерена с помощью программы ImageJ. (Ж) Статистический анализ интегральной плотности гибридизационного сигнала по двухвыборочному t-критерию Стьюдента для выборок разного размера с различной дисперсией с пороговым уровнем 0,001.

.

Список публикаций по теме диссертации 1. Ерошкин Ф.М., Байрамов А.В., Мартынова Н.Ю., Зарайский А.Г.. Использование люциферазных репортерных конструкций для изучения способности белка Noggin2 ингибировать сигнальные каскады в эмбрионах шпорцевой лягушки. // Биоорганическая химия, 2012, том 38, № 3, с. 385– 2. Мартынова Н.Ю., Ермолина Л.В., Ерошкин Ф.М., Гиоева Ф.К., Зарайский А.Г..

Транскрипционный фактор Xanf1 взаимодействует с белком зиксином комплекса фокальной адгезии в раннем периоде развития головного мозга шпорцевой лягушки. // Биоорганическая химия, 2008, том 34, №4, с. 573-576.

3. Bayramov A.V., Eroshkin F.M.*, Martynova N.Y., Ermakova G.V., Solovieva E.A., Zaraisky A.G. Novel functions of Noggin proteins: inhibition of Activin/Nodal and Wnt signaling. // Development, 2011 Dec;

138(24):5345-5356.

4. Martynova N.Y., Eroshkin F.M., Ermolina L.V., Ermakova G.V., Korotaeva A.L., Smurova K.M., Gyoeva F.K., Zaraisky A.G. The LIM-domain protein Zyxin binds the homeodomain factor Xanf1/Hesx1 and modulates its activity in the anterior neural plate of Xenopus laevis embryo. // Developmental Dynamics, 2008 Mar;

237(3):736-749.

5. Eroshkin F.M., Ermakova G.V., Bayramov A.V., Zaraisky A.G. Multiple noggins in vertebrate genome: cloning and expression of noggin2 and noggin4 in Xenopus laevis. // Gene Expression Patterns 2006 Jan;

6(2):180-186.

6. Bayramov A.V., Martynova N.Y., Eroshkin F.M., Ermakova G.V., Zaraisky A.G. The homeodomain-containing transcription factor X-nkx-5.1 inhibits expression of the homeobox gene Xanf 1 during the Xenopus laevis forebrain development. // Mechanisms of Development. 2004 Dec;

121(12):1425-1441.

7. Martynova N.Y., Eroshkin F.M.*, Ermakova G.V., Bayramov A.V., Gray J, Grainger R, Zaraisky A.G. Patterning the forebrain: FoxA4a/Pintallavis and Xvent2 determine the posterior limit of Xanf1 expression in the neural plate. // Development. 2004 May;

131(10):2329-2338.

8. Eroshkin F.M., Kazanskaya O.V., Martynova N.Y., Zaraisky A.G. Characterization of cis regulatory elements of the homeobox gene Xanf-1. // Gene. 2002 Feb 20;

285(1-2):279-286.

(* - совмещенное первое авторство).

Тезисы конференций 1. Ерошкин Ф.М., Байрамов А.В., Мартынова Н.Ю., Ермакова Г.В., Соловьева Е.А., Зарайский А.Г. Новые функции белков семейства Noggn: ингибирование сигнальных каскадов TGF- и Wnt. V российский симпозиум "Белки и пептиды", Петрозаводск, Россия, август 2011.

2. Bayramov A.V., Eroshkin F.M., Martynova N.Y., Ermakova G.V, Solovieva E.A., Serebryakova M. and Zaraisky A.G. Noggin2 can modulate activin signaling and is essential for normal forebrain development. 16th International Society of Developmental Biologists Congress Edinburgh, august 2009, Scotland, U.K.

3. Zaraisky A.G, Ermakova G.V, Eroshkin F.M., Martynova N.Y, Novoselov V.V. Investigation of the the regulatory cascade of the homeobox gene Anf. HHMI Annual meeting 2002. Palm Cove, Australia.

Патенты 1. Зарайский А.Г., Байрамов А.В., Ерошкин Ф.М. РФ Патент N 2354662 "Способ блокирования активности Activin с помощью Noggin2", 10 мая 2009 г.

2. Байрамов А.В., Ерошкин Ф.М., Мартынова Н.Ю., Ермакова Г.В., Серебрякова М.В., Соловьева Е.А., Зарайский А.Г. РФ Патент N 2391352 "Способ блокирования сигнального пути, активируемого TGF-beta фактором Vg1 в клетках животных", 10 июня 2010 г.

3. Байрамов А.В., Ерошкин Ф.М., Мартынова Н.Ю., Ермакова Г.В., Серебрякова М.В., Соловьева Е.А., Зарайский А.Г. РФ Патент N 2407799 "Способ блокирования сигнального пути, активируемого TGF-beta фактором Derriere в клетках животных", 27 декабря 2010 г.

4. Байрамов А.В., Ерошкин Ф.М., Мартынова Н.Ю., Ермакова Г.В., Серебрякова М.В., Соловьева Е.А., Зарайский А.Г. Патентная заявка РФ N 2011139524 "Способ блокирования сигнального пути, активируемого TGF-beta фактором Wnt8 в клетках животных с помощью белков семейства Noggin", 2011 г.

.