Анализ дифференцировки in vitro сателлитных клеток и миобластов, выделенных из скелетных мышц крыс на разных стадиях онтогенеза
На правах рукописи
БАЛАН ОЛЬГА ВИКТОРОВНА АНАЛИЗ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ in vitro САТЕЛЛИТНЫХ КЛЕТОК И МИОБЛАСТОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ КРЫС НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ОНТОГЕНЕЗА 03.00.30 – биология развития, эмбриология 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2009
Работа выполнена в лаборатории биофизики развития Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН Научные руководители: доктор биологических наук, профессор ОЗЕРНЮК Николай Дмитриевич, кандидат биологических наук ВОРОТЕЛЯК Екатерина Андреевна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук АЛЕКСАНДРОВА Мария Анатольевна доктор биологических наук ДОРОНИН Юрий Константинович
Ведущая организация: кафедра гистологии и эмбриологии лечебного факультета ГОУ ВПО «Российского государственного медицинского университета» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.
Защита диссертации состоится «20» мая 2009 г. в1400 часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу:
119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26.
Сайт: http://idbras.comcor.ru/;
e-mail: [email protected].
С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К.
Кольцова РАН.
Автореферат разослан «_»2009 года.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Абрамова Е.Б.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Изучение процессов роста, дифференцировки и восстановления мышечной ткани за счет стволовых клеток представляет собой одно из актуальных направлений современной биологии развития, молекулярной и клеточной биологии. В литературе имеются данные, что стволовые клетки скелетных мышц представляют собой гетерогенную популяцию, в которой имеется два типа клеток. Первый тип – сателлитные клетки, формирующие популяцию коммитированных клеток-предшественников миогенной линии дифференцировки (Zammit, Beauchamp, 2001;
Charge, Rudnicki, 2004);
второй – мультипотентные предшественники сателлитных клеток, которые и являются собственно стволовыми клетками мышц (Seale, Rudnicki, 2000). Однако большинство авторов придерживается общепризнанной точки зрения, согласно которой процессы роста и регенерации скелетных мышц обеспечиваются за счет популяции сателлитных клеток (Bailey et al., 2001;
Seale et al., 2001;
Zammit, Beauchamp, 2001;
Charge, Rudnicki, 2004). Cателлитные клетки мышечной системы являются перспективной моделью для изучения клеточных и молекулярно-генетических механизмов пролиферации, дифференцировки, апоптоза и других процессов, протекающих в ходе развития мышц.
Исследования, которые проводятся в области биологии сателлитных клеток, направлены на изучение формирования их пула в период развития мышечной ткани в эмбриогенезе (Seale, Rudnicki, 2000;
Gros et al., 2005), регуляции самообновления и поддержания пула этих клеток в ходе индивидуального развития, контроля процессов активации, пролиферации и дифференцировки сателлитных клеток (Cooper et al., 1999;
Anderson, 2000;
Shen et al., 2002;
Hill et al., 2003;
Charge, Rudnicki, 2004;
Shinin et al., 2006).
Поскольку сателлитные клетки образуются в эмбриогенезе в период формирования мышечной ткани и функционируют на протяжении всего онтогенеза, важно выяснить, существуют ли различия между сателлитными клетками, выделенными из мышц в период эмбрионального и постнатального периодов развития. Существенным является вопрос о том, способны ли сателлитные клетки к самоподдержанию в культуре, полученной из мышц животных на разных этапах индивидуального развития. Терминальный этап дифференцировки сателлитных клеток in vitro, как и in vivo – синтез белков сократительного аппарата, прежде всего миозина. Несмотря на многочисленные исследования генов различных изоформ миозина in vivo, в литературе отсутствуют данные о специфичности экспрессии этих генов в ходе дифференцировки in vitro миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц животных на разных этапах онтогенеза.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы – сравнительное исследование процесса дифференцировки in vitro сателлитных клеток и миобластов, выделенных из мышц крыс на разных этапах онтогенеза.
В работе предстояло решить следующие задачи:
1. Получить культуры клеток из мышц крыс на 20-21 сут эмбриогенеза, 3-5 сут постнатального развития, а также из мышц взрослых половозрелых крыс;
2. Охарактеризовать полученные культуры с использованием иммуноцитохимических и молекулярно-генетических маркеров;
3. Сравнить адгезивные свойства и темпы дифференцировки миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц животных на разных этапах индивидуального развития;
4. Исследовать экспрессию гена Pax7 – основного транскрипционного фактора, ответственного за самообновление и поддержание пула сателлитных клеток;
5. Провести сравнительный анализ экспрессии генов-маркеров миогенной дифференцировки клеток-предшественников, выделенных из мышц животных на разных этапах онтогенеза;
6. Проанализировать экспрессию различных изоформ тяжелых цепей миозина (эмбриональную, перинатальную, - и 2а) при дифференцировке сателлитных клеток и миобластов, выделенных из мышц животных на разных этапах онтогенеза.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Впервые проведено комплексное исследование дифференцировки сателлитных клеток и миобластов (миогенных клеток-предшественников), выделенных из бедренных мышц на 20-21 сут эмбриогенеза (20-21Э), на 3-5 сут постнатального развития (3-5П) и взрослых крыс (3 мес). Показано, что полученные культуры способны к самоподдержанию in vitro, о чем свидетельствует постоянство экспрессии гена транскрипционного фактора Рах7. Впервые выявлены различия в адгезивных свойствах и темпах дифференцировки in vitro миогенных клеток-предшественников, изолированных из мышц животных на разных этапах индивидуального развития. Эти различия обусловлены, по-видимому, особенностями микроокружения, в котором данные клетки находятся in vivo. Впервые показана последовательная экспрессия генов, кодирующих эмбриональные, перинатальные, - и дефинитивные 2а тяжелые цепи миозина в ходе дифференцировки миогенных клеток-предшественников из мышц животных на разных этапах онтогенеза. Модифицирован метод получения культуры миогенных клеток-предшественников, позволивший повысить эффективность выделения сателлитных клеток.
Полученные результаты могут быть использованы при чтении курсов лекций по биологии развития, клеточной биологии и биологии стволовых клеток, а также учитываться при проведении биомедицинских исследований.
Личное участие автора. Вся работа выполнена непосредственно автором.
Поставленные задачи решены с применением современных иммуноцитохимических и молекулярно-генетических методов. Выводы сделаны на основании собственных оригинальных данных.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на II Съезде Общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт Петербург, 2007 г.);
на конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова (Москва, 2007 г.);
на XV Школе «Актуальные проблемы биологии развития» (Звенигород, 2008 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК – 3, глава в коллективной монографии – 1, тезисов докладов и материалов конференций – 3.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на страницах, содержит 33 рисунка, 7 таблиц и состоит из следующих разделов:
введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего цитируемых источника.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект исследования. Работа проводилась на клеточных культурах, которые содержали сателлитные клетки и одноядерные миобласты. Культуры клеток получали из бедренных мышц крыс на 20-21 сут эмбрионального развития (20-21Э), на 3-5 сут постнатального развития (3-5П) и из мышц взрослых крыс (3 мес.) неинбредной линии Wistar.
Получение и культивирование клеток. Изолированную мышечную ткань измельчали и помещали в 0.2% раствор коллагеназы I типа (Worthington, США) на 20-40 мин при 370С, затем последовательно центрифугировали.
Конечный осадок, содержащий миогенные клетки-предшественники, ресуспендировали в 1 мл среды культивирования. Количество клеток подсчитывали с использованием камеры Горяева. Суспензию миогенных клеток-предшественников высевали в культуральные флаконы (Greiner, Германия) для выделения тотальной РНК (плотность посева 2 х 105 кл/мл) и в 12 или 24-луночные планшеты (Greiner) для иммуноцитохимического анализа (плотность посева 2 х 104 кл/мл). Культивировали клетки в среде F12 (HyClone, Великобритания) или DMEM (Sigma, США) с содержанием 10% эмбриональной телячьей сыворотки (БиоЛот, Россия), 2.0 мМ L-глютамина, ед/мл пенициллина-стрептомицина и 10 мг/мл гентамицина. Смену среды проводили каждые 3-4 сут. После пассирования миогенные клетки предшественники культивировали без добавления антибиотиков.
Гистологическое исследование. Для гистологического анализа применяли методику окрашивания клеток азур-эозином по Романовскому Гимза. Клетки промывали раствором Хэнкса (БиоЛот), фиксировали 96% этиловым спиртом в течение 10-15 мин и окрашивали в течение 40-45 мин азур эозином (ПанЭко), приготовленным на 0.1 М фосфатно-солевом буфере (PBS) рН 6.8 из расчета 1 : 20. Гистологическую реакцию анализировали с помощью светового микроскопа Olympus AH-3 (Австрия).
Приготовление криосрезов. Мышечную ткань фиксировали в 4% параформальдегиде, приготовленном на 0.1 M PBS (pH 7.4), в течение 24 ч при комнатной температуре. Затем отмывали в 3 сменах 0.1 M PBS и последовательно выдерживали в 5%, 10% и 20% сахарозе. Замораживали при -70°С в смеси Tissue Tec O.C.T. (Leica, Германия) и 0,1 M PBS с 20% сахарозой в соотношении 1 : 1. На криостате получали поперечные срезы толщиной 7- мкм. Перед инкубацией с антителами срезы отмывали в 0.1 М PBS (30 мин).
Иммуноцитохимический анализ. Для иммуноцитохимических исследований культуры клеток фиксировали 4% параформальдегидом. После 10 минутной фиксации клетки промывали PBS и пермабилизировали в 0.25% ном растворе Triton X-100 30 мин. Для уменьшения неспецифического связывания антител клетки инкубировали в блокирующем растворе 3% бычьего сывороточного альбумина (Sigma). Список использованных антител, фирм производителей и разведения представлены в таблице 1. После инкубации с первичными антителами клетки промывали PBS и наносили вторичные антитела, конъюгированные с флуорохромом Alexa Fluor 488 или (Molecular Probes, США). Для окрашивания ядер клеток использовали Hoechst 33342 (1 : 1000, Sigma) или йодистый пропидий (PI) (1 : 100, Sigma). При использовании PI клетки предварительно обрабатывали РНКазой. Готовые препараты заключали под покровные стекла в глицерин. Специфичность антител подтверждали в контрольных экспериментах. Для анализа полученных результатов использовали флуоресцентный микроскоп Leica DM RXA (Германия), оснащенный набором светофильтров и фотокамерой Olympus DP70. Обработку результатов проводили с использованием программы ImageJ.
Таблица 1. Антитела, используемые для иммуноцитохимии.
Антитела Фирма Разведение Mouse monoclonal anti Pax7 R&D; Systems, UK 1 : Mouse monoclonal anti CD34 Santa Cruz, USA 1 : Mouse monoclonal anti CD45 BioLegend, USA 1 : Mouse monoclonal anti Desmin Abcam, UK 1 : Mouse monoclonal anti M-Cadherin Abcam, UK 1 : Mouse monoclonal anti Myosin Slow Skeletal Abcam, UK 1 : Mouse monoclonal anti Myosin Fast Skeletal Abcam, UK 1 : Mouse monoclonal anti Ki67 Chemicon, USA 1 : Выделение тотальной РНК и мРНК. Тотальную РНК (тотРНК) выделяли из культур миогенных клеток-предшественников на разных стадиях дифференцировки in vitro. Выделение тотРНК осуществляли с помощью TRI® Reagent (Sigma) согласно протоколу производителя. Из тотРНК выделяли мРНК с использованием магнитных частиц (Силекс, Россия) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.
Получение и нормировка кДНК библиотек. Синтез первой цепи кДНК проводили на мРНК с помощью фермента M-MLV обратной транскриптазы и олиго(дТ)15 праймеров (Силекс). Для оценки уровня экспрессии исследуемого гена кДНК были предварительно отнормированы по гену глицеральдегид-3 фосфат-дегидрогеназы (GAPDH). Нуклеотидная последовательность праймеров к GAPDH, размер ПЦР-фрагмента представлены в таблице 2.
Конструирование праймеров. При конструировании праймеров для ПЦР использовали компьютерную программу DNAStar. Информацию о структуре исследуемых генов получали из международной базы данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI BLAST, GeneBank, США). Для исключения возможности получения ПЦР-продукта на матрице хромосомной ДНК праймеры обычно конструировали по нуклеотидной последовательности разных экзонов. Нуклеотидные последовательности и размер ПЦР-фрагментов представлены в таблице 2.
Полимеразная цепная реакция. ПЦР со специфическими праймерами проводили на матрице кДНК с использованием ColoredTaq-полимеразы (Силекс) на амплификаторе Mastercycler (Eppendorf, Германия). ПЦР-продукты разделяли электрофоретически в 1.5%-ном агарозном геле (Amersco, США) с добавлением бромистого этидия (Sigma, США). Уровень экспрессии генов оценивали на УФ-анализаторе гелей с использованием программы Quantity One® (BIO RAD, США).
Таблица 2. Праймеры для ПЦР-анализа Ген Нуклеотидная последовательность Размер ПЦР-фрагмента, н.п.
праймера 5 cgggaccggctgctgaaggac 3 (экзон 3) Pax 5 aagttggtggaagacggccc 3 (экзон 6) 5 ggagacatcctcaagcgatgc 3 (экзон 3) MyoD 5 agcacctggtaaatcggattg 3 (экзон 3) 5 atgtgccacagccacatcg 3 (экзон 12) M-Cadherin 5 gccatacatgtccgccagc 3 (экзон 13) 5agaaggccaaaaaggccat 3 (экзон 37) Эмбриональные 5 atgtggaaaggggttacgt 3 (экзон 42) ТЦМ 5 agaaggccaagaaagccat 3 (экзон 34) Перинатальные 5 agtcagcagtgggagaaaag 3 (экзон 38) ТЦМ 5 acagaggaagacaggaagaacctac 3 (экзон 36) ТЦМ 5 gggcttcacaggcatccttag 3 (экзон 38) 5 tatcctcaggcttcaagatttg 3 (экзон 37) ТЦМ 2а 5 taaatagaatcacatggggaca 3 (экзон 39) 5 tgcagtgccagcctcgtctcatag 3 (экзон 1) GAPDH 5cccttttggccccacccttcag 3 (экзон 1) Статистическая обработка данных. Статистическая обработка результатов, полученных на основе данных иммуноцитохимии, проводилась в программе MS Excel. При обработке результатов оценивали значение средней величины, стандартное отклонение. При оценке достоверности различий показателей использовали t-критерий Стьюдента. Различия считали статистически достоверными, если уровень значимости был р0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Поведение миогенных клеток-предшественников в культуре.
Поведение клеток в культуре во многом обусловлено микроокружением (нишей), из которого эти клетки были выделены. В связи с этим интересным представлялась сравнительная характеристика миогенных клеток предшественников, изолированных из мышц животных на разных стадиях индивидуального развития. Для изучения поведения миогенных клеток предшественников in vitro культуры клеток были получены из фетальных (2021Э), неонатальных (35П) и мышц взрослых крыс. Для культивирования миогенных клеток использовали питательные среды: F12 с содержанием 10% ЭТС и 0.2 мМ Са2+ и F12 или DMEM с содержанием 10% ЭТС и 2.0 мМ Са2+.
Анализ первичных культур, проведенный на первом этапе исследований, позволил выявить различия в адгезивных свойствах миогенных клеток предшественников, выделенных из мышц животных на разных стадиях онтогенеза. Было показано, что миогенные клетки-предшественники, выделенные из бедренных мышц крыс 20-21Э, обладают более выраженными адгезивными свойствами по сравнению с клетками из мышц 3-5П и взрослых животных. В первичной культуре прикрепление и распластывание клеток, изолированных из мышц крыс 20-21Э, происходит в течение первых 24 часов культивирования, тогда как для клеток, полученных из мышц 3-5П и взрослых крыс, это время составляет 48-72 часа. Адгезивные свойства клеток не зависели от типа используемых сред. Гистологическое окрашивание клеточных культур азур-эозином после первых суток инкубации в ростовой среде показало, что полученные культуры содержали два морфологических типа клеток:
вытянутые, характерной для миобластов биполярной веретеновидной формы и более округлые с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением, свойственным, как правило, сателлитным клеткам (рис. 1). Подобные различия могут быть связаны с разной степенью зрелости клеток. Однако для идентификации и характеристики этих клеток необходимо применение комплексного подхода с использованием молекулярно–генетических и иммуноцитохимических методов. Следует отметить, что миогенные клетки предшественники отличались не только по морфологическим критериям, но и по адгезивным свойствам. Так вытянутые клетки веретеновидной формы обладали более выраженными адгезивными свойствами по сравнению с клетками округлой формы. Время прикрепления к субстрату после пересева составляла 5-10 мин. На основании различных адгезивных свойств были получены культуры клеток, в которых преобладали более округлые клетки с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением.
Рис. 1. Культуры миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц 20-21Э (А), 3 5П (Б) и взрослых (В) крыс. Окраска азур-эозином. Ув. х20.
В культуре миогенные клетки-предшественники проходят те же этапы дифференцировки, что и in vivo в процессе роста и восстановления мышечной ткани: активация сателлитных клеток, формирование миобластов, их слияние с образованием многоядерных миотуб, характеризующихся в дальнейшем сократительной активностью.
При использовании среды F12 с содержанием 10% ЭТС и 0.2 мМ Са2+ отмечалась только пролиферация клеток без признаков миогенной дифференцировки. Культивирование миогенных клеток-предшественников в среде DMEM с содержанием 10% ЭТС и 2.0 мМ Са2+ приводило к слиянию одноядерных миобластов с образованием двуядерных клеток, а впоследствии многоядерных миотуб (рис. 2). При дальнейшем культивировании отмечалось ритмичное сокращение сформировавшихся миотуб, которое продолжалось в течение нескольких суток. Подобное явление было характерно как для культуры клеток из мышц 20-21Э, так и для культур клеток из мышц 3-5П и взрослых животных.
В дальнейших исследованиях среда F12 с содержанием 10% ЭТС и 0. мМ Са2+ была использована в качестве ростовой, а среда DMEM с содержанием 10% ЭТС и 2.0 мМ Са2+ – дифференцировочной.
Рис. 2. Дифференцировка in vitro миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц 20-21Э (А, Г, Ж), 3-5П (Б, Д, З) и взрослых (В, Е, И) животных.
А, Б, В – образование двуядерных миобластов (указаны стрелкой).
Окраска азур-эозином. Ув. х 20.
Г, Д, Е – слияние миобластов с образованием 3–4-ядерных миотуб.
Прижизненная съемка. Ув. х20.
Ж, З, И – формирование многочисленных многоядерных миотуб. Прижизненная съемка. Ув. х4.
Иммуноцитохимическая характеристика культур сателлитных клеток и миобластов, выделенных из мышц крыс на разных стадиях онтогенеза.
Иммуноцитохимическое исследование проводили с использованием специфических антител против Pax7, CD34, CD45, десмина и м-кадгерина.
Антитела к Pax7 и CD34 были выбраны для выявления сателлитных клеток.
Мембранный белок CD34 также присутствует в сателлитных клетках (Beauchamp et al., 2000), однако отсутствует в миобластах и в терминально дифференцированных миофибриллах. Антитела к CD45 были использованы в качестве негативного контроля. Для идентификации одноядерных миобластов как пролиферирующих, так и вышедших из клеточного цикла и коммитированных к слиянию, были использованы антитела к 2+ цитоплазматическому белку промежуточных филаментов десмину и Са связывающему мембранному белку м-кадгерину.
Иммуноцитохимический анализ свидетельствует о том, что полученные нами клеточные культуры гетерогенны по своему составу и включают две популяции клеток: сателлитные клетки и одноядерные миобласты (рис. 3).
Сравнительная характеристика полученных культур клеток на основе иммуноцитохимического анализа показала, что количество сателлитных клеток в культуре из мышц 20-21Э, 3-5П и взрослых животных значительно не отличалось. Так, культура миогенных клеток-предшественников, выделенная из мышц 20-21Э, содержала в среднем 86 ± 2,3% сателлитных клеток, из мышц 3-5П – 88 ± 2,6%, из мышц взрослых животных – 84 ± 2,7%. Остальную часть клеток составляли одноядерные миобласты.
Рис. 3. Содержание сателлитных клеток (А) и миобластов (Б) в культуре миогенных клеток предшественников, выделенных из фетальных (1), неонатальных (2) и мышц взрослых животных (3) Субпопуляцию сателлитных клеток идентифицировали по наличию транскрипционного фактора Pax7 и мембранного белка CD34. Данные по иммуноцихимическому выявлению Pax7, CD34 приведены на рисунках 4 и 5.
Одноядерные миобласты выявляли по окрашиванию антителами к десмину и м кадгерину (рис. 6).
Рис. 4. Иммуноцитохимическое выявление Рис. 5. Иммуноцитохимическое транскрипционного фактора Pax7 (а, б, в) в окрашивание антителами против CD сателлитных клетках в культуре миогенных (а, б, в) и CD45 (а', б', в') миогенных клеток-предшественников, выделенных из клеток-предшественников, выделенных мышц 20-21Э (а), 3-5П (б) и взрослых (в) из мышц крыс 20-21Э (а), 3-5П (б) и животных. Ядра клеток окрашены Hoechst взрослых (в) животных. Ядра клеток 33342 (а', б', в'). окрашены Hoechst 33342.
Согласно данным литературы источником миофибрилл в культуре могут служить не только сателлитные клетки и миобласты, но и мышечные SP (side population)-клетки (Asakura et al., 2002;
Bachrach et al., 2006;
Gussoni et al., 1999), поэтому было важно оценить присутствие в культуре клеток этого типа.
Миогенные SP-клетки выявляются по коэкспрессии CD34 и CD45, а также по способности выводить витальные красители, в частности, Hoechst 33342.
Отрицательная реакция при окрашивании антителами к CD45 свидетельствует о том, что культуры клеток-предшественников не содержали миогенных SP клеток (рис. 5а', б', в').
Сравнительный анализ экспрессии генов маркеров миогенных клеток предшественников.
Важной задачей настоящей работы был сравнительный анализ экспрессии ряда генетических маркеров сателлитных клеток и миобластов в культурах миогенных клеток-предшественников, полученных из мышц животных на разных стадиях индивидуального развития.
Исследование экспрессии гена Pax7 в культурах миогенных клеток предшественников. Из данных литературы известно, что важную роль в процессе самообновления и поддержания пула сателлитных клеток in vivo играет транскрипционный фактор Pax7. В связи с этим представлялось интересным сравнительное исследование экспрессии гена Pax7 в культурах миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц животных 20-21Э, 3-5П и взрослых крыс. Для изучения экспрессии гена Pax7 были получены кДНК-библиотеки, синтезированные на мРНК из миогенных клеток предшественников, выделенных из мышц крыс на разных стадиях индивидуального развития. Для получения ПЦР-фрагментов были сконструированы пары праймеров по нуклеотидным последовательностям гена Pax7 крысы. Результаты ПЦР-анализа экспрессии Pax7 в культурах миогенных клеток-предшественников представлены на рисунке 6. Существенных различий в уровне экспрессии Pax7 в культурах клеток, полученных из мышц животных на разных стадиях онтогенеза, не наблюдается.
Рис. 6. ПЦР-анализ экспрессии Pax в культурах миогенных клеток предшественников, полученных из мышц крыс 20-21Э (1), 3-5П (2) и из мышц взрослых животных (3).
кДНК отнормированы по GAPDH.
Иммуноцитохимический анализ экспрессии десмина и м-кадгерина в культурах сателлитных клеток и миобластов.
Как было отмечено выше, исследуемые клеточные культуры были гетерогенны и помимо сателлитных клеток включали субпопуляцию одноядерных миобластов.
Идентификацию миобластов проводили по экспрессии специфического маркера десмина. Известно, что цитоплазматический белок десмин в процессе дифференцировки впервые появляется в одноядерных миобластах и детектируется практически на протяжении всего миогенеза вплоть до формирования многоядерных миофибрилл. Использование Рис. 7. Иммуноцитохимическое выявление десмина (а), Ki67 (б) и м-кадгерина (в) в антител к этому белку миобластах в культуре миогенных клеток позволило идентифицировать предшественников, выделенных из мышц крыс все миобласты, входящие в эту 20-21Э. а', б', в' – совмещение изображений субпопуляцию: это и результата флуоресцентного мечения и ядер пролиферирующие клетки, и клеток, окрашенных Hoechst 33342.
миобласты вышедшие из клеточного цикла и готовые к слиянию.
Пролиферативную активность клеток оценивали по наличию в ядрах специфического белка Ki67, который присутствует на всех стадиях клеточного цикла за исключением фазы G0 (стадия пролиферативного покоя). Результаты иммуноцитохимического окрашивания антителами к десмину, Ki67 и м кадгерину представлены на рисунках 7, 8 и 9.
Субпопуляция одноядерных миобластов в составе гетерогенной клеточной культуры была представлена пролиферирующими Ki67(+) клетками и закончившими деление м-кадгерин(+) клетками. Следует отметить, что уровень экспрессии Ki67 и м-кадгерина в миобластах, выделенных из мышц животных на разных стадиях онтогенеза, существенно отличался. Так, субпопуляция миобластов культуры из мышц животных 20-21Э была представлена в основном м-кадгерин(+) миобластами, и только единичные клетки давали положительное окрашивание на антитела к Ki67 (рис. 7). В культуре из мышц крыс 3-5П и взрослых животных, наоборот, преобладали миобласты с иммунопозитивной реакцией на Ki67, а незначительное количество клеток экспрессировали м-кадгерин (рис. 8, 9).
Рис. 8. Иммуноцитохимическое Рис. 9. Иммуноцитохимическое выявление выявление десмина (а), Ki67 (б) и м- десмина (а), Ki67 (б) и м-кадгерина (в) в кадгерина (в) в миобластах в культуре миобластах в культуре миогенных клеток миогенных клеток-предшественников, предшественников, выделенных из мышц выделенных из мышц крыс 3-5П. а', б', в' взрослых крыс. а', б', в' – совмещение – совмещение изображений результата изображений результата флуоресцентного флуоресцентного мечения и ядер клеток, мечения и ядер клеток, окрашенных окрашенных Hoechst 33342. Hoechst 33342.
Была проведена также визуальная оценка распределения десмина, м кадгерина и Ki67 в миобластах, выделенных из мышц 20-21Э, 3-5П и взрослых животных (табл. 3). Исследование распределения маркеров м-кадгерина и Ki выявило различия в культурах клеток, выделенных из мышц животных на разных стадиях онтогенеза. В субпопуляции миобластов в культуре клеток предшественников, полученных из мышц животных 20-21Э, в отличие от клеток из мышц 3-5П и взрослых крыс, преобладают миобласты, коммитированные к слиянию.
Таблица 3.
Визуальная оценка распределения некоторых маркеров в миобластах в культуре миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц 20-21Э, 3-5П и взрослых животных.
Уровень экспрессии маркера в миобластах из мышц крыс Маркеры 20-21Э 3-5П и взрослые Десмин высокий высокий Ki67 низкий высокий М-кадгерин высокий низкий Влияние Са2+ на дифференцировку сателлитных клеток и одноядерных миобластов in vitro.
Поскольку кальций играет важную роль во многих клеточных процессах, одной из задач нашего исследования было изучение влияния внеклеточного Са2+ на дифференцировку сателлитных клеток и миобластов, выделенных из мышц новорожденных и взрослых крыс.
При культивировании миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц животных на разных стадиях онтогенеза, в течение 3, 5, 7, 10 и 14 сут в среде F12 с низкой концентрацией Са2+ (до 0.2 мМ) слияния миобластов не наблюдалось. Повышение концентрации Са2+ в среде культивирования до 1. мМ приводило к слиянию миобластов с образованием двуядерных клеток, в которых иммуноцитохимическим методом было показано наличие м-кадгерина, характерного для сливающихся миогенных клеток (табл. 4). Появление двуядерных миобластов, экспрессирующих мышечную форму кадгерина, отмечалось в культуре клеток, выделенных из мышц крыс 20-21Э, 3-5П и взрослых животных. Культивирование сателлитных клеток и миобластов в среде F12 или DMEM с концентрацией Са2+ 2.0 мМ приводило к активации сателлитных клеток с последующим их делением (рис. 11) и слиянию миобластов с образованием многоядерных миотуб. При дальнейшем культивировании клеток в указанных выше условиях отмечалось ритмичное сокращение сформировавшихся многоядерных миотуб.
Источником формирования многоядерных миотуб и миофибрилл служат, очевидно, не только одноядерные миобласты, входящие в состав исходной гетерогенной клеточной культуры, но и активирующиеся сателлитные клетки, дающие начало миобластам. Таким образом, только наличие в среде культивирования 2.0 мМ Са2+ приводит к образованию миофибрилл, экспрессирующих миозин.
Таблица 4.
Влияние различной концентрации Са2+ в среде культивирования на дифференцировку миобластов, выделенных из мышц животных на разных стадиях индивидуального развития.
Концентрация Са2+ в среде культивирования Сроки культиви- 0.2 мМ 1.25 мM 2.0 мМ рования, 20-21Э 3-5П и 20-21Э 3-5П и 20-21Э 3-5П и сут взрослые взрослые взрослые 3 одноядерные клетки Одноядерные Одноядерные Двуядерные Одноядерные клетки клетки миобласты клетки 5 одноядерные клетки Двуядерные Одноядерные Многоядерные Одноядерные миобласты клетки миотубы клетки 7 одноядерные клетки Двуядерные Двуядерные Многоядерные Двуядерные миобласты миобласты миотубы миобласты 10 одноядерные клетки Двуядерные Двуядерные Многоядерные Многоядерные миобласты миобласты миотубы миотубы Таким образом, при наличии всех факторов роста в среде культивирования низкая концентрация внеклеточного 2+ Са (0.2 мМ) служит ингибитором не только слияния миобластов и последующего образования многоядерных миотуб, но и активации сателлитных клеток. Повышение концентрации внеклеточного 2+ Са до 2.0 мМ (концентрация близкая к физиологической Рис. 11. Иммуноцитохимическое выявление концентрации во внеклеточной Pax7 (а, б, в) и Ki67 (а', б', в') в среде in vivo) способствует пролиферирующих сателлитных клетках.
Са2+-зависимых активации Клетки выделены из мышц крыс 20-21Э (ряд а), белков, участвующих в запуске 3-5П (ряд б) и взрослых животных (ряд в). Ядра дифференцировки сателлитных клеток окрашены Hoechst 33342 (а'', б'', в'').
клеток и миобластов.
Темпы дифференцировки сателлитных клеток и одноядерных миобластов in vitro.
Были изучены также темпы дифференцировки сателлитных клеток и одноядерных миобластов, выделенных из бедренных мышц животных на разных стадиях онтогенеза. Стадии дифференцировки клеток миогенного ряда определяли по экспрессии специфических маркеров, определяемых иммуноцитохимически. Темпы дифференцировки при культивировании этих клеток существенно отличаются. Если одноядерные клетки (сателлитные клетки и миобласты) из мышц крыс 20-21Э превращаются в двуядерные миобласты на третьи сутки культивирования, то из мышц 3-5П и взрослых животных - только на 7 сут. Формирование многоядерных миотуб происходило на 5 сут (20-21Э) и 10 сут (3-5П и взрослые) дифференцировки in vitro миогенных клеток-предшественников (табл. 4). При дальнейшем культивировании этих клеток наблюдалось активное сокращение миотуб, которое отмечалось на 6-7 сут (20-21Э) и 12-14 сут (3-5П и взрослые).
Таким образом, миогенные клетки-предшественники из скелетных мышц животных 20-21Э отличаются от клеток-предшественников из мышц 3-5П и взрослых крыс как в отношении адгезивных свойств, так и темпов миогенной дифференцировки в культуре.
Сравнительный анализ экспрессии генов маркеров миогенных клеток предшественников в ходе дифференцировки in vitro.
Исследование экспрессии гена Pax7 в процессе дифференцировки сателлитных клеток in vitro. Анализ экспрессии гена Pax7 проводили на разных этапах дифференцировки сателлитных клеток и одноядерных миобластов, выделенных из мышц крыс 20-21Э, 3-5П и взрослых животных.
Согласно полученным данным, которые представлены на рисунке 12, экспрессия гена Pax7 не претерпевает заметных изменений при культивировании сателлитных клеток в среде дифференцировки.
Рис. 12. ПЦР-анализ экспрессии гена Pax7 в культурах миогенных клеток-предшественников на стадиях дифференцировки: 1 – одноядерные клетки, 2 – двуядерные миобласты, 3 – многоядерные миотубы, 4 –сокращающиеся миотубы. кДНК отнормированы по GAPDH.
Таким образом, в ходе дифференцировки сателлитных клеток, выделенных из мышц крыс на разных этапах индивидуального развития, экспрессия гена Pax7 существенно не изменяется, что может свидетельствовать о сохранении сателлитными клетками способности к самоподдержанию.
Анализ экспрессия гена MyoD в процессе дифференцировки сателлитных клеток и миобластов. При изучении особенностей дифференцировки сателлитных клеток и миобластов in vitro представлялось интересным анализ экспрессии MyoD – мастер-гена миогенной дифференцировки, одного из представителей транскрипционных факторов сем.
bHLH. Известно, что активация экспрессии этого гена приводит к запуску программы дифференцировки в сателлитных клетках.
С использованием ПЦР-анализа были выявлены транскрипты MyoD на всех этапах дифференцировки миогенных клеток-предшественников.
Результаты ПЦР-анализа экспрессии MyoD представлены на рисунке 13.
Наличие транскриптов MyoD на стадии одноядерных клеток (рис. 13, колонка 1) указывают на тот факт, что в культуре уже присутствии клетки, более продвинутые в направлении миогенной дифференцировки. При культивировании клеток-предшественников в среде дифференцировки наблюдается заметное увеличение уровня экспрессии гена MyoD. Повышение уровня экспрессии исследуемого гена свидетельствует о запуске программы миогенеза. Максимальный уровень его экспрессии детектировался на стадии образования двуядерных миобластов, а далее отмечалось незначительное снижение. Полученные результаты подтверждают данные литературы, согласно которым in vivo транскрипционный фактор, кодируемый геном MyoD, участвует в регуляции только первых этапов миогенеза: активации сателлитных клеток и образования миобластов.
Рис. 13. ПЦР-анализ экспрессии гена MyoD в культуре миогенных клеток предшественников на стадиях дифференцировки:
1 – одноядерные клетки, 2 – двуядерные миобласты, 3 – многоядерные миотубы, 4 – сокращающиеся миотубы.
кДНК отнормированы по GAPDH.
Рис. 14. ПЦР-анализ экспрессии гена м-кадгерин в культуре миогенных клеток-предшественников на стадиях дифференцировки:
1 – одноядерные клетки, 2 –двуядерные миобластов, 3 –многоядерные миотубы, 4 – сокращающиеся миотубы.
кДНК отнормированы по GAPDH.
Анализ экспрессии гена, кодирующего м-кадгерин, в ходе дифференцировки миогенных клеток-предшественников. Для подтверждения данных иммуноцитохимического исследования м-кадгерина был проведен ПЦР-анализ экспрессии гена, кодирующего этот белок. Транскрипты гена м кадгерина были выявлены уже на стадии одноядерных клеток (рис. 14, колонка 1), что свидетельствует о наличии в культуре миобластов, коммитированных к слиянию. Следует отметить, что уровень экспрессии исследуемого гена в культуре клеток из мышц животных 20-21Э был несколько выше, чем в культуре клеток из мышц 3-5П и взрослых крыс. Таким образом, данные ПЦР анализа подтверждают результаты иммуноцитохимического исследования, согласно которым в культуре клеток из мышц животных 20-21Э в субпопуляции миобластов преобладали клетки, вышедшие из клеточного цикла и готовые к слиянию. В культуре клеток из мышц 3-5П и взрослых крыс субпопуляция миобластов представлена в основном пролиферирующими клетками. Транскрипты гена м-кадгерина были выявлены на всех этапах дифференцировки сателлитных клеток и миобластов (рис. 14, колонки 2, 3, 4).
Использование ПЦР-анализа позволило выявить различия в уровне экспрессии м-кадгерина. В ходе дифференцировки миогенных клеток-предшественников наблюдается заметное увеличение уровня экспрессии исследуемого гена.
Максимальный уровень экспрессии м-кадгерина детектировался на стадии образования двуядерных миобластов, когда наблюдается активное слияние клеток. Начиная со стадии формирования многоядерных миотуб наблюдалось незначительное снижение уровня экспрессии этого гена.
Исследование экспрессии различных изоформ тяжелых цепей миозина в процессе дифференцировки сателлитных клеток и миобластов in vitro.
Поскольку основу миофибриллярного аппарата составляют сократительные белки, в частности миозин, исследованию экспрессии генов, кодирующих тяжелые и легкие цепи миозина, посвящено немало работ.
Однако, данные представленные в литературе достаточно противоречивы.
Поэтому следующий этап нашего исследования был связан с изучением особенностей экспрессии различных изоформ тяжелых цепей миозина (ТЦМ) в ходе миогенеза in vitro.
Иммуноцитохимический анализ экспрессии медленной и быстрых изоформ ТЦМ. Использование специфических антител к ТЦМ позволило выявить наличие соответствующего белка на ранних этапах дифференцировки в одноядерных миобластах до момента их слияния с последующим образованием многоядерных миотуб (рис. 15), что согласуется с данными, представленными в литературе. Медленная изоформа ТЦМ выявлялась в одноядерных миобластах на 4 сут дифференцировки миогенных клеток предшественников, выделенных из мышц крыс 20-21Э (рис. 15а). В культуре клеток-предшественников из мышц 3-5П и взрослых животных медленная изоформа ТЦМ также была обнаружена в одноядерных миобластах, но на 5 сут инкубации в дифференцировочной среде (рис. 15а', а'').
Рис. 15. Иммуноцитохимическое выявление медленных ТЦМ на разных стадиях дифференцировки сателлитных клеток и миобластов, полученных из мышц 20-21Э (а, б, в), 3-5П (а', б', в') и взрослых животных (а'', б'', в''). Одноядерные (ряд а), двуядерные (ряд б) миобласты (обозначены стрелками) и многоядерные миотубы (ряд в). Ядра клеток окрашены Hoechst 33342.
В дальнейшем экспрессия этой изоформы ТЦМ выявлялась также на стадии двуядерных миобластов (рис. 15, ряд б) и на стадии многоядерных миотуб (рис. 15, ряд в). Следует отметить, что локализация миозина в одноядерных миобластах отличалась от локализации этого белка в многоядерных миотубах. В одноядерных миобластах ТЦМ, по-видимому, еще не собраны в пучки миофиламентов, как это происходит в дефинитивных миофибриллах.
При окрашивании антителами к изоформам ТЦМ, характерным для быстрых мышечных волокон, иммунопозитивная реакция выявлялась только в сокращающихся многоядерных миотубах. Подобное явление наблюдалось в культуре клеток-предшественников, выделенных из мышц 20-21Э (6-7 сут дифференцировки) и из мышц 3-5П и взрослых животных (12-14 сут дифференцировки). Метод двойного иммунофлуоресцентного мечения позволил выявить колокализацию медленной и быстрых изоформ ТЦМ в сокращающихся миотубах (рис. 16) и отсутствие быстрых изоформ миозина в миотубах, не обладающих сократительной активностью, что соответствует данным, полученным с использованием ПЦР-анализа. Описанное явление в равной степени характерно как для культуры клеток, полученных из мышц крыс 20-21Э, так и для культуры клеток из мышц 3-5П и взрослых животных.
Рис. 16. Иммуноцитохимическое окрашивание многоядерных миотуб антителами к медленным (а, б, в) и быстрым (а', б', в') ТЦМ. Многоядерные миотубы сформированы из миогенных клеток-предшественников, полученных из мышц 20-21Э (ряд а), 3-5П (ряд б) и взрослых животных (ряд в). Ядра клеток окрашены Hoechst 33342.
Для подтверждения данных иммуноцитохимического исследования, а также для выявления специфичности экспрессии генов, кодирующих различные изоформы ТЦМ в процессе дифференцировки миогенных клеток предшественников, был проведен ПЦР.
Анализ экспрессии эмбриональной изоформы ТЦМ. Экспрессия гена эмбрионального миозина была выявлена в культуре клеток-предшественников из мышц крыс 20-21Э уже на 3 сут дифференцировки (рис. 17А), что согласуется с данными литературы об экспрессии этой изоформы ТЦМ в клетках, выделенных из мышц животных в эмбриональный период развития.
Однако впервые транскрипты гена эмбриональной формы миозина были обнаружены и в культуре миогенных клеток-предшественников, выделенных из мышц животных 3-5П (рис. 16Б) и взрослых (рис. 16В). Ранее рядом авторов было показано наличие этой изоформы миозина только в многоядерных миотубах, которые были сформированы из клеток-предшественников, выделенных из мышц животных в эмбриональный период развития.
Экспрессия гена, кодирующего эмбриональную изоформу ТЦМ, в культуре клеток из мышц 3-5П и взрослых животных начинается позднее (4 сут дифференцировки), чем в клетках, полученных из фетальных мышц.
Максимальный уровень экспрессии гена эмбрионального миозина выявлялся на 5 сут (20-21Э) и 10 сут (3-5П и взрослые) культивирования, которые соответствуют образованию многоядерных миотуб. На 14 сут дифференцировки экспрессия исследуемого гена ТЦМ незначительно снижается, как в культуре клеток из мышц крыс 20-21Э, так и в культуре клеток из мышц 3-5П и взрослых животных.
Рис. 17. ПЦР-анализ уровня экспрессии гена Рис. 18. Оценка уровня экспрессии гена эмбриональных ТЦМ на разных стадиях перинатальных ТЦМ на разных стадиях дифференцировки в культуре клеток, дифференцировки в культуре клеток, полученных из мышц 20-21Э (А), 3-5П (Б) и полученных из мышц 20-21Э (А), 3-5П (Б) и взрослых животных (В). взрослых животных (В).
кДНК отнормированы по GAPDH. кДНК отнормированы по GAPDH.
Экспрессия перинатальной изоформы ТЦМ. Использование ПЦР анализа впервые позволило обнаружить не только транскрипты эмбриональной, но и перинатальной формы миозина в культуре клеток-предшественников, выделенных из мышц 20-21Э, 3-5П и взрослых животных (рис. 18). Экспрессия гена перинатального ТЦМ выявлялась в миогенных клетках-предшественниках, выделенных из мышц животных на разных стадиях онтогенеза, на 4 сут культивирования в дифференцировочной среде. Характер экспрессии гена перинатального ТЦМ отличался от экспрессии эмбрионального миозина. На протяжении всего процесса дифференцировки, от стадии одноядерных клеток до стадии активного сокращения сформировавшихся многоядерных миотуб, наблюдалось постепенное повышение уровня экспрессии гена перинатального миозина.
Анализ экспрессии ТЦМ-. С использованием специфических праймеров было выявлено наличие транскриптов гена -миозина в культурах сателлитных клеток и одноядерных миобластов, полученных из мышц крыс на разных этапах индивидуального развития (рис. 19). Следует отметить, что экспрессия -миозина, также как и перинатальной изоформы ТЦМ, выявлялась на 4 сут дифференцировки миогенных клеток-предшественников.
Таким образом, результаты исследования экспрессии эмбриональной, перинатальной и - изоформ тяжелых цепей миозина, полученные с использованием ПЦР, согласуются с данными иммуноцитохимического анализа.
Рис. 19. ПЦР-анализ уровня экспрессии гена Рис. 20. ПЦР-анализ уровня экспрессии гена ТЦМ на разных стадиях дифференцировки ТЦМ 2а на разных стадиях дифференцировки в культуре клеток, полученных из мышц 20- в культуре клеток, полученных из мышц 20 21Э (А), 3-5П (Б) и взрослых животных (В). 21Э (А), 3-5П (Б) и взрослых животных (В).
кДНК отнормированы по GAPDH. кДНК отнормированы по GAPDH.
Исследование экспрессии гена, кодирующего ТЦМ 2а. Известно, что существует три изоформы ТЦМ, характерные для дефинитивных быстрых мышечных волокон: 2а, 2в и 2х. Исследование экспрессии быстрых ТЦМ с использованием ПЦР-анализа выявило наличие транскриптов миозина 2а в миогенных клетках-предшественниках, выделенных из мышц 20-21Э, 3-5П и взрослые животных (рис. 20). Экспрессия миозина 2а впервые детектировалась на этапе активного сокращения сформировавшихся многоядерных миотуб (7 и 14 сут дифференцировки).
Полученные результаты ПЦР-анализа экспрессии эмбриональной, перинатальной, - и 2а изоформ миозина в ходе дифференцировки клеток предшественников in vitro соответствуют данным литературы об особенностях экспрессии этих генов в период эмбрионального миогенеза. На основе полученных данных можно предположить, что при дифференцировке клеток предшественников в ходе регенерации мышечной ткани характер экспрессии изоформ миозина будет сходным с отмеченной выше последовательностью экспрессии отдельных ТЦМ.
Таким образом, анализ дифференцировки in vitro миогенных клеток предшественников, полученных из мышц животных на разных стадиях онтогенеза, выявил ряд отличий (особенности клеточного состава, экспрессия миогенных маркеров, адгезивные свойства, темпы дифференцировки, в том числе экспрессия различных изоформ миозинов), которые могут быть обусловлены спецификой их микроокружения в условиях in vivo.
ВЫВОДЫ 1. В ходе дифференцировки миогенных клеток-предшественников (сателлитных клеток и одноядерных миобластов), выделенных из мышц животных на 20-21 сут эмбриогенеза, 3-5 сут постнатального развития, а также из мышц взрослых крыс, экспрессия гена специфического транскрипционного фактора Pax7 не изменяется, что свидетельствует о сохранении сателлитными клетками способности к самоподдержанию.
2. Впервые установлено, что уровень экспрессия генов MyoD и м-кадгерина в культуре клеток-предшественников, полученных из мышц животных на 20-21 сут эмбриогенеза, выше по сравнению с клетками, выделенными из мышц на 3-5 сут постнатального развития, а также из мышц взрослых крыс, что свидетельствует о преобладании в субпопуляции миобластов из фетальных мышц клеток, коммитированных к дифференцировке.
3. Обнаружено, что клетки-предшественники, изолированные из мышц животных на 20-21 сут эмбриогенеза, характеризуются более выраженными адгезивными свойствами и более высоким темпом дифференцировки по сравнению с клетками, полученными из мышц животных на 3-5 сут постнатального развития и мышц взрослых крыс.
4. Показано, что в культуре клеток-предшественников, выделенных из мышц животных на разных стадиях онтогенеза, повышение концентрации Са2+ (до 2.0 мМ) в среде культивирования приводит к активации сателлитных клеток, слиянию миобластов и последующему образованию многоядерных сокращающихся миотуб.
5. Впервые в ходе дифференцировки миогенных клеток-предшественников, изолированных из фетальных, неонатальных и мышц взрослых животных, выявлена специфичность экспрессии генов ТЦМ, кодирующих четыре изоформы: эмбриональную, перинатальную, - и 2а миозин.
Работа выполнена при поддержке Программ Президиума РАН:
«Молекулярная и клеточная биология» и «Биоразнообразие и динамика генофондов».
Список работ опубликованных по теме диссертации Статьи в журналахсоответствующих Перечню ВАК:
1. Озернюк Н.Д., Балан О.В. Сателлитные клетки мышечной системы и регуляция восстановительного потенциала мышц // Известия РАН. Серия биологическая. 2007. № 6. С. 650-660.
2. Балан О.В., Воротеляк Е.А., Смирнова Т.Д., Озернюк Н.Д. Особенности сателлитных клеток и миобластов на разных стадиях онтогенеза крыс // Известия РАН. Серия биологическая. 2008. № 2. С. 151-155.
3. Балан О.В., Мюге Н.С., Озернюк Н.Д. Анализ экспрессии тяжелых цепей миозина в процессе дифференцировки in vitro сателлитных клеток и миобластов, выделенных из скелетных мышц крыс // Известия РАН. Серия биологическая. 2009. №3. С. 261-268.
Глава в коллективной монографии:
1. Озернюк Н.Д., Балан О.В. Биология сателлитных клеток мышц и механизмы восстановления мышечной системы // Биология стволовых клеток и клеточные технологии / Под ред. Пальцева М.А. М.: Медицина, Шико. 2009.
Т.2. С. 36-52.
Тезисы конференций:
1. Балан О.В. Анализ дифференцировки сателлитных клеток из мышц крыс разного возраста. // Цитология. Тезисы докладов II Съезда Общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН. 2007. №49(9). С 713-714.
2. Балан О.В. Дифференцировка сателлитных клеток и миобластов в культуре. Анализ экспрессии миогенных маркеров. // Онтогенез. Тезисы докладов конференции молодых ученых ИБР РАН. 2008. №39(4). С. 309-310.
3. Балан О.В. Исследование экспрессии тяжелых цепей миозина в дифференцирующихся сателлитных клетках и миобластах из скелетных мышц зародышей и новорожденных крыс. // XV школа «Актуальные проблемы биологии развития». Звенигород 19-24 октября 2008. Сборник тезисов. С. 10-12.