Характеристика биологических свойств бактерий рода citrobacter при межмикробных взаимодействиях в микросимбиоценозе
1На правах рукописи
Туйгунова Вера Георгиевна ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИЙ РОДА CITROBACTER ПРИ МЕЖМИКРОБНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯХ В МИКРОСИМБИОЦЕНОЗЕ 03.02.03 – «Микробиология»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Оренбург – 2013 2
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учре ждении высшего профессионального образования «Башкирский государствен ный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Научный консультант:
Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, Габидуллин Зайнулла Гайнулинович профессор
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профес сор - Институт клеточного и внутри клеточного симбиоза Уро РАН, заведующая лабораторией Карташова Ольга Львовна доктор медицинских наук, профессор - МБУЗ Роддом №4 г.Уфы, заместитель главного врача Амирова Виктория Радековна
Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Южно-уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Феде рации
Защита состоится «14» ноября 2013 г. в 9-30 часов на заседании диссерта ционного совета Д. 208.066.03. при Оренбургской государственной медицин ской академии по адресу: Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6, в конференц-зале (аудитория №205), телефон: (3532) 40-35-62, факс (3532) 77-24 59, e-mail: [email protected], официальный сайт: http://orgma.ru/.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО ОрГМА Минздрава России
Автореферат разослан «_» 20 г., автореферат и текст объявления размещены на официальном сайте ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Немцева Наталия Вячеславовна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Бактерии рода Citrobacter высокоадаптив ные микроорганизмы, о чем свидетельствует их широкое распространение в окружающей среде и обнаружение в составе различных микросимбиоценозов организма человека, где данный род бактерий является представителем ассо циативной микробиоты. Наряду с другими условно-патогенными бактериями семейства Enterobacteriaceae, Citrobacter spp. способны вызывать оппортунисти ческие инфекции, удельный вес которых в структуре инфекционной патологии человека, в настоящее время имеет тенденцию к неуклонному росту. Представи тели этого рода часто являются этиологической причиной гнойно-воспалительных и токсико-септических процессов, инфекций мочеполового тракта, острых ки шечных, респираторных и внутрибольничных инфекций. При этом выделенные штаммы, как правило, проявляют в определенной степени факторы патогенности и мультирезистентности к широко применяемым антибактериальным препаратам (Страчунский Л.С., Козлов С.Н., 2002, 2004).
С позиции инфекционной симбиологии, популяции микроорганизмов, вступая в сложные взаимоотношения – конкурентные или кооперативные, при заселении различных биотопов макроорганизма формируют специфический микросимбиоценоз, являющийся одним из векторов ассоциативного симбиоза человека (Бухарин О.В. и др., 2006, 2012). Исходя из данной концепции, пато генный потенциал бактерий рода Citrobacter, при формировании симбиотиче ских взаимосвязей с микробиотой, также подвержен изменениям, что может от ражаться на гомеостазе организма человека. В ряде работ отмечены различия экспрессии вирулентных и некоторых персистентных (АЛА и АИА) свойств Citrobacter spp., изолированных при моно- и ассоциированой инфекции (Габи дуллин З.Г. и др. 2006 г., Суфияров Р.С. 2012 г.). Однако отсутствует комплекс ная характеристика патогенного потенциала бактерий рода Citrobacter в ассо циации с другими видами бактерий, представителями доминантной и ассоциа тивной микробиоты, не изучены регуляторные взаимоотношения Citrobacter spp. с доминантной микрофлорой, не определены изменения генетического профиля цитробактера при этих взаимодействиях. Указанные моменты и пре допределили тематическую направленность наших исследований.
Цель и задачи исследования Цель исследования – изучение биологические свойств бактерий рода Ci trobacter при взаимодействии с ассоциативной и доминантной микробиотой че ловека.
Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:
Оценить качественный и количественный состав Citrobacter spp., 1.
изолированных от пациентов с различной патологией (дисбиоз кишечника, инфекции мочеполовой системы, а также гнойно-воспалительные заболевания кожи и мягких тканей).
Определить видовой состав микробиоты, образующей ассоциации 2.
с Citrobacter spp. и провести сравнительную характеристику вирулентных и персистентных свойств цитробактеров при моно- и ассоциированной инфекции.
Изучить особенности персистентных и вирулентных свойств Citro 3.
bacter spp. при воздействии на них метаболитов представителей доминантной и ассоциативной микрофлоры на модели микробиоты дистального отдела толсто го кишечника человека.
Определить внехромосомную генетическую изменчивость Citro 4.
bacter spp. при сокультивировании с ассоциативной микробиотой (на модели взаимодействия со штаммом B. subtilis).
Новизна исследования Представлена комплексная характеристика патогенного потенциала бак терий рода Citrobacter, изолированных из различного клинического материала, при моно- и ассоциированной инфекции. Установлено, что клинические изоля ты Citrobacter spp. обладают набором факторов персистенции (АЛА, АИА, БПО), вирулентности (гемолизины, липолитическая, ДНК-азная активности, токсинопродукция), антибиотикорезистентности, а также способностью обра зовывать ассоциации с условно-патогенной микробиотой человека, определяя формирование патологического микросимбиоценоза.
В экспериментах in vitro определено два типа направленности коммуни кативой активности бактерий при формировании ассоциаций с Citrobacter spp. – синергидный и антагонистический. Представители ассоциативной микробиоты, стимулировали антилизоцимную активность и биопленкообразование C.
freundii, и, напротив, бифидобактерии (доминанты) и лактозопозитивные неге молитические эшерихии (представители нормофлоры), изолированные при эу биозе, ингибировали адаптационную функцию Citrobacter spp.
Установлено, что метаболиты C. freundii, предварительно соинкубиро ванные с культурами бифидобактерий, индуцировали у доминантов усиление антагонистической активности, подавляя АЛА и БПО цитробактеров. Получен ные данные свидетельствуют о том, что бактерии рода Citrobacter распознаются доминантами как «чужеродный» микроорганизм, что может рассматриваться в качестве механизма защитного действия нормофлоры при эубиозе.
Впервые установлены изменения биологических свойств клинических штаммов бактерий рода Citrobacter при их совместном сокультивировании с модельным штаммом Bacillus subtilis 3H, которые проявлялись как на феноти пическом (повышение чувствительности к антибактериальным препаратам, снижение патогенного потенциала), так и на генотипическом уровнях (элими нации плазмид токсигенности).
Научно-практическая значимость Выявленные фенотипические изменения биологических свойств бактерий рода Citrobacter в условиях in vitro и in vivo, а также изменение плазмидного профиля токсигенных штаммов при совместном культивировании с B. subtitlis 3H, расширяют теоретические представления о механизмах межмикробных взаимодействий в микросимбиоценозе при ассоциативном симбиозе человека.
Практическое значение исследований определяется подбором модельных штаммов, обладающих высоким патогенным потенциалом, депонированных в НИИ ГИСК им. Л.А. Тарасевича (патенты РФ № 2293764 и № 2293765). Дан ные культуры используются в работе практических лабораторий и научных уч реждений в качестве модельных штаммов при изучении изменений патогенного потенциала бактерий под влиянием на них различных препаратов, а также в ис следованиях механизмов формирования микросимбиоценозов человека.
Результаты исследований используются в учебном процессе кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Башкирского государственного медицинского университета, в бактериологических лабораториях лечебно профилактических учреждений г.Уфы (Акт внедрения ГБОУ ВПО БГМУ, Акт внедрения № 10 РКБ им. Куватова, Акт внедрения №11 ДРКБ.).
Представленные данные - составная часть темы открытого плана НИР по теме «Молекулярная диагностика инфекций, вызываемых патогенами различных уровней организации» (№ гос. регистрации 01200906698).
Положения, выносимые на защиту 1. Ассоциативная микробиота усиливает вирулентный и персистентный потенциал бактерий рода Citrobacter, способствуя формированию патологиче ского (дисбиотического) микросимбиоценоза.
2. Доминантные микросимбионты - бифидобактерии обладают антаго нистической направленностью воздействия в отношении Citrobacter spp. и спо собны распознавать данный вид бактерий как чужеродный, снижая персистент ный потенциал цитробактеров.
3. Регуляция токсигенности бактерий рода Citrobacter осуществляется на внехромосомном генетическом уровне посредством элиминации плазмиды LТ энтеротоксина под действием B. subtilis.
Апробация работы Материалы диссертации были доложены и обсуждены на Ежегодной междисциплинарной научно-практической конференции стран СНГ (г. С.-Петербург, 2006, 2007 гг.), Всероссийской научно-практической конференции (г. Уфа, 2009 - 2012 гг.) Публикации По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ в журналах, рекомендованных ВАК и 2 патента на изобретение.
Объем и структура диссертационной работы Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста и содер жит введение, обзор литературы, главу с описанием материалов и методов ис следования, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы и указа тель литературы, включающий 87 отечественных и 197 зарубежных источни ков. Иллюстрации представлены 4 таблицами и 14 рисунками.
_СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
: Материалы и методы исследования Материалом для исследований явились 136 клинических штаммов бактерий рода Citrobacter, выделенных от пациентов с дисбиозом кишечника II – III степени, а также с инфекциями урогенитального тракта (уретрит) и гнойно воспалительными заболеваниями кожи и мягких тканей (флегмона, нагноение послеоперационной раны). Из микросимбиоценозов в консорциуме с бактериями рода Citrobacter было изолировано 252 штамма микроорганизмов родов Escherichia, Proteus, Enterobacter, Klebsiella, Hafnia, Staphylococcus, Enterococcus и Candida, являющиеся представителями ассоциативной микробиоты человека.
Среди доминантной микрофлоры, 36 штаммов были представлены Bifidobac terium spp., выделенных из микросимбиоценоза кишечника.
Исследование микробиоценоза кишечника проводили в соответствии с «Методическими рекомендациями по применению бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника» (М., 1986). Бактериологическое исследо вание при гнойной раневой инфекции проводили путем посева гнойного отде ляемого на селективные среды с определением уровня бактериальной обсеме ненности методом секторальных посевов (Биргер О.М., 1982). Выделение мик роорганизмов из мочи при инфекции мочевых путей осуществляли методом секторальных посевов по Gould.
Для выделения облигатно-анаэробных бактерий анаэробные условия соз давали с помощью газогенераторных пакетов “GasPakAnaerobicSystem” (BBL, США) в анаэробной камере “GasPak 150” (BBL, США). Идентификация обли гатно-анаэробных микроорганизмов проводились в соответствии с руково дством «Wadsworth-KTL anaerobic bacteriology manual» (2002). Биохимический профиль факультативно-анаэробных микроорганизмов оценивали с помощью коммерческих тест-систем: "ENTEROtest 24", "STREPTOtest 16", "STAPHYtest 16", "NEFERMtest" (LACHEMA, Чехия) и "API20CAUX" (bioMerieux, Фран ция).
Определяли уровень бактериальной обсемененности (Шапиро А.В., Фельдман Ю.М., 1984), видовой состав возбудителей и их биологические свой ства: плазмокоагулазную, гемолитическую активности по общепринятым мето дикам (Биргер М.О., 1982), липолитическую активность - чашечным методом (Slifkin M., 2000), ДНК-азную активность - по методу PowerD.A., McCuenP.J.
(1988), антилизоцимную (АЛА) и «антиинтерфероновую» (АИА) активности по методикам О.В. Бухарина с соавт. (1999). Образование биоплнок оценивали по способности штаммов бактерий к адгезии на поверхности 96-луночных по листероловых стерильных планшет (O`TooleG., 2000).
Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам проводили методом серийных микроразведений в соответствии с международным стандартом NCCLS (NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards, 1997). Определяли ан тибиотикочувствительность штаммов к широко применяемым в практике антибак териальным препаратам класса -лактамных антибиотиков: группа пенициллинов незащищенных (ампициллин, карбенициллин, амоксициллин) и ингибиторзащи щенных (амоксициллин/клавуланат), группа цефалоспоринов I-IV поколений (це фазолин, цефуроксим, цефотаксим, цефтриаксон, цефепим) группа карбепенемов (имипенем), а также препараты групп аминогликозидов (канамицин, гентамицин, тобрамицин, амикацин), фторхинолонов (ципрофлоксацин, офлоксацин, моксиф локсацин), тетрациклинов (тетрациклин, доксициклин), нитрофуранов (нитрофу рантоин, фуразолидон) и хлорамфеникол (левомицетин).
Адгезивную активность цитробактеров выявляли при постановке реакции гемагглютинации с эритроцитами различных животных и птиц (Габидуллин З.Г., 1998) с количественной оценкой по Брилису В.И. с соавт. (1986).
Токсигенность культур Citrobacter spp. определяли на моделях лигированной петли тонкого кишечника кролика (GianellaR., 1976), на мышах-сосунках и в плантарном тесте (Вартанян Ю.П., 1978).
Модельные эксперименты по изучению регуляции проводили на клини ческих изолятах микроорганизмов и эталонных штаммах бактерий и грибов коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича и Американской коллекции типовых культур микроорганизмов (АТСС). В качестве доминантной микрофлоры были использованы культуры Bifidobacterium spp., а в качестве ассоциантов - микро организмы родов Escherichia, Proteus, Staphylococcus. В качестве эталонных штаммов в работе были использованы культуры Citrobacter frеundii № 255 и Citrobacter diversus № 256 (коллекция штаммов кафедры микробиологии ГБОУ ВПО БГМУ), обладающие комплексом факторов патогенности.
Исследование биологических свойств микроорганизмов в условиях меж микробных взаимодействий проводили при добавлении стерильных суперна тантов (продуктов жизнедеятельности микроорганизмов) микроорганизмов симбионтов в питательный бульон по алгоритму, описанному в ряде работ (Елагина Н.Н., 2001;
Перунова Н.Б., 2003, Иванова Е.В., 2010). Распознавание «свой-чужой» в паре «доминант-ассоциант» микросимбионтов определяли по разработанной методике (Бухарин О.В., Перунова Н.Б., 2011).
Выделение плазмидной ДНК проводилось с помощью стандартных набо ров Plas/miniIsolationKit XL («AppliChem», Германия). Получаемые плазмидные ДНК подвергались агарозному гель-электрофорезу (Маниатис Т. Фрич Э. Сэм брук Дж., 1984). Визуализация результатов разделения нуклеиновых кислот проводилась в проходящем ультрафиолетовом свете с длиной волны 312 нм на установке гель-документирования «VilberLourmat».
Для оценки размера и количества плазмид использовался линейный маркер «100 bp» (ООО «Лаборатория Медиген», Россия) в количестве 1,5 мкг.
Выявление случаев возможной полной утраты плазмид проведено путем рассева микробиологической петлей бульонной культуры микроорганизмов в поздней логарифмической фазе на 1,5% LB-агар с последующим анализом получаемых клонов на наличие выделяемых плазмид.
Статистическая обработка результатов проводилась общепринятыми ме тодами вариационной статистики с определением средней арифметической ва риационного ряда (М), среднего квадратичного отклонения (), средней ошибки средней арифметической (m). Показатель достоверности различий (р) опреде лялась по таблице с использованием критерия Стьюдента (t).
Данные по определению регулирующего влияния экзометаболитов мик роорганизмов-симбионтов на биологические свойства бактерий рода Citrobacter были статистически обработаны непараметрическим методом с применением критерия Манна-Уитни. Разница между сравниваемыми величинами считалась достоверной при значении р0,05.
Результаты исследования и их обсуждение Проведенный анализ видового состава бактерий рода Citrobacter в раз личных биотопах организма человека показал, что среди изолированных штам мов Citrobacter spp., независимо от источника выделения, чаще обнаруживался вид C. freundii (в 75,0 ± 3,9 % случаев), в сравнении с другими видами - C. diversus и С. amolanaticus, которые выявлялись реже - в 16,9 ± 3,3 % и 8,1 ± 2,4 % случаев соответственно.
В зависимости от патологического материала, среди всех выделенных штаммов наибольшая частота встречаемости Citrobacter spp. приходилась на урогенитальных тракт человека (32,4 ± 4,2 % случаев) и дистальный отдел тол стого кишечника (30,1 ± 4,1 %), тогда как при обследовании гнойного отделяемого при раневой инфекции, бактерии данного рода обнаруживались с меньшей часто той: у 22,1 ± 3,7 % и 15,4 ± 3,2 % пациентов соответственно.
Значения показателя микробной обсемененности изолированных штаммов цитробактеров также зависели от источника выделения. Средние значения показателя микробной обсемененности бактерий рода Citrobacter при дисбиозе дистального отдела толстого кишечника составляли 106 КОЕ/г, а при инфекции урогенитального тракта и раневой инфекции - 104 КОЕ/мл.
Установлено, что подавляющее большинство штаммов C. frеundii (в 91, ± 3,0 % случаев) были изолированы в ассоциации с другими видами бактерий, тогда как только в 8,8 ± 3,0 % бактерий данного вида выделялись в виде моно культуры, что было характерно для штаммов урогенитального тракта. Напро тив, культуры C. diversus в 78,3 ± 8,6 % случаев обнаруживались в виде моно культур, С. amolanaticus одинаково выделялись как в ассоциации с микробио той (54,5 ± 15,0 % штаммов), так и в монокультуре (в 45,5 ±15,0 % случаев).
При определении структуры ассоциативной микробиоты обнаружено, что несколько чаще (в 27,2 – 33,8 % случаев) с бактериями рода Citrobacter обнаружи вались коагулазопозитивные стафилококки (S. aureus), протеи (P. vulgaris, P. mirabi lis) и энтерококки (E. faecalis, E. faecium) (p0,05) (рис. 1). Реже в ассоциации с цитробактерами обнаруживались энтеробактеры (18,4 ± 3,5 %), клебсиеллы (14,7 ± 3,0 %), лактозонегативные (13,2 ± 2,9 %) и гемолитические эшерихии (11 ± 2,7 %).
Другие виды бактерий и грибы рода Candida встречались менее чем в 10 % случа ев. В кишечном микросимбиоценозе Citrobacter spp., как правило, обнаруживались при отсутствии или низкой численности (менее 107 КОЕ/г) доминантной микро флоры – бифидобактерий.
Полученные данные свидетельствуют о сохранении лидирующих позиций C.
freundii среди других видов бактерий данного рода, что соотносится с данными ли тературы (Габидуллин З.Г., 2002). Не исключено, что высокая частота обнаружения C. freundii связана с особенностью его биологических свойств (экспрессии факто ров вирулентности и персистенции), которые имеют значение при инфекционном процессе в условиях ассоциативного симбиоза человека (Бухарин О.В., 2007). Кро ме того, образование ассоциаций с условно-патогенной микробиотой позволяет бо лее эффективно осуществлять стратегию выживания ассоциативных микроорга низмов в условиях микросимбиоценоза. В связи с этим, на следующем этапе рабо ты, было произведено сравнение биопрофиля бактерий рода Citrobacter, изолиро ванных из ассоциаций микроорганизмов и в монокультуре.
При определении показателей специфической адгезии, имеющей значение на начальной стадии инфекционного процесса, было установлено, что цитробактеры в ассоциации чаще, в сравнении в монокультурой, проявляли способность адгезиро ваться к эритроцитам цыпленка (80 ±3,6 % против 68,6 ± 4,1 % штаммов). Из об щего числа изолятов, большинство (62,9 ± 4,3 %) культур обладали маннозорези стентной (MR) адгезией и лишь 37,1 ± 4,3 % культур – маннозочувствительной.
Рис 1. – Частота встречаемости бактерий и грибов в ассоциации с Citrobacter spp.
Условные обозначения: * - достоверность различий между группами ассоциантов (p0,05).
Высокая степень MR адгезивной активности (более 5 мкг/мл) наблюда лась у штаммов Citrobacter spp., выделенных при ассоциированных инфекциях, в сравнении с монокультурой. При условном разделении исследуемых штаммов на группы по степени адгезивной активности, оказалось, что чаще (21,7 ± 3,7% случаев) высокие показатели адгезии (в среднем 5,8 ± 0,2 ед.) имели культуры, изолированные из урогенитального тракта, в сравнении с кишечными изолятами (10,5 ± 2,7 %) и штаммами, выявленными при раневой инфекции (в 17,4 ± 3,4 % случаев) (рис. 2).
Определение адгезии бактериальных клеток к формалинизованным эрит роцитам человека 1(0) группы крови показало ее наличие у 63,2 ± 4,3 % штам мов Citrobacter spp. При этом, штаммы, изолированные из ассоциации с бакте риями, в 47,4 ± 4,4 % случаев обладали высокой степенью адгезивной активно сти (более 5 ед.). Напротив, при моноинфекции, культуры бактерий рода Citro bacter, реже адгезировались к эритроцитам (в 13,5 ± 3,0 % случаев) и характери зовались низкой степенью адгезивной активности (менее 2 ед.).
Рис. 2. – Частота выявления адгезивной активности бактерий рода Citro bacter в различных биотопах организма человека.
Условные обозначения: 1 – штаммы, проявляющие высокую степень адге зии (более 5 ед.), 2 – среднюю степень адгезии (от 2,1 до 4,9 ед.), 3 - низкую степень адгезии (2 ед. и менее), 4 – не обладающие адгезивной активностью.
Полученные данные об адгезивной активности исследуемых штаммов Ci trobacter spp. были подтверждены с помощью электронно-микроскопического исследования: у высокоадгезивных штаммов цитробактеров по периметру были обнаружены реснички длиной 110 - 420 нм и шириной 5,0 - 5,4 нм.
Далее были изучены пенетрантность и экспрессия факторов персистенции, от которых зависит продолжительность течения и наличие осложнений ряда заболеваний (Бухарин О.В., 1999;
Шагинян И.А., 2000).
Анализ распространенности персистентных свойств показал, что у бактерий рода Citrobacter, изолированных из микробных ассоциаций чаще, чем в монокультуре, встречалась «антиинтерфероновая» активность (63,2 ± 4,3 % против 52,6 ± 4,4 %) (p0,05) (рис. 3).
Рис. 3. – Распространенность патогенных свойств Citrobacter spp., изоли рованных в монокультуре и из ассоциации микроорганизмов.
Условные обозначения: 1 – адгезия к эритроцитам цыпленка, 2 – адгезия к эритроцитам человека, 3 – АИА, 4 – АЛА, 5 – БПО, 6 - -гемолизин, 7 - тиолза висимый гемолизин, 8 - энтерогемолитическая активность, 9 – липолитическая активность, 10 – ДНК-азная активность.
монокультура Citrobacter spp., штаммы Citrobacter spp., изолированные из микробных консорциумов.
Антилизоцимная активность и биопленкообразование данного вида бактерий в равной степени часто встречалась, как у штаммов, изолированных при моноинфекции, так и из ассоциации микроорганизмов (в среднем 85,7 ± 3, % и 95,5 ± 1,8 % соответственно).
Частота встречаемости «антиинтерфероновой» активности бактерий рода Ci trobacter убывала в ряду: раневое отделяемое (75,2 ± 3,8 %) дистальный отдел толстого кишечника (63,2 ± 4,3 %) урогенитальный тракт (56,6 ± 4,4 %).
Пенетрантность антилизоцимной активности и биопленкообразованияцитробактеров, изолированных из различных источников, варьировала в переделах 85,7 – 95,5 %.
При исследовании экспрессии «антиинтерфероновой» активности оказа лось, что штаммы, выделенные из микробной ассоциации имели более высокие средние значения исследуемого свойства (0,4±0,03 ед.), в сравнении с моно культурой (0,3±0,03 ед.). Кроме того, выраженность АИА у штаммов Citrobacter spp. различалась в зависимости от источника выделения. Культуры цитробак теров, полученные из раневого отделяемого при гнойной раневой инфекции имели более высокий уровень АИА (0,4±0,03 ед.) в сравнении со штаммами, вы деленными из кишечника (0,2±0,01 ед.) и урогенитального тракта (0,3±0,03 ед.) (p0,05).
Наиболее высокие средние значения АЛА были характерны для штаммов цитробактеров, изолированных при раневой инфекции (1,4 ± 0,01 мкг/мл*ОП) и из микросимбиоценоза кишечника (1,1 ± 0,01 мкг/мл*ОП), в сравнении с куль турами Citrobacter spp., полученных при моноинфекции из урогенитального тракта (в среднем 0,7 ± 0,01 мкг/мл*ОП) (p0,05).
Экспрессия биопленкообразования Citrobacter spp., так же как и другие персистентные свойства (АИА и АЛА), имела более высокие средние значения (4,2 ± 0,05 ед.) у штаммов, входящих в состав микробных ассоциаций, тогда как в монокультуре данный показатель имел низкие значения (2,8 ± 0,04 ед.) (p0,05). В зависимости от биотопа выраженность БПО исследуемых штаммов бактерий ранжировалась в порядке убывания следующим образом: урогенитальный тракт (4,8 ± 0,05 ед.) кишечник (4,1 ± 0,05 ед.) раневое отделяемое (3,2 ± 0, ед.).
При изучении факторов, использующихся в качестве показателей потен циальной токсичности, были определены некоторые гемолизины бактерий рода Citrobacter. Фенотипическая характеристика исследуемых культур Citrobacter spp. показала, что 8,8 ± 2,5 % штаммов обладали -гемолизином, 18,4 ± 3,5 % культур имели тиолзависимый гемолизин и 13,2± 3 % штаммов характеризова лись энтерогемолитической активностью. Все штаммы, обладающие гемолити ческой активностью были изолированы из микросимбиоценоза кишечника че ловека и раневого отделяемого при гнойной раневой инфекции.
Среди других факторов патогенности у цитробактеров было выявлено на личие липолитической активности (в среднем у 42,6 ± 4,4 % штаммов) и ДНК азной активности (в среднем у 25 ± 3,8 % культур). Как распространенность, так и выраженность исследуемых вирулентных свойств Citrobacter spp. варьировала и имела более высокие значения у штаммов, изолированных из микробных консорциумов в сравнении с монокультурой.
При исследование чувствительности бактерий рода Citrobacter к антимикробным препаратом, выявлена устойчивость исследуемых штаммов к лактамным антибиотикам. Так, к ампициллину устойчивость регистрировалась у 97,1 ± 1,5 % штаммов, к карбенициллину - у 91,2 ± 2,5 % культур, к цефазолину – у 86 ± 3,1 % изолятов, к амоксициллину – у 77,9 ± 3,7 % штаммов и к канамицину – у 76,5 ± 3,8 % культур бактерий. Частота встречаемости антибиотикорезистентности к другим группам антимикробных препаратов варьировала в пределах 50 -75 % случаев. Реже устойчивость Citrobacter spp.
формировалась к карбапенемам и фторхинолонам: к имипенемам - у 5,1± 1,9 % штаммов, к моксифлоксацину – у 7,4 ± 2,3 % культур, к ципрофлоксацину - у 14 ± 3,1 % изолятов и к офлоксацину - у 16,2 ± 3,3 % штаммов бактерий.
Изучение вирулентности в экспериментах invivo различными штаммами бактерий рода Citrobacter показало, что в 17,7 ± 4,1 % случаев изоляты цитробактеров проявляли способность вызывать поражение органов дыхания у животных, а у 14,5 ± 3,8 % белых мышей – давали эффект «отечной лапки».
Таким образом, полученные данные показали, что бактерии рода Citro bacter обладают комплексом патогенных свойств, позволяющим им выступать не только в качестве «агрессора», проявляя вирулентные свойства, но и дли тельно сохраняться (персистировать) в организме человека, в том числе, вклю чаясь в состав микросимбиоценозов. При формировании и функционировании микросимбиоценоза между микроорганизмами складываются различные взаи моотношения, которые определяются качественной и количественной характе ристикой микробного пейзажа (Несвижский Ю.В. и др., 1997), приводя к изме нению биологических свойств симбионтов (Бухарин О.В. и др., 2011). В связи с этим, на следующем этапе работы было оценено изменение биологических свойств бактерий рода Citrobacter при взаимодействии с ассоциативной и доми нантной микробиотой человека.
Эксперименты invitro и invivo были осуществлены с использованием модельных штаммов C. freundii, а также ассоциативных (P. vulgaris, S. aureus, E.
coli) и доминантных микросимбионтов (B. longum) (коллекция кафедры микро биологии ГБОУ ВПО «Башкирский Государственный медицинский универси тет»).
Анализ полученных результатов позволил установить наличие синергид ных связей в ассоциации C. freundii с P. vulgaris, S. aureus и гемолитическими (hly +) E. coli. Под действием супернатантов данных видов ассоциантов пре имущественно отмечалась стимуляция антилизоцимной активность у 55 – 63, % исследуемых штаммов цитробактеров (рис. 4).
В контроле (без воздействия супернатантов ассоциантов) выраженность АЛА C. freundii составляла 1,2 ± 0,01 мкг/мл*ОП, тогда как после соинкубирования с метаболитами P. vulgaris, S. aureus и E. сoli hly + данный показатель увеличился до 1,6 ± 0,01 мкг/мл*ОП, до 1,9 ± 0,01 мкг/мл*ОП и до 1,4 ± 0,01 мкг/мл*ОП соответственно.
Значительно реже (у 8,3 - 22,2 % штаммов) было отмечено снижение ан тилизоцимного признака C. freundii с 1,2 ± 0,01 мкг/мл*ОП до 0,7 - 0, мкг/мл*ОП (p0,05). В 29,6 ± 8,9 % случаев ассоцианты не изменяли АЛА цит робактера.
Рис. 4. – Распространенность изменений антилизоцимной активности среди штаммов C. freundii при соинкубировании с метаболитами бактерий.
Условные обозначения: белым цветом - снижение экспрессии свойства, черным цветом - увеличение экспрессии свойства, штриховка - отсутствие изменений экспрессии свойства * - достоверность различий (p0,05) Напротив, представители нормофлоры (бифидобактерии и лактозопози тивные негемолитические эшерихии), в большинстве случаев (50 – 63,9 %) про являли антагонистический эффект, ингибируя АЛА C. freundii. При этом значе ния АЛА цитробактера снижались с 1,2 ± 0,01 мкг/мл*ОП до 0,6 ± 0, мкг/мл*ОП (p0,05).
Доминантные бактерии (B. longum) и эшерихии увеличивали АЛА у 25 33,3 % штаммов C. freundii (c 1,2 ± 0,01 мкг/мл*ОП до 1,5 ± 0,01 мкг/мл*ОП).
Отсутствие изменения АЛА было выявлено в 11,1 - 16,7 % случаев Аналогичная направленность биокоммуникативной активности микро симбионтов была выявлена при исследовании изменения биопленкообразова ния C. freundii (рис. 5).
Стимуляция биопленкообразования C. freundii в 47,2 – 69,4 % случаев на блюдалась при взаимодействии с ассоциативной микробиотой, характерной для дисбиотических изменений микросимбиоценоза. Так, под действием метаболи тов S. aureus, значения БПО цитробактера увеличивались с 3,8 ± 0,3 ед. до 5,1 ± 0,5 ед., при воздействии E. сoli hly + - до 4,9 ± 0,4 ед. (p0,05), а Рис. 5. – Распространенность изменений биопленкообразования среди штаммов C. freundii при соинкубировании с метаболитами бактерий.
Условные обозначения: белый цвет - снижение экспрессии свойства, черный цвет - увеличение экспрессии свойства, штриховка - отсутствие из менений экспрессии свойства * - достоверность различий (p0,05).
под влиянием супернатантов P. vulgaris имели тенденцию к увеличению (до 4, ± 0,3 ед.).
Вместе с тем ингибирование БПО было характерно только для 11,1 – 27, % штаммов C. freundii. При этом значения биопленкообразования исследуемых штаммов цитробактеров снижалось с 3,8 ± 0,3 ед. до 2,9 ± 0,3 ед., до 3,1 ± 0, ед. и до 2,5 ± 0,2 ед. под действием супернатантов P. vulgaris, S. aureus и гемо литических E. coli соответственно. Отсутствие изменений биопленкообразова ния (индифферентный эффект) наблюдался в 19,5 – 27,8 % случаев.
Противоположный – антагонистический эффект был характерен при влиянии метаболитов представителей нормофлоры на биопленкообразование C.
freundii. Ингибирование БПО отмечалось у 69,4 ± 9 % штаммов Citrobacter spp.
при действии супернатантов лактозопозитивных E. coli и у 80,5 ± 7,7% куль тур – под влиянием B. longum. Экспрессия БПО снижалась с 3,8 ± 0,3 ед. до 2, ± 0,3 ед. и до 1,8 ± 0,2 ед. соответственно при действии супернатантов эшери хий и бифидобактерий.
Стимуляцию биопленкообразования C. freundii под действием лактозо позитивных E. coli и B. longum выявляли не более, чем в 13,9 ± 6,8 % случаев (с 3,8 ± 0,3 ед. до 2,4 ± 0,2 ед.), а индифферентный эффект не превышал 16,7 ± 7, % случаев.
Таким образом, полученные данные позволили установить, что в ассо циации Citrobacter spp. с бактериями формируются по два основных типа взаи модействий, зависящие от вида микросимбионтов. Синергидные связи форми ровались с представителями ассоциативной микробиоты (P. vulgaris, S. aureus и гемолитические E. coli), как правило, присутствующие наряду с C. freundii при дисбиозе кишечника. Представители нормофлоры, напротив, подавляли АЛА и БПО цитробактеров, что можно рассматривать как защитную функцию бифи добактерий и эшерихий, осуществляющих контроль численности и физиологи ческой активности условно-патогенных бактерий в условиях ассоциативного симбиоза человека.
Поскольку ранее было установлено, что предварительное соинкубирова ние бифидобактерий с супернатантами ассоциантов, позволяет дифференциро вать «свои» и «чужие» виды микроорганизмов в паре «доминант-ассоциант» (Перунова Н.Б., 2011, Бухарин О.В.. 2012), дальнейшие эксперименты были проведены по алгоритму с использованием в качестве модели пары «C. freundii – B. longum». При оценке были использованы только базовые физиологические критерии адаптации микросимбионтов - антилизоцимная активность и био пленкообразование, поскольку исследуемые штаммы бифидобактерий не ока зывали влияния на ростовые свойства Citrobacter spp.
Предварительное соинкубирование B. longum с супернатантами C. freundii, приводило к исчезновению стимулирующего эффекта влияния би фидобактерий, как в случае антилизоцимной активности цитробактеров, так и в отношении их биопленкообразования (рис. 6). Наряду с этим отмечено увели чение распространенности ингибирующего и индифферентного воздействия бифидофлоры на персистентные свойства Citrobacter spp.
Что же касается выраженности исследуемых свойств, то предварительное соинкубирование B. longum с метаболитами C. freundii также приводило к сни жению экспрессии АЛА и БПО цитробактеров на 18,9 – 36,4 % от значений контроля (без предварительного соинкубирования), на основании чего они бы ли отнесены к «чужим» видам микросимбионтов.
С целью оценки патогенного потенциала Citrobacter spp., изолированного из ассоциации с бактериями, были проведены эксперименты in vivo на модели штамма C. freundii № 255, выделенного ранее из ассоциации с E. coli и P. vulga ris и обладающего в экспериментах in vitro высокими значениями вирулентных и персистентных свойств, в сравнении с культурами Citrobacter spp., изолиро ванных в монокультуре.
Рис. 6. – Изменение БПО и АЛА штаммов C. freundii при соинкубирова нии с метаболитами B. longum.
Условные обозначения:
1 – изменение БПО и АЛА C. freundii после соинкубирования с супернатантом бифидобактерий;
2 – изменение БПО и АЛА C. freundii после соинкубирования с метаболитами бифидобактерий, предсоинкубированных с супернататом цит робактера.
Белый цвет - снижение экспрессии свойств, черный цвет - увеличение экспрессии свойств, штриховка - отсутствие изменений экспрессии свойств В экспериментах in vivo установлена способность штамма C. freundii № 255 вызывать «отек лапки» у белых мышей и одновременно диссеминиро вать в легкие экспериментальных животных при «легочной модели» инфекции.
Исследование природы токсического вещества, вызвавшего развитие «отека лапки» экспериментальных животных, выявило, что гретый при 560 С центрифугат культуры C. freundii № 255 давал разницу в весе между отечной и контрольной лапками от 50 до 75 мг, а при 850 С - от 25 до 40 мг, что свиде тельствовало о присутствии в супернатанте исследуемого штамма цитробактера термочувствительного и лабильного токсического компонента белковой при роды. По данным литературы таким белком может являться ЛТ-энтеротоксин, обусловленный активностью генов, входящих в состав плизмид микробной клетки (Бондаренко В.М., 1993, Габидуллин З.Г., 1995).
В связи с этим предположением был проведен анализ плазмидного про филя Citrobacter spp. с целью обнаружения плазмиды массой 60 МД, кодирую щей энтеротоксин. В качестве контроля использовали культуры цитробактеров, не продуцирующие ЛТ-энтеротоксин (различия в массе не более 35 мг на мо дели «отека лапки» белых мышей).
В результате анализа полученных в эксперименте фореграмм, установле но наличие у C. freundii № 255 плазмиды, соответствующей положительному контролю наличия ЛТ-энтеротоксина (рис. 7).
Рис. 7. - Электрофореграмма профиля плазмидной ДНК клонов Citrobacter spp., после сокультивирования, продуцирующих ЛТ-энтеротоксин.
Условные обозначения: 1 – маркеры молекулярных масс ДНК;
2 – штамм С. freundii № 255, содержащий плазмиду 60 МД (токсигенный штамм);
3,4,5,6 клоны штамма С. freundii № 255 не содержащие плазмиду 60 МД.
Для исследования изменений плазмидного профиля C. freundii в ассоциа ции с бактериями, в экспериментах in vitro был использован модельный штамм B. subtilis 3 H, изолированный из пробиотика «Бактиспорин». Данный штамм также представляет интерес, поскольку биологически активные вещества, вы деляемые при культивировании бацилл, наряду с пробиотической активностью, перспективны в качестве основы антимикробных препаратов, действующих из бирательно на патогенные микробы без нарушений сложившегося микробиоце ноза, обычно имеющих место при применении антибиотиков широкого спектра действия (Бондаренко В.М., 2003).
Исследование плазмидного профиля популяции токсигенного штамма C.
freundii после совместного культивирования с B. subtilis 3 H, выявило исчез новение плазмиды 60 МД у клонов исследуемой культуры цитробактера. Из отобранных клонов цитробактера, у двух на фореграмме просматривалась плазмида массой 60 МД, а остальные клоны родительского штамма C. freundii № 255 оказались не несущими данной плазмиды (рис. 7.).
Элиминация плазмиды 60 МД у клонов C. freundii № 255, сопровожда лось изменением их токсинопродукции. В экспериментах in vivo бесплазмид ные клоны C. freundii № 255 не вызывали дилатацию и экссудацию в петле тон кого кишечника кролика и гибель инфузорий в течение 5 минут.
Исследование других фенотипических признаков C. freundii № 255 после сокультивирования с B.subtilis 3H выявило также снижение уровня антилизо цимной активности цитробактера (с 1,9 до 1,2 мкл/мл*ОП), его способности синтезировать -гемолизин и проявлять липолитическую активность.
Анализ антибиотикорезистентности C. freundii № 255 показал, что его совме стное культивирование их с B. subtilis 3H приводит к снижению минимальной по давляющей концентрации -лактамных антибиотиков (незащищенные ампицилли ны, цефазолин) и аминогликозидов (канамицин), что можно расценивать как по вышение чувствительности цитробактера к данным антимикробным препаратам.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют об изменении плаз мидного профиля бактерий рода Citrobacter при сокультивировании с бактериями.
На модели взаимодействия C. freundii и B.subtilis 3 H в условиях совместного культивирования происходит элиминация плазмиды токсигенности, что сопро вождается исчезновением токсического действия изогенных бесплазмидных клонов на организм экспериментальных животных. Изменение антилизоцим ной, гемолитической, липолитической активностей и антибиотикочувствитель ности C. freundii после сокультивирования со штаммом B.subtilis возможно свя зано c нарушением ферментных систем микробной клетки цитробактера и/или разрушения факторов патогенности протеазами, секретируемыми бациллами (Wangetal., 2006).
В итоге проведенной работы следует выделить три основных момента:
Инфекционный процесс с участием бактерий рода Citrobacter, сопро вождается формированием микробных ассоциаций цитробактера с условно патогенной микробиотой усилением их факторов патогенности: адгезивной ак тивности, персистентных свойств, токсигенности и антибиотикорезистентности.
Образование бактериальных консорциумов с ассоциативной микро биотой сопровождается синергидным эффектом - усилением вирулентного и персистентного потенциала бактерий рода Citrobacter при дисбиозе/инфекции, и, напротив, формированием антагонистических отношений с доминантными бактериями при эубиозе.
Сокультивирование модельных штаммов C. freundii и B. subtilis приводит к элиминации плазмиды токсигенности цитробактера, что фенотипи чески проявляется в отсутствии токсигенного действия Citrobacter spp. экспе риментальных животных и снижении патогенного потенциала и антибиотико резистентности исследуемых культур в условиях in vitro.
ВЫВОДЫ:
Среди клинических изолятов бактерий рода Citrobacter независимо 1.
от источника их выделения, преобладает вид C. freundii, обладающий высокой адгезивной -гемолитической, лецитиназной, ДНК-азной, антилизоцимной, «антиинтерфероновой» активностями, проявляющий способность синтезиро вать термолабильный энтеротоксин и характеризующийся множественной ан тибиотикоустойчивостью.
Бактерии рода Citrobacter выявляются в виде консорциумов с ассо 2.
циативными бактериями (Proteus spp., Staphylococcus spp., Enterococcus spp. и др.), при воздействии метаболитов которых происходит увеличение экспрессии и пенетрантности факторов вирулентности и персистенции цитробактеров, спо собствуя формированию патологического микросимбиоценоза.
3. Бифидобактерии и лактозопозитивные негемолитические эшерихии ингибируют антилизоцимную активность и биопленкобразование C. freundii, что можно рассматривать в качестве одного из защитных механизмов нормоф лоры при функционировании микросимбиоценоза в условиях эубиоза.
4. Защитное действие доминантной микробиоты (бифидобактерий) про является в их способности «распознавать» токсигенные и гемолитические штаммы C. freundii в качестве «чужеродного» микроорганизма, усиливая свое антагонистическое действие в отношении адаптивной функции цитробактера.
5. Уменьшение патогенного потенциала бактерий рода Citrobacter при совместном сокультивировании с Bacillus subtilis 3H, связано с элиминацией плазмиды массой 60 МД контролирующих синтез ЛТ-энтеротоксина, что при водит к исчезновению токсического воздействия цитробактера на организм экспериментальных животных и снижению его патогенного потенциала.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК:
1. Использование антагонистических свойств бактерий Bacillus subtilis в терапии госпитальной инфекции мочевых путей /А.М. Пушкарев, Р.Р.Зайнуллин, Т.Н.Кузнецова, В.Г. Туйгунова, Ю.З. Габидуллин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. –2007. – № 2. – С. 90 – 93.
2. Комплексое лечение гнойно-воспалительных заболеваний, вызванных ассоциациями грамположительных и грамотрицательных бактерий / Р.С.Суфияров, З.Г.Габидуллин, М.В.Тимербулатов, В.Г. Туйгунова и др. // Медицинский вестник Башкортостана. -2010. -Т.5., - № 3, - С.60- 3. Лечение ассоциированных ран цитробактерно-стафилококковой при роды. / Р.С.Суфияров, З.Г.Габидуллин, Р.Р.Суфияров, А.А.Ахтариева, В.Г.
Туйгунова // Вестник Южно-уральского госудаственного университета. -2011.– вып. 28. -№ 26. - С.108-111.
4. Биологические свойства клинических штаммов батерий рода цитробак тер, выделенных в моно и ассоциированных инфекциях / В.Г. Туйгунова, З.Г.Габидуллин, М.М.Туйгунов, А.Г. Губайдуллин, И.Р. Хажин // Инфекция и иммунитет. – 2012. -Т.2. -№1-2. -С. 5. Изменение биопленкообразования и антилизоцимной активности Сitrobacter freundii под действием метаболитов кишечной микробиоты / Н.Б.Перунова, В.Г. Туйгунова, Е.В.Иванова, Ю.З.Габидуллин // Медицинский вестник Башкортостана. - 2013. - Т.8. - № 4. - С. 61 – 64.
Патенты 6. Штамм бактерий Escherichia coli ГИСК № 281, обладающий способно стью продуцировать термолабильный ЛТ-энтеротоксин [Текст]: пат. Рос. Фед.: МПК C12N1/00 /З.Г.Габидуллин, М.М.Алсынбаев, М.М.Туйгунов, А.К.Булгаков, Н.Н.Гибазов, Э.Ф.Мамбетова, В.Г. Туйгунова, Д.Т.Гашимова, Ю.З.Габидуллин, А.А.Ахтариева, Ф.С.Билалов;
заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО БГМУ Росздрава (RU);
опубл. 20.02.2007, Бюл. №5 -4 с.
7. Штамм бактерий Escherichia coli ГИСК № 280, обладающий способно стью продуцировать термолабильный ЛТ-энтеротоксин [Текст]: пат. Рос. Фед.: МПК C12N1/20 / З.Г. Габидуллин, М.М. Алсынбаев, М.М.Туйгунов, А.К. Булгаков, Н.Н. Гибазов, Э.Ф.Мамбетова, В.Г. Туйгунова, Д.Т.Гашимова, Ю.З. Габидуллин, Ф.С. Билалов, А.А.Ахтариева;
заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО БГМУ Росздрава (RU);
опубл. 20.02.2007 г. -Бюл. -№ 5. -4 с.
Список сокращений:
АТСС – AmericanTypeCultureCollection (американская коллекция типовых культур) КОЕ – колониеобразующая единица БПО – биопленкообразование АЛА – антилизоцимная активность АИА – «антиинтерфероновая» активность УПМ – условно-патогенные микроорганизмы r – коэффициент ранговой корреляции Спирмена УПМ – условно-патогенные микроорганизмы МД – мегадальтон (молекулярная масса ДНК) Туйгунова Вера Георгиевна Характеристика биологических свойств бактерий рода Citrobacter при межмикробных взаимодействиях в микросимбиоценозе Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оригинал-макет подготовлен в программе Microsoft Office Word Подписано в печать 26.09.2013 г.
Формат 60*84/16. Усл.-печ. л. 1,0. Печать оперативная.
Бумага офсетная. Гарнитура Times.
Тираж 100 экз.