Разработка технологии формирования биосенсорных тест-систем на основе композиционных материалов
На правах рукописи
Филиппова Анастасия Михайловна Разработка технологии формирования биосенсорных тест-систем на основе композиционных материалов 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Ставрополь – 2013
Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образователь ном учреждении высшего профессионального образования «Северо-Кавказский федеральный университет»
Научный консультант:
кандидат биологических наук, Воробьева Оксана Владимировна
Официальные оппоненты:
Тюменцева Ирина Степановна, доктор медицинских наук, профессор, Феде ральное казнное учреждение здравоохранения «Ставропольский научно исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, заведующая науч но-производственной лабораторией препаратов для диагностики особо опасных и других инфекций Ядерец Вера Владимировна, кандидат биологических наук, Федеральное госу дарственное бюджетное учреждение науки Центр "Биоинженерия" Российской академии наук, научный сотрудник лаборатории биотехнологии стероидов
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской акаде мии наук
Защита диссертации состоится «26» февраля 2013 г. в 14.00 час. на заседа нии диссертационного совета Д 208.109.01 при ФКУЗ Ставропольский проти вочумный институт Роспотребнадзора по адресу: 355035, г. Ставрополь, ул. Со ветская, 13-15.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора.
Автореферат разослан «» января 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Жарникова Ирина Викторовна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. На сегодняшний день одним из перспективных направлений развития биотехнологии является разработка композиционных ма териалов различной структуры. Полученные композиции обладают уникальны ми свойствами, которых не имеют отдельные их составляющие, что значительно расширяет спектр их применения. Преимуществом высокомолекулярных компо зиций перед обычными материалами является возможность варьирования раз личных свойств и характеристик в зависимости от предназначения получаемого материала.
Технологии создания композиционных материалов включают в себя ряд от крытий последних лет в области химии и физики высокомолекулярных систем и структур (Володькин Д.В., 2005;
Тулинов А.Б., Корнеев А.А., Овчаренко Л.В., Гармаш И.И., 2007;
Андрианова Г.П., 2010;
Буниятзаде И.А., Мамедов Г.Г. и др., 2010;
Межиковский С.М., 2010;
Олтаржевская Н.Д., Коровина М.А., 2010).
Использование научных подходов при конструировании композиционных материалов, направленных на изменение их структуры, реакционной способно сти и др., позволяет получить новый материал с заранее заданными свойствами в качестве основы для иммобилизации ферментов.
Иммобилизация открывает новые перспективы применения биокатализато ров, повышая их стабильность при хранении и позволяя использовать фермент многократно.
Работы по созданию биосенсоров на основе иммобилизованных ферментов актуальны и востребованы. Все большее количество ферментов используется при получении уникальных устройств, детектирующих наличие ингибиторов в различных объектах окружающей среды.
В настоящее время проблема загрязнения окружающей среды имеет прио ритетное социальное и экономическое значение. Отходы производства, газооб разные, жидкие и твердые вещества, поступающие в окружающую среду от раз личных источников, вызывают деградацию среды обитания и наносят ущерб здоровью населения, влияя на нервную и сердечно-сосудистую системы, органы кроветворения, репродуктивную сферу (Ушаков И.Б., Володин А.С., Губин В.В.
и др., 2003).
Для повышения урожайности в сельском хозяйстве часто используются разнообразные фосфорорганические и хлорорганические пестициды (дихлор дифенилтрихлорэтан (ДДТ), гексахлоран, хлорофос, метафос, тиофос, карбофос, метилмеркаптофос, дихлофос, диазинон, хлорпирифос), медьсодержащие ядо химикаты (бордосская жидкость, сульфат меди, хлорокись меди), обладающие высокой токсичностью и избирательным действием, значительная часть кото рых попадает в продукты растениеводства и животноводства.
Одним из наиболее часто используемых пестицидов в агропромышленности является карбофос – высокотоксичный фосфорорганический инсектицид, хоро шо проникающий через кожу, способный угнетать действие фермента ацетилхо линэстеразы.
В результате прямого окисления сульфидов меди кислородом воздуха или сульфатредуцирующими бактериями происходит загрязнение природных гидро систем токсичными ионами меди. Миграция меди в природных поверхностных и грунтовых водах связана с высокой подвижностью ее иона в сульфатных сре дах (Патент RU № 2182131).
Существующие физико-химические методы контроля достаточно трудоем ки и малопригодны для проведения анализа вне лаборатории (Стойкова Е.Е, 1997;
Евтюгин Г.А., 1999).
Ферментативные методы анализа являются перспективным направлением в диагностике окружающей среды при проведении эколого-аналитического мони торинга. Высокая селективность и чувствительность к ингибиторам ферментов – загрязнителям окружающей среды - является основанием для создания на их ос нове биосенсорных тест-систем с такими параметрами, как простота и удобство в применении, высокая чувствительность и надежность (Ильичева Н.Ю., 2002).
Цель диссертационной работы: разработка биотехнологии получения вы сокомолекулярных композиционных полимерных материалов, обладающих ферментативным действием, и биосенсорных тест-систем на их основе.
Основные задачи исследования:
1. Синтезировать композиционные материалы на основе высокомолекуляр ного природного полисахарида, белкового комплекса и пластификатора.
2. Исследовать физико-химические свойства полученного биополимерного материала (спектры поглощения в УФ - области, предел прочности, статический коэффициент, относительное удлинение при разрыве).
3. Разработать метод иммобилизации фермента ацетилхолинэстеразы и ис следовать влияние различных факторов на его активность (рН среды, температу ра). Изучить динамику потери удельной активности в различных температурных условиях в процессе хранения.
4. Иммобилизовать фермент панкреатин в композиционные материалы и исследовать влияние некоторых факторов на его удельную активность (рН сре ды, температура). Изучить влияние времени постановки реакции, динамику по тери удельной активности фермента панкреатина при хранении в течение дли тельных интервалов времени в различных температурных условиях.
5. Сконструировать биосенсорные тест-системы на основе высокомолеку лярных композиционных материалов с иммобилизованными ферментами аце тилхолинэстерой и панкреатином.
6. Провести апробацию биосенсорных тест-систем на содержание токсикан тов в модельных системах.
Научная новизна работы. Получены новые композиционные материалы, способные к разложению в естественных условиях и обладающие следующими преимуществами: прозрачность, пластичность, механическая прочность струк туры при разрывном напряжении.
Впервые проведена иммобилизация ферментных препаратов ацетилхо линэстеразы и панкреатина в структуру высокомолекулярных композиционных материалов с высоким процентом сохранения их удельной активности.
Проведены исследования факторов, влияющих на чувствительность, селек тивность и снижение удельной активности ферментов при их иммобилизации в структуру композиционных материалов.
Впервые разработаны биосенсорные тест-системы на основе композицион ных материалов с иммобилизованными ферментами ацетилхолинэстеразой, пан креатином, которые могут быть использованы для контроля остаточных коли честв карбофоса и ионов меди (II) в объектах окружающей среды.
Теоретическая и практическая значимость работы. Разработаны техно логические приемы получения высокомолекулярных композиционных материа лов, обладающих ферментативным действием.
Получены высокомолекулярные композиционные материалы с иммобили зованными в их структуру ферментами, способные выступать в качестве биосен сорных тест-систем для определения ионов меди (II) и карбофоса в анализируе мых образцах.
Разработан метод определения активности фермента панкреатина по прото типу определения амилазной активности. Упрощена методика определения ак тивности фермента ацетилхолинэстеразы относительно ранее известной.
Разработаны методические подходы к использованию полученных биосен сорных тест-систем.
Материалы диссертации используются в лекциях и на практических заня тиях курсов «Высокомолекулярные соединения» (лекция «Композиционные биополимерные материалы как основа для иммобилизации ферментов»), «Вве дение в нанотехнологии» (лекция «Структура и свойства наноматериалов») ФГАОУ ВПО «Северо-Кавказский федеральный университет». Имеются акты испытаний: «Акт испытаний биосенсорной тест-системы на основе панкреати на» (от 10 октября 2012 г.), составленный в лаборатории биогеохимии и эколо гической экспертизы Института естественных наук ФГАОУ ВПО «Северо Кавказский федеральный университет»;
«Акт испытаний биосенсорной тест системы на основе ацетилхолинэстеразы» (от 18 сентября 2012 г.), составлен ный в лаборатории защиты растений ГНУ Ставропольский НИИСХ Россельхоз академии. На разработанные биосенсорные тест-системы составлены стандарты организации: «Тест-система биосенсорная для обнаружения остаточных коли честв карбофоса в объектах внешней среды» (СТО 02067965-003-2012 от 15 ок тября 2012 г.);
«Тест-система биосенсорная для обнаружения остаточных коли честв меди в объектах внешней среды» (СТО 02067965-002-2012 от 15 октября 2012 г.).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Методические подходы к конструированию композиционных полимер ных материалов нелинейной архитектуры на основе природного полисахарида метилцеллюлозы, пластификатора - глицерина и белкового комплекса - желати на, их физико-химические свойства.
2. Определены физико-химические параметры иммобилизации ферментов ацетилхолинэстеразы и панкреатина в структуру композиционной матрицы, обеспечивающие сохранение их высокой удельной активности.
3. Сконструированные биосенсорные тест-системы на основе композицион ных материалов с иммобилизованными ферментами для обнаружения инсекти цида карбофоса, детектирования ионов меди (II) в объектах окружающей среды и методические подходы к их использованию отличаются экспрессностью, спе цифичностью, не требуют дорогостоящего оборудования.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на: Московской международной конференции «Мир биотехноло гии» (Москва, 2010), 55 научно-практической конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2010), I Международной научной конференции «Наука в современном обществе» (Ставрополь, 2011), IV Международной кон ференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ро стов-на-Дону, 2011), 56 научно-практической конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2011), 57 научно-практической конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2012).
Личный вклад автора. Диссертационная работа выполнена самостоятель но. Отдельные этапы работы были выполнены совместно с кандидатом биологи ческих наук Воробьевой О.В. (ФГАОУ ВПО «Северо-Кавказский федеральный университет»).
Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 15 опублико ванных работах (в ведущих научных журналах, рекомендуемых ВАК - 6 статей).
Структура и объм работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка использованной литературы и приложения. Работа изложена на 139 страницах, содержит 19 таблиц и 42 рисунка. Список литерату ры включает 126 отечественных и зарубежных литературных источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и сформулирована цель проведения исследований.
Материалы и методы исследований Были использованы композиции, содержащие в качестве основы возобнов ляемый природный полисахарид - метилцеллюлозу (МЦ). В качестве реагента пластификатора, для придания пластичности материалу, использовали глицерин.
Для получения прочного композиционного материала в его структуру вводили природный белковый комплекс - желатин.
Прочность композиционных материалов определяли при деформации путем растяжения (ГОСТ 17035-86). Для испытания использовали разрывные и уни версальные испытательные машины с электромеханическим приводом (ГОСТ 7855-84).
Относительное удлинение при разрыве определяли на разрывной машине (ГОСТ 14236-81). За результат испытаний принимали среднее арифметическое результатов пяти определений отдельно в продольном и поперечном направле ниях.
За статический коэффициент трения принимали значение тангенса угла наклона плоскости, при котором начиналось скольжение двух поверхностей ис пытуемой пленки (ГОСТ 10354-82).
Номинальную толщину композиции определяли по ГОСТ 17035-86. Для измерений применяли устройства и приборы по ГОСТ 10593-74, ГОСТ 6933-81, ГОСТ 11007-66, ГОСТ 11098-75.
Каталитическую активность фермента ацетилхолинэстеразы оценивали по количеству уксусной кислоты в продуктах расщепления ацетилхолин хлорида.
Оптическую плотность замеряли на ФЭК-КФК-2 в пробе против контроля в кю вете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 540 нм (Филиппович Ю.Б., Егоро ва Т.А., Севастьянова Г.А., 1982).
Количественное определение удельной активности панкреатина проводили по методу определения амилазной активности фермента, в качестве субстрата использовали крахмал.
Биосенсорные тест-системы с иммобилизованными ферментами ацетилхо линэстеразой и панкреатином были апробированы на модельных системах.
Математическую обработку результатов экспериментов осуществляли на компьютере (программы Microsoft Excel, Statistica 6.0). Для подтверждения до стоверности результатов, полученных при исследовании, применяли статисти ческие методы (Тамбовцев Е.П., Ахметкалиев С.Г., 1969;
Скутч Д., Уэст Д., 1979).
Результаты собственных исследований и их обсуждение Формирование структуры основы высокомолекулярных композиций для иммобилизации ферментов В основу синтеза материалов, обладающих деструктивной способностью, положен принцип разрушения межмолекулярных и внутримолекулярных связей в естественных условиях среды (Воробьева О.В., Иванова А.М., Аванесян С.С. и др., 2011).
Получали 3-5% раствор метилцеллюлозы. Для этого метилцеллюлозу вно сили в воду температурой 5060. Смесь выдерживали 1,52 часа. В получен ный коллоидный гель метилцеллюлозы вводили белок животного происхожде ния – желатин в концентрации от 3 до 8% от общей массы составляющих ком позиции. В качестве пластификатора, придающего изделию гибкость, использо вали глицерин в концентрации от 0,5 до 1% от общей массы составляющих ком позиции. Полученную композицию наносили на гладкую стеклянную поверх ность желаемой формы толщиной от 1 до 3 мм и оставляли на воздухе при тем пературе 2022 на 2-3 суток до полного высыхания (Патент № 2395540). Для анализов использовали по пять экспериментальных серий каждого препарата.
Для получения данных сравнительного анализа спектров поглощения в УФ - области разработанных композиционных материалов и традиционных матери алов проводили измерения оптической плотности на спектрофотометре СФ- (рисунок 1).
Результаты свидетельствуют о повышении барьера поглощения, что может быть связано с повышением плотности упаковки в аморфных областях МЦ за счет модификации структуры молекулами глицерина и желатина (Воробьева О.В., Андрусенко С.Ф., Волосова Е.В. и др., 2011).
4, D - оптическая плотность 3, 3, 2, 2, 1, 1, 0, 0, 185 205 225 245 265 285 305 325 345 365 - длина волны Полиэтилен Целлофан Синтезируемая пленка Рисунок 1 - Сравнение спектров поглощения полученных композиционных материалов, целлофана и полиэтилена Композиции исследованы на прочность по длине и ширине, относительное удлинение при разрыве по длине и ширине, определен статический коэффици ент трения. Полученные данные сравнили с показателями полиэтилена марки Н (таблица 1).
Таблица 1 – Сравнительные механические характеристики полиэтилено вой пленки (марки Н) и разработанного образца Образцы материалов Разработанный образец Состав композиции:
Полиэтилен Наименование показателя МЦ (53,8 масс. %);
желатин марки Н (33,3 масс. %);
глицерин (10, (ГОСТ 10354-82) масс. %);
вода (2,6 масс. %) Номинальная толщина 0,040 0, материала, мм по ширине Прочность при 13,70 15, растяжении, МПа по длине 14,70 15, (кгс/см2), не менее по ширине Относительное 350 удлинение при раз по длине 300 рыве, %, не менее:
Статический коэффициент 0,1-0,5 0,1-0, трения A0, мм2 0,60 0, l0, мм 15 ts=4,3;
Р=0, Из таблицы 1 видно, что разработанные композиционные материалы по ме ханическим свойствам не уступают пленкам из полиэтилена.
Иммобилизация фермента ацетилхолинэстеразы Способность карбофоса ингибировать действие фермента ацетилхолинэсте разы можно использовать для конструирования биосенсорной тест-системы по обнаружению остаточных количеств инсектицидов в объектах окружающей среды. Фосфатный участок инсектицида карбофоса, имитируя сложную группу ацетилхолина, выступающего в качестве субстрата для фермента ацетилхо линэстеразы, блокирует активный центр фермента. Положительно заряженный атом фосфора притягивается к свободной гидроксильной группе серина, а один из спиртовых остатков притягивается к карбоксилат-аниону.
Для иммобилизации ацетилхолинэстеразы (КФ 3.1.1.7) в структуру компо зиционного материала использовали водный раствор фермента в объеме 0,1 мл с концентрацией 0,15%. Для анализа активности растворимого и иммобилизован ного фермента была модифицирована методика с использованием в качестве субстрата ацетилхолин хлорида.
К 0,1 мл раствора фермента ацетилхолинэстеразы (15 мг в 10 мл дистилли рованной воды) добавляли 2 мл буферного раствора (рН 8,4) и термостатирова ли 30 минут при 37. Параллельно термостатировали 2% водный раствор аце тилхолин хлорида. К анализируемому раствору ацетилхолинэстеразы добавляли 0,5 мл 2% водного раствора ацетилхолин хлорида, смесь перемешивали и инку бировали в течение 30 минут при 37. Ферментативную реакцию останавлива ли, добавляя по 0,2 мл 1% водного раствора карбофоса. В качестве контрольной пробы использовали смесь, в состав которой ингибитор вносили перед термо статированием. По окончании реакции в каждую пробу вносили по 2,1 мл ди стиллированной воды и по 0,3 мл индикатора фенолового красного (0,02% вод ный раствор). Выделившееся количество уксусной кислоты оценивали по мали новой окраске на ФЭК–КФК-2 при длине волны 540 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Количество выделившейся кислоты определяли по разности экс тинкции контрольной и опытной проб.
С целью оптимизации количества фермента ацетилхолинэстеразы в составе биосенсорной тест-системы использованы растворимый и иммобилизованный ферменты в количествах 0,01;
0,05;
0,10;
0,15;
0,20;
0,25 и 0,30 мг. Количество фермента 0,2 мг соответствует оптимуму разности удельной активности ацетил холинэстеразы реакций без ингибирования и с ингибированием при определе нии карбофоса (рисунки 2, 3).
50 Удельная активность, ммоль УК/г фермента Удельная активность, ммоль УК/г фермента 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0, Количество фермента, мг Количество фермента, мг Введение инсектицида в конце Введение инсектицида в конце Введение инсектицида в начале Введение инсектицида в начале Рисунок 2 – Влияние количества фер- Рисунок 3 – Влияние количества фер мента на удельную активность раство- мента на удельную активность иммо римого фермента ацетилхолинэстеразы билизованного фермента ацетилхо линэстеразы Оптимизация количества субстрата предполагала определение карбофоса, используя различные количества ацетилхолин хлорида: 0,027;
0,055;
0,082;
0, и 0,220 ммоль. Оптимальное количество субстрата ацетилхолин хлорида на 0, мг растворимого и иммобилизованного ферментов ацетилхолинэстеразы - 0, ммоль (рисунки 4, 5).
50 Удельная активность, Удельная активность, ммоль УК/г фермента ммоль УК/г фермента 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0, 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0, Количество субстрата, ммоль Количество субстрата, ммоль Введение инсектицида в конце Введение инсектицида в конце Введение инсектицида в начале Введение инсектицида в начале Рисунок 4 - Влияние количества суб- Рисунок 5 - Влияние количества суб страта на удельную активность рас- страта на удельную активность иммо творимого фермента ацетилхолинэсте- билизованного фермента ацетилхо разы линэстеразы С целью изучения влияния рН среды на удельную активность растворимого и иммобилизованного ферментов ацетилхолинэстеразы проводили постановку ферментативной реакции в буферном растворе с различным значением рН: 5,0;
7,5;
8,4;
10,0;
11,0;
12,0. Определено, что для растворимого и иммобилизованно го ферментов ацетилхолинэстеразы рабочий диапазон рН от 7 до 9, оптимум при рН = 8,4.
Для изучения влияния температуры на удельную активность фермента про водили постановку ферментативных реакций при температурах 25, 37, 45, 55 и 60. При введении инсектицида с увеличением температуры удельная активность растворимого и иммобилизованного фермента увеличивается, что можно объяснить изменениями в структуре карбофоса – вследствие чего его способность как ингибитора снижается. Оптимум температуры, при которой разность удельной активности растворимого и иммобилизованного фермента ацетилхолинэстеразы в контрольной и опытной пробах максимальна, соответ ствует 37.
Для выбора оптимальных условий проведения ферментативной реакции ис следованы влияние времени ингибирования и времени постановки фермента тивной реакции. Оптимумы времени ингибирования и времени ферментативной реакции совпадают и равны 30 минутам, как для растворимого, так и для иммо билизованного фермента ацетилхолинэстеразы.
Проведены исследования по сохранению удельной активности иммобили зованного фермента и фермента, находящегося в растворе во времени.
К третьему месяцу хранения иммобилизованный фермент ацетилхолинэсте раза сохраняет 75% удельной активности, а фермент ацетилхолинэстераза, нахо дящийся в растворе, сохраняет 8,4% удельной активности. Полученные данные по сохранению активности фермента-анализатора, иммобилизованного в компо зиционные материалы, делают возможным создание на его основе биосенсорной тест-системы.
Разработана тест-система для обнаружения остаточных количеств инсекти цида карбофоса в объектах окружающей среды, представляющая собой компо зиционный материал (m = 37 мг), включенный в него фермент ацетилхолинэсте раза (m = 0,2 мг) и индикатор феноловый красный (m = 0,02 мг).
Для разработки способа обнаружения инсектицида была составлена мо дельная система, которая представляла собой почву с внесенными количествами карбофоса: 0,7610-3 ммоль;
3,810-3 ммоль;
8,510-3 ммоль;
1510-3 ммоль;
3010-3 ммоль;
4510-3 ммоль.
Анализ проводили в следующей последовательности. Образцы почвы мас сой 5 г, предварительно обработанные раствором карбофоса, помещали в кони ческую колбу V = 250 мл и заливали 20 мл дистиллированной воды. Колбу с суспензией встряхивали в течение 60 минут на аппарате для встряхивания с ча стотой 50 Гц. После декантации отбирали аликвоту (V = 2,6 мл) для анализа. В исследуемую аликвоту помещали тест-систему, содержащую фермент в количе стве 0,2 мг и индикатор в количестве 0,02 мг (масса композиции 37 мг). Далее смесь термостатировали 30 минут при 37. После термостатирования прибав ляли 2% раствор субстрата в объеме 0,5 мл, 2 мл буферного раствора (рН = 8,4), смесь термостатировали 30 минут при 37. По истечении времени фиксировали изменение окраски исследуемого раствора визуально в соответствии со шкалой и на ФЭК-КФК-2 (рисунки 6,7).
Удельная активность, ммоль УК/г фермента Удельная активность, 45 ммоль УК/г фермента 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Количество инсектицида, Количество инсектицида, ммоль10-3 ммоль10- Введение инсектицида в конце Введение инсектицида в конце Введение инсектицида в начале Введение инсектицида в начале Рисунок 6 – Влияние количества кар- Рисунок 7 – Влияние количества кар бофоса на растворимый фермент аце- бофоса на иммобилизованный фермент тилхолинэстераза ацетилхолинэстераза Количество карбофоса, равное 0,7610-3 ммоль, снижает удельную актив ность растворимого и иммобилизованного фермента ацетилхолинэстеразы на 21,4% и 20,8% соответственно. Дальнейшее увеличение количества инсектицида с 0,7610-3 до 4510-3 ммоль полностью угнетает действие фермента. Таким об разом, чувствительность определения концентрации инсектицида карбофоса лежит в диапазоне от 0,7610-3 до 45,010-3 ммоль для разработанной тест системы следующего состава: композиционный материал (m = 37 мг), содержа щий фермент ацетилхолинэстеразу (m = 0,2 мг) и индикатор феноловый крас ный (m = 0,02 мг) в исследуемой пробе V = 2,6 мл.
Иммобилизация фермента панкреатина Разработка биосенсорной тест-системы для определения ионов меди пред полагает использование в качестве одного из компонентов тест-системы фер мента, активность которого зависит от действия ионов меди на активный центр.
Установлено, что за ферментативную амилазную активность панкреатина ответ ственны свободные аминогруппы, поэтому при действии ионов меди, вероятнее всего, образуется комплекс аминогруппы с ионами меди, который блокирует фермент.
Для иммобилизации фермента панкреатина (это пищеварительное фермент ное средство, представляющее собой экстракт содержимого поджелудочной же лезы) в структуру композиционного материала разработана методика, согласно которой фермент в структуру композиций вводили в виде его раствора объемом 1 мл (15 мг порошкового панкреатина в 50 мл дистиллированной воды).
Исследования по оптимизации количества фермента и субстрата в биосен сорной тест-системе показало, что массовое соотношение компонентов в систе ме субстрат-фермент при постановке ферментативной реакции следующее: 1 мг крахмала на 0,003 мг фермента. Анализ влияния времени ингибирования и вре мени ферментативной реакции свидетельствует о том, что оптимум времени ин гибирования для растворимого и иммобилизованного ферментов панкреатина совпадает и равен 30 минутам, при этом наблюдается максимум разности удель ной активности опытной и контрольной проб.
Для исследования длительности сохранения каталитической активности ферментного препарата, заключенного в композиции, образцы тест-систем хра нили в течение 4 месяцев при температурах +4 и +20. При этом остаточную активность измеряли один раз в месяц. Из полученных данных можно сделать вывод: композиции, хранившиеся при температуре +4, к четвертому месяцу имели стабильный процент сохранения биокаталитической активности, а компо зиции, хранившиеся при температуре +20, потеряли 78% своей удельной ак тивности. При включении протеолитических ферментов в композиционные по крытия можно добиться стабилизации их против автолиза за счет изменения микроокружения.
Было изучено влияние рН среды и температуры на удельную активность растворимого и иммобилизованного ферментов панкреатина. Полученные дан ные указывают на то, что оптимумы рН среды и температуры проведения фер ментативной реакции совпадают как для растворимого, так и для иммобилизо ванного ферментов панкреатина и соответственно равны 6,9 и 37 (рисунки 8, 9, 10, 11).
Рисунок 8 - Динамика изменения удель- Рисунок 9 – Динамика изменения удель ной активности растворимого фермента ной активности растворимого фермента панкреатина от температуры и рН при панкреатина от температуры и рН при введении ионов меди в конце анализа введении ионов меди в начале анализа (контроль) (опыт) Рисунок 10 – Динамика изменения Рисунок 11 – Динамика изменения удельной активности иммобилизованного удельной активности иммобилизованного в композиционные материалы фермента в композиционные материалы фермента панкреатина от температуры и рН при панкреатина от температуры и рН при введении ионов меди в конце анализа введении ионов меди в начале анализа (контроль) (опыт) Разработана биосенсорная тест-система для обнаружения ионов меди в объ ектах окружающей среды, представляющая собой композиционный материал (m = 33 мг), включающий фермент (m = 0,003 мг).
Для разработки способа обнаружения меди была составлена модельная си стема, которая представляла собой образцы дистиллированной воды, содержа щие ионы меди в следующих количествах: 0,25 мкг;
2,5 мкг;
25 мкг;
125 мкг;
250 мкг и 375 мкг. Для анализа использовали шесть экспериментальных серий препарата иммобилизованного фермента панкреатина.
Анализ проводили в следующей последовательности. В анализируемую пробу (V = 2,75 мл) помещали композиционный материал с иммобилизованным ферментом (m = 0,003мг) и термостатировали 30 минут при 37. Затем прибав ляли буферный раствор (рН = 6,9;
V = 1,6 мл) и раствор субстрата (V = 1 мл 0,1% раствора крахмала) и инкубировали в течение 5 минут. По истечении вре мени реакцию останавливали подкисленным раствором индикатора йода (рас твор, приготовленный разведением в 50 раз 0,2N раствором соляной кислоты основного раствора, состав которого: 2 г йода, 0,66 г йодида калия в 20 мл во ды). Содержание меди определяли качественно по окраске раствора и количе ственно на ФЭК-КФК-2 при = 430 нм (рисунки 12, 13).
1,8 2,0 25 125 250 ( мг крахмала/г фермента) 125 250 ( мг крахмала/г фермента) 2, 1,80,25 1, Удельная активность, 0, Удельная активность, 1,6 1, 2, 1,4 0,25 1,2 0, 1, 1, 1, 0, 0, 0, 0,6 2, 0,4 2, 0,4 0,2 125 250 375 0,2 125 250 0,0 0, 0 50 100 150 200 250 300 350 400 0 50 100 150 200 250 300 350 Количество меди, мкг Количество меди, мкг Введение меди в начале Введение меди в начале Введение меди в конце Введение меди в конце Рисунок 12 – Влияние количества Рисунок 13 – Влияние количества ионов меди (II) на растворимый фер- ионов меди (II) на иммобилизованный мент панкреатин фермент панкреатин Из полученных данных видно, что 125 мг меди полностью ингибируют 3 мкг фермента панкреатина. Сравнительный анализ метода обнаружения ионов меди (II) с использованием биосенсорной тест-системы на основе фермента панкреати на и существующих методов по ГОСТ 4388-72 показал специфичность и высокую чувствительность разработанной биосенсорной тест-системы. Определению ионов меди не мешают ионы висмута, железа и свинца. Постановка анализа тре бует небольшого объема исследуемой пробы (V = 2,75 мл). Анализ позволяет проводить детекцию ионов меди на уровне предельно допустимой концентрации (ПДК) меди в объектах внешней среды.
Таким образом, возможно получение экспрессных биосенсорных тест-систем на основе высокомолекулярных композиционных материалов с включенными ферментными препаратами, обладающими специфичностью и чувствительно стью, которые не требуют дорогостоящего оборудования и специально подготов ленного персонала для проведения анализа.
ВЫВОДЫ 1. Синтезированы композиционные материалы нелинейной архитектуры на основе высокомолекулярного природного полисахарида - метилцеллюлозы, пла стификатора – глицерина и белкового комплекса - желатина. Прочность разрабо танных композиционных материалов на разрыв по длине и ширине, статический коэффициент трения соответствуют данным полиэтилена марки Н при одинако вых условиях и составляют 15,26 и 15,20 МПа и 0,1 - 0,5 соответственно.
2. Разработан метод и оптимизированы параметры иммобилизации фермен та ацетилхолинэстеразы в структуру высокомолекулярных композиционных ма териалов, обеспечивающие сохранение высокой удельной активности фермента:
количество ацетилхолинэстеразы – 0,2 мг;
количество субстрата ацетилхолин хлорида – 0,055 ммоль;
рН буферного раствора - 8,4;
температура - 37;
время ингибирования – 30 минут;
время постановки ферментативной реакции - 30 ми нут.
3. Проведена иммобилизация фермента панкреатина в композиционные ма териалы и определены оптимальные параметры синтеза: рН среды - 6,9;
темпе ратура - 37;
количество фермента – 0,003 мг;
время ингибирования – 30 минут;
время постановки ферментативной реакции - 5 минут.
4. На основе полученных высокомолекулярных биоразлагаемых компози ций разработаны биосенсорные тест-системы и определены диапазоны концен траций остаточных количеств ингибитора фермента ацетилхолинэстеразы – ин сектицида карбофоса (от 0,7610-3 до 4510-3 ммоль) и блокатора активного цен тра фермента панкреатина – ионов меди (II) (от 0,02 до 1,45 мг/л), детектируемых с помощью сконструированных тест-систем.
5. Биосенсорные тест-системы, обладающие высокой специфичностью, чув ствительностью, не требующие дорогостоящего оборудования и специально подготовленного персонала для проведения анализа, могут быть использованы для энзиматического определения фосфорорганического инсектицида карбофоса и ионов меди (II) в объектах окружающей среды.
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации 1. Андрусенко С.Ф., Воробьева О.В., Филь А.А., Волосова Е.В., Аванесян С.С., Иванова А.М., Каданова А.А. Пленка для «авоськи» // Экология и жизнь. 2009. - № 10. - С. 30-32 (из перечня ВАК ведущих рецензируемых научных журналов и изданий).
2. Воробьева О.В., Иванова А.М., Аванесян С.С., Волосова Е.В., Андрусен ко C.Ф., Каданова А.А. Получение ферментативных пленочных материалов на основе природных полисахаридов // Известия высших учебных заведений. Хи мия и химическая технология. Иваново. - 2011. - Т. 54, Вып. I. - С. 53-56 (из пе речня ВАК ведущих рецензируемых научных журналов и изданий).
3. Воробьева О.В., Андрусенко С.Ф., Волосова Е.В., Аванесян С.С., Иванова А.М., Каданова А.А. Модификация природных полимеров для синтеза материа лов, подвергающихся биодеградации // Химия в интересах устойчивого разви тия. - 2011. - № 19. - С. 137-140 (из перечня ВАК ведущих рецензируемых научных журналов и изданий).
4. Филиппова А.М., Аванесян С.С., Воробьева О.В. Тест-системы на основе иммобилизованных ферментов для определения пестицида паратион-метила и ионов меди // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А.
Овчинникова. - 2011. - Т. 7., № 4. - С. 7-12 (из перечня ВАК ведущих рецен зируемых научных журналов и изданий).
5. Воробьева О.В., Филиппова А.М., Аванесян С.С. Иммобилизация фер мента панкреатина в композиционные материалы и создание на их основе тест систем для обнаружения остаточных количеств меди // Современные проблемы науки и образования. – 2012. – № 6;
URL: www.science-education.ru/106-7946 да та обращения: 29.12.2012 (из перечня ВАК ведущих рецензируемых науч ных журналов и изданий).
6. Филиппова А.М., Воробьева О.В., Аванесян С.С. Биосенсорная тест система на основе иммобилизованного фермента ацетилхолинэстеразы для определения карбофоса // Современные проблемы науки и образования. – 2012.
– № 6;
URL: www.science-education.ru/106-8023 дата обращения: 29.12.2012 (из перечня ВАК ведущих рецензируемых научных журналов и изданий).
7. Филь А.А., Волосова Е.В., Воробьева О.В., Аванесян С.С., Ростова М.С., Иванова А.М. Иммобилизация - гиалуронидазы методом включения в био разлагаемые полимерные пленки // Материалы V съезда Общества био технологов России им. Ю.А. Овчинникова: Москва 2-4 декабря 2008 г. / Под ред. Р.Г. Васильева. - М.: ИАЦ, 2008. - С. 187-188.
8. Волосова Е.В., Иванова А.М., Воробьева О.В., Филь А.А., Аванесян С.С.
Гиалуронидазные биоразлагаемые полимерные материалы // Материалы V еже годной научной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр южного научного центра РАН: 8-27 апреля 2009 г. - Ростов-на-Дону: ЮНЦ РАН, 2009. С. 11-12.
9. Иванова А.М., Воробьева О.В., Аванесян С.С. Получение пленочных ма териалов с иммобилизованным ферментом -гиалуронидаза // Материалы IV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Науч ный потенциал студенчества в XXI веке» Том первый. Естественные и техниче ские науки. - Ставрополь: СевКавГТУ, 2010. – С. 457-460.
10. Иванова А.М., Аванесян С.С., Волосова Е.В. Биосенсоры для обнаруже ния фосфорорганических пестицидов // Биоразнообразие, биоресурсы, новые материалы и здоровье населения региона: Материалы 55 научно-методической конференции «Университетская наука - региону» (6-30 апреля 2010 года). Ставрополь: СГУ, 2010. - С. 101-102.
11. Иванова А.М., Аванесян С.С., Воробьева О.В., Филь А.А. Тест-системы для обнаружения метафоса // Биоразнообразие, биоресурсы, новые материалы и здоровье населения региона: Материалы 56 научно-методической конференции “Университетская наука - региону” (7-30 апреля 2011 года). – Ставрополь: Изд во СГУ, 2011. – С. 168–171.
12. Иванова А.М., Аванесян С.С., Воробьева О.В. Разработка тест-системы для обнаружения ионов Сu2+ в объектах окружающей среды // Материалы IV Международной научно-практической конференции - Ростов-на-Дону, 22- сентября 2011 г. Ростов н/Д: Изд-во СКНЦ ВШ ЮФУ, 2011. – С. 213.
13. Иванова А.М., Аванесян С.С., Воробьева О.В. Разработка тест-системы на основе иммобилизованного фермента для обнаружения ионов Cu2+ в объектах окружающей среды // Наука в современном обществе: материалы I Междуна родной научной конференции. – Ставрополь: Центр научного знания «Логос», 2011. – С. 3-5.
14. Филиппова А.М., Аванесян С.С., Воробьева О.В. Иммобилизация пан креатина в пленочные материалы // Биоразнообразие, биоресурсы, новые мате риалы и здоровье населения региона: Материалы 57 научно-методической кон ференции “Университетская наука - региону” (2-30 апреля 2012 года). – Ставро поль: Изд-во СГУ, 2012 – С. 125-128.
15. Филиппова А.М., Воробьева О.В., Аванесян С.С. Разработка тест системы на основе иммобилизованного фермента холинэстеразы // Физико химическая биология. Материалы международной научной интернет конференции – Ставрополь: СтГМА, 2012 – С. 29-32.
Выражаю искреннюю благодарность инженеру кафедры медицинской био химии, клинической лабораторной диагностики и фармации ФГАОУ ВПО «Се веро-Кавказский федеральный университет» Аванесян Светлане Суреновне за помощь, оказанную при постановке и проведении научных исследований.
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ И ЕДИНИЦ УФ - ультрафиолетовая область ОП - оптическая плотность ФГАОУ ВПО «Севе- - федеральное государственное автономное образова ро-Кавказский феде- тельное учреждение высшего профессионального об ральный универси- разования «Северо-Кавказский федеральный универ тет» ситет» МЦ - метилцеллюлоза МПа - мега паскаль ДДТ - дихлордифенилтрихлорэтан УК/г фермента - количество уксусной кислоты на 1г фермента ПДК - предельно допустимая концентрация ФЭК-КФК-2 - фотоэлектроколориметр КФК-