Исследование деформируемости эритроцитов млекопитающих с использованием усовершенствованного эктацитометра

На правах рукописи

САЙФИЕВ РУСЛАН РИНАТОВИЧ ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕФОРМИРУЕМОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УСОВЕРШЕНСТВОВАННОГО ЭКТАЦИТОМЕТРА 03.00.13. – Физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Тюмень - 2002 Диссертация выполнена на кафедре анатомии и физиологии человека и жи вотных Тюменского государственного университета НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор биологических наук, профессор Шалабодов Александр Дмитриевич кандидат биологических наук, доцент Белкин Алексей Васильевич ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор Кузнецов Александр Павлович доктор медицинских наук, профессор Сашенков Сергей Львович ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт эволюционной физиологии и биохи мии им. И.М. Сеченова РАН

Защита состоится «_»_2003 г. в часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.274.07 в Тюменском государ ственном университете по адресу: 625043, г. Тюмень, ул. Пирогова,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тюменского госу дарственного университета Автореферат разослан «_»_2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор, Е.А.Чирятьев Актуальность проблемы. Эритроциты являются преобладающим ти пом клеток крови. Способность эритроцитов к упругой деформации позволя ет этим клеткам доставлять необходимые для жизнедеятельности организма вещества по сосудистой системе включающей капилляры, диаметр которых достигает 2 мкм. Деформируемость эритроцитов при прохождении по кровя ному руслу обусловлена упругими свойствами самой мембраны этих клеток и наличием особой белковой структуры, выстилающей внутреннюю сторону мембраны и называемой цитоскелетом /Ивенс, Скейлак, 1982;

Mohandas, 1992/.

Деформируемость эритроцитов претерпевает существенные изменения при воздействии различных физико-химических факторов /Koutsouris, Dela tour-Hanss, Hanss, 1985;

Fiocco, Quattrocchi, Neirotti, et al., 1984;

Sung, Chien, 1992/ и при ряде заболеваний /Никулин с соавт., 1998;

Ганелина с соавт., 2000;

Фатенков, Зарубина, Миляков, 2002/.

Важным моментом при проведении исследований деформируемости эритроцитов является объективная оценка этого показателя. Для исследова ния деформируемости эритроцитов используются такие экспериментальные методы как центрифугирование /Corry, Mieselman, 1978/, фильтрация /Jones e.a., 1984/, реоскопия /Mohandas e.a., 1981/. Однако они либо недостаточно информативны, либо трудоемки по выполнению. Метод, который позволяет провести оперативную и информативную оценку деформируемости эритро цитов основан на компьютерной эктацитометрии и реализован в приборе по лучившим название эктацитометр /Bessis, et.al., 1981;

Mohandas, et.al., 1981/.

Существующие эктацитометры являются крупногабаритными и не транспортабельными. В связи с этим разработка и создание усовершенство ванного эктацитометра с компьютерной обработкой полученной информа ции, внедрение эктацитометрии в практику научно-исследовательских и кли нических лабораторий является актуальной проблемой как для практической, так и теоретической медицины. Примером использования эктацитометриче ской установки в клинической практике является исследование деформируе мости эритроцитов у больных артериальной гипертонией, при которой отме чается ухудшение реологических показателей крови /Китаева с соавт., 1991;

Александрова с соавт., 1991;

Кравцов, Дулин, Постнов, 1991;

Вершинина с соавт., 1998;

Муравьев с соавт., 2000/.

Цель и задачи исследования:

разработать и апробировать усовершенствованный эктацитометр для количе ственной оценки деформируемости эритроцитов млекопитающих в норме и при различных патологических состояниях.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следую щие задачи:

1. Разработать и создать усовершенствованный эктацитометр.

2. Изучить влияние физико-химических факторов на деформируемость эрит роцитов крыс в опытах in vitro с использованием усовершенствованного эк тацитометра.

3. Изучить влияние стресс-нагрузок на деформируемость эритроцитов крыс в опытах in vivo с использованием усовершенствованного эктацитометра.

4. Провести эктацитометрические исследования деформируемости эритроци тов у больных артериальной гипертонией.

Научная новизна.

Усовершенствованный нами эктацитометр имеет ряд преимуществ по сравнению с существующими аналогами. Благодаря небольшим размерам и массе установка легко транспортируется и может применяться в различных лабораториях по исследованию реологических свойств крови. Использование специальных аппаратных средств позволяет обеспечивать взаимодействие эктацитометра с ЭВМ и передавать четкое изображение дифракционных кар тин для анализа деформируемости эритроцитов с помощью компьютера.

Специальное программное обеспечение позволяет проводить точный экс пресс-анализ деформируемости эритроцитов, рассчитывать основные стати стические показатели, наглядно отображать с помощью графиков динамику деформируемости эритроцитов в зависимости от приложенного к ним усилия сдвига. Благодаря примененными нами новыми техническими решениями обеспечивается автоматизация научно-исследовательской работы и значи тельно ускоряется и упрощается работа с эктацитометром.

С использованием усовершенствованного эктацитометра исследовалась деформируемость эритроцитов крыс под влиянием различных физико химических факторов в опытах in vitro, а также проводилось исследование деформируемости эритроцитов экспериментальных животных под влиянием стресс-нагрузок в опытах in vivo.

Было проведено исследование деформируемости эритроцитов у боль ных артериальной гипертонией с нормальным и повышенным уровнем холе стерина в крови, а также исследовалась деформируемость эритроцитов боль ных артериальной гипертонией с повышенным содержанием холестерина по сле 4-х месячного амбулаторного курса лечения гипотензивным препаратом моноприл (фозиноприл).

Впервые показано, что гипотензивный препарат моноприл снижает де формируемость эритроцитов у больных артериальной гипертонией после 4-х месячного амбулаторного курса лечения.

Полученные результаты исследований в опытах in vitro, in vivo и в кли нических испытаниях свидетельствуют о высокой чувствительности уста новки и возможности ее использования в научно-исследовательской и кли нической практике.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Усовершенствованный эктацитометр позволяет проводить объектив ный экспресс-анализ деформируемости эритроцитов млекопитающих с ис пользованием компьютерных технологий, что обеспечивает высокую степень автоматизации исследований.

2. Воздействие физико-химических факторов на эритроциты крыс в опы тах in vitro изменяет деформируемость клеток.

3. Влияние стресс-нагрузок на эритроциты крыс в опытах in vivo вызы вает увеличение деформируемости этих клеток.

4. У больных артериальной гипертонией деформируемость эритроцитов снижена.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на конференциях: «Физика и биология в медицине» (Екатеринбург, 2001), «Ак туальные проблемы эволюционной и популяционной физиологии человека» (Тюмень, 2001), «Актуальные проблемы адаптации человека» (Сургут, 2001), «XII Международное совещание и V школа по эволюционной физиологии» (С.-Петербург, 2001), «Международная конференция по гемореологии» (Яро славль, 2001), «XVIII Съезд физиологического общества им. И.П. Павлова» (Казань, 2001), «Биомеханика – 2002» (Н. Новгород, 2002).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем работы: Диссертация изложена на 109 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Рабо та иллюстрирована 3 таблицами и 23 рисунками. Библиографический указа тель включает 207 работ отечественных и зарубежных авторов.

Материал и методы исследований Эксперименты проводились на половозрелых беспородных крысах сам цах массой 180-200 г (74 особи).

Все животные содержались в стандартных условиях вивария на полно ценной диете и были одного возраста. Опыты проводились в зимне-весенний период.

Исследование по влиянию стресс-нагрузок на деформируемость эрит роцитов экспериментальных животных проводили по методике “свободное плавание в клетке” /Бондаренко с соавт., 1999/. В эксперименте по кратко временному перегреванию животных использовался термостат SPT - (Poland), позволяющий создавать и сохранять заданный тепловой режим. Для оценки стрессорного состояния организма животных использовали анализ лейкоформулы, который проводили по общепринятым методам и формулам /Стенко, 1975/.

После экспериментального воздействия животных помещали в специ ально сконструированный «домик» из органического стекла и забирали кровь из хвостовой вены в гепаринизированные капилляры (фирма Radiometr, Co penhagen, Дания).

Исследование деформируемости эритроцитов больных артериальной гипертонией проводилось на базе Тюменского кардиологического центра – филиала НИИ кардиологии ТНЦ СО РАМН. Было обследовано 67 человек в возрасте от 35 до 65 лет с нормальным и повышенным уровнем холестерина в крови. Контролем служили 20 человек в возрасте от 30 до 55 лет, которые не страдали артериальной гипертонией.

Кровь у больных и здоровых людей забиралась с помощью венопунк ции из вены правого плеча в одноразовый шприц объемом 2 мл и стабилизи ровалась 0.3% раствором цитрата натрия.

Проба крови экспериментальных животных и людей в объеме 100 мкл помещалась в 3 мл 20% раствора полисахарида Ficoll-400 растворенного в фосфатном буфере (0.3 М NaCl, 0.02 M Na2HPO4, 0.005 M KH2PO4, pH = 7.4, при температуре 37°С). Размешивание эритроцитов в растворе Ficoll- проводили в фарфоровой чашке до появления однородно окрашенного рас твора без включений и клеточных агрегатов. Деформируемость эритроцитов определяли на разработанном нами эктацитометре.

Для исследования деформируемости эритроцитов инкубированных в средах с различной концентрацией NaCl осмоляльность растворов контроли ровали при помощи осмометра 1Ц-01. В экспериментах по влиянию темпера туры среды инкубирования на деформируемость эритроцитов контроль тем пературы проводили с помощью термостата марки UTU-2 (Poland), при этом, учитывая влияние температурного фактора на изменение кислотности среды инкубирования эритроцитов, в среды добавляли либо 10% раствор HCl либо 10% раствор КОН. В опытах с инкубированием эритроцитов в средах с раз личным рН контроль над кислотностью сред проводили с использованием pH метра марки Анион – 7010.

Статистическая обработка данных проводилась на персональном ком пьютере оснащенным процессором марки Celeron 1700 с помощью програм мы Ecto-1, в программный код которой были записаны основные формулы для расчета статистических показателей. О достоверности различий судили по t-критерию Стьюдента Результаты исследований и их обсуждение.

1. Создание экспериментальной модели эктацитометра.

Для исследования деформируемости эритроцитов в настоящее время используются различные методы, среди которых наибольшее применение получили следующие: центрифугирование /Corry, Mieselman, 1978/, фильт рация /Jones e.a., 1984/, реоскопия /Mohandas e.a., 1981/. Однако, вследствие низкой информативности получаемых этими методами данных и трудоемко сти выполнения экспериментальных исследований, мы остановили свой вы бор на методе лазерной дифрактометрии или эктацитометрии /Bessis, e.a., 1981/, который позволяет провести оперативную и информативную оценку деформируемости эритроцитов в короткие сроки с использованием незначи тельных проб крови и компьютерного анализа полученных данных.

Существующие эктацитометры являются крупными и нетранспорта бельными установками, в которых основные технические элементы крепятся на горизонтальной основе, что приводит к увеличению размера и массы экс периментального прибора. Для создания усовершенствованного эктацито метра было решено использовать не горизонтальную ориентацию техниче ских элементов, а вертикальную, что позволило значительно уменьшить размер установки. Масса усовершенствованной нами установки составляет 6.5 кг, высота 50 см, длина 30 см и ширина 20 см, при этом все основные ра бочие узлы прибора были размещенны внутри светонепроницаемого и жест кого чехла, который может легко сниматься при смене опытных образцов.

Блок-схема усовершенствованного эктацитометра изображена на рис.1.

В качестве основания разработанной нами установки служит неболь шая металлическая опора с вертикальным стержнем, на котором крепятся все технические элементы эктацитометра. Для проведения исследования де формируемости эритроцитов используются две пластины, выполненные из прозрачного для видимого света материала (оргстекло). Усилие сдвига, вы зывающее деформацию эритроцитов, создается за счет вращения нижней пластины относительно верхней - неподвижной. Термостабилизация пластин обеспечивается наличием специальной «рубашки», размещенной на верхней пластине. Для контроля температурного режима к верхней пластине крепит ся термодатчик, цифровое табло которого размещается снаружи установки.

Привод нижней пластины обеспечивает серводвигатель, оснащенный пере ключателем, позволяющим дискретно менять скорость вращения, которая варьирует в пределах от 0 до 28 об/мин. Ширина зазора между пластинами регулируется и в нижней отметке составляет 0.5 мм. Минимально допусти мая величина зазора, при которой проводились экспериментальные исследо вания, достигается при помощи специального «блокатора», который меха нически препятствует полному опусканию верхней пластины на нижнюю, что препятствует перетиранию исследуемого материала - эритроцитов. В ка честве когерентного источника света использовался лазер ГИ-3-1 (Р = 1,9*10-3 Вт, = 632,8 нм). Изображение дифракционной картины проециро валось на полупроницаемый экран и регистрировалось при помощи цифро вой видеокамеры Canon (рис. 2).

Воспроизведенная при помощи видеокамеры динамика деформируемо сти эритроцитов при разных усилиях сдвига на персональном компьютере записывалась в видеофайл формата avi посредством программы Movie Maker. Для вычисления индекса деформируемости эритроцитов при разных усилиях сдвига и построения соответствующих графиков использовалась программа, написанная по специальному заказу в среде программирования Delphi 5 и получившая название Ecto – 1.

Эта программа позволяла считывать изображение непосредственно с экрана (по аналогии с принципом сканирования) и рассчитывать геометрию изображения.

11.

10. 12.

9.

8.

6. 7. 13.

5.

1.

4.

3.

2.

Рис. 1. Блок-сема портативного эктацитометра.

1 - лазер;

2 - металлическая опора;

3 - модуль серводвигателя;

4 - пово ротное зеркало;

5 - нижняя вращающаяся пластина с пробой крови;

6 верхняя термостатируемая пластина с «рубашкой» для циркуляции во ды;

7 - термодатчик;

8 - механизм регулирования ширины зазора между пластинами;

9 - экран;

10 - вертикальный крепежный стержень;

11 цифровая видеокамера;

12 - персональный компьютер;

13 - цифровое табло термодатчика.

Рис.2. Реальное изображение дифракционной картины, получаемое при прохождении луча лазера через слой эритроцитов и выводимое на мони тор для программного анализа. А-дифракционная картина для покоя щихся эритроцитов;

В-дифракционная картина для эритроцитов нахо дящихся в сдвиговом потоке.

С учетом того, что радиус вращающегося сектора в районе прохожде ния луча лазера составлял - 38 мм формула для расчета скорости где - частота вращения, R – радиус вращающейся пластины, l – зазор между пластинами, N – скорость вращения (N/60 – число оборотов в минуту), приобретала вид:

При фиксированных значениях радиусов верхней и нижней пластин скорость сдвига зависела только от скорости вращения нижней пластины, а при постоянном значении динамической вязкости, усилие сдвига также определялось только скоростью вращения:

= Поэтому информация о технических константах нашей установки была записана в память программы Ecto-1, а различные усилия сдвига достигались изменением скорости вращения нижней пластины за счет переключателя, расположенного на серводвигателе.

Для количественной оценки выявляемого среднеклеточного удлинения при сдвиге использовался эктацитометрический показатель или индекс де формируемости Id = (A-B)/(A+B), где A и B – большая и малая полуоси ди фракционного эллипса.

Формулы по вычислению индекса деформируемости и основных стати стических показателей также были записаны в память программы Ecto-1.

Для оценки разрешающей способности усовершенствованного эктаци тометра необходимо было провести серии экспериментов, которые бы позво лили определить степень достоверности получаемых результатов и соответ ствия их результатам исследований, полученных на зарубежных аналогах и представленных в литературе.

2. Экспериментальные исследования деформируемости эритроци тов крыс в опытах in vitro.

Исследовалось воздействие на деформируемость эритроцитов крыс та ких физико-химических факторов как температура, рН среды инкубирования эритроцитов, осмоляльность инкубационной среды. Кроме того, изучалось влияние различных концентраций глютарового диальдегида на деформируе мость эритроцитов крыс.

На первом этапе исследовалась зависимость деформируемости эритро цитов крыс в опытах in vitro от температуры среды инкубирования этих кле ток. Термостабилизация пластин и суспензии эритроцитов поддерживалась за счет регулируемого нагревания воды в термостате. Результаты исследова ний представлены на рис. 3.

Рис. 3. График зависимости индекса деформируемости эритроцитов крыс от температуры среды инкубирования: 1. T- 37°С;

2. Т- 30°С;

3. Т 20°С (n=14).

Видно, что деформируемость эритроцитов крыс изменялась от прило женного усилия сдвига в интервале от 5.2 – 24.5 H/m2. На интервале усилий сдвига 33.2 – 49 H/m2 индекс деформируемости эритроцитов не возрастал, что по-видимому обусловлено достижением максимальной величины этого показателя.

Отмечены достоверные различия в деформируемости эритроцитов на больших усилиях сдвига после инкубирования этих клеток в средах с темпе ратурами 37°С и 20°С. Значение индекса деформируемости эритроцитов на усилии сдвига 49 Н/m2 и при температуре среды инкубирования 37°С дости гали 0.24 ± 0.012, тогда как при температуре 20°С и на том же усилии сдвига этот показатель составлял 0.15 ± 0.015 (Р 0.05).

Таким образом, показано, что снижение температуры среды инкубиро вания клеток до 20°С сопровождалось снижением деформируемости эритро цитов. Полученные нами результаты исследований хорошо согласуются с данными других авторов, проводивших исследования деформируемости эритроцитов при разных температурах с использованием метода фильтрации /Fiocco, Quattrocchi, Neirotti, et al., 1984;

Sung, Chien, 1992/.

Известно, что деформируемость эритроцитов зависит от кислотности среды инкубирования клеток и достигает максимальных значений при рН = 7.4, в то время как при сдвиге этого показателя в кислую или щелочную сто рону было отмечено снижение способности эритроцитов к упругой деформа ции /Crandal, Critz, Osher, 1972;

Koutsouris, Delatour-Hanss, Hanss, 1985/.

Эксперимент проводился при постоянном усилии сдвига = 49 Н/м2 и температуре 37°С. Результаты исследований представлены на рис. 4.

Id 0, 0, 0, 0, 0, 0, рН 5,4 5,8 6,2 6,6 7 7,4 7,8 8,2 8,6 Рис.4. График зависимости индекса деформируемости эритроцитов крыс от рН среды инкубирования (n=7).

Видно, что индекс деформируемости эритроцитов в интервале рН от 7.0 до 7.4 достигал максимального значения (0.24 ± 0.012), в то время как при отклонении рН инкубационной среды в кислую и щелочную сторону наблю далось достоверное снижение этого показателя. Так, например, при рН=8. среды инкубирования эритроцитов крыс индекс деформируемости клеток со ставлял 0.20±0.012, а при рН =5.8 – 0.16±0.013. Результаты исследований хо рошо согласуются с данными, полученными в работах других авторов, изу чавших деформируемость эритроцитов методами фильтрации /Crandal, Critz, Osher, 1972;

Kucera, et.al., 1984/ и эктацитометрии /Koutsouris, Delatour-Hanss, Hanss, 1985/.

В следующей серии экспериментов проводилось исследование дефор мируемости эритроцитов, инкубированных в средах с различной концентра цией глютарового диальдегида. Взаимодействие глютарового диальдегида с мембраной эритроцита приводит к возникновению поперечных сшивок меж ду мембранными белками, в результате чего снижаются вязкоэластические свойства мембран этих клеток /Heusinkveld e.a., 1977;

Белкин, 1996/. Иссле дование деформируемости эритроцитов крыс проводили после 5 минут инку бации клеток в средах содержащих 21% раствор Ficoll-400 в буферном рас творе (0.30 М NaCl, 0.020 M Na2HPO4, 0.005 M KH2PO4, pH = 7.4, при 37°С) с добавлением глютарового диальдегида в конечных концентрациях равных 0.01%, 0.02%, 0.03%. Результаты исследований представлены на рис.5.

Видно, что после инкубирования эритроцитов в средах с различными концентрациями глютарового диальдегида наблюдалось достоверное сниже ние деформируемости клеток относительно контроля. Так, после инкубиро вания эритроцитов в среде содержащей глютаровый диальдегид в концен трации 0.01% индекс деформируемости этих клеток на максимальном усилии сдвига (49 H/m2) составлял 0.18±0.014, тогда как в отсутствие глютарового диальдегида в среде инкубирования - 0.24±0.014 (P0.05). При увеличении концентрации глютарового диальдегида в среде инкубирования до 0.02% и 0.03% - индекс деформируемости составил 0.12±0.012 и 0.06 ± 0.012 соответ ственно, т.е. наблюдалось снижение деформируемости эритроцитов при уве личении концентрации глютарового диальдегида в среде инкубирования кле ток.

Id 1.

2.

3.

4.

Н/м Рис. 5. График зависимости индекса деформируемости эритроцитов крыс от концентрации глютарового диальдегида в среде инкубирова ния: 1 - в отсутствие глютарового диальдегида (контроль);

2 - 0.01% концентрация глютарового диальдегида;

3 – 0.02% концентрация глю тарового диальдегида;

4 – 0.03% концентрация глютарового диальдеги да (n=14).

Известно, что способность эритроцитов к упругой деформации зависит от осмоляльности среды инкубирования /Schmid-Schonbein, 1982/. Деформи руемость эритроцитов достигает максимальных значений в изоосмоляльных средах, тогда как увеличение или уменьшение осмоляльности среды инкуби рования приводит к снижению деформируемости этих клеток. На следующем этапе нашего исследования изучалась деформируемость эритроцитов после инкубирования клеток в растворах с различной осмоляльностью.

Результаты проведенных исследований представлены на рис. 6.

Id 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 mOsm kg 100 150 200 250 300 350 400 Рис. 6. График зависимости индекса деформируемости эритроцитов крыс от осмоляльности среды инкубирования клеток (n=7).

Видно, что максимальное значение индекса деформируемости эритро цитов крыс (0.24 ± 0.013) зарегистрировано после инкубации этих клеток в изоосмоляльной среде (300 mOsm/kg). При увеличении осмоляльности инку бационной среды от 300 до 450 mOsm/kg наблюдалось постепенное сниже ние индекса деформируемости эритроцитов. Так, после инкубации эритроци тов в гиперосмоляльном растворе (450 mOsm/kg) индекс деформируемости эритроцитов достоверно снизился до 0.12±0.021 и это снижение по сравне нию со значением индекса деформируемости эритроцитов, инкубированных в изоосмоляльной среде составило 50% (P 0.05). После инкубирования эритроцитов в гипоосмоляльной среде (200 mOsm/kg) индекс деформируемо сти эритроцитов составил 0.18±0.013, т.е. был на 20% ниже значения индекса деформируемости эритроцитов, инкубированных в изоосмоляльной среде (P 0.05).

Таким образом, результаты исследований показывают, что различные физико-химические факторы по-разному влияют на деформируемость эрит роцитов, а использование сконструированного нами эктацитометра позволяет выявлять эти различия.

3. Исследование деформируемости эритроцитов крыс в опытах in vivo.

Известно, что деформируемость эритроцитов изменяется под влиянием стресс-нагрузок на организм /Fiocco, Quattrocchi, Neirotti, et al., 1984;

Sung, Chien, 1992;

Викулов, Мельников, Осетров 1999;

Муравьев с соавт., 2000/.

В наших исследованиях в качестве факторов, влияющих на деформи руемость эритроцитов, использовались такие стресс-нагрузки как принуди тельное плавание и кратковременное перегревание. Известно, что стресс нагрузки изменяют иммуногематологическую реакцию, которая развивается достаточно быстро и может быть зарегистрирована по изменению количест венного состава лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови /Гольдберг, 1992/. Поэтому в качестве гематологического критерия стрессор ного состояния организма экспериментальных животных использовался ана лиз лекоформулы /Стенко, 1975/, результаты которого отображены в табли цах 1 и 2.

Таблица № Лейкоформула крыс, подвергнутых принудительному плаванию (М±m) Показатель Лейкоциты, Палочкояд. Сегмент. Эозинофи- Моноци- Лимфоци 109/л нейтр,% нейтр.,% лы,% ты,% ты,% Контроль 4.40±0.11 0.75±0.25 16.75±2.03 1.38±0.42 1.82±0.23 79.30±2. (n=8) Принудитель- 6.03±0.19 1.55±0.21 25.73±1.74 0.18±0.12 2.00±0.38 70.73±1. ное плавание *** * ** * ** (n=8) Примечание: достоверность различий по сравнению с контролем: * Р 0.05;

**- Р 0.01;

*** - Р 0. Таблица № Лейкоформула крыс, подвергнутых перегреванию (M±m) Показатель Лейкоциты, Палочкояд. Сегмент. Эозинофи- Моноци- Лимфоци 109/л нейтр,% нейтр.,% лы,% ты,% ты,% Контроль 4.20±0.12 0.71±0.22 16.61±2.1 1.42±0.41 1.9±0.25 80.31±2. (n=8) Перегревание 6.10±0.21 1.68±0.20 26.84±1.65 2.57±0.38 1.34±0.32 68.29±1. (n=8) *** * ** * *** Примечание: достоверность различий по сравнению с контролем: * Р 0.05;

**- Р 0.01;

*** - Р 0. Как видно из таблиц 1 и 2 после принудительного плавания и перегре вания в крови опытных животных было зарегистрировано достоверное уве личение количества лейкоцитов, палочкоядерных нейтрофилов, сегментоя дерных нейтрофилов и эозинофилов, и достоверное снижение количества лимфоцитов.

Анализ полученных экспериментальных данных свидетельствует о стресс-реакции животных, возникшей на стадии напряжения стресса под воз действием стресс-нагрузок, что несомненно должно было отразиться на из менении деформируемости эритроцитов.

Результаты исследования по деформируемости эритроцитов крыс под влиянием стресс-нагрузок представлены на рис. 7 и 8.

Id 1.

2.

H/m Рис.7. График зависимости индекса деформируемости эритроцитов крыс от усилия сдвига после принудительного плавания животных.

1 –принудительное плавание животных;

2 - контроль (n=16).

Id 1.

2.

H/m Рис.8. График зависимости индекса деформируемости эритроцитов крыс от усилия сдвига после перегревания животных. 1 – перегревание жи вотных;

2- контроль (n=16).

Как показали результаты исследования, после принудительного плава ния крыс деформируемость эритроцитов достоверно увеличивалась при ма лых, средних и больших усилиях сдвига по сравнению с контролем. Так при усилии сдвига 5.2 Н/м2 индекс деформируемости клеток контрольных крыс составил 0.11 ± 0.013, а после принудительного плавания - увеличился на 27% и составил 0.14 ± 0.012 (P 0.05). На максимальном значении усилия сдвига (49 Н/м2) индекс деформируемости эритроцитов крыс в контроле со ставил 0.23 ± 0.012, а в опыте - 0.26 ± 0.014, т.е. увеличился на 13% (P0.05).

У крыс, подвергнутых кратковременному перегреванию, индекс де формируемости эритроцитов достоверно увеличивался при малых и больших значениях усилия сдвига по сравнению с показателями контрольной группы крыс. Так, например, при усилии сдвига 5.2 Н/м2 индекс деформируемости эритроцитов опытных крыс увеличивался на 45 % и составлял 0.16 ± 0.012, в отличие от показателей контрольной группы крыс - 0.11 ± 0.013 (P0.05), а при максимальном усилии сдвига (49 Н/м2) индекс деформируемости эрит роцитов опытных крыс увеличивался на 20% и составлял 0.29 ± 0.012 в отли чие от показателей контрольной группы крыс - 0.24 ± 0.014 (P0.05).

Результаты проведенных исследований деформируемости эритроцитов крыс демонстрируют хорошую разрешающую способность нашего эктаци тометра и согласуются с результатами исследований по влиянию стресс нагрузок на деформируемость эритроцитов полученных другими авторами /Fiocco, Quattrocchi, Neirotti, et al., 1984;

Sung, Chien, 1992;

Викулов, Мельни ков, Осетров 1999;

Муравьев с соавт., 2000/.

В связи с этим, было целесообразно апробировать наш эктацитометр в клинической практике для исследования деформируемости эритроцитов больных артериальной гипертонией, а также для оценки влияния лекарствен ной терапии на исследуемый показатель крови.

4. Исследование деформируемости эритроцитов у больных артериальной гипертонией.

Было проведено клиническое испытание эктацитометрической уста новки при исследовании деформируемости эритроцитов у больных артери альной гипертонией с нормальным и повышенным содержанием холестерина в крови. Кроме того, исследовалась деформируемость эритроцитов больных артериальной гипертонией после 4-х месячного амбулаторного курса лечения гипотензивным препаратом моноприл (фозиноприл).

Результаты исследований деформируемости эритроцитов больных ар териальной гипертонией с различным уровнем холестерина в крови пред ставлены на рис. 9.

Id 3.

H/m Рис. 9. График зависимости индекса деформируемости эритроцитов здоровых людей и больных артериальной гипертонией с различным со держанием холестерина в крови: 1 – здоровые люди (n=20);

2 – больные артериальной гипертонией и с нормальным содержанием холестерина в крови (n=35);

3 – больные с артериальной гипертонией и с повышенным содержанием холестерина в крови (n=32).

Отмечено достоверное снижение деформируемости эритроцитов у больных артериальной гипертонией с повышенным и нормальным уровнем холестерина в крови по сравнению со здоровыми людьми. Так, у больных ар териальной гипертонией с повышенным содержанием холестерина в крови индекс деформируемости эритроцитов на максимальном усилии сдвига ( Н/m2) составил 0.33 ± 0.014, а у здоровых людей - 0.37 ± 0.013 (снижение на 11%, P 0.05). У больных артериальной гипертонией с нормальным содержа нием холестерина в крови на усилии сдвига 49 Н/m2 индекс деформируемо сти эритроцитов составил 0.33 ± 0.012 по сравнению со здоровыми людьми 0.37 ± 0.013 (снижение на 11%, P0.05). Достоверных различий в деформи руемости эритроцитов при всех усилиях сдвига между больными артериаль ной гипертонией с повышенным и нормальным уровнем холестерина в крови обнаружено не было.

Результаты проведенных исследований хорошо согласуются с данными других авторов, которые также отмечали снижение деформируемости эрит роцитов у больных артериальной гипертонией /Китаева с соавт., 1991;

Алек сандрова с соавт., 1991;

Кравцов, Дулин, Постнов, 1991;

Муравьев с соавт., 2000/.

На следующем этапе исследования изучалось влияние 4–х месячного амбулаторного курса лечения гипотензивным препаратом моноприл на де формируемость эритроцитов больных артериальной гипертонией с повы шенным содержанием холестерина в крови. При этом регистрировалось ар териальное давление и содержание холестерина в крови. Было отмечено дос товерное снижение систолического и диастолического артериального давле ний у больных гипертонией на протяжении курса лечения препаратом моно прил. Так, например, средний показатель систолического артериального дав ления у больных до лечения моноприлом составлял 158 ± 1.2 мм. рт. ст., а после лечения наблюдалось достоверное снижение этого показателя до 135 ± 1.1 мм. рт. ст. (P0.05). Уровень диастолического артериального давления до лечения составлял 100±0.3 мм. рт. ст., а после лечения – 85±0.4 (P0.05).

Уровень холестерина в крови больных артериальной гипертонией не изме нялся на протяжении курса лечения (6.13 ± 0.51 ммоль/л, и 5.85 ± 0. ммоль/л до и после лечения соответственно).

Результаты исследования деформируемости эритроцитов больных арте риальной гипертонией с повышенным содержанием холестерина в крови до и после 4-х месячного курса лечения препаратом моноприл представлены на рис.10.

Видно, что после 4-х месячного амбулаторного лечения препаратом мо ноприл у больных артериальной гипертонией наблюдалось достоверное сни жение деформируемости эритроцитов на усилии сдвига 49 Н/m2. Так, индекс деформируемости эритроцитов у больных артериальной гипертонией до ле чения препаратом моноприл составлял 0.33 ± 0.011, а после 4-х месячного курса лечения снизился на 12% и составил 0.29 ± 0.012 (P 0.05). На средних и малых усилиях сдвига достоверные различия в деформируемости эритро цитов отсутствовали Id 0, 0,35 0,3 2.

0, 0, 0, 0, 0, 0 Н/m 5,2 8,7 12,2 17,5 21 24,5 33,2 36,7 45,5 Рис.10. График зависимости индекса деформируемости эритроцитов у больных артериальной гипертонией с повышенным содержанием холе стерина в крови: 1 – до лечения;

2 – после 4 –х месячного курса лечения моноприлом (n =32).

Выводы 1. Создан усовершенствованный эктацитометр с хорошей разрешающей спо собностью, позволяющий проводить эффективный экспресс-анализ дефор мируемости эритроцитов с использованием персонального компьютера и специального программного обеспечения в опытах in vivo, in vitro и в клини ческих исследованиях.

2. В опытах in vitro отмечалось снижение деформируемости эритроцитов по сле инкубирования клеток в средах с разными значениями рН, температуры, осмоляльности и в средах инкубирования с различными концентрациями глютарового диальдегида. Максимальная деформируемость эритроцитов от мечалась после инкубирования клеток в средах с температурой 37°С, рН 7 7.4, осмоляльностью = 300 mOsm/kg и в среде инкубирования, не содержа щей глютаровый диальдегид.

3. Принудительное плавание и кратковременное перегревание крыс приводи ло к снижению количества лимфоцитов и увеличению числа эозинофилов, нейтрофилов и лейкоцитов в периферической крови. Деформируемость эритроцитов опытных животных после стресс-нагрузок увеличивалась.

4. Деформируемость эритроцитов больных артериальной гипертонией с по вышенным и нормальным уровнем холестерина в плазме крови достоверно ниже деформируемости эритроцитов здоровых людей. Деформируемость эритроцитов больных артериальной гипертонией с повышенным содержани ем холестерина в крови не отличалась от деформируемости эритроцитов больных артериальной гипертонией с нормальным уровнем холестерина в крови.

5. У больных артериальной гипертонией с повышенным содержанием холе стерина в крови после 4-х месячного амбулаторного курса лечения препара том моноприл отмечалось снижение артериального давления и деформируе мости эритроцитов на максимальном усилии сдвига (49 H/m2). При этом со держание холестерина в крови не изменялось.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Эктацитометрия. Новые технические решения. Новые перспективы / Бел кин А.В., Марьинских В.В., Сайфиев Р.Р., Шалабодов А.Д. // Сборник тези сов научных работ: «Физика в биологии и медицине»- Екатеринбург, 2001. – С. 10-11.

2. Оценка деформируемости эритроцитов различной степени зрелости /Белкин А.В., Марьинских В.В., Сайфиев Р.Р., Шалабодов А.Д. // Тезисы докладов: «XVIII Съезд физиологического общества им. И.П. Павлова» - Ка зань, 2001. С. – 309.

3. Исследование адаптационных механизмов системы кроветворения в ответ на острую кровопотерю / Белкин А.В., Доценко А.А., Сайфиев Р.Р., Шалабо дов А.Д. // Межвузовский сборник научных трудов: «Актуальные проблемы адаптации человека» - Сургут, 2001. С. – 35-36.

4. Влияние физиологических стрессов на реологические показатели эритро цитов крыс /Белкин А.В., Марьинских В.В., Сайфиев Р.Р., Шалабодов А.Д. // В сборнике научных работ: «Актуальные проблемы эволюционной и популя ционной физиологии человека» - Тюмень, 2001. С. – 39 - 40.

5. Новые конструктивные решения в эктацитометрии / Белкин А.В., Марь инских В.В., Сайфиев Р.Р., Шалабодов А.Д. // Тезисы докладов: «XII Между народное совещание и V школа по эволюционной физиологии» - С. Петербург, 2001. - С. 20.

6. Исследование деформационных свойств эритроцитов с использованием усовершенствованного эктацитометра / Белкин А.В., Марьинских В.В., Сай фиев Р.Р., Шалабодов А.Д. // Тезисы докладов: «VI Всероссийская конферен ция по биомеханике – Биомеханика – 2002» - Н. Новгород, 2002. - С. 33.

7. Исследование эффективности ингибитора АПФ моноприла в терапии ос ложненной артериальной гипертонии /Попова С.Н., Вершинина А.М., Вебер Э.Е., Гапон Л.И., Сайфиев Р.Р. // Сборник тезисов научных докладов: «Акту альные проблемы кардиологии» - Тюмень, 2002.- С.-141-142.