Радиозащитные свойства ряда пуриновых соединений
На правах рукописи
АСАДУЛЛИНА Нелли Рустамовна РАДИОЗАЩИТНЫЕ СВОЙСТВА РЯДА ПУРИНОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ 03.01.01 – радиобиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Москва 2012
Работа выполнена в лаборатории изотопных исследований Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, г. Пущино доктор химических наук, профессор Научные руководители:
Брусков Вадим Иванович кандидат биологических наук Гудков Сергей Владимирович доктор медицинских наук, профессор
Официальные оппоненты:
Засухина Галина Дмитриевна доктор биологических наук, профессор Сынзыныс Борис Иванович Федеральное государственное бюджетное
Ведущая организация:
учреждение науки Институт биофизики клетки РАН
Защита диссертации состоится 15 марта 2012 года в _часов на заседании диссертационного совета Д.501.001.65. в Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, г.Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, ауд..
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.
Отзывы просим присылать по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологических факультет, Веселовой Т.В. Факс: (495) 939-11-15.
Автореферат диссертации разослан «» февраля 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Т.В. Веселова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Поиск и изучение новых природных Актуальность проблемы.
радиозащитных соединений, способных модифицировать повреждающие эффекты ионизирующего излучения, обусловленные повреждением биологических макромолекул - ДНК, белков, липидов, которые приводят к патологическим последствиям, являются актуальной проблемой. Известно, что повреждения молекул ДНК являются одной из основных причин пострадиационной гибели животных (Ярмоненко, Вайнсон, 2004).
Воздействие ионизирующего излучения на живые организмы может происходить как за счет непосредственного возбуждения и ионизации макромолекул (прямое действие), так и за счет высокореакционных свободных радикалов, которые образуются в результате радиолиза воды - косвенное действие радиации (Кудряшов, 2004). Около 80% радиационно индуцированных повреждений в клетке являются результатом косвенного действия радиации (Газиев, 1999). Индуцированные радиацией повреждения ДНК приводят к генетически запрограммированному сигнально-регуляторному запуску сложной системы реакций ответа клетки на повреждения. Она сопряжена с изменением экспрессии многих генов: активацией систем антиоксидантной защиты клетки, систем контроля клеточного цикла пролиферации, репарации ДНК, инициации апоптоза и других процессов (Газиев, 2011). Так как свободные радикалы, образующиеся в результате радиолиза воды и других молекул, из-за их высокой реакционной способности являются короткоживущими продуктами, основное направление в области радиационной защиты было связано с поиском и использованием радиопротекторов – веществ, которые нейтрализуют свободные радикалы при введении их в организм непосредственно перед облучением.
В настоящее время известен и хорошо изучен ряд эффективных радиопротекторов, которые проявляют защитные свойства при введении их незадолго до воздействия радиации. Это существенно ограничивает возможности их практического использования и создаёт необходимость разработки радиозащитных средств, защищающих организм от повреждающего воздействия ионизирующей радиации при введении их в организм после облучения.
В середине прошлого столетия было обнаружено, что препараты РНК (Detre, Finch, 1958;
Лучник, 1958) защищали растения и животных от радиационно-индуцированных повреждений и увеличивали выживаемость облученных животных при введении их как до, так и после облучения.
Гидролизаты РНК до уровня мононуклеотидов проявляли аналогичные защитные свойства (Maisin et al., 1959). Позднее было показано, что из всех основных природных рибонуклеозидов, входящих в состав РНК, только инозин и гуанозин обладают ярко выраженными антиоксидантными и радиозащитными свойствами. Причем наиболее эффективные радиозащитные свойства они проявляли при введении их в организм вскоре после облучения (Gudkov et al., 2006;
Gudkov et al., 2009). В связи с этим изучение радиозащитных свойств ряда природных пуриновых соединений, а также механизмов их действия, представленные в данной работе, актуально и связано с потенциальной возможностью использования полученных результатов в практических медицинских целях.
Цель исследования: изучить антиоксидантные и радиозащитные свойства природных пуриновых соединений: ксантозина (Xao), кофеина (1,3,7 триметилксантин, Caf), инозин-5’-монофосфата (IMP) и гуанозин-5’ монофосфата (GMP).
Задачи исследования:
1. Исследовать антиоксидантные свойства данных пуриновых соединений.
2. Изучить их влияние на радиационно-индуцированное образование повреждений ДНК in vitro и in vivo.
3. Определить радиозащитные свойства этих пуриновых соединений и исследовать возможные механизмы их защитного действия.
Научная новизна исследования: Впервые установлено, что пуриновые соединения: Xao, Caf, IMP и GMP проявляют существенные антиоксидантные свойства, значительно уменьшая радиационно-индуцированный выход перекиси водорода и гидроксильных радикалов в водных растворах и образование 8-оксогуанина (7,8-дигидро-8-оксогуанина, 8-ОГ) в ДНК под действием рентгеновского излучения in vitro. В работе впервые показано, что исследуемые пуриновые соединения проявляют выраженные радиозащитные свойства, увеличивая выживаемость мышей при внутрибрюшинном введении их после радиационного воздействия в летальной дозе 7 Гр. Показано, что фактор изменения дозы (ФИД) для этих пуриновых соединений равен примерно 1,2. В работе установлено, что введение этих пуриновых соединений стимулирует процессы кроветворения, увеличивая количество лейкоцитов и тромбоцитов в периферической крови облученных животных и нормализуя гемопоэз в пострадиационный период. Установлено, что исследуемые соединения стимулируют ускоренное пострадиационное восстановление повреждений ДНК при введении их как до, так и в существенно большей степени после облучения мышей. Они уменьшают процентное содержание полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ), содержащих микроядра (МЯ), в костном мозге животных и уровень деградации ДНК в клетках тимуса мышей, подвергнутых воздействию рентгеновского излучения. Впервые установлено, в системе in vitro нейтрализуют что данные пуриновые соединения долгоживущие активные формы бычьего сывороточного альбумина.
Научно-практическая ценность работы: Впервые установлено, что исследуемые пуриновые соединения проявляют антиоксидантные свойства in vitro и in vivo и могут быть использованы как биологически активные добавки, препятствующие патологическим последствиям окислительного стресса.
Впервые показано, что исследуемые пуриновые соединения проявляют радиозащитные свойства при введении их животным вскоре после воздействия рентгеновского излучения. Таким образом, данные пуриновые соединения могут рассматриваться как потенциально перспективные профилактические и терапевтические средства для уменьшения патологических эффектов, индуцированных воздействием ионизирующего излучения на организм млекопитающих и человека.
Основные положения, выносимые на защиту:
Пуриновые соединения: Xao, Caf, IMP и GMP в системе in vitro 1.
проявляют антиоксидантные свойства.
Данные пуриновые соединения проявляют радиозащитные свойства in 2.
vivo: увеличивают выживаемость облученных животных, стимулируют кроветворение у облученных мышей в пострадиационный период и пострадиационное восстановление повреждений ДНК при введении пуриновых соединений мышам как до, так и после облучения.
3. Обоснование возможных механизмов действия исследованных пуриновых соединений и применения их как потенциально перспективных профилактических и терапевтических радиозащитных средств.
Апробация работы: Материалы диссертации были представлены на международных и 9 российских конференциях: XI и XII Межд. научно практическая конференция «Человек и космос» (Днепропетровск 2009, 2010), 14 и 15-я Межд. школа-конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино 2010, 2011), IX Межд. симпозиум «Биологические механизмы старения» (Харьков 2010), VIII Межд. конференция «Биоантиоксидант» (Москва 2010), 38th Annual Meeting of the European Research Society (Stockholm 2010), III Всероссийской конгресс с межд. участием «Симбиоз-Россия 2010» (Нижний Новгород 2010), XVIII Межд.научная конференция «Ломоносов 2011» (Москва 2011), конференция с международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии» (Санкт-Петербург 2011), 38-я научной конференция студентов (Самара 2007), 34 Самарская областная студенческая научная конференция (Самара 2008), конференция «90-летие создания Института биофизики в России (Пущино 2009), конференция «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Москва 2009), «VIII и IX Конференция молодых ученых, специалистов и студентов» посвященная Дню космонавтики (Москва 2009, 2010), конференция «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (Пущино 2010), III Евразийский конгресс по медицинской физике «Медицинская физика 2010» (Москва 2010), VI Съезд по радиационным исследованиям (Москва 2010).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 25 печатных работ, в том числе 5 статей в рецензируемых журналах, из которых 4 статьи в изданиях рекомендованных ВАК, и 20 статей в сборниках и в тезисах научных конференций.
Структура и объем диссертации: диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, заключения, экспериментального исследования (материалов и методов исследования), результатов исследования и их обсуждения, общего заключения, выводов, списка используемых сокращений и обозначений, списка цитируемой литературы (316 источников). Работа иллюстрирована 16 рисунками и содержит 10 таблиц.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Экспериментальные исследования выполнены на 6-ти Животные.
недельных самцах белых мышей аутбредной линий SHK массой 18-22 г.
Животных содержали в стандартных условиях вивария ИТЭБ РАН не более чем по 10 мышей в клетке. Работа с животными проводилась согласно рекомендациям Комиссии по биоэтике ИТЭБ РАН.
Пуриновые соединения. В работе использовали Xao, Caf, IMP и GMP (Sigma, США) в концентрациях 0,02, 0,05, 0,1, 1 мМ в 1 мМ фосфатном буфере рН=7,4 для экспериментов in vitro и в концентрации 5 мМ в 0,14 М растворе NaCl для экспериментов in vivo. Мышам пуриновые соединения вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 45 мг/кг.
Воздействие ионизирующего излучения. Облучение проводили на рентгеновской терапевтической установке РУТ-15 (Мосрентген, Россия).
Животных и водные растворы облучали при мощности 1 Гр/мин (фокусное расстояние 37,5 см, ток 20 мА, напряжением 200 кВ), раствор ДНК при мощности 4,5 Гр/мин (фокусное расстояние 19,5 см, ток мА, напряжение 200 кВ).
Определение концентрации перекиси водорода в водных растворах.
Использовали высокочувствительный метод усиленной хемилюминесценции в системе люминол–4-йодофенол–пероксидаза хрена (Брусков и др., 2001).
Пуриновые соединения (0,02-1мМ) добавляли в раствор непосредственно перед облучением. Регистрацию величины хемилюминесценции осуществляли с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика “Бета-1” (СССР), работающего в режиме счета одиночных фотонов.
Определение Определение продукции гидроксильных радикалов.
концентрации гидроксильных радикалов осуществляли с помощью их реакции с кумарин-3-карбоновой кислотой (ККК), продукт гидроксилирования которой – 7-ОН-ККК – является удобным флуоресцентным зондом для определения образования этих радикалов (Черников, Брусков, 2002). Пуриновые соединения (0,02-1мМ) добавляли в раствор ККК непосредственно перед облучением.
Интенсивность флуоресценции измеряли на спектрофлуориметре SFM 25A (“Kontron Instruments”, Италия) при ex = 400 нм, em = 450 нм в зеркальной кварцевой кювете при комнатной температуре (Gudkov et al., 2009).
Иммуноферментный анализ по определению содержания 8 оксогуанина в ДНК. Для количественного определения 8-оксогуанина в ДНК использовали иммуноферментный анализ с применением моноклональных антител, специфичных к 8-ОГ. Экспериментальные процедуры подробно описаны ранее (Брусков и др., 1999, Bruskov et al., 2002).
Микроядерный тест. Величину цитогенетических повреждений в клетках костного мозга мышей определяли по появлению ПХЭ, содержащих МЯ.
Мышей умерщвляли методом цервикальной дислокации через 28 ч после облучения. Гистологические препараты готовили и окрашивали по стандартной методике с модификациями, связанными с растворением клеточного материала. Подсчет ПХЭ, содержащих МЯ, осуществляли с помощью светового микроскопа с иммерсионным объективом при увеличении (Карп и др., 2010).
Тест на выживаемость. Выживаемость мышей после воздействия рентгеновского излучения определяли ежедневно в течение 30 сут. Пуриновые соединения (5 мМ) вводили внутрибрюшинно мышам по 0,5 мл за 15 мин до облучения или через 15 мин, 3, 5 или 8 ч после облучения. Контролем служили две группы мышей, инъецированные изотоническим раствором NaCl и облученные в той же дозе или не подвергавшиеся облучению.
Подсчет форменных элементов крови. В группе из 10 животных у пяти, отобранных случайным образом, было подсчитано количество форменных элементов периферической крови, а затем эти результаты были усреднены. В конце эксперимента, если число выживших мышей в группе было меньше пяти, кровь для подсчета забиралась у всех оставшихся животных. Образцы периферической крови брались из хвостовой вены. Все экспериментальные процедуры подробно описаны ранее (Gudkov et al., 2009).
Мышей умерщвляли методом Проточная цитофлуориметрия.
цервикальной дислокации через 22 ч после облучения. Клетки тимуса выделяли, охлаждая их на льду, и помещали в раствор для выделения. Далее все процедуры осуществляли в соответствии с протоколом Ormerod (2000).
Измерение проводили на цитофлуориметре Partec PAS III (Германия).
Измерение индуцированной рентгеновским излучением Данный метод позволяет хемилюминесценции белковых растворов.
определить количество образующийся в растворе долгоживущих активных форм белка. Измерение индуцированной хемилюминесценции раствора БСА проводили с помощью хемилюминометра Биотокс 7А-M (Россия). БСА (0,1%) растворяли в 20 мМ Трис-HCl буфере, рН 8,0. Пуриновые соединения добавляли к раствору белка через 1 ч после облучения в конечной концентрации 0,1 мМ.
Статистический анализ. Средние значение и величина стандартной ошибки были рассчитаны для большинства результатов. Средние значения в экспериментальных группах сравнивали с контрольной группой, используя «U» критерий теста Манна-Уитни или непарный t-критерий Стьюдента. В экспериментах на выживание различия между группами сравнивались по точному критерию Фишера. При р 0,05 разница считалась статистически значимой.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние пуриновых соединений на радиационно-химический выход АФК в водных растворах и образование 8-оксогуанина в ДНК, индуцированные рентгеновским излучением in vitro.
Влияние Xao, Caf, IMP и GMP (0,02-1 мМ) на радиационно-химический выход перекиси водорода при воздействии рентгеновского излучения в дозе Гр представлено на рис. 1. Все исследуемые пуриновые соединения уменьшали выход перекиси водорода, в концентрации соединений 1 мМ на 50-75% относительно контроля. Антиоксидантные свойства исследуемых соединений в концентрации 1 мМ уменьшаются в ряду: Xao GMP IMP Caf.
Рис. 1. Влияние Xao, Caf, IMP и GMP (0,02-1мМ) на генерацию перекиси водорода в водном растворе при действии рентгеновского излучения ( Гр) (М ± m, n=3, *- p 0,05).
Значения концентраций представлены в логарифмическом масштабе.
Рис. 2. Влияние Xao, Caf, IMP и GMP (0,02-1мМ) на генерацию гидроксильных радикалов в фосфатном буфере (20 мМ, рН=6,8) при действии рентгеновского излучения (7 Гр) (М ± m, n=3, *- p 0,05). Значения концентраций представлены в логарифмическом масштабе.
Исследовано влияние пуриновых соединений (0,02-1 мМ) на радиационно индуцированный (7 Гр) выход гидроксильных радикалов (рис. 2). Все исследуемые пуриновые соединения уменьшают образование гидроксильных радикалов на 55-80% относительно контроля, причем защитные свойства уменьшаются в ряду (в концентрации 1 мМ): Caf IMP = GMP Xao.
Рис. 3. Влияние Xao, Caf, IMP и GMP (0,02-1мМ) на образование 8-оксогуанина в ДНК in vitro при действии рентгеновского излучения ( Гр). (М ± m, n=6, *- p 0,05).
Значения концентраций представлены в логарифмическом масштабе.
Методом неконкурентного иммуноферментного анализа исследовано влияние Xao, Caf, IMP и GMP в диапазоне концентраций 0,02-1 мМ на образование 8-оксогуанина в ДНК спермы лосося, индуцированное воздействием рентгеновского излучения в дозе 7 Гр, in vitro. Полученные данные представлены на рис. 3. Количество 8-оксогуанина, образовавшегося в ДНК под воздействием рентгеновского облучения, линейно зависит от дозы.
Все исследуемые соединения существенно уменьшают образование 8 оксогуанина в ДНК в концентрации 1 мМ на 50-85%, защитные свойства снижаются в ряду: Caf IMP Xao GMP.
Таким образом, показано, что ксантозин, кофеин, IMP и GMP проявляют существенные антиоксидантные свойства, уменьшая радиационно индуцированный выход таких АФК, как перекиси водорода и гидроксильных радикалов в водных растворах, а также образование 8-оксогуанина в ДНК in vitro. Антиоксидантные свойства исследуемых пуриновых соединений могут проявляться за счет их низкого окислительно-восстановительного потенциала (Faraggi et al., 1996;
Pan et al., 2001;
Kim et al., 2000), благодаря чему они могут легко окисляться в присутствии свободных радикалов, образуемых в процессе радиолиза воды.
2. Влияние ксантозина, кофеина, IMP и GMP при введении до воздействия облучения на образование повреждений ДНК in vivo.
Поскольку Xao, Caf, IMP и GMP проявляют антиоксидантные свойства in vitro (рис. 1, 2, 3), можно предположить, что исследуемые пуриновые соединения способны проявлять антиоксидантные свойства in vivo. Для проверки данного предположения с помощью микроядерного теста исследовано влияние Xao, Caf, IMP и GMP на процентное содержание ПХЭ с МЯ в красном костном мозге мышей при их внутрибрюшинном введении за мин до облучения в дозе 1,5 Гр. Полученные результаты представлены в Таблице 1.
Таблица 1. Влияние пуриновых соединений при внутрибрюшинном введении (~ 45 мг/кг) за 15 мин до воздействия рентгеновского облучения в дозе 1,5 Гр на процентное содержание ПХЭ с МЯ в костного мозга мышей. (М ± m, *- p 0,05).
Количество Количество Количество ПХЭ Воздействие ПХЭ животных ПХЭ с МЯ, % с МЯ 10188 Контроль 0 Гр 5 0,53 0,06* Контроль 1,5 Гр 5 10532 513 4,88 ± 0, Xao + 1,5 Гр 5 10312 372 3,61 ± 0,31* Caf + 1, 5 Гр 5 10398 372 3,58 ± 0,12* IMP +1,5 Гр 5 10055 171 1,71 ± 0,09* GMP + 1,5 Гр 5 10306 358 3,48 ± 0,25* После облучения животных процент ПХЭ с МЯ увеличился в ~ 9 раз от 0,53%, при отсутствии воздействия до 4,88% при 1,5 Гр. При введении пуриновых соединений интактным животным не наблюдалось достоверного изменения процента ПХЭ с МЯ. При введении пуриновых соединений животным до облучения процент ПХЭ, содержащих МЯ, уменьшается на 30-60% по сравнению с облученным контролем. Защитные свойства пуриновых соединений уменьшаются к ряду IMP GMP Caf Xao. Появление таких радиационно-индуцированных повреждений, как МЯ, отражает образование разрывов ДНК активными формами кислорода и дефектов их репарации (Ярмоненко, Вайнсон, 2004). Вероятно, что исследуемые пуриновые соединения уменьшают образование повреждений ДНК при введении их до облучения за счет своих антиоксидантных свойств.
3. Влияние пуриновых соединений на выживаемость облученных животных.
Б А Г В Рис. 4. Влияние Xao (А), Caf (Б), IMP (В) и GMP (Г) (~45 мг/кг) на выживаемость мышей при внутрибрюшинном введении до или после воздействия рентгеновского излучения в дозе 7 Гр. Каждая экспериментальная группа состояла из 30-90 мышей.
Исследовано влияние Xao, Caf, IMP и GMP на выживаемость мышей при внутрибрюшинном однократном введении их за 15 мин до или после воздействия рентгеновского излучения в летальной дозе 7 Гр (рис. 4). В группе контрольных облученных мышей, которым вводили изотонический раствор, средняя продолжительность жизни составила 6 сут, а максимальное время дожития 13 сут. Введение пуриновых соединений до воздействия облучения в летальной дозе не оказало существенного защитного эффекта. Так средняя продолжительность жизни мышей составила 10 сут, а максимальное время дожития в среднем составило 15 сут. Существенный радиозащитный эффект наблюдается при введении пуриновых соединений после облучения. В этом случае при введении Xao (А), Caf (Б), GMP (В) и IMP (Г) приблизительно 30%, 45%, 50% и 35% животных оставались живыми в течение 30 сут после облучения, соответственно, при 100% гибели в контрольной группе облученных животных. Выживаемость животных уменьшается при введении пуриновых соединений в ряду: IMP Caf GMP Xao.
Рис. 5. Влияние IMP (~ мг/кг) на выживаемость мышей при внутрибрюшинном введении через 15 мин, 3, или 8 ч после воздействия рентгеновского излучения в дозе 7 Гр. Каждая экспериментальная группа состояла из 20-90 мышей.
Исследована зависимость защитного эффекта от времени введения пуриновых соединений мышам (через 15 мин, 3, 5 или 8 ч). Показано, что наибольший радиозащитный эффект наблюдается при введении IMP через 15 мин после облучения (рис. 5). Данные представлены только для IMP, поскольку: для этого соединения наблюдалась максимальная выживаемость облученных животных и для Xao, Caf, GMP наблюдалась сходная зависимость защитного эффекта от времени введения пуриновых соединений животным.
Исследована зависимость защитного эффекта от вводимой концентрации соединений (15, 45, 90 мг/кг). В дополнительных экспериментах было показано, что при увеличении концентрации пуриновых соединений от 15 до 45 мг/кг защитный эффект увеличивается, при увеличении концентрации до 90 мг/кг не наблюдалось дальнейшего достоверного увеличения радиозащитного эффекта.
А Б В Г Рис. 6. Влияние Xao (А), Caf (Б), IMP (В) и GMP (Г) (~ 45 мг/кг) на выживаемость мышей при внутрибрюшинном введении через 15 мин после облучения. График представлен в координатах доза – смертность пробит. На каждую точку на графике приходилось не менее 20 мышей.
Кроме того, концентрация пуриновых соединений 45 мг/кг, применяемая в работе, превышает внутриклеточную и сывороточную концентрации в ~ 20 раз и не является токсичной для мышей (Traut, 1994;
Lecka et al., 2010;
Sigma Aldrich MSDS, 2011;
Lewis, 1989). В связи с этим в данной работе использовалась концентрация исследуемых соединений 45 мг/кг.
Для определения фактора изменения дозы, исследована зависимость защитного эффекта пуриновых соединений от дозы излучения в диапазоне доз 5-8 Гр для 30-тидневного теста на выживаемость мышей (рис. 6). Для мышей, которым вводили изотонический раствор через 15 мин после облучения, ЛД50/ (ЛД50/30 - дозы вызывающие 50% смертность в течение 30 сут) составила 5,8 Гр.
После введения Xao (А), Caf (Б), IMP (В) и GMP (Г) ЛД50/30 увеличился до 6,7, 6,9, 7,1 и 6,8 Гр, соответственно. Фактор изменения дозы, который рассчитывается как отношение ЛД50/30 доз в присутствии и в отсутствие радиозащитного соединения - составляет для исследуемых пуриновых соединений 1,22 – IMP, 1,20 – Caf, 1,17 – GMP, 1,16 – Xao.
4. Возможные механизмы радиозащитного действия пуриновых соединений при введении их после воздействия рентгеновского излучения.
Радиозащитный эффект пуриновых соединений может быть связан с возможностью влияния на процессы пострадиационного восстановления критических (наиболее радиочувствительных) органов и тканей, репарацию лучевых повреждений, а также на нейтрализацию долгоживущих активных форм белка, которые способны генерировать вторичные АФК в течение длительного времени после облучения in vivo.
Рис. 7. Влияние Xao, Caf, IMP и GMP при внутрибрюшинном введении (~ 45 мг/кг) через 15 мин после воздействия рентгеновского облучения в дозе 7 Гр на количество лейкоцитов в периферической крови мышей. Каждая точка состояла из 2-10 животных (М ± m, *- p 0,05). Ось ординат представлена в логарифмическом масштабе.
Известно, что в диапазоне доз от 3-4 до 10 Гр критическими системами, нарушение которых определяет летальный исход мышей, при действии радиации - являются системы кроветворения и пищеварения. Поскольку в течение экспериментов на выживаемость у подавляющего большинства животных отсутствовали признаки диареи, то было предположено, что смерть мышей наступает в результате костномозгового синдрома. Результаты, полученные при проведении некропсии, подтвердили данное предположение.
Исследовано влияние Xao, Caf, IMP и GMP на количество лейкоцитов в периферической крови мышей, при введении после воздействия рентгеновского излучения (рис. 7). Количество лейкоцитов в группе необлученных животных практически не изменялось на всем протяжении эксперимента. Во всех группах облученных животных регистрировалось уменьшение количества лейкоцитов вплоть до 8 сут. В контрольной группе животных количество лейкоцитов уменьшалось более чем на ~90%, относительно интактных мышей, и существенно не увеличилось вплоть до смерти. В группах с введением пуриновых соединений количество лейкоцитов, начиная с 11 сут эксперимента начало увеличиваться и к 30-м сут эксперимента составило 65-80% по отношению к необлученному контролю.
Рис. 8. Влияние Xao, Caf, IMP и GMP при внутрибрюшинном введении (~ 45 мг/кг) через 15 мин после воздействия рентгеновского облучения в дозе 7 Гр на количество гранулоцитов в периферической крови мышей. Каждая точка состояла из 2-10 животных (М ± m, *- p 0,05).
Исследовано влияние пуриновых соединений при внутрибрюшинном введении на количество гранулоцитов в периферической крови облученных мышей (рис. 8). Количество гранулоцитов в группе необлученных животных практически не изменялось на всем протяжении эксперимента. Изменение количества гранулоцитов в группах облученных животных схоже с изменением количества лейкоцитов. В группе облученного контроля количество гранулоцитов уменьшилось на ~ 95% относительно необлученного контроля и не изменилось вплоть до смерти мышей. В группе животных, которым вводились Xao, Caf, IMP и GMP количество гранулоцитов с 11 сут начало постепенно увеличиваться и составило к 30-м сут 70-90% по отношению к необлученному контролю.
Тромбопения, индуцированная радиацией, играет значительную роль в нарушении прочности капилляров и возникновении кровотечений, что способствует проникновению бактерий в кровь и развитию инфекции (Кудряшов, 2004). Влияние пуриновых соединений при внутрибрюшинном введении после воздействия рентгеновского излучения на количество тромбоцитов в периферической крови мышей представлено на рис. 9.
Рис. 9. Влияние Xao, Caf, IMP и GMP при внутрибрюшинном введении (~ 45 мг/кг) через 15 мин после воздействия рентгеновского облучения в дозе 7 Гр на количество тромбоцитов в периферической крови мышей. Каждая точка состояла из 2-10 животных.
(М ± m, *- p 0,05).
В группе необлученных животных количество тромбоцитов практически не изменялось на всем протяжении эксперимента. В группе облученных контрольных животных количество тромбоцитов к 8-м сут снизилось на ~ 80% относительно количества тромбоцитов в периферической крови интактных мышей и не увеличилось до смерти животных. В группе животных, получивших Xao, Caf, IMP и GMP после облучения, количество тромбоцитов к 30-м сут составляло 70-85% по сравнению с необлученным контролем.
Период наибольшей лейкопении и тромбоцитопении у контрольных облученных мышей приходится на 8-13 сут, что коррелирует с максимумом летальности животных в этот период.
Известно, что основными причинами гибели клеток при воздействии ионизирующего излучения являются необратимые повреждения молекулы ДНК. В связи с этим с помощью микроядерного теста исследовано влияние ксантозина, кофеина, IMP и GMP на процентное содержание ПХЭ с МЯ в красном костном мозге мышей при их внутрибрюшинном введении через мин после облучения (1,5 Гр). Образование МЯ является основным биомаркером двунитевых разрывов цепи ДНК (Газиев, 1999).
Таблица 2. Влияние Xao, Caf, IMP и GMP при внутрибрюшинном введении (~45 мг/кг) через 15 мин после воздействия рентгеновского облучения в дозе 1,5 Гр на процентное содержание ПХЭ с МЯ в костного мозга мышей. (М ± m, *- p 0,05).
Количество Количество Количество Воздействие ПХЭ ПХЭ с МЯ, % животных ПХЭ с МЯ 10188 Контроль 0 Гр 5 0,53 0,06* Контроль 1,5 Гр 5 10532 513 4,88 ± 0, 1,5 Гр + Xao 5 10312 319 3,10 ± 0,30* 1,5 Гр + Caf 5 10398 252 2,43 ± 0,12* 1,5 Гр + IMP 5 10055 149 1,48 ± 0,09* 1,5 Гр + GMP 5 10306 263 2,56 ± 0,25* Полученные результаты представлены в Таблице 2. Показано, что после облучения животных в дозе 1,5 Гр процент ПХЭ с МЯ увеличился в ~ 9 раз после воздействия рентгеновского излучения. При введении исследуемых соединений необлученным животным не наблюдается достоверного изменения процента ПХЭ с МЯ. При введении Xao, Caf, IMP и GMP животным после воздействия ионизирующего излучения процентное содержание ПХЭ с МЯ, уменьшилось на ~40-70% относительно облученного контроля. Радиозащитные свойства пуриновых соединений уменьшаются в ряду: IMP Caf GMP Xao.
Известно, что в результате действия облучения, помимо образования хромосомных аберраций и микроядер происходит деградация ДНК (Umansky S.
et al., 1982). С помощью метода проточной цитофлуориметрии (Ormerod, 2000) исследовало влияние пуриновых соединений при внутрибрюшинном введении после облучения на степень деградации ДНК в клетках тимуса мышей (рис. 10).
Рис. 10. Влияние Xao, Caf, IMP и GMP при внутрибрюшинном введении (~ 45 мг/кг) через 15 мин после воздействия рентгеновского облучения в дозе 7 Гр на степень деградации ДНК в клетках тимуса мышей. Каждая группа состояла из 4- животных (М ± m, n=3, *- p 0,05).
Внутрибрюшинное введение исследуемых соединений необлученным животным не оказало существенного эффекта на уровень поврежденности ДНК в клетках тимуса. В контрольной группе облученных животных процент деградированной ДНК в клетках увеличился более чем в 6 раз. При введении пуриновых соединений процент деградации ДНК уменьшается на 20-35% относительно группы облученных контрольных животных. В результате эффект пуриновых соединений уменьшается в ряду Xao IMP GMP Caf.
Помимо короткоживущих АФК, индуцируемых ионизирующим излучением, в клетках и в растворах различных белков образуются долгоживущие активные формы белков (ДАФБ) (главным образом в виде пероксильных радикалов и гидропероксидов) (Kumagai, 2003;
Гудков и др., 2007).
Влияние Рис. 11.
ксантозина, кофеина, IMP и GMP в концентрации 0,1 мМ на нейтрализацию долгоживущих активных форм бычьего сывоточного альбумина в течение 3,5 ч после облучения в дозе 7 Гр.
Фоновые значения хемилюминесценции вычтены из полученных результатов (М ± m, n=4, * p 0,05).
Эти активные формы белков, как было показано недавно, способны продлять окислительный стресс в организме млекопитающих путем генерации активных форм кислорода АФК (1О2, НО2•, Н2О2 и ОН•) в течение длительного (до ~ 5 ч) времени (Гудков и др., 2010). Исследовано влияние Xao, Caf, IMP и GMP (0,1 мМ) на нейтрализацию долгоживущих активных форм белков, индуцированных воздействием рентгеновского излучения. Полученные данные представлены на рис. 11. Показано, что уже через 30 мин после добавления пуриновых соединений наблюдается снижение уровня долгоживущих белковых радикалов. Так через 3,5 ч инкубации пуриновые соединения уменьшали количество долгоживущих активных форм БСА на 30-75% относительно контроля. Таким образом, антиоксидантные свойства уменьшаются к ряду Xao Caf GMP IMP.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Одним из механизмов радиозащитного действия исследованных пуриновых соединений при введении их в организм млекопитающих вскоре после воздействия рентгеновского облучения может быть нейтрализация долгоживущих активных форм белков, индуцируемых ионизирующим излучением. Эти активные формы белков, как было показано недавно (Гудков и др., 2010), способны продлять окислительный стресс в организме млекопитающих путем генерации активных форм кислорода в течение длительного времени. Нейтрализация этого процесса за счет антиоксидантных свойств данных пуриновых соединений может быть эффективным способом противодействия развитию окислительного стресса. При этом не исключаются и другие возможные механизмы: комплексное системное воздействие этих соединений на процессы, связанные с сигнально-регуляторной ролью АФК в клетках, воздействие пуриновых соединений на некоторые пуриновые рецепторы и включение клеточных механизмов антиоксидантной защиты и репарационных процессов.
Важно подчеркнуть, что радиозащитный эффект достигается даже при однократном введении этих соединений. Не исключено, что еще более выраженные радиозащитные свойства могут быть достигнуты путем неоднократного дополнительного введения этих соединений в организм после воздействия облучения. Таким образом, данные пуриновые соединения могут рассматриваться как потенциально перспективные профилактические и терапевтические средства для устранения рисков патологического воздействия ионизирующего излучения на организм млекопитающих и человека. В настоящее время разработка и использование таких средств весьма актуальны в связи с необходимостью защиты населения в случае угрозы осуществления радиационного терроризма и возникновения радиационных аварий.
ВЫВОДЫ 1. Пуриновые соединения: ксантозин, кофеин, IMP и GMP в диапазоне концентраций 0,02-1 мМ проявляют антиоксидантные свойства in vitro.
Они существенно уменьшают образование перекиси водорода и гидроксильных радикалов, индуцированное рентгеновским излучением в водных растворах, и предотвращают образование 8-оксогуанина основного биомаркера окислительных повреждений в ДНК. Ксантозин, кофеин, IMP и GMP в системе in vitro нейтрализуют долгоживущие активные формы бычьего сывороточного альбумина.
2. Исследуемые пуриновые соединения проявляют выраженные радиозащитные свойства, увеличивая выживаемость мышей при внутрибрюшинном введении после радиационного воздействия в летальной дозе 7 Гр. Фактор изменения дозы при таком введении составляет величину 1,2. Введение этих пуриновых соединений стимулирует процессы кроветворения, увеличивая количество лейкоцитов и тромбоцитов в периферической крови облученных животных в пострадиационный период.
3. Исследуемые соединения стимулируют пострадиационное восстановление повреждений ДНК при введении их как до, так и, что более существенно, после облучения, уменьшая процентное содержание ПХЭ с МЯ в костном мозге и деградацию ДНК в клетках тимуса мышей, подвергнутых радиационному воздействию.
4. Данные пуриновые соединения можно рассматривать как потенциально перспективные профилактические и терапевтические средства для уменьшения рисков патологического воздействия ионизирующего излучения на организм млекопитающих и человека.
СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Gudkov S., Karp O., Shtarkman I., Asadullina N., Garmash S., Andrievsky G., Nedzvetsky V., Tykhomyrov A. DNA-protective and radioprotective effects of hydrated C60 fullerene // Physics of the Alive. 2009. Vol. 17, p.82-88.
2. Asadullina N.R., Usacheva A.M., Smirnova V.S., Gudkov S.V. Antioxidative and radiation modulating properties of guanosine 5’-monophosphate // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2010. Vol. 29(10), p. 786-799.
3. Асадуллина Н.Р., Гудков С.В., Брусков В.И. Антиоксидантные свойства ксантозина при воздействии рентгеновского излучения // Фундаментальные исследования. 2011. №10 (1), с. 22-25.
4. Асадуллина Н.Р., Гудков С.В., Брусков В.И. Кофеин модифицирует эффекты рентгеновского излучения при воздействии на мышей после облучения, проявляя радиозащитные свойства // Доклады РАН. 2012. Т.
442, №3, с. 405-408.
5. Гудков С.В., Штаркман И.Н., Карп О.Э., Ассадулина Н.Р., Гармаш С.А., Черников А.В., Брусков В.И. Использование рибоксина (инозина) после рентгеновского облучения для защиты клеток крови мышей // Нижегородский медицинский журнал. 2008. №4, с. 18-24.
6. Гудков С.В., Асадуллина Н.Р., Карп О.Э., Гармаш С.А., Штаркман И.Н., Брусков В.И. Антиоксидантные и радиозащитные свойства некоторых пуриновых соединений // Вестник Российской военно-медицинской академии (приложение 1). 2008. № 3, с. 211.
7. Асадуллина Н.Р. Антиоксидантные свойства гуанозина, инозина, ксантозина и гуанозинмонофосфата // Тезисы тридцать восьмой научной конференции студентов, Самара, 2007, с. 67.
8. Асадуллина Н.Р. Гуанозин, инозин, ксантозин и гуанозинмонофосфат как природные антиоксиданты и радиопротекторы // Тезисы докладов XXXIV Самарской областной студенческой научной конференции. Ч.1, Самара, 2008, с. 151.
9. Асадуллина Н.Р. Антиоксидантные и радиозащитные свойства гуанозин 5’-монофосфата // Тезисы конференции «90-летие создания Института биофизики в России». Пущино, 2009, с. 13.
10.Асадуллина Н.Р. Антирадикальные и радиозащитные свойства гуанозин 5’-монофосфата // Тезисы конференции «Фундаментальная наука и клиническая медицина», Москва, 2009, с. 24.
11.Асадуллина Н.Р., Гудков С.В., Брусков В.И.. Гуанозин-5’-монофосфат уменьшает тяжесть радиационной лейко- и тромбопении и увеличивает выживаемость мышей подвергнутых воздействию рентгеновского излучения // XI Miжнародна науко-практична конференция «Людина I Космос», Днепропетровск, Украина, 2009, с. 218.
12.Асадуллина Н.Р., Гудков С.В., Брусков В.И. Гуанозин- 5’-монофосфат проявляет антирадикальные и радиозащитные свойства // Тезисы VIII «Конференции молодых ученых, специалистов и студентов» посвященная Дню космонавтики, Москва, 2009, с. 5.
13.Асадуллина Н.Р., Гудков С.В., Брусков В.И. Инозин- 5’-монофосфат как антиоксидант и радиопротектор // Тезисы 14-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология- наука XXI века». Пущино, 2010, с. 103.
14.Асадуллина Ксантозин проявляет антиоксидантные и Н.Р.
радиопротекторные свойства. Труды конференции Экспериментальная и теоретическая биофизика ’10, Пущино, 2010, с. 12.
15.Гудков С.В., Брусков В.И. Возможность Асадуллина Н.Р., использования ряда пуриновых соединений в качестве геропротекторов // Тезисы IX Международного симпозиума «Биологические механизмы старения», Харьков, Украина, 2010, с. 69.
16.Асадуллина Н.Р. Пуриновое производное проявляет радиозащитные свойства. // XII Miжнародна науко-практична конференция «Людина I Космос», Днепропетровск, Украина, 2010, с. 241.
17.Асадуллина Н.Р., Гудков С.В., Брусков В.И. Инозин- 5’-монофосфат проявляет радиозащитные свойства. Сборник тезисов III Евразийского конгресса по медицинской физике «Медицинская физика 2010», Москва, 2010, с. 428-430.
18.Асадуллина Н.Р., Гудков С.В., Брусков В.И. Антиоксидантные свойства некоторых пуриновых соединений // Тезисы докладов VIII Международной конференции «Биоантиоксидант», Москва, 2010, с.28.
19.Asadullina NR. Inosine-5’-monophosphate as a radioprotective agent // 38th Annual Meeting of the European Research Society. Stockholm, Sweden, 2010, p. 206.
20.Асадуллина Н.Р., Гудков С.В., Брусков В.И. Антиоксидантные и радиопротекторные свойства инозин-5-монофосфата // Сборник тезисов III Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов «Симбиоз-Россия 2010», Нижний Новгород, 2010, с. 160.
21.Асадуллина Н.Р., Гудков С.В. Гено- и гемопротекторные свойства инозин- 5’-монофосфата // Тезисы IX «Конференции молодых ученых, специалистов и студентов» посвященная Дню космонавтики, Москва, 2010, с. 17.
22.Асадуллина Усачева А.М., Гудков С.В., Брусков В.И.
Н.Р., Радиозащитные свойства инозин- 5’-монофосфата // Тезисы докладов VI Съезда по радиационным исследованиям, Москва, 2010, с. 176.
23.Асадуллина Н.Р., Гудков С.В., Брусков В.И. Ксантозин проявляет радиозащитные свойства при введении его мышам после воздействия рентгеновского излучения // Тезисы 15-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология- наука XXI века».
Пущино, 2011, с. 124.
24.Асадуллина Н.Р., Гудков С.В., Антиоксидантный эффект ксантозина in vitro и in vivo // Материалы XVIII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ-2011», Москва, 2011, с. 33.
25.Асадуллина Н.Р., Гудков С.В., Брусков В.И. Модулирующий эффект кофеина при введении его мышам после воздействия рентгеновского излучения // Тезисы докладов российской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии», Санкт-Петербург, 2011, с. 217.