Структура неравновесия по сцеплению гена mthfr в популяциях северной евразии и у больных коронарным атеросклерозом
На правах рукописи
ТРИФОНОВА Екатерина Александровна СТРУКТУРА НЕРАВНОВЕСИЯ ПО СЦЕПЛЕНИЮ ГЕНА MTHFR В ПОПУЛЯЦИЯХ СЕВЕРНОЙ ЕВРАЗИИ И У БОЛЬНЫХ КОРОНАРНЫМ АТЕРОСКЛЕРОЗОМ 03.00.15 - генетика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Томск – 2009 2
Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно исследовательском институте медицинской генетики Сибирского отделения РАМН, г. Томск доктор биологических наук Научные руководители:
Степанов Вадим Анатольевич академик РАМН, профессор, доктор медицинских наук Пузырев Валерий Павлович академик РАМН, профессор,
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук Коненков Владимир Иосифович кандидат медицинских наук Рудко Алексей Анатольевич
Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение Высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Защита состоится «_» декабря 2009 года в час. на заседании диссертационного совета ДМ 001.045.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ медицинской генетики Сибирского отделения РАМН по адресу: 634050, г. Томск, ул. Набережная р. Ушайки, д. 10.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ медицинской генетики Сибирского отделения РАМН (634050, г. Томск, ул. Набережная р. Ушайки, д. 10).
Автореферат разослан «_» _ 2009 года
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Кучер А.Н.
ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования. Генетическая вариабельность составляет основу фенотипической изменчивости человека и имеет огромное значение для объяснения индивидуальных различий в подверженности к мультифакториальным заболеваниям (МФЗ) и определения метаболических путей, вовлеченных в прогрессирование патологического процесса. Наиболее распространенным типом вариабельности генома являются однонуклеотидные замены (SNPs). Усилиями международного консорциума по SNP к настоящему моменту в геноме человека выявлено около 10 миллионов SNPs с плотностью приблизительно 1 полиморфизм на 300 п.н. [Altshuler et al., 2008]. Каждый новый аллель SNP возникает на фоне уже существующего гаплотипа, с аллелями, составляющими который, он изначально ассоциирован. Совместное наследование аллелей в гаплотипе на популяционном уровне проявляется как неравновесие по сцеплению (LD).
Предполагается, что характеристика структуры LD позволит реконструировать демографическую историю популяций и займет центральное место при картировании генов МФЗ [Jeffreys et al., 2001;
Gabriel et al., 2002;
Slatkin, 2008].
В данной работе в качестве локуса для изучения неравновесия по сцеплению в популяциях был выбран ген метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), являющейся катализатором единственной внутриклеточной реакции образования 5-метилтетрагидрофолата, который необходим для восстановления гомоцистеина до метионина. Снижение активности данного энзима, часто обусловленное мутациями в гене MTHFR, приводит к накоплению гомоцистеина (ГЦ) и развитию умеренной гипергомоцистеинемии (ГГЦ).
Согласно результатам проспективных когортных исследований (Physicians Health Study, British United Provident Study, Tromso Study и British Regional Heart Study) высокий уровень ГЦ в крови увеличивает риск атеросклероза, ишемических нарушений и болезни Альцгеймера, а частота выявления ГГЦ составляет около 5% в общей популяции и достигает 13-47% среди пациентов с ССЗ [Nygard et al., 1995;
Дербенева и др., 2003;
Libby et al., 2005;
Верткин и др., 2007].
Стенозирующий атеросклероз и последующая эмболизация сосудистого русла, сопровождаемая ишемией тканей, является ведущей причиной заболеваемости и смертности населения экономически развитых стран [Nabel, 2003;
Торшин, 2008]. Данные многочисленных эпидемиологических, семейных и близнецовых исследований, полногеномного картирования свидетельствуют о значительном вкладе наследственности в этиологию и патогенез этого МФЗ [Herrmann et al., 2002;
Zieske et al., 2002;
Воевода и др., 2006;
Пузырев, 2009].
Выявление структуры генетической компоненты распространенных болезней является одним из ключевых направлений в современной генетике человека. Эффекты отдельных полиморфизмов, выявляемые при классическом анализе ассоциаций, как правило, невелики и могут быть связаны не с самим изучаемым маркером, а со сцепленным с ним функционально значимым вариантом [Altshuler et al., 2008]. В силу этого анализ ассоциаций на уровне гаплотипов и их tagSNPs может оказаться более мощным и информативным средством, чем изучение отдельных маркеров [Collins et al., 2004;
Crawford et al., 2005;
Wollstein et al., 2007;
Petterson, 2009]. Поскольку характер LD в современных популяциях человека является результатом комплексного эволюционного процесса, который включает как демографическую историю популяций, так и гено-специфические факторы, то маловероятно, что характер LD, выявленный в конкретной популяции или выборке может быть автоматически распространен на другие популяции, по крайней мере, в некоторых участках генома [Reich et al., 2001;
Shifman et al., 2003;
Liu et al., 2004;
Oota et al., 2005].
Таким образом, работа, выполненная в рамках изучения характера LD в области генов-кандидатов и обнаружение связанных с болезнью гаплотипов и их tag-меток в конкретных популяционных группах, является высокопродуктивным подходом, позволяющим идентифицировать функциональные варианты, лежащие в основе предрасположенности к коронарному атеросклерозу (КА).
Цель исследования: выявление структуры гаплотипов и неравновесия по сцеплению в гене MTHFR у населения Северной Евразии и ее особенностей у больных коронарным атеросклерозом.
Задачи исследования:
1. Оценить вариабельность локуса MTHFR на уровне частот генотипов и гаплотипов в популяциях Северной Евразии.
2. Охарактеризовать структуру неравновесия по сцеплению гена MTHFR в популяциях Северной Евразии.
3. Идентифицировать информативные маркеры (tagSNPs), описывающие структуру гаплотипов в гене MTHFR.
4. Провести анализ ассоциаций полиморфизмов и гаплотипов гена MTHFR с атеросклерозом коронарных артерий.
5. Описать характер неравновесия по сцеплению в гене MTHFR у больных коронарным атеросклерозом.
6. Провести анализ ассоциаций исследованных SNPs гена MTHFR с патогенетически значимыми количественными признаками.
Научная новизна исследования: В результате выполнения работы в популяциях Северной Евразии впервые охарактеризовано генетическое разнообразие локуса MTHFR по 12 полиморфным вариантам. Показано, что структура LD в гене MTHFR носит популяционно-специфичный характер.
Произведена оценка возраста генерации разнообразия по 12 исследованным SNPs гена MTHFR, составившая 314000 ± 135000 лет. Выявлена эволюция гаплотипов и их роль при формировании КА в русской популяции. Идентифицированы tagSNPs гена MTHFR, показана корреляция вариабельности структуры LD и уровня гаплотипического разнообразия гена MTHFR с количеством tagSNPs. Впервые выявлена ассоциация полиморфизмов rs7533315 и rs2066462 с КА. Получены данные о взаимосвязи генетической вариабельности локуса MTHFR у больных КА с патогенетически значимыми показателями липидного обмена.
Продемонстрирована высокая информативность гаплотипического подхода в анализе ассоциаций с МФЗ методом случай – контроль.
Практическая значимость: Полученные в работе данные могут быть использованы в эволюционной генетике для анализа структуры генофондов мирового народонаселения и создания геногеографических карт. Информация об идентифицированных tagSNPs гена MTHFR может служить основой при планировании дальнейших работ по выявлению генетической предрасположенности к КА и другим заболеваниям, в этиопатогенез которых вовлечен исследованный локус. Сведения о вкладе полиморфизма изученных генетических маркеров в формирование вариабельности подверженности к КА могут быть учтены при формировании групп риска и организации профилактических мероприятий.
Положения, выдвигаемые на защиту:
1. Структура LD в гене MTHFR носит популяционно-специфичный характер.
Сильное сцепление между исследованными локусами обнаружено в популяциях кетов, южных киргизов и бурят. Популяции русских, хантов и северных киргизов характеризуются средним уровнем LD среди всех исследованных групп. Максимальное количество гаплотипических блоков и слабое сцепление наблюдается в популяциях тувинцев и якутов. Проведенный филогенетический анализ гаплотипов и идентичность основных гаплотипов во всех исследованных выборках свидетельствуют об общем механизме формирования данных паттернов LD.
2. Вариабельность структуры LD и уровень гаплотипического разнообразия гена MTHFR в исследованных выборках обуславливают определенный набор tagSNPs с установленной прогностической значимостью для каждой популяции. Наиболее информативно ценными tagSNPs из исследованного массива данных являются rs4846052, rs1801133, rs6541003, rs7533315, rs1801131 и rs3753588.
3. Полиморфизмы rs7533315 и rs2066462 и гаплотип GCCTTCGCACGC гена MTHFR являются структурными элементами наследственной компоненты подверженности к КА у русских г. Томска, а гаплотип GCCCTCGCCCGC проявляет протективный эффект. Характер структуры LD в группе пациентов с КА и контрольной выборке имеет во многом схожие черты.
4. У пациентов с КА генотипы шести SNPs (rs7533315, rs6541003, rs2066462, rs1801131, rs17375901, rs1537516) коррелируют с вариабельностью содержания в плазме общего холестерина и/или триглицеридов, с уровнем липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) ассоциированы два полиморфных варианта (rs7533315 и rs2066462). Физиологический механизм подверженности к КА у носителей неблагоприятного гаплотипа 3’-концевого блока сцепления реализуется через нарушения липидного обмена.
Апробация работы: Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Российской научно-практической конференции «Здоровье девочки, девушки, женщины» (Томск, 2006), VIII научной конференции «Генетика человека и патология» (Томск, 2007);
VIII конгрессе молодых ученых и специалистов (Томск, 2007);
межлабораторном научном семинаре Учреждения РАМН НИИ медицинской генетики СО РАМН (Томск, 2009).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 5 в журналах перечня ВАК, рекомендованных для защиты по медицине.
Структура и объем диссертации: Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Данные проиллюстрированы 16 таблицами и рисунками. Библиографический указатель включает 247 источников, из них работ отечественных авторов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалом для исследования послужили образцы ДНК 9 популяционных выборок, проживающих в регионах Северной Евразии (табл. 2), принадлежащих к 7 этническим группам и 4 языковым семьям (алтайской, палеоазиатской, уральской и индоевропейской). Общая численность обследованных индивидов составила 978 человек. Кроме того, в качестве объекта для популяционных сравнений были использованы данные по популяциям европеоидов (штат Юта), китайцев (г. Пекин), японцев (г. Токио) и йоруба (Ибадан), полученные в ходе реализации проекта HapMap [The International HapMap Consortium, 2003].
В рамках данной работы также были обследованы пациенты с КА и контрольная выборка. В группу больных вошли неродственные индивиды европеоидной национальности (128 мужчин и 13 женщин в возрасте от 30 до лет) с атеросклерозом коронарных артерий, наблюдавшихся в отделениях неотложной кардиологии, реабилитации, хронической ишемической болезни сердца и атеросклероза НИИ кардиологии СО РАМН (директор-академик РАМН Р.С. Карпов). Наличие стенозирующего процесса в коронарных артериях было подтверждено ангиографическим обследованием. Контрольную группу составили 126 неродственных индивида европеоидной национальности (123 мужчины и женщины в возрасте от 20 до 58 лет), которые не имели клинических появлений сердечно-сосудистых нарушений. Данная выборка была сформирована в ходе эпидемиологических исследований факторов риска развития ИБС в г. Томске, проводимом в НИИМГ СО РАМН. В контрольной группе и у больных КА были проанализированы следующие количественные признаки: содержание общего холестерина (ОХ), липопротеинов высокой и низкой плотности (ЛПВП и ЛПНП) и триглицеридов (ТГ) в плазме крови, систолическое (САД) и диастолическое (ДАД) артериальное давление, антропометрические показатели.
В качестве маркеров для изучения LD были выбраны 12 SNPs гена MTHFR (табл. 1), относительно равномерно охватывающие все участки гена (экзоны, интроны, 3’-нетранслируемый участок), частота минорного аллеля (MAF) для большинства исследованных локусов составляет не менее 5% (по данным базы NSBI). Генотипирование проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Для локусов rs1801131 и rs1801133 использовались описанные в литературе праймеры и рестрктазы [Frosst et al., 1995;
van der Put et al., 1996]. Для остальных SNPs условия генотипирования были подобраны в данной работе.
Статистическая обработка результатов исследования проводилась с помощью пакетов статистических программ «Statistica 7.0», «ARLEQUIN» и «Haploview 4.0». Различие двух сравниваемых величин считалось достоверным при достижении уровня значимости р0,05.
Таблица Характеристика исследованных SNPs гена MTHFR (по данным базы NSBI) № SNPs dbSNP allele Тип мутации Локализация в гене 1 rs3753588 A/G 1 интрон 2 rs2066470 C/T Синонимичная (39 Pro/Pro) 2 экзон 3 rs17037397 А/С 2 интрон 4 rs7533315 C/T 3 интрон 5 rs4846052 С/Т 4 интрон 6 rs1801133 С/T Несинонимичная (222 Val/Ala) 5 экзон 7 rs6541003 A/G 5 интрон 8 rs2066462 C/T Синонимичная (352 Ser/Ser) 7 экзон 9 rs1801131 A/C Несинонимичная (429 Ala/Glu) 8 экзон 10 rs17375901 C/T 9 интрон 11 rs2274976 А/G Несинонимичная (594 Gln/Arg) 12 экзон 12 rs1537516 С/Т 12 экзон (3’UTR) Примечание: жирным шрифтом выделен предковый аллель Для определения характера распределения полученных данных использовали критерий Колмогорова-Смирнова. При проведении попарного сравнения частот аллелей, генотипов и гаплотипов, между анализируемыми группами использовали критерий 2 с поправкой Йейтса. При сравнении количественных показателей применялся непараметрический критерий Манна – Уитни. Роль генотипов изучаемых полиморфных вариантов гена в вариабельности количественных признаков определяли с помощью критерия Крускала-Уоллиса [Гланц, 1999]. В исследуемых группах для SNPs вычисляли отношение шансов (OR) и доверительные интервалы (CI) для отношения шансов (95% CI). Соответствие распределения частот аллелей и генотипов равновесию Харди-Вайнберга проверяли по критерию 2 [Вейр, 1995]. Частоты гаплотипов определялись с помощью EM-алгоритма. LD между парами SNPs оценивалось с помощью коэффициента D’, предложенного Левонтином и коэффициента корреляции r Пирсона. Блочная структура определялась посредством алгоритма «Solid spine LD» [Barret et al, 2005], с заданным порогом D’ 0,75. Уровень генетического разнообразия и межпопуляционной дифференциации вычисляли методом анализа молекулярной вариабельности (AMOVA).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Генетическое разнообразие, структура гаплотипов и неравновесия по сцеплению гена MTHFR в некоторых популяциях Евразии Распределение генотипов и частоты аллелей исследованных SNPs гена MTHFR приведены в таблице 2. Все 12 локусов оказались полиморфными практически во всех изученных популяциях (за исключением rs2066470 в популяции кетов). Частота минорного аллеля варьировала от 0 до 39%, семь SNPs (rs3753588, rs7533315, rs4846052, rs1801133, rs6541003, rs1801131 и rs1537516) встречались с частотой более 5% во всех популяциях. Полученные данные находятся в пределах вариаций частот аллелей и генотипов SNP гена MTHFR, представленных в литературе для европеоидных и монголоидных популяций.
Практически по всем маркерам во всех популяциях распределение частот генотипов соответствует равновесию Харди-Вайнберга (исключение составляют локусы rs17375901, rs2066470, rs3753588, rs2274976 и rs1537516 в популяции бурятов из пос. Хуромша, а также маркеры rs4846052 и rs6541003 в группе больных КА). Наблюдаемое в данном исследовании отклонение от равновесия Харди-Вайнберга может быть обусловлено действием случайных факторов или отражать специфику популяционно-генетических процессов в популяции [Хедрик, 2003].
Таблица Распределение генотипов и минорных аллелей изученных полиморфных вариантов гена MTHFR в исследованных выборках Частота, % Генотип, SNPs Улан-Удэ, Хуромша, северные, Тувинцы, аллель Киргизы Киргизы (N=111) (N=134) (N=142) (N=126) Русские южные, Буряты Буряты Ханты, Якуты, (N=60) (N=85) (N=38) (N=60) (N=81) Кеты, гена MTHFR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 rs3753588 AA 2 1 1 - - 3 4 2 AG 13 14 22 11 17 5 20 28 GG 85 85 77 89 83 92 76 70 A 8 8 12 5 8 6 14 16 rs2066470 CC 90 85 78 100 83 92 76 79 CT 10 14 18 - 17 5 19 19 TT - 1 1 - - 3 5 2 T 5 8 10 - 8 6 14 11 rs17037397 АА - - - - - - 3 - AC 12 11 8 16 20 5 17 26 CC 88 89 92 84 80 95 80 74 A 6 5 4 8 10 3 11 13 rs7533315 CC 55 69 60 68 78 63 63 75 CT 38 29 39 29 19 35 37 23 TT 7 2 1 3 3 2 - 2 T 26 16 21 17 13 19 18 13 rs4846052 CC 46 55 40 55 58 58 40 51 CT 41 42 52 39 36 35 53 39 TT 13 3 8 6 6 7 7 10 T 34 24 34 25 23 24 34 29 rs1801133 CC 67 53 53 79 72 55 61 67 CT 28 37 44 18 25 42 33 29 TT 5 10 3 3 3 3 6 4 T 19 28 24 12 16 24 23 18 rs6541003 AA 43 54 38 53 60 58 37 49 AG 46 43 52 42 35 35 52 40 GG 11 3 10 5 5 7 11 11 G 34 24 36 26 23 24 32 31 Окончание таблицы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 rs2066462 CC 94 88 93 89 97 97 89 74 CT 6 12 7 11 3 3 11 26 TT - - - - - - - - T 3 6 3 5 2 2 6 13 rs1801131 AA 44 62 34 58 60 58 46 51 AC 35 35 54 37 36 35 48 38 CC 21 3 12 5 4 7 6 11 C 38 20 39 24 21 24 30 30 rs17375901 CC 98 96 89 97 98 94 94 94 CT 2 4 11 3 2 3 6 6 TT - - - - - 3 - T 1 2 5 1 1 5 3 3 rs2274976 AA - - - - - 3 3 1 AG 10 30 11 8 17 4 17 23 GG 90 70 89 92 83 93 80 76 A 5 15 5 4 8 5 13 13 rs1537516 CC 84 85 80 89 83 92 80 69 CT 16 14 20 11 17 5 17 29 TT - 1 - - - 3 3 2 T 8 8 10 5 8 6 13 16 Число найденных 47 27 40 11 17 13 37 40 гаплотипов Гаплотипическое 0,82 0,62 0,77 0,49 0,59 0,55 0,72 0,78 0, разнобразие Примечание: N – количество индивидуумов в выборке В исследованных выборках обнаружено 160 гаплотипов из 4096 возможных.
Максимальное число гаплотипов выявлено в популяции тувинцев (47), минимальное – в выборке кетов (11). Большинство из исследованных выборок характеризовалось высоким уровнем гаплотипического разнообразия, за исключением кетов, бурят и южных киргизов (Табл. 2). Гаплотипы, встречающиеся с частотой менее 0,5 % в одной популяции, были исключены из анализа. Гаплотипы с частотой более 5 % обозначены как основные гаплотипы. Во всех обследованных популяциях, за исключением русских, наблюдалось основных гаплотипа - GCCCCCACACGC, GCCCCTACACGC, GCCTTCGCCCGC, частоты которых в сумме составляют более 83 % наблюдаемых хромосом в популяциях кетов и бурят, более 61 % в остальных выборках. В данной работе обнаружена различная степень гаплотипического разнообразия в исследованных популяциях, тем не менее, во всех выборках наблюдались одинаковые основные гаплотипы, что указывает на возможность общего механизма формирования данных паттернов LD.
На рисунке 1 показана структура LD между исследованными локусами гена MTHFR в 13 популяционных выборках. У русских и хантов выявлены 3 блока. У северных киргизов обнаружено два блока: первый включает три SNPs (rs2066470, rs17037397, и rs7533315), второй охватывает участок гена в 10 т.п.о. и содержит SNPs. У южных киргизов и кетов все исследованные SNPs находятся в тесном сцеплении и входят в состав одного блока. Сильное сцепление между первыми девятью SNPs, составляющими первый блок размером 9 т.п.о., и между rs и rs1537516, образующими второй небольшой блок, выявлено у бурятов пос.
Хуромша. В популяции бурятов г.Улан-Удэ также выявлено значительное сцепление между многими полиморфными вариантами, но структура LD в этой популяции характеризуется наличием трех блоков. В популяциях тувинцев и якутов можно выделить четыре небольших гаплотипических блок, состоящих из двух или трех соседних SNPs. Гаплотипические блоки длиной от 847 п.о. до т.п.о. представлены несколькими (3-6) основными гаплотипами, которые в сумме составляют более 90% наблюдаемых хромосом. Примечательно, что функционально значимые полиморфизмы С677Т и А1298С во всех популяциях, кроме южных киргизов и кетов не сцеплены.
Рис. 1. Гаплотипические блоки в исследованных популяциях. Нумерация SNPs: 1 rs3753588, 2 - rs2066470, 3 - rs17037397, 4 - rs7533315, 5 - rs4846052, 6 - rs1801133, 7 - rs6541003, 8 - rs2066462, 9 - rs1801131, 10 - rs17375901, 11 - rs2274976, 12 rs1537516.
Тесное сцепление между исследованными SNPs также было выявлено в популяциях из проекта HapMap. У китайцев и японцев все полиморфизмы входят в состав одного блока, у европеоидов также обнаружен один гаплотипический блок, включающий девять SNPs. В популяции йоруба наблюдалось два блока:
первый - размером 2 т.п.о. и второй достаточно протяженный блок (8) состоящий из 6 локусов (Рис. 1).
В данной работе получено подтверждение популяционно-специфического характера формирования паттернов LD. Наиболее сильное сцепление (все SNPs входят в состав одного блока) между исследованными локусами обнаружено в популяциях кетов, южных киргизов, китайцев и японцев. Тесное сцепление наблюдалось также у бурят. Возможно два объяснения наблюдаемому сохранению структуры и протяженности блока: недавнее происхождение от общих предков или позитивный отбор, который часто приводит к увеличению размера блока, содержащего полезный аллель [Zang, 2006]. Поскольку у кетов и бурят выявлено минимальное число гаплотипов среди всех исследованных популяций, есть вероятность, что в данном случае имел место эффект основателя. Однако на увеличение структуры LD влияет и ряд других факторов [Oraguzie, 2006, De La Vega, 2008] (генетическая изоляция, подразделенность или смешение популяций, балансирующий отбор, эффект «горлышка бутылки», небольшой размер популяции и другие причины), действие которых на некоторые популяции также нельзя исключить.
Показано, что протяженность паттернов LD в геноме человека определяет потенциал и дизайн ассоциативных исследований, использующих SNPs для картирования генов, лежащих в основе комплексных признаков. Текущая оценка числа маркеров, необходимых для LD-базирующего геномного сканирования различных популяций варьирует от 120000 до нескольких миллионов SNPs, свидетельствует об огромной стоимости генотипирования и возможных проблемах статистических выводов. Предполагается, что в популяциях с высокой степенью LD количество маркеров, необходимых для картирования МФЗ, существенно снизится [Service et al., 2007].
Выбор tagSNPs гена MTHFR По оценкам различных исследователей геном человека содержит более миллионов распространенных SNPs с MAF не менее 10% и более 7,5 миллионов распространенных SNPs с MAF более 5% [Carlson et al., 2003;
Gonzalez-Neira et al.,2006], которые объясняют часть наследственного риска развития многих МФЗ.
Исходя из несомненной потенциальной пользы выбора tagSNPs для ассоциативных исследований, ряд авторов предлагает эффективно идентифицировать tagSNPs посредством различных алгоритмов [Carlson et al., 2004;
Wang et al., 2003]. Одним из методов, использованных при определении TagSNPs гена MTHFR в данном исследовании, был алгоритм «STAMPA» [Halperin et al., 2005], предусмотренный программным обеспечением «GEVALT» (Табл. 3).
Исходя из данных результатов, можно выделить ряд наиболее информативно ценных полиморфных маркеров. Например, rs4846052 является tagSNP во всех исследованных группах, а rs1801133, rs6541003, rs7533315, rs1801131 и rs присутствуют в качестве tag-меток во многих популяциях.
Таблица Набор TagSNPs гена MTHFR с точностью прогноза не менее 95%, установленный посредством алгоритма «STAMPA» Исследованные популяции Количество SNPs гена MTHFR tagSNPs Русские 6 2 3 8 10 11 1 4 5 6 7 Северные киргизы 6 2 3 4 8 10 1 5 6 7 9 Южные киргизы 4 2 3 7 8 9 10 11 1 4 5 Тувинцы 5 2 3 4 8 10 11 1 5 6 7 Кеты 2 2 3 4 6 7 8 9 10 11 1 Ханты 7 1 9 10 11 2 3 4 5 6 7 Якуты 7 2 3 8 10 1 4 5 6 7 9 Буряты г. Улан-Удэ 2 1 3 4 6 7 8 9 10 11 2 Буряты пос. Хуромша 2 1 2 3 6 7 8 9 10 11 4 Примечание: в таблицах 3 и 4 использована следующая нумерация SNPs - 1 rs3753588, 2 - rs2066470, 3 - rs17037397, 4 - rs7533315, 5 - rs4846052, 6 - rs1801133, 7 - rs6541003, 8 - rs2066462, 9 - rs1801131, 10 - rs17375901, 11 - rs2274976, 12 rs1537516. Жирным шрифтом выделены tagSNPs.
Также в данной работе tagSNPs определялись посредством алгоритма «Aggressive tagging» метода «Tagger» программного обеспечения «HaploView».
Тag SNPs, выявленные посредством вышеописанного алгоритма в исследованных популяциях представлены в таблице 4. Предсказательная способность данного набора tag-меток относительно всего массива исследованных полиморфизмов составляет 100%.
Таблица TagSNPs гена MTHFR, вычисленные в программе «Tagger» Исследованные популяции Количество SNPs гена MTHFR tagSNPs Русские 9 1 7 2 3 4 5 6 8 9 10 Северные киргизы 11 1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 Южные киргизы 8 1 5 7 2 3 4 6 8 9 10 Тувинцы 11 3 1 2 4 5 6 8 9 10 11 Кеты 8 1 2 5 3 4 6 8 9 10 11 Ханты 9 1 7 2 3 4 5 6 8 9 10 Якуты 10 1 5 2 3 4 6 8 9 10 11 Буряты г. Улан-Удэ 8 2 7 9 1 3 4 5 6 8 10 Буряты пос. Хуромша 7 2 5 7 11 1 3 4 6 8 9 Согласно приведенным данным, в различных популяциях наблюдаются неодинаковые наборы tagSNPs, обладающие различной прогностической значимостью, что, вероятно, обусловлено варьированием структуры LD и гаплотипического разнообразия в исследованных выборках. Подтверждением этого служит обнаруженная достоверная корреляция гаплотипического разнообразия и вариабельности количества tagSNPs (r2=0,85;
p0,01). Показано также, что качество выбранных tagSNPs зависит от исходного массива, в котором они охарактеризованы. Необходимая плотность маркеров в исходном массиве данных варьирует в различных участках генома в зависимости от ряда показателей, таких, например, как уровень рекомбинации, частоты SNPs, характер мутации и демографическая история населения [Zang, 2007].
Филогенетический анализ взаимоотношений гаплотипов локуса MTHFR и оценка селективной нейтральности исследованных SNPs В данном исследовании филогенетический анализ взаимоотношений гаплотипов, определяемых по диаллельным маркерам и встречающихся с частотой более 1% в тотальной выборке, проводили, конструируя филогенетические деревья (сети) гаплотипов по алгоритму медианных сетей [Bandelt et al., 1999], реализованному в программе «Network». В качестве предкового гаплотипа рассматривали гаплотип, состоящий из предковых аллелей (информация взята из базы данных NSBI). Полученные результаты свидетельствуют о схождении всех гаплотипов, наблюдаемых в современных популяциях человека к одному общему предковому варианту, встречающемуся с частотой около 1% в популяциях тувинцев и северных киргизов и 14% у йоруба. Все наблюдаемые гаплотипы находятся в пределах 7 мутационных шагов от предкового варианта при анализе всего гена MTHFR и в пределах 4-х мутационных шагов от общего предка при поблочном анализе. Наблюдаемое гаплотипическое разнообразие сложилось в результате эволюции гаплотипов на протяжении длительного исторического времени и зависит от времени происхождения данной линии, скорости мутирования гаплотипов и демографической истории популяций (Li et al., 1996).
Поскольку темп мутирования SNPs и разнообразие, наблюдаемое в современных популяциях, поддаются оценке, можно рассчитать время происхождения данной гаплотипической линии через оценки разнообразия. Для оценки времени коалесценции гаплотипов в качестве мутационного шага рассматривали изменения аллелей одного SNPs в одном локусе на единицу. Для всех исследованных SNPs задавали одинаковый темп мутирования (1 10-8 на локус на поколение), а время одного поколения принимали за 20 лет. В целом возраст генерации разнообразия по 12 исследованным SNPs гена MTHFR составил 314000 ± 135000 лет. Также были получены данные, свидетельствующие о незначительной роли рекомбинации в генерации генетического разнообразия локуса MTHFR в современных популяциях человека. Хотя проведенный филогенетический анализ является достаточно мощным и продуктивным, так как он описывает и отображает отношения между гаплотипами, следует отметить, что абсолютные оценки времени коалесценции следует интерпретировать с осторожностью, т.к. ключевым параметром, на котором строятся эти оценки, является темп мутирования.
Согласно результатам ряда исследований [Kidd, Kidd, 2008;
Tenesa et al., 2007] сравнительно недавняя и быстрая экспансия человека из Африки оставила существенный «отпечаток» в нашем геноме с основными географическими различиями и биомедицинскими последствиями. Необходимо отметить, что для двух индивидуумов вариабельность генома, обуславливающая фенотипические различия, составляет всего 0,1%. Фактически большинство из этих изменений в ДНК должно быть эволюционно нейтральным, но, тем не менее, наблюдается большое число полиморфизмов, влияющих на фенотип, которые могут быть объектами отбора или подвергнуться ему в дальнейшем [Kidd, Kidd, 2008].
В данной работе селективная нейтральность полиморфизмов гена MTHFR исследовалась с помощью теста Эвенса-Ваттерсона. Из всех изученных SNPs отклонение от нейтральности обнаружено только для rs4846052 и rs6541003 в выборках русских, больных КА и европеоидов из проекта HapMap. Все три функционально значимых SNPs, обусловливающие повышение уровня ГЦ в крови, оказались селективно нейтральными. Вероятно, это объясняется тем, что даже некоторое изменение фенотипа может быть селективно нейтральным, если не влияет на репродуктивную эффективность [Spiroski, 2008].
Роль давления отбора в формирование паттернов LD и уровня генетического разнообразия в популяциях оценивалась с использованием стандартных статистических тестов нейтральности Таджимы и Фу [Tajima, 1989;
Fu, 1997]. В данной работе значение критерия D Таджимы оказалось отрицательным во всех исследованных популяциях, но статистически не значимым. Значение критерия Fs теста Фу было отрицательным и статистически значимым в популяциях тувинцев, северных киргизов, якутов и хантов, что свидетельствует о возможности действия отрицательного отбора на данный участок генома в этих популяциях, либо о популяционной экспансии. Однако смешение данных популяций с соседними популяциями также могло привести к увеличению разнообразия ДНК и, вместе с этим, значения критерия Fs.
Генетическая дифференциация исследованных популяций Уровень генетической дифференциации изученных популяций по частотам аллелей 12 исследованных SNPs гена MTHFR составил 0,015, а по частотам гаплотипов 0,017. Оценка проводилась с помощью коэффициента Fst. Все изученные полиморфные варианты показали достоверную дифференциацию.
Данные по отдельным локусам показывают, что наибольший вклад в межпопуляционное разнообразие вносят различия по частотам аллелей локусов rs4846052, rs1801133, rs6541003, rs2066462, rs1801131, и rs2274976. Наименьшая же степень межпопуляционного разнообразия характерна для rs17375901.
Анализ структуры неравновесия по сцеплению и ассоциаций полиморфных вариантов гена MTHFR с коронарным атеросклерозом Сравнение частот генотипов и аллелей контрольной группы и группы пациентов с КА выявило значимые различия по двум полиморфным вариантам гена MTHFR - rs7533315 и rs2066462 (Рис. 2). Частоты мутантных аллелей Т, генотипов СТ и ТТ были достоверно выше в группе больных КА. Анализ отношения шансов также подтвердил возможную связь генетической изменчивости rs7533315 и rs2066462 с наследственной предрасположенности к КА (OR=1,60;
95% Cl: 1,08-2,36 и OR=2,71;
95% Cl: 1,13-6,72 соответственно).
Частоты аллелей всех 12 исследованных SNPs, за исключением rs2066462, в контрольной группе значимо не отличались от частот у европеоидов из проекта HapMap.
50 43 40 36* 35 31 30 15 10 10 99 8* 10 6 4 44 rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs Контрольная группа Больные КАС Рис. 2. Распределение частот минорных аллелей у больных КАС и в контрольной группе. Достоверные различия (р0,05), полученные при сравнении частот аллелей контрольной группы и группы больных КА обозначены *.
В данном исследовании не получено достоверной взаимосвязи КА ни с одним из трех функционально значимых SNPs гена MTHFR (С677Т, А1298С и G1793А). Однако КА ассоциирован с rs7533315, расположенной в третьем интроне гена MTHFR, и синонимичной заменой 7 экзона rs2066462. Можно предположить, что эффект синонимичной замены rs2066462 гена MTHFR на синтез кодируемого им протеина может заключаться в нарушении сплайсинга или необходимости для клетки вовлекать более редкую тРНК, что замедляет синтез белка. Что касается rs7533315, вероятно, полученная ассоциация обусловлена тем, что данный SNP находится в тесном сцеплении (D’=1) с несинонимичной заменой rs2274976 (G1793А), но в силу малой частоты минорного аллеля А rs2274976 связь этой миссенс-мутации с КА не удалось зафиксировать на столь небольшой выборке. Показано, что гетерозиготность по сайту G1793А приводит к повышению в крови уровня ГЦ на 40% [Мао, 2008]. Некоторые исследователи выделяют rs2274976 как клинически важный полиморфизм, особенно при анализе генетической подверженности к МФЗ, в патогенез которых вовлечены нарушения фолатного метаболизма [Melo, 2006]. Возможно также, что rs7533315 сцеплен с каким-то функционально значимым неисследованным в данной работе полиморфизмом гена MTHFR.
Необходимо отметить, что в различных популяциях и этно-географических группах ассоциации формируются на различном генетическом и средовом фоне.
Возникновение мутации, выражающейся, допустим, в повышении предрасположенности к КА могло происходить неоднократно и в различном аллельном окружении. Известно, что любой новый аллель изначально ассоциирован с другими аллелями, на фоне которых этот аллель возник. И хотя каждый SNP может анализироваться независимо, вероятно, более информативно, изучать их в гаплотипах, специфических для популяций вследствие уникальной демографической истории.
Структура гаплотипов и неравновесия по сцеплению у больных КА и в контрольной группе В данной работе по локусу MTHFR в группе пациентов с КА обнаружено гаплотипов из 4096 возможных, в контрольной выборке – 35. Гаплотипы, встречающиеся с частотой более 1%, представлены на рисунке 3. При сравнении больных КА и контрольной группы по частотам гаплотипов выявлена достоверная ассоциация с КА гаплотипа GCCTTCGCACGC (гаплотип № 22 на рис. 3, 2 с поправкой Йейтса=5,90, p=0,015;
OR 2,98, 95% CI 1,53-5,88). Кроме того, обнаружен один протективный гаплотип GCCCTCGCCCGC (гаплотип №17 на рис. 3, 2 с поправкой Йейтса=8,32, p=0,004;
OR 0,18, 95% CI 0,04-0,69), по остальным гаплотипам значимых различий не найдено.
Построенное медианное древо гаплотипов гена MTHFR демонстрирует, что именно эти два гаплотипа образовались непосредственно из предполагаемого гаплотипа-основателя. Гаплотип №22 содержит один мутантный аллель Т (выделен жирным шрифтом) маркера rs7533315, для которого в данном исследовании была зафиксирована ассоциация с КА. Однако все остальные аллели данного гаплотипа являются предковыми, что указывает на возможное тесное сцепление rs7533315 c каким-то неисследованным в текущей работе функционально значимым SNP гена MTHFR. Гаплотип №17 также включает в себя только один мутантный аллель, принадлежащий rs1801133 (А1298С). Однако этот гаплотип оказался протективным с довольно высоким показателем отношения шансов. Показано, что использование гаплотипов, а не SNPs в ассоциативных исследованиях может существенно повысить статистическую мощность теста, особенно если предрасполагающие к заболеванию полиморфизмы не анализируются непосредственно или в случае существования высокой степени мультилокусного LD. [Schaid, 2004;
Zeng, Lin, 2006].
Имитационное моделирование, проведенное Akey et al. (2001) продемонстрировало, что мощность гаплотипических тестов находится под влиянием генетической дистанции между наблюдаемыми маркерами и причинной мутацией, частот аллелей и возраста причинной мутации.
Выше нами была показана популяционная специфичность структуры LD гена MTHFR в различных популяциях Евразии. Настоящая работа подтверждает также наличие межпопуляционных и межгрупповых различий в структуре LD локуса MTHFR. В контрольной выборке, которая по своим параметрам близка к популяции русского населения города Томска, выявлены 3 блока: первый - из двух близко расположенных SNPs (rs3753588 и rs2066470), второй включает полиморфизмов - rs7533315, rs4846052, rs1801133, rs6541003 и rs2066462, третий состоит из четырех SNPs - rs1801131, rs17375901, rs2274976 и rs1537516. В то же время европеоиды из проекта HapMap демонстрируют тесное сцепление 9-и из проанализированных в настоящей работе SNPs, формирующих единый блок длиной 10 т.п.н. У больных коронарным атеросклерозом из томской популяции обнаружено 2 сцепленных блока. Первый, охватывающий примерно 9 т.п.н. в 5’ области гена, включает 8 полиморфизмов (rs3753588, rs2066470, rs17037397, rs7533315, rs4846052, rs1801133, rs6541003, rs2066462). Второй блок в 3’-области MTHFR длиной около 6 т.п.н. составляют 4 SNPs (rs1801131, rs17375901, rs 2274976 и rs1537516). Данный блок сцепления идентичен третьему гаплотипическому блоку в контрольной выборке. Примечательно, что считающийся наиболее функционально значимым полиморфизмом гена MTHFR вариант С677Т (rs1801133) не показывает тесного сцепления ни с одним из исследованных маркеров.
Контрольная группа Больные КАС 1, №34 GTCTTCGCCCGC 1, №33 GCCTTTGCACGC 1, №31 GCCCTCGCACGC №30 GCCCTCACACGC 2,5* №28 ATCCTCGTCCGT 3, №26 GCCTTTGCCCGC 3, 13, №23 GCCTTCGCCCGC 12, 10,2* №22 GCCTTCGCACGC 4, Гаплотипы №18 GCCCTTACACGC 1, №17 GCCCTCGCCCGC 5,7* 17, №13 GCCCCTACACGC 19, 1, №12 GCCCCCGCACGC 0, №11 GCCCCCACACGC 31, №10 GCATTCGCCCGC 1, №9 GCACCCACACGC 1, №7 ATCCTCGTCTGT 1, №6 ATCCTCGCCTGT 1, №5 ATCCTCGCCCAT 1, 1, №4 ATACTCGTCCAT 1, 0 5 10 15 20 25 30 % Рис. 3. Распределение частот гаплотипов у больных КА и в контрольной группе.
Ассоциированный с КА гаполотип GCCTTCGCACGC в соответствии с блочной структурой LD в локусе MTHFR у больных распадается на 2 более коротких гаплотипа: гаплотип GCCTTCGC блока 1 (он является вторым по частоте среди больных - 25%) и гаплотип ACGC блока 2, который является наиболее частым вариантом (67%) этого блока в изученной выборке больных.
Дополнительным подтверждением ассоциации наблюдаемой гаплотипической структуры гена MTHFR с коронарным атеросклерозом в данной работе является выявленная взаимосвязь исследованные маркеров гена MTHFR с патогенетически значимыми показателями липидного обмена.
Анализ ассоциаций с патогенетическими значимыми количественными признаками Согласно результатам нашего исследования, среднее содержание ТГ и ЛПНП в плазме крови, значение индекса массы тела (ИМТ) и систолического САД в группе больных с КА статистически значимо превышает данные показатели в группе сравнения. Уровни ОХ и ЛПВП достоверно выше в контрольной группе.
Однако, средние значения исследуемых показателей в обеих группах в пределах референтных значений.
Посредством множественного сравнения была найдена ассоциация генотипов шести SNPs: rs7533315, rs6541003, rs2066462, rs1801131, rs17375901, rs1537516 с вариабельностью содержания в плазме общего холестерина и/или триглицеридов в группе больных КА. Необходимо отметить, что в группе больных КА максимальный уровень общего холестерина и триглицеридов соответствовал гомозиготе по «мутантному» аллелю (rs7533315, rs1801131, rs1537516) или гетерозиготе, включающий данный аллель (rs2066462, rs17375901).
Обратная тенденция наблюдалась для rs6541003: носители предкового генотипа по данному локусу имели достоверно повышенные уровни общего холестерина и триглицеридов по сравнению с «мутантными» гомозиготами. Показатели САД и ДАД крови, содержание ЛПНП в плазме и ИМТ у носителей различных генотипов MTHFR достоверно не отличались ни в одной из групп.
Достоверная ассоциация с уровнем общего холестерина и триглицеридов у больных коронарным атеросклерозом была обнаружена для 3-х из 4-х ОНП, входящих в 3’-концевой блок сцепления (блок 2), гаплотипы которого ассоциированы с заболеванием как качественным фенотипом. Возможно, это свидетельствует о том, что физиологический механизм подверженности у носителей неблагоприятного гаплотипа блока 2 реализуется через нарушения липидного обмена, модификации белков ГЦ-тиолактоном и инициации окисления ЛПНП.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ В представленной работе исследована структура гаплотипов и LD в гене метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) в 8 популяционных выборках, проживающих на территории Северной Евразии, группе больных коронарным атеросклерозом (КА) и контрольной выборке из русской популяции города Томска. Также в рамках данного исследования изучалась взаимосвязь 12 SNPs гена MTHFR с КА и вариабельностью патогенетически значимых количественных показателей. В качестве объекта для популяционных сравнений в работе были использованы данные по популяции европеоидов, китайцев, японцев и йоруба, полученные в ходе реализации проекта HapMap.
В результате данного исследования была выявлена популяционная специфичность структуры LD гена MTHFR в различных популяциях Северной Евразии. Наряду с этим были обнаружены сходства в архитектуре LD среди некоторых популяций. У кетов, южных киргизов, японцев и китайцев все изученные SNPs входят в состав одного гаплотипического блока, что указывает на значительную силу сцепления между исследованными полиморфными вариантами. Тесное сцепление было выявлено также в выборке бурят. Популяции русских, хантов и северных киргизов характеризуются средним уровнем LD среди всех исследованных групп. Минимальная степень LD и максимальное количество небольших по размеру гаплотипических блоков в локусе MTHFR обнаружено в популяциях тувинцев и якутов. Полученные данные свидетельствуют о том, что архитектура LD в геноме человека в значительной степени определяется эволюционной историей популяций. Необходимо отметить, что в данной работе обнаружена различная степень гаплотипического разнообразия в исследованных популяциях, тем не менее, во всех выборках наблюдались одинаковые основные гаплотипы, что указывает на возможность общего механизма формирования данных паттернов LD.
Вариабельность структуры LD и уровень гаплотипического разнообразия гена MTHFR в исследованных выборках обуславливают определенный набор tag SNPs с установленной прогностической значимостью для каждой популяции.
Наибольшая информативная ценность показана для 6 tag SNPs из исследованного массива данных (rs4846052, rs1801133, rs6541003, rs7533315, rs1801131 и rs3753588). Дизайн ассоциативных исследований, основанный на выборе маркеров согласно доступным на сегодняшний день картам LD с достаточно высокой плотностью SNPs, имеет несомненные преимущества, так как существенно уменьшает затраты на генотипирование и позволяет обнаружить маркеры, непосредственно не анализируемые в исследовании [Carlson et al., 2003, 2004;
Gonzalez-Neira et al., 2006].
Проведенный филогенетический анализ гаплотипов свидетельствует о схождении всех гаплотипов, наблюдаемых в современных популяциях человека, к одному общему предковому варианту и о незначительной роли рекомбинации в генерации генетического разнообразия локуса MTHFR в исследованных популяциях. Возраст генерации разнообразия по 12 исследованным SNPs гена MTHFR составил 314000 ± 135000 лет.
Также в представленной работе получены данные, подтверждающие действие балансирующего отбора на локусы rs4846052 и rs6541003 у европеоидов и влияние отрицательного отбора на определенные гаплотипы гена MTHFR в популяциях тувинцев, северных киргизов, якутов и хантов, характеризующихся наиболее высоким уровнем гаплотипичекого разнообразия (более 70%) и низким уровнем LD среди всех исследованных групп.
Все изученные SNPs гена МTHFR показали достоверную дифференциацию.
Данные по отдельным локусам показывают, что наибольший вклад в межпопуляционное разнообразие вносят различия по частотам аллелей локусов rs4846052, rs1801133, rs6541003, rs2066462, rs1801131, и rs2274976. Наименьшая же степень межпопуляционного разнообразия характерна для rs17375901.
В данном исследовании получена достоверная ассоциация с КА локусов rs7533315 и rs2066462 гена MTHFR. Сравнение частот гаплотипов больных КА и контрольной группы выявило достоверную взаимосвязь с КА гаплотипа GCCTTCGCACGC и один протективный гаплотип GCCCTCGCCCGC.
Дополнительным подтверждением связи выявленных гаплотипов с коронарным атеросклерозом в нашей работе являются данные по взаимосвязи генетического полиморфизма MTHFR с эндофенотипами – патогенетически значимыми количественными признаками.
Полученные в настоящей работе данные представляют, по нашему мнению, значительный интерес в понимании нескольких генетических феноменов:
межпопуляционных различий в характере LD;
структуры генетической компоненты МФЗ с точки зрения сравнительной информативности ассоциативных связей с болезнью на уровне отдельных маркеров и гаплотипов;
функциональной значимости и плейотропного «поля действия» гена MTHFR.
Суммируя результаты настоящего исследования можно заключить, что анализ вариабельности с акцентом на структуру LD в популяциях человека является мощным инструментом, способным внести большой вклад в такие отрасли медико-биологической науки как эволюционная биология человека, функциональная геномика, генетика МФЗ и фармакогеномика.
ВЫВОДЫ 1. Структура LD в гене MTHFR носит популяционно-специфичный характер.
Наиболее сильное сцепление (все SNPs входят в состав одного блока) между исследованными локусами обнаружено в популяциях кетов и южных киргизов.
Тесное сцепление наблюдалось также у бурят. Популяции русских, хантов и северных киргизов характеризуются средним уровнем LD среди всех исследованных групп. Максимальное количество гаплотипических блоков (4) и слабое LD наблюдается в популяциях тувинцев и якутов.
2. В исследованных популяциях наблюдается различная степень гаплотипического разнообразия, тем не менее, во всех выборках обнаружены одинаковые основные гаплотипы (с частотой более 5%), что указывает на возможность общего механизма формирования данных паттернов LD.
3. В изученных популяциях наблюдается различный состав набора tagSNPs, являющийся, следствием вариабельности структуры LD гена MTHFR в исследованных выборках. Наиболее информативно ценными tagSNPs являются rs4846052, rs1801133, rs6541003, rs7533315, rs1801131 и rs3753588.
4. Проведенный филогенетический анализ гаплотипов свидетельствует о схождении всех гаплотипов, наблюдаемых в современных популяциях человека, к одному общему предковому варианту. Значимой роли рекомбинации в генерации генетического разнообразия локуса MTHFR у современного человека не выявлено. Возраст генерации разнообразия по исследованным SNPs гена MTHFR, полученный при анализе филогенетического древа гаплотипов, составляет 314000 ± 135000 лет.
5. Уровень генетической дифференциации изученных популяций по частотам аллелей 12 исследованных SNPs гена MTHFR составил 0,015, а по частотам гаплотипов 0,017. Наибольший вклад в межпопуляционное разнообразие вносят различия по частотам аллелей локусов rs4846052, rs1801133, rs6541003, rs2066462, rs1801131, и rs2274976. Наименьшая степень межпопуляционного разнообразия характерна для rs17375901.
6. Показана ассоциация маркеров rs7533315 (OR=1,60;
95% Cl: 1,08-2,36) и rs2066462 (OR=2,71;
95% Cl: 1,13-6,72) и гаплотипа GCCTTCGCACGC (OR=2,98;
95% CI 1,53-5,88) гена MTHFR с КА. Выявлен один протективный гаплотип - GCCCTCGCCCGC (OR 0,18;
95% CI 0,04-0,69).
7. Характер структуры LD в группе пациентов с КА и контрольной выборке имеет во многом схожие черты: наличие «горячей точки» рекомбинации между rs2066462 и rs1801131, идентичный гаплотипический блок в 3’-области гена.
Тем не менее, в 5’-области гена сцепление более выражено у больных КА.
8. Определена ассоциация генотипов шести SNPs (rs7533315, rs6541003, rs2066462, rs1801131, rs17375901, rs1537516) с вариабельностью содержания в плазме общего холестерина и/или триглицеридов в группе больных КА. С уровнем ЛПВП в данной группе показали корреляцию два полиморфных варианта (rs7533315 и rs2066462). Физиологический механизм подверженности у носителей неблагоприятного гаплотипа блока 2 реализуется через нарушения липидного обмена.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Трифонова Е.А., Степанов В.А. Структура гаплотипов локуса метилентетрагидрофолатредуктазы в якутской популяции // Якутский медицинский журнал. 2009. № 2(26). С. 40-42.
Трифонова Е.А., Спиридонова М.Г., Пузырёв В.П., Степанов В.А.
2.
Структура гаплотипов локуса метилентетрагидрофолатредуктазы:
популяционная специфичность и ассоциация с коронарным атеросклерозом // Медицинская генетика. 2009. № 1(79). С. 39-47.
3. Трифонова Е.А., Спиридонова М.Г., Степанов В.А., Пузырёв В.П. Роль полиморфных вариантов некоторых генов, участвующих в развитии эндотелиальной дисфункции в формировании гестоза // Молекулярная медицина. 2009 № 1. С. 3-8.
4. Трифонова Е.А., Спиридонова М.Г., Степанов В.А.. Генетическое разнообразие и структура неравновесия по сцеплению в локусе метилентетрагидрофолатредуктазы // Генетика. 2008. т.44. № 10. С. 1410 1419.
Спиридонова М.Г., Трифонова Е.А., Фадюшина С.В, Диденко Л.И., 5.
Ерёмина Е.Р., Минайчева Л.И., Назаренко Л.П., Соколова Т.Ю., Агаркова Л.А., Габитова Т.А., Федоренко О.А., Степанов В.А., Пузырёв В.П.
Молекулярно-генетический анализ полиморфных маркеров генов, ответственных за функционирование факторов эндотелиальной системы в связи с осложнённым протеканием беременности // Медицинская генетика.
2007. Т.6. №7. С.38-42.
6. Спиридонова М.Г., Трифонова Е.А, Фадюшина С.В, Минайчева Л.И., Назаренко Л.П., Соколова Т.Ю., Агаркова Л.А., Габитова Н.А., Федоренко О.А., Диденко Л.И., Степанов В.А.. Молекулярно-генетический анализ полиморфных маркеров генов метилентетрагидрофолатредуктазы, эндотелиальной синтазы окиси азота и ангиотензин-превращающего фермента у женщин с осложнённым протеканием беременности // Сибирский медицинский журнал. 2006. № 5. С.17-19.
7. Трифонова Е.А., Степанов В.А. Ассоциация гаплотипов локуса MTHFR с атеросклерозом коронарных артерий // Тез. V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва. 2009. С. 510.
8. Трифонова Е.А., Спиридонова М.Г., Степанов В.А., Пузырёв В.П.
Ассоциация полиморфных вариантов и гаплотипов гена MTHFR с коронарным атеросклерозом // Мат. III Межд. науч.-практ. конф.
«Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины». Ростов-на Дону, 2009. С. 175-176.
9. Trifonova E., Spiridonova M., Stepanov V. Genetic diversity and structure of linkeage disequilibrium in the MTHFR locus // European Human Genetic Conference. May 31 – June 3, Barcelona. Spain. Eur. J. Hum. Genet. 2008. V. 16, Suppl. 2. P. 323.
10. Трифонова Е.А., Спиридонова М.Г., Фадюшина С.В., Гончарова И.А., Минайчева Л.И., Назаренко Л.П., Соколова Т.Ю., Степанов В.А.
Молекулярно-генетический анализ полиморфизмов генов, участвующих в формировании эндотелиальной дисфункции при гестозе // Генетика человека и патология: Сб. науч. Трудов. Под ред. В.П. Пузырева. Томск:
Печатная мануфактура, 2007. Вып. 8. С.124-128.
11. Трифонова Е.А., Спиридонова М.Г., Фадюшина С.В., Степанов В.А.
Ассоциация полиморфных вариантов генов, ответственных за функционирование факторов эндотелиальной системы, с развитием гестоза.
// Мат. VIII конгр. молодых ученых и специалистов. Томск: СибГМУ, 2007.
С. 138 – 139.
12. Спиридонова М.Г., Трифонова Е.А., Ерёмина Е.Р., Минайчева Л.И., Назаренко Л.П., Степанов В.А. Молекулярно-генетическое исследование полиморфного варианта С677Т гена метилентетрагидрофолатредуктазы в бурятских популяциях в связи с гестозами // Мат. науч.-практ. конф.
«Актуальные вопросы профилактической медицины». Улан-Удэ, 2005. С.
103-106.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ДАД - диастолическое артериальное давление САД - систолическое артериальное давление ИБС - ишемическая болезнь сердца ИМТ - индекс массы тела ГГЦ - гипергомоцистеинемия ГЦ - гомоцистеин КА - коронарный атеросклероз ЛПВП - липопротеины высокой плотности ЛПНП - липопротеины низкой плотности ЛПОНП - липопротеины очень низкой плотности МФЗ - мультифакториальное заболевание п.н. - пар нуклеотидов ССЗ - сердечно-сосудистые заболевания ХС - холестерин ТГ - триглицериды т.п.о. - тысяча пар оснований LD (linkage disequilibrium) - неравновесие по сцеплению SNP (single nucleotide polymorphism) - однонуклеотидный полиморфизм MTHFR - 5,10-метилентетрагидрофолатредуктаза tagSNPs (tagging single nucleotide polymorphisms) - таг-метки