Татьяна валерьяновна блокада nmda-каналов пирамидных нейронов гиппокампа крысы местными анестетиками и их производными
На правах рукописи
УДК 577.352.465 Колесникова Татьяна Валерьяновна БЛОКАДА NMDA-КАНАЛОВ ПИРАМИДНЫХ НЕЙРОНОВ ГИППОКАМПА КРЫСЫ МЕСТНЫМИ АНЕСТЕТИКАМИ И ИХ ПРОИЗВОДНЫМИ 03.00.02 – биофизика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук
Москва – 2005 2
Работа выполнена в Научно-исследовательском институте общей патологии и патофизиологии РАМН и на кафедре физики живых систем Московского физико технического института (Государственного университета).
Научный консультант:
Доктор медицинских наук, профессор Борис Израилевич Ходоров
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук, Денис Борисович Тихонов Кандидат физико-математических наук, Николай Филиппович Перевозчиков
Ведущая организация:
НИИ Мозга РАМН
Защита состоится 15 декабря 2005 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (Государственном университете) по адресу: 141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер., 9, МФТИ.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физико-технического института (Государственного университета).
Автореферат разослан «_» _ 2005 г.
Ученый секретарь диссертационного совета К 212.156. кандидат физико-математических наук В.Е. Брагин.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В большинстве синапсов центральной нервной системы млекопитающих и человека передача возбуждающего сигнала осуществляется с помощью медиатора - глутамата. Ионотропные рецепторы глутамата подразделяются на NMDA- (N метил-D-аспартат), AMPA- (-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазол пропионат) и каинатный подтипы. Среди семейства глутаматных рецепторов NMDA-подтип отличается потенциалзависимой блокадой ионами Mg2+ (Mayer et al., 1984;
Nowak et. al., 1984;
Ascher and Nowak;
1988), медленной кинетикой активации, неполной десенситизацией (Johnson and Ascher, 1987;
Lester et al., 1990), относительно высокой проницаемостью для ионов Са2+ (MacDermott et al., 1986). Эти и другие свойства NMDA-каналов лежат в основе формирования нервной системы на эмбриональной стадии, памяти и способности к обучению (Bliss and Collingridge, 1993;
Asztely and Gustafsson, 1996;
Kullmann et al., 2000), а также патогенеза болезней Паркинсона, Альцгеймера, ишемической болезни мозга, эпилепсии и др. (Doble, 1999;
Arundine and Tymianski, 2004;
Hynd et al., 2004;
Rho, 2004).
Существенный прогресс, достигнутый за последнее время в развитии методов молекулярной биологии и биохимии, позволил установить субъединичный состав, первичную структуру, трансмембранную топологию полипептидной цепи и.т.д. (см. обзоры Dingledine et al., 1999;
Mayer and Armstrong, 2004;
Wollmuth and Sobolevsky, 2004). Однако представления о трехмерном строении NMDA-каналов и механизме их активации остаются до сих пор неудовлетворительными.
Опыт исследований блокады ионных каналов различными соединениями показал, что результаты таких работ являются ценным источником информации о самих каналах (Hille, 2001). На протяжении ряда лет этот подход используется в работах нашего коллектива для изучения свойств NMDA-каналов (Кошелев и Ходоров, 1992, 1995;
Sobolevsky et al, 1999).
Настоящая работа является продолжением проводимых в лаборатории исследований. В качестве новых инструментов изучения биофизических свойств и функциональной архитектуры NMDA-каналов в ней использованы местные анестетики и их производные (МА). В отличие от ранее применявшихся блокаторов, большинство МА содержит три функциональные группировки: ароматическое кольцо, третичную аминогруппу и полярную (амидную или эфирную) связь. рКа аминогруппы этих соединений лежит в диапазоне 8.19. (Strichartz et al., 1990), поэтому при физиологических рН МА находятся преимущественно в заряженной форме. Такое строение МА обусловливает их амфифильные свойства.
Цель работы: экспериментальный и теоретический анализ механизмов действия местных анестетиков и их производных на NMDA-каналы пирамидных нейронов гиппокампа крысы.
Задачи исследования:
1) В опытах на свежеизолированных нейронах зоны СА1 гиппокампа крысы с помощью метода “пэтч-кламп” (patch-clamp) в конфигурации “целая клетка” изучить зависимость действия МА от: (а) их концентрации и длительности действия;
(б) концентрации агониста;
(в) мембранного потенциала, (г) состояния воротного механизма канала.
2) На основании полученных данных выяснить, является ли уменьшение амплитуды тока через NMDA-каналы в присутствии МА результатом закупорки ионной поры канала или следствием аллостерического влияния на работу воротного механизма.
3) С помощью модели Вудхулл оценить в долях мембранного потенциала глубину расположения связывающих участков МА в NMDA-канале.
4) Используя математическое моделирование ионных токов через NMDA-каналы, определить влияние МА на работу воротного механизма NMDA-канала.
5) С помощью сравнительного анализа сродства различных МА к NMDA-каналу оценить вклад функциональных группировок этих соединений в связывание.
6) Используя собственные и литературные данные, провести сравнительный анализ блокады Na+- и NMDA-каналов МА.
Научная новизна:
- Впервые проведено систематическое изучение действия пяти местных анестетиков (новокаин (НОВ), бензокаин (БЕНЗ), тетракаин (ТЕТР), лидокаин (ЛИД), этидокаин (ЭТ)) и трех их производных (новокаинамид (НОВА), QX-314 и L30) на ионные токи через NMDA каналы механически изолированных пирамидных нейронов гиппокампа крысы.
- Изучена зависимость блокады NMDA-каналов этими соединениями от их концентрации, концентрации агониста и мембранного потенциала.
- Показано, что подавление ионных токов через NMDA-каналы протонируемыми МА и постоянно заряженным QX-314 является результатом закупорки ионной поры канала.
Оценена глубина проникновения в канал протонируемой аминогруппы третичных МА и постоянно заряженной аммониевой группы четвертичного QX-314. Наряду с этим показано существование потенциал-независимого механизма блокады у МА ксилидинового ряда.
- Изучена кинетика взаимодействия МА с NMDA-каналами и проанализированы структурные факторы, определяющие ее.
- Проанализировано влияние блокады ионной поры NMDA-канала МА на работу воротного механизма.
- Проведен систематический анализ связи эффективности блокады NMDA-каналов МА с их структурой. Оценен вклад заряженных, полярных и гидрофобных группировок во взаимодействие МА с NMDA-каналами.
Научно-практическая ценность. Блокаторы NMDA-каналов считаются перспективными терапевтическими агентами для лечения нейродегенеративных заболеваний, однако введение этих средств в медицинскую практику на текущий момент существенно ограничивается серьезными осложнениями, которые вызывают многие из них.
Анализ этих явлений показывает, что безопасность применения блокаторов NMDA-каналов зависит от их аффинности, кинетики блокады и взаимодействия с воротным механизмом канала (Rogawski, 2000). Поэтому выявленные в данной работе закономерности блокирующего действия МА на NMDA-каналы и их связь со структурой этих соединений могут быть использованы в дальнейшем для направленного синтеза новых лекарственных препаратов, мишенью действия которых являются NMDA-каналы.
Практическая значимость исследования действия МА на NMDA-каналы определяется широким применением этих соединений в медицине для местной, спинальной и других видов анестезии. При этом с побочным действием МА на NMDA-каналы могут быть ассоциированы как положительные (предотвращение сенситизации болевой чувствительности), так и отрицательные (характерные для многих блокаторов NMDA каналов) эффекты применения анестетиков. Полученная информация о действии МА на NMDA-каналы может быть использована в дальнейшем для анализа этих явлений и создании усовершенствованных средств для контроля над болевой чувствительностью.
Апробации работы. Материалы диссертации доложены на III Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004);
XLIV и XLVII научных конференциях МФТИ (Долгопрудный, 2001 и 2004), международных семинарах, организованных физиологическим обществом Великобритании (Лидс, 2002;
Санкт-Петербург, 2004;
Севилья, 2005), VIII Международном далемском симпозиуме по клеточному узнаванию сигналов и их передаче (Берлин, 2003), 32 ежегодной конференции Американского общества по нейронаукам (Орландо, 2002).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения и пяти глав. Работа изложена на 183 страницах, проиллюстрирована 64 рисунками и содержит шесть таблиц. Библиографический список содержит 291 источник.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Опыты проводились на свежеизолированных пирамидных нейронах зоны СА гиппокампа крысы линии Вистар (возраст 14-21 день). Клетки выделяли методом вибродиссоциации (Vorobjev, 1991) из срезов гиппокампа толщиной 300-500 мкм, проинкубированных не менее 3 часов в растворе следующего состава (мМ): NaCl 124.0, KCl 3.0, CaCl2 2.0, глюкоза 10.0, NaHCO3 26.0. Раствор непрерывно продували карбогеном (96% О2 и 4% СО2) при температуре 32°С. Выделение клеток и регистрация токов проводились в безмагниевом растворе, содержащем (в мМ): NaCl 140.0, KCl 5.0, CaCl2 2.0, глюкоза 15.0, N (2-гидроксиэтил)пиперазин-N-2-этансульфоновую кислоту (HEPES) 10.0, глицин 0.003, pH7.3. Смена растворов при применении различных веществ осуществлялась методом концентрационного скачка (Benveniste et al., 1990). Постоянная времени смены раствора wash 30 мс. Система подачи растворов на клетку представляла собой три параллельных трубки диаметром 0.5 мм, перемещение которых осуществлялось с помощью шагового двигателя. Регистрация токов проводилась при комнатной температуре методом “пэтч кламп” в конфигурации “целая клетка” с помощью микропипеток, изготовленных из стекла Пирекс и заполненных раствором следующего состава (мМ): CsF 140, NaCl 4, HEPES 10;
pH7.2. Сопротивление заполненных микропипеток составляло 3-7 МОм. Регистрируемые токи оцифровывали с частотой 1 кГц и записывали в память компьютера. Статистический анализ данных проводился с помощью компьютерной программы Microcal Origin 6. (Microcal Software, Inc, USA). Экспериментальные данные представлены как x ± x, где x среднее значение измеренной величины, x - стандартное отклонение. Исследование значимости различия между средними проводилось с помощью однофакторного дисперсионного анализа (one-way ANOVA). Величина уровня значимости была принята равной р = 0.05.
Глицин, аспартат получены от фирмы “Sigma” (США). Местные анестетики и их производные получены от фирмы “Astra” (Швеция).
Компьютерное моделирование ионных токов основывалось на решении линейных систем дифференциальных уравнений первого порядка численным методом, описанным ранее (Benveniste et al., 1990).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Активация NMDA-каналов вызывалась применением 100 мкМ аспартата (АСП) в течение 3.5 с в растворе, содержащем 3 мкМ глицина и не содержащем Mg2+. В ответ на воздействие АСП при мембранном потенциале Eh = -100 мВ возникал входящий ток амплитудой 300-2000 пА, который после быстрого начального подъема до пиковой величины (IC0) уменьшался до некоторого уровня плато ICS (рис. 2, серые кривые). В соответствии с существующими представлениями (Digledine et al., 1999) такое снижение амплитуды тока во время продолжительного действия агониста в отсутствие блокатора мы интерпретировали как результат десенситизации NMDA-канал-рецепторного комплекса.
На рис. 1 показаны структурные формулы применявшихся МА.
O C2H O NH2 C CH2 N CH O NH2 C CH CH O C2H Бензокаин Новокаин O O C4H9 CH3 C2H N C CH2 N CH O NH2 C CH2 N CH NH CH H C2H Тетракаин Новокаинамид CH3 O CH3 O C2H5 C2H C NH CH2 N C NH CH2 CH2 N C2H5 C2H CH3 CH Лидокаин L CH3 C2H O CH3 O C2H5 C2H N+ C2H5 C NH N CH C NH CH C3H CH C2H CH QX-314 Этидокаин Рис. 1. Структура применявшихся МА.
Воздействие 3 мМ БЕНЗ, 200 мкМ НОВ, 600 мкМ ТЕТР, 4 мМ ЛИД, 4 mM QX-314, 300 мкМ НОВА, 1 мМ ЭТ, 5 мМ L30 в отсутствие АСП при Eh = -100 мВ не вызывало токового ответа.
1. Влияние МА на ионные токи через NMDA каналы. При сочетанном применении АСП с МА амплитуда пикового и стационарного тока была ниже, чем в контроле (рис. 2).
Несмотря на принципиальное сходство в строении МА, изменение параметров ионных токов под действием этих соединений было различным. Блокада тока НОВ и НОВА, в отличие от действия остальных МА, усиливалась при их повторном применении (рис. 2, кривые 1-4 для НОВ и НОВА). При блокаде NMDA-каналов БЕНЗ, ТЕТР, ЭТ, НОВ и НОВА имело место снижение отношения плато/пик NMDA-тока (т.е. IBS/IB0 ICS/IC0). Спад тока после окончания воздействия АСП с БЕНЗ, НОВ или НОВА был монотонным во всем диапазоне применявшихся концентраций МА. В отличие от этого, деактивация тока после сочетанного воздействия АСП с ТЕТР, ЛИД, ЭТ, L30 или QX-314 содержала кратковременное возрастание амплитуды тока с последующим ее спадом до нуля, причем в случае блокады ЛИД спадающая фаза запаздывала по сравнению со спадом тока в контроле в 12 из 17 клеток (71%), а в случае блокады QX-314 - в 100% случаев (24 клетки). Более того, в ряде клеток амплитуда пика следового тока после действия QX-314 превышала стационарный уровень тока в контроле.
1мМ БЕНЗ 0.2 мМ НОВ 0.6 мМ ТЕТР 0.3 мМ НОВА IBS 2, 3, ICS IB 1 200 пA IC 1с 4 мМ L 8 мМ QX-314 4 мМ ЭТ 4 мМ ЛИД Рис. 2. Блокада ионных токов через NMDA-каналы МА при Eh = -100 мВ. Токовые кривые, зарегистрированные в ответ на сочетанное воздействие АСП с МА (черные линии), совмещены с контрольными кривыми, полученными в ответ на индивидуальное применение АСП (серые линии). В выносках показана деактивация тока в контроле и после прекращения сочетанного воздействия АСП с МА. Цифрами обозначены порядковые номера ответов на сочетанные применения АСП с НОВ или НОВА. Длины вертикальных отрезков соответствуют силе тока 200 пА.
Концентрационные зависимости подавления тока МА были аппроксимированы уравнением:
IB/ IC= 1 / [1+([МА] / IC50)р], где [МА] – концентрация МА, IC50 - концентрация МА, при которой наблюдается 50%-ное (от максимального) снижение амплитуды тока, p – коэффициент Хилла. Величины IC50 и p, определенные по пику (IC500, p0) и плато (IC50S, pS) тока при Eh = -100 мВ приведены в Табл. 1. Поскольку необходимым условием для определения величины IC50 является состояние (квази)равновесия реакции связывания блокатора с каналом, то для НОВ и НОВА эти величины определялись после насыщения кумулятивной блокады этими соединениями.
Сравнение величин IC50 МА для NMDA-каналов (Табл. 1) и Na+-каналов (Strichartz, 1973;
Негуляев и Носырева, 1979, Brau et al., 1998) показало, что при отрицательных мембранных потенциалах ТЕТР, ЛИД, ЭТ и QX-314 на порядок и выше эффективнее блокируют Na+-, чем NMDA-каналы;
БЕНЗ и НОВ блокируют эти каналы в сходных концентрациях;
а НОВА на два порядка эффективнее блокирует NMDA-каналы. Таким образом, в условиях клинического применения НОВ, БЕНЗ и НОВА следует учитывать возможность побочной блокады NMDA-каналов.
Таблица 1. Блокирующая способность МА при Eh = -100 мВ Пиковый ток Стационарный ток IC500 / IC50S МА n IC500, IC50S, S мМ p мМ p ТЕТР 0.41±0.02 1.21±0.04 0.24±0.02 1.32±0.09 1.71±0.08 Эфиры БЕНЗ 1.31±0.05 0.72±0.02 0.46±0.04 0.74±0.06 2.8±0.3 НОВ 0.069±0.002 0.88±0.03 0.028±0.003 0.94±0.08 2.5±0.3 8- НОВА 0.056±0.008 0.99±0.02 0.040±0.002 1.08±0.06 1.4±0. ЛИД 1.92±0.08 1.20±0.07 2.00±0.10 1.08±0.07 0.96±0. Амиды QX-314 2.67±0.14 1.16±0.08 2.63±0.09 1.12±0.05 0.99±0. 0.81±0.02 1.43±0. ЭТ 0.62±0.02 1.51±0.05 1.31±0. L30 9- 2.34±0.07 1.17±0.06 2.08±0.03 1.29±0.03 1.13±0. 2. Кинетика взаимодействия МА с NMDA-каналами. На рис. 3а показан экспериментальный протокол, использовавшийся для изучения данного вопроса. Чтобы исключить вклад десенситизации свободных от блокатора каналов в кинетику изменения тока, МА применялись не ранее того момента, когда ток в ответ на воздействие АСП достигал стационарного уровня. Кинетика блокирования и деблокирования NMDA-каналов большинством МА была монотонной. Исключение составил QX-314: в 2 из 7 клеток ток в ответ на применение этого МА резко снижался до некоторого минимального значения, после чего плавно увеличивался до стационарного уровня блокады. После удаления QX-314 из омывающего раствора в большинстве клеток в процессе деблокирования наблюдали кратковременное превышение амплитудой тока стационарного уровня в контроле (“овершут”, Кошелев и Ходоров, 1995, рис. 3б).
Параметры аппроксимации экспоненциальными функциями спада и восстановления NMDA-тока в ответ на добавление и удаление МА из окружающего раствора приведены в Табл. 2. Кинетика блокады всеми МА, за исключением ЭТ и ЛИД (в ряде клеток), имела быструю и медленную компоненты.
НОВA а АСП Рис. 3. Кинетика взаимодействия МА с NMDA каналами в присутствии 200 пA агониста при Eh = -100 мВ. а – 2с экспериментальный протокол показан на примере применения 0.2 мМ НОВА. б – кинетика НОВ б БЕНЗ ТЕТР восстановления тока после удаления 1 мМ БЕНЗ, 0.1 мМ НОВ, 0.4 мМ ТЕТР, 4 мМ ЛИД, 100 пA 2с 8 мМ QX-314 и 1 мМ ЭТ.
Длины вертикальных отрезков в б соответствуют силе тока QX- ЛИД ЭТ 100 пА.
Таблица 2. Кинетические параметры спада и восстановления NMDA-тока в ответ на добавление и удаление МА из омывающего раствора в условиях постоянного присутствия АСП * Блокирование Деблокирование Eh, [МА], МА 1-IBS/ICS n Аfon Аfoff fon, мс son, с foff, мс soff, с мВ мМ БЕНЗ -100 1 0.77±0.02 0.91±0.04 19±2 1.0±0.3 0.91±0.05 57±8 1.9±0. -100 0.1 8- 0.72±0.01 0.69±0.02 68±9 0.71±0.09 0.53±0.06 170±28 1.1±0. НОВ -40 0.8 0.80±0.02 0.76±0.02 47±8 0.44±0.07 0.57±0.04 72±12 0.55±0. +40 1.6 0.60±0.02 0.76±0.02 41±3 0.40±0.12 0.60±0.07 34±2 0.19±0. ТЕТР -100 0.4 0.58±0.02 0.94±0.02 12±2 0.53±0.07 0.81±0.03 30±2 0.46±0. НОВА -100 0.2 0.87±0.02 0.56±0.05 57±5 0.86±0.09 0.25±0.03 87±19 1.6±0. 1 - ЛИД -100 4 1 0.69±0.04 14±3 32± 0.88±0.02 0.9±0. QX- on off 314 -100 4 3 0.65±0.02 0.07±0. 1.36±0.12 1.27±0.04 0.38±0. 16±2 22± - 7 1 1 1.22±0. -40 8 1 0.74±0.02 21±2 34±4 0.24±0. 1 * Аfon, Аfoff – удельный вес быстрой компоненты блокирования и деблокирования. fon, son, foff, soff постоянные времени быстрой и медленной компонент блокирования и деблокирования, соответственно.
+50 8 1 - 0.70±0.02 26±3 1.22±0.03 47±4 0.30±0. ЭТ -100 1 1 - 1 - 0.66±0.04 12±2 26± Видно, что fon, foff и удельный вес медленных компонент блокирования и деблокирования НОВ и НОВА, которые имеют кумулятивный характер блокады, существенно выше, чем при действии других соединений.
Исследование зависимости кинетики действия МА от мембранного потенциала на примере блокады НОВ и QX-314 показало, что удельный вес быстрой и медленной компонент блокирования и деблокирования не зависит от мембранного потенциала в диапазоне от –100 до +50 мВ, наблюдается только значительное увеличение скорости блокирования и деблокирования в случае НОВ (Табл. 2).
3. Влияние мембранного потенциала на блокаду МА. Сдвиг мембранного потенциала в положительную сторону в диапазоне от -120 до 0 мВ ослаблял блокаду всеми протонируемыми МА и постоянно заряженным QX-314 (рис. 4). Дальнейшее увеличение потенциала разным образом сказывалось на действии МА. Блокада НОВ и НОВА полностью устранялась при положительных потенциалах (показано на примере НОВА, рис 4в). В отличие от этого, степень подавления NMDA-тока соединениями ксилидинового ряда (ЛИД, ЭТ, QX-314 и L30) оставалась постоянной и отличной от нуля в диапазоне 060 мВ (показано на примере ЛИД, рис. 4в).
Наряду с этим, блокада нейтральным при физиологических рН БЕНЗ не зависела от мембранного потенциала во всем диапазоне, в котором проводились эксперименты (от - до +60 мВ, p=0.25, n=6, рис. 4г). Это показывает, что зависимость блокады протонируемыми МА и постоянно заряженным QX-314 от мембранного потенциала является результатом непосредственного взаимодействия заряда блокатора с мембранным полем, а не связана с изменением свойств канала при сдвиге мембранного потенциала.
Ослабление блокады протонируемыми МА и постоянно заряженным QX-314 при деполяризации мембраны свидетельствует о том, что механизмом действия этих соединений является закупорка ионной поры канала. Потенциал-независимая компонента блокады теоретически может быть результатом взаимодействия нейтральной формы МА с каналом.
Однако наличие этой компоненты у постоянно заряженного QX-314 позволяет исключить это предположение и сделать вывод о существовании в канале дополнительного участка связывания ксилидинов, расположенного вне мембранного поля.
Зависимости блокады протонируемыми МА и постоянно заряженным QX-314 от мембранного потенциала были аппроксимированы уравнением Вудхулл (1973):
IB/ IC= (1-A) / {1+ [МА] / [IC50(0)*exp(FEh/RT)]}, где A – удельный вес потенциал-независимой компоненты блокады, IC50(0) - концентрация МА, при которой наблюдалось бы 50%-ное снижение амплитуды тока при 0 мВ (от максимального потенциалзависимого), - доля мембранного электрического поля, пересекаемая заряженной группировкой блокатора при диффузии из раствора к участку связывания внутри канала, F – постоянная Фарадея, R – универсальная газовая постоянная, T – температура. Значения A, и IC50(0) приведены в Табл. 3.
а б АСП ЛИД +60 мВ +40 мВ +60 мВ +40 мВ -30 мВ -30 мВ -60 мВ IB0 -120, -90, -60 мВ -90 мВ 200 пА -120 мВ IC 1с в г 1,0 1, 0,8 0, 0,6 0, IB0 / IC 0,4 0, ЛИД БЕНЗ 0,2 0, НОВА ТЕТР 0,0 0, -150 -100 -50 0 50 -150 -100 -50 0 Eh, мВ Eh, мВ Рис. 4. Влияние мембранного потенциала на блокаду NMDA-каналов МА. а и б – токи, вызванные индивидуальным применением АСП (а) и в сочетании с 4 мМ ЛИД (б) при различных мембранных потенциалах. в и г – усредненные значения величины IB0/IC0 при различных мембранных потенциалах при блокаде 4 мМ ЛИД, 0.3 мМ НОВА, 0.5 мМ БЕНЗ и 0.4 мМ ТЕТР. В диапазоне +20 +40 мВ воздействие ксилидинов в применявшихся концентрациях в отсутствие АСП вызывало отклонение токовой кривой от нуля, поэтому при расчете степени блокирования производилась компенсация вклада АСП-независимой компоненты в суммарный ток.
Из Табл. 3 видно, что алифатическая аминогруппа большинства МА при блокаде NMDA каналов пересекает 60-90% мембранного поля, что совпадает с соответствующей величиной для классических блокаторов NMDA-каналов, таких, как МК-801, кетамин, фенциклидин и.т.д. (Sobolevsky, 2003, обзор). Исследования на рекомбинантных каналах показали, что участок связывания классических блокаторов NMDA-каналов образован селективным фильтром и прилегающими к нему областями. На этом основании мы заключили, что алифатическая аминогруппа большинства МА во время блокады располагается в районе селективного фильтра.
Таблица 3. Значения параметров аппроксимации зависимости блокады NMDA-каналов МА от мембранного потенциала уравнением Вудхулл (1973) Степень протониро- [МА], IC50(0), МА pKA A n z вания МА мМ мМ при pH7. ТЕТР 8.59 0.95 0.4 0 0.08±0.02 0.6±0. Эфиры бензоаты Амино НОВ 9.06 0.98 0.2 0 0.86±0.02 1.9±0. НОВА 9.42 0.99 0.3 0 0.90±0.05 2.3±0.4 ЛИД 8.19 0.89 4 (8±2)*10 0.158±0.010 0.64±0. Ксилидины Амиды QX-314 - 1 4 0.61±0.13 (6±2)*10 0.342±0. ЭТ 8.11 0.87 1 0.67±0.09 0.08±0.02 16± L30 9.00 0.98 5 0.24±0.07 0.85±0.07 (15±4)* Среди третичных МА выделялся ТЕТР, алифатическая аминогруппа которого пересекает около 8% мембранного поля. Эту особенность действия ТЕТР можно объяснить, если предположить, что, находясь в канале, ТЕТР, в отличие от других МА, ориентирован алифатической аминогруппой в сторону наружного устья, вследствие чего во время блокирования его заряд пересекает только малую долю поля. Мы предполагаем, что инвертированная ориентация ТЕТР в канале может быть объяснена связыванием ароматического радикала ТЕТР в районе селективного фильтра. Причиной этого может являться бутильный заместитель парааминогруппы, который, принимая квазициклическую конформацию, в совокупности с ароматическим кольцом воспроизводит пространственную структуру высокоаффинных блокаторов NMDA-каналов (Kroemer et al., 1998). Это может обусловливать повышенное, по сравнению с другими МА, сродство ароматической части ТЕТР к участку связывания классических NMDA-блокаторов.
Итак, установлено, что МА проникают внутрь ионной поры канала и преграждают проход для проникающих ионов. Рассмотрим, как это сказывается на работе воротного механизма канала и диссоциации комплекса канал-агонист. Начнем с МА с медленной кинетикой блокирования.
4. Кумулятивный характер блокады НОВ и НОВА. Как сказано выше, при повторном сочетанном применении АСП с НОВ или НОВА блокирование NMDA-тока возрастает. При Eh = -100 мВ, длительности импульсов 3.5 с и интервале между ними 0.5-2.0 минуты амплитуда пикового тока в ответ на первое, второе и третье сочетанное применение АСП с 300 мкМ НОВА составила 63±4%, 18±2%, 15.7±1.1% (n=7) от значения в контроле и оставалась неизменной при последующих импульсах (рис. 2). Сходная картина имела место при блокаде НОВ. Кумулятивный характер блокады НОВ и НОВА указывает на то, что каналы, занятые этими МА, сохраняют способность закрываться, после чего агонист может покинуть блокированный канал. В результате эго блокирующая частица оказывается закрытой в канале, как в ловушке (эффект “ловушки”). На примере НОВ была показана независимость эффекта «ловушки» от мембранного потенциала в диапазоне от -120 до -30 мВ.
Итак, установлено, что NMDA-каналы, блокированные НОВ или НОВА, могут закрываться с последующей диссоциацией комплекса канал-агонист. Далее описаны эксперименты, в которых исследовалась способность этих МА блокировать и покидать NMDA-каналы в закрытом состоянии.
5. Взаимодействие МА с NMDA-каналами в отсутствие агониста. На рис. 5а показаны токовые ответы на применение АСП в контроле и в сочетании с 40 мкМ НОВ.
Рис. 5. Исследование Нов а Асп способности НОВ взаимодействовать с закрытыми NMDA каналами. а и б– токовые 100 пА ответы на применение АСП в контроле и в 1с сочетании с 40 мкМ НОВ.
б а – МА применялся одновременно с АСП, б – после контрольного воздействия АСП МА постоянно находился в омывающем клетку растворе.
Видно, что при втором сочетанном применении АСП с НОВ блокада пика тока возрастала.
На рис. 5б показаны токовые кривые, полученные в сходном эксперименте, однако на этот раз после контрольного воздействия АСП (первая токовая кривая) в омывающий клетку раствор добавлено 40 мкМ НОВ. Через 0.5-2.0 минуты NMDA-каналы были активированы АСП. Несмотря на то, что НОВ находился в растворе до воздействия АСП, блокада пикового тока при первом импульсе АСП была слабой и возрастала при последующем импульсе, что указывает на необходимость активации NMDA-каналов агонистом для блокады НОВ.
Сходная картина имела место при действии НОВА.
Итак, НОВ и НОВА не могут блокировать NMDA-каналы в отсутствие агониста. На примере блокады НОВ мы проверили способность МА покидать каналы в отсутствие агониста. В результате проведенных опытов мы не зафиксировали утечки НОВ из закрытых каналов в течение 3 мин после окончания сочетанного применения АСП с НОВ.
Заметим, что рассмотренные критерии взаимодействия блокаторов с каналами в отсутствие агониста неприменимы для быстрых блокаторов, поэтому результаты сходных экспериментов с БЕНЗ, ТЕТР, ЭТ, ЛИД, QX-314 и L30 не могут рассматриваться как доказательство отсутствия взаимодействия этих МА с не активированными агонистом NMDA-каналами.
Итак, установлено, что (1) блокированные НОВ или НОВА NMDA-каналы могут закрываться, а агонист покидать центр связывания, (2) для блокирования и деблокирования NMDA-каналов НОВ и НОВА необходима их активация агонистом. Следовательно, в качестве исходной для описания действия НОВ и НОВА можно принять модель 1, где остается невыясненным вопрос о возможности десенситизации занятого блокатором канала (СААВ-DAAB переход). Этот вопрос, а также соответствие предсказаний модели экспериментальным данным будут проверены ниже.
модель 1 † DAAB DAA ' ' 2l2' l2' ' k1[B] l1[A] 2l1[A] OAA* CAB 2l '[A] CB CA OAAB ' C CAAB CAA k2 l1'[A] l2 2l2 Перейдем теперь к вопросу о влиянии закупорки ионной поры МА с быстрой кинетикой блокирования на работу воротного механизма NMDA-канала. Для исследования этого вопроса были использованы критерии, разработанные для быстрых блокаторов (Sobolevsky, Koshelev, Khodorov, 1999, далее - SKK-критерии). При этом мы предполагали, что при Eh = -100 мВ, при котором проводились описанные ниже эксперименты, доминирующую роль играет взаимодействие ЛИД, ЭТ, QX-314 и L30 с участком связывания внутри поры канала, т.к. отрицательное мембранное поле способствует диффузии положительно заряженных молекул к нему. Тем не менее, необходимо принимать во внимание, что потенциал-независимая компонента блокады NMDA-каналов ксилидинами может оказывать влияние на некоторые параметры блокады МА.
Для выяснения действия МА с быстрой кинетикой блокады на закрывание и десенситизацию NMDA-каналов (ОААВ-СААВ и СААВ-DААВ переходы) были исследованы † С – закрытые состояния канала, индексы А и АА указывают на связывание 1-ой и 2-ух молекул агониста, индекс В – обозначает связывание блокатора, DAA – десенситизированное состояние, О*АА – открытое проводящее состояние.
кинетика восстановления тока после удаления блокатора в условиях продолжающегося воздействия агониста и отношение плато/пик NMDA-тока в присутствии блокатора.
6. Кинетика восстановления тока после удаления МА в условиях продолжающегося воздействия АСП показана на рис. 3. В соответствии с SKK-критериями монотонный характер восстановления тока после удаления БЕНЗ, ТЕТР, ЛИД и ЭТ из среды свидетельствует о способности блокированных каналов закрываться и десенситизироваться.
В тоже время, овершут тока небольшой амплитуды, который возникал после прекращения действия QX-314, свидетельствует о снижении статистического веса десенситизированных каналов при блокаде этим МА.
7. Отношение плато/пик NMDA-тока. На рис. 6б показано отношение плато/пик NMDA-тока в присутствии МА, нормированное к соответствующей величине в контроле, при различной степени подавления стационарного тока. Видно, что при действии БЕНЗ, ТЕТР, ЛИД, ЭТ и L30 отношение плато/пик было ниже, чем в контроле, а при действии а в б БЕНЗ ЛИД НОВ QX- 1, 1,4 модель ТЕТР ЭТ IBS (IBS / IB0) / (ICS / IC0) (IBS / IB0) / (ICS / IC0) НОВА L30 1, НОВ 1, 1, 1, 2 IB0 ICS 0, 0, 0, К 0, 100 пА 0, 0, 1с 0,0 0,2 0,4 0,6 0, 0,0 0,2 0,4 0,6 0, IC 1 - (IBS / ICS) 1 - (IBS / ICS) г е д 1,4 1, (IBS/ IB0) / (ICS / IC0) 1 воздействие 1 воздействие (IBS/ IB0) / (ICS / IC0) 1,2 1, Б 2 воздействие 2 воздействие 1,0 1, 1 0,8 0, 0,6 0, К 0,4 0, 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 10 100 1000 - 1 - (IBS / ICS) k2, с Рис. 6. Влияние МА на отношение плато/пик NMDA-тока. а – экспериментальные кривые, зарегистрированные в ответ на индивидуальное применение АСП (к) и первое и второе сочетанное применение АСП и 100 мкМ НОВ (кривые НОВ 1, 2). б и в – отношение плато/пик NMDA-тока в присутствии МА (б) и предсказываемое моделью 1 (в, Sobolevsky et al., 1999), нормированное к соответствующей величине в контроле. По оси абсцисс отложена степень подавления стационарного тока. Для НОВ и НОВА отношение плато/пик определялось после насыщения кумулятивной блокады. г – результат компьютерного моделирования токовых ответов на стимуляцию NMDA каналов агонистом в контроле (кривая к) и в присутствии “медленного” блокатора, действие которого описывается моделью 1 (кривые б). д и е - нормированное к соответствующей величине в контроле отношение плато/пик NMDA-тока, предсказываемое моделью 1, при различных степенях подавления стационарного тока (д) и константах скорости k2 (е) в ответ на первое и второе применение агониста с блокатором. Степень подавления стационарного тока в е (1 IBS/ICS)=0.75. Расчеты сделаны при k1 = 1000 M-1c-1, k2 = 70 c-1 и [B] = 2.3Kd, l1 = 2 мкM-1с-1и l2 = 25 с-1, = 200 с-1, = 10 с-1, =1.2 с-1, =1.2 с- QX-314 – не изменялось. Согласно SKK-критериям это свидетельствует о возможности десенситизации каналов, занятых БЕНЗ, ТЕТР, ЛИД, L30 и ЭТ, и незначительном снижении статистического веса десенситизированного состояния при блокаде QX-314.
Однако сравнение данных компьютерного моделирования с полученными в экспериментах показало, что БЕНЗ, ТЕТР, ЭТ и L30 снижают отношение плато/пик в большей степени, чем это предсказывается моделью (ср. рис 6б,в). В рамках моделей блокады открытых каналов это может быть объяснено существованием медленной компоненты взаимодействия блокатора с каналом или усилением десенситизации канала, вызываемым блокатором. Первое предположение было проверено с помощью компьютерного моделирования. На рис. 6г показаны токи, предсказываемые моделью 1 при значении константы скорости распада комплекса канал-блокатор, k2 = 70 c-1. Видно, что при медленной кинетике взаимодействия блокатора с каналом моделирование предсказывает кумулятивный характер блокады, причем при первом применении агониста с блокатором подавление стационарного тока действительно значительно превышает подавление пикового тока, однако при повторном воздействии отношение плато/пик становится близким к соответствующей величине в контроле. На рис. 6д видно, что эта закономерность имеет место при любой степени подавления стационарного тока. Рис. 6е показывает, что при снижении константы скорости k2 от 10000 до 25 с-1 отношение плато/пик NMDA-тока в ответ на первое применение агониста с блокатором уменьшается и при k2 1000 c-1 становится существенно ниже единицы. Однако при этом блокада становится кумулятивной (данные не приведены). При повторном применении агониста с блокатором (при котором в данном диапазоне значений k2 кумулятивная блокада достигает насыщения) отношение плато/пик NMDA-тока всегда близко к единице.
Таким образом, значительное снижение отношения плато/пик NMDA-тока не может быть объяснено существованием медленной компоненты взаимодействия МА с каналами.
Остается второе предположение: блокада NMDA-каналов МА вызывает усиление десенситизации. Однако при проверке этой гипотезы мы столкнулись с необходимостью ввести дополнительные предположения (см. раздел 8).
Рассмотрим отношение плато/пик NMDA-тока в присутствии НОВ и НОВА. Как видно из рис. 6б, после насыщения кумулятивной блокады эта величина была значительно ниже единицы. В то же время моделирование ионных токов в присутствии медленного блокатора (рис. 6г-е) предсказало, что при насыщении кумулятивной блокады отношение плато/пик, нормированное к контролю, должно быть близким к единице. Таким образом, как и в случае БЕНЗ, ТЕТР, ЭТ и L30, отношение плато/пик NMDA-тока в присутствии НОВ и НОВА даже после насыщения кумулятивной блокады было значительно ниже, чем это предсказывается моделированием. Как и в случае с быстрыми блокаторами, причиной этого может быть усиление десенситизации каналов, занятых МА, возможность чего будет обсуждаться в разделе 8.
Перейдем к рассмотрению влияния блокады МА на диссоциацию комплекса канал агонист (CAAB-CAB-CB переходы). Для изучения этого вопроса были исследованы зависимость блокирующего действия МА от концентрации агониста, кинетика спада тока после удаления агониста из омывающего раствора в непрерывном присутствии блокатора и величина заряда, переносимого через каналы во время следовых токов.
8. Зависимость блокирующего действия МА от концентрации агониста.
Рассматриваемый критерий применим как для быстрых, так и для медленных блокаторов (Sobolevsky et al., 1999), что позволяет использовать его для проверки соответствия предсказаний модели 1 действию НОВ и НОВА. На рис. 7а показаны токовые кривые, зарегистрированные в ответ на индивидуальное применение АСП в различных концентрациях и в сочетании с 250 мкМ ТЕТР. На рис. 7б показаны средние значения степени подавления стационарного тока МА (1-IBS/ICS) в зависимости от концентрации АСП.
а АСП+0.25мкМ ТЕТР 3.7 мкМ 33 мкМ 11 мкМ 100 мкМ IBS б б кб ICS б Рис. 7. Зависимость 200 пA к степени подавления к ионных токов через 1с к NMDA-каналы МА б от концентрации БЕНЗ ЛИД агониста. а – токи в 0,9 0, НОВ QX- ответ на индивидуальное 1-IBS / ICS 0,6 0, применение АСП в различных 0,3 0,3 концентрациях (кривые к) и в сочетании с 0,0 0, 10 100 10 250 мкМ ТЕТР АСП,мкМ АСП,мкМ (кривые б). б – средние значения 0,9 0, ТЕТР ЭТ степени подавления НОВА стационарного тока 1-IBS / ICS 0,6 0, МА (1-IBS/ICS) в зависимости от 0,3 0,3 концентрации АСП.
0,0 0, 10 100 10 АСП,мкМ АСП,мкМ Степень подавления стационарного тока БЕНЗ, НОВ НОВА, ТЕТР и ЭТ не зависела от концентрации агониста (р = 0.24, 0.31, 0.13, 0.5 и 0.11, соответственно). Блокирование ЛИД и (p = 3*10-4 8*10-6, QX-314 ослаблялось при возрастании концентрации АСП и соответственно). Согласно SKK-критериям независимость блокады большинством применявшихся МА от концентрации агониста свидетельствует о том, что эти соединения не только не препятствуют агонисту покинуть блокированный канал, но и не влияют на работу воротного механизма. Снижение эффективности блокады ЛИД и QX-314 при увеличении концентрации агониста свидетельствует об уменьшении удельного веса десенситизированного состояния блокированных каналов.
Раннее было показано, что отношение плато/пик NMDA-тока в присутствии БЕНЗ, ТЕТР, ЭТ и L30, а также НОВ и НОВА (после насыщения кумулятивной блокады) значительно ниже единицы. Указанная особенность NMDA-токов может быть объяснена усилением десенситизации канала, вызванным блокатором. Однако, как отмечают Sobolevsky et al. (1999), в этом случае эффективность блокирования должна возрастать при увеличении концентрации агониста. В действительности этого не наблюдалось при действии БЕНЗ, ТЕТР, ЭТ, L30, НОВ и НОВА. Следует учесть, что эффективность блокады соединением, которое понижает сродство агониста к каналу или вероятность нахождения последнего в закрытом связанном с агонистом состоянии (СААВ), должна убывать при увеличении концентрации агониста. Поэтому независимость блокады от концентрации агониста соединением, усиливающим десенситизацию каналов, теоретически возможна, однако в этом случае действие блокатора на десенситизацию и закрывание канала или распад комплекса канал-агонист должны в точности компенсировать друг друга, что представляется маловероятным.
Таким образом, модели блокатора открытых каналов, обладающего медленной кинетикой связывания (раздел 7) или усиливающего десенситизацию каналов (раздел 8), не описывают снижение отношения плато/пик NMDA-тока, которое наблюдалось при блокаде БЕНЗ, НОВ, НОВА, ТЕТР, L30, и ЭТ. На этом основании мы заключили, что указанное явление вызвано не блокадой ионной поры канала, а некоторым иным, пока не идентифицированным механизмом. Снижение отношения плато/пик тока в присутствии МА может быть обусловлено существованием второго - модулирующего участка связывания МА, взаимодействие с которым не блокирует канал. Однако этот вопрос требует дальнейшего изучения.
9. Кинетика деактивации тока после удаления агониста в непрерывном присутствии блокатора. Исследование этого процесса показало, что ни одно из соединений не влияет на кинетику деактивации NMDA-тока. В соответствии с SKK критериями это указывает на то, что ни один из МА с быстрой кинетикой блокады не препятствует диссоциации комплекса канал-агонист.
10. Величина заряда, переносимого во время следовых токов после удаления агониста и МА из среды (Q). Величина Q измерялась интегрированием площади между токовой кривой и осью абсцисс от момента прекращения воздействия АСП и МА и до полного исчезновения тока, после чего нормировалась на соответствующую величину в контроле (рис. 8а). Величина Q была больше единицы при действии QX-314, приближенно равна единице при действии ЛИД и ЭТ, и меньше единицы при действии остальных соединений (рис. 8б). Согласно SKK-критериям это свидетельствует о замедлении распада комплекса канал-агонист при блокаде QX-314, ЛИД и ЭТ и об отсутствии влияния остальных МА на кинетику этого процесса.
Рис. 8. Величина заряда, переносимого во время БЕНЗ QX- а б 1, АСП+ТЕТР деактивации NMDA-тока ТЕТР ЭТ ЛИД L 1,4 после одновременного удаления агониста и МА Q=QB/QC 1, из раствора (QB), 1, QB нормированная к соответствующей 0, величине в контроле (QC).
0, По оси абсцисс в б 100 пА 0, 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 отложена степень 0, подавления 1c 1 - (IBS / ICS) стационарного тока.
Последние три критерия свидетельствуют о том, что большинство МА не нарушают работу воротного механизма NMDA-канала. Исключение составляет QX-314 и ЛИД, ослабление блокады которыми при увеличении концентрации агониста свидетельствует о том, что блокада этими МА может препятствовать десенситизации NMDA-каналов. Данные о влиянии QX-314 и ЛИД на диссоциацию комплекса канал-агонист противоречивы. С одной стороны, кинетика спада NMDA-тока после удаления АСП в присутствии этих МА свидетельствует о том, что блокада QX-314 и ЛИД не препятствует агонисту покинуть канал.
С другой стороны, величина Q свидетельствует об обратном. Кроме того, этот же критерий указывает на затруднение диссоциации комплекса канал-агонист в случае действия ЭТ.
Выявленные противоречия между выводами, сделанными на основе различных критериев, могут быть связаны с существованием потенциал-независимого механизма блокады ксилидинами, который может маскировать овершут тока после удаления ЛИД из среды в продолжающемся присутствии агониста (рис. 3), а также сказываться на отношении плато/пик NMDA-тока (рис. 6) и виде агонистзависимости (рис. 7). Кроме того, потенциал независимый механизм блокады ксилидинами может маскировать запаздывание деактивации NMDA-тока после удаления агониста из среды в продолжающемся присутствии блокатора (раздел 9). Это, с одной стороны, может объяснить наблюдаемые противоречия, с другой стороны, говорит о ненадежности применения вышеуказанных критериев для анализа блокады ксилидинами. Ситуация была частично прояснена с помощью следующего критерия.
11. Кинетика следовых токов после одновременного прекращения воздействия АСП и МА описана в разделе 1 (рис. 2, вставки). Согласно SKK-критериям задержка деактивации NMDA-тока после применения ЛИД и QX-314 свидетельствует о том, что эти МА нарушают работу воротного механизма. Поскольку возникновение кратковременного увеличения тока после окончания применения агониста и блокатора и задержка деактивации тока обусловлены исключительно взаимодействием блокатора с участком связывания внутри ионной поры канала, рассматриваемый критерий позволяет достоверно утверждать, что, находясь в канале, ЛИД и QX-314 нарушают работу воротного механизма.
Отсутствие задержки деактивации NMDA-тока после действия ЭТ, L30, ТЕТР и БЕНЗ может свидетельствовать о том, что блокада этими соединениями не изменяет протекание воротных процессов. Однако запаздывание деактивации тока при действии L30 и ЭТ может быть замаскировано потенциал-независимой компонентой блокады этими соединениями.
Тем не менее, то, что практически ни один из критериев не показал, что блокада L30 и ЭТ препятствует закрыванию, десенситизации канала и распаду комплекса канал-агонист, свидетельствует о сохранении нормальной работы воротного механизма при блокаде этими МА.
Обобщая результаты анализа влияния блокады ионной поры NMDA-каналов МА на работу воротного механизма, можно заключить, что большинство применявшихся соединений не препятствует работе воротного механизма и диссоциации комплекса канал агонист (модель 1). Исключение составляют ЛИД и QX-314, блокада которыми затрудняет десенситизацию канала и/или распад комплекса канал-агонист, однако установить это точно не представляется возможным, поскольку выводы, сделанные на основе отдельных критериев, могут искажаться потенциал-независимой компонентой блокады этими МА.
12. Связь структуры и активности МА. Чтобы исключить вклад мембранного поля в изменение свободной энергии блокирующих частиц при проникновении внутрь канала, для оценки Kd МА были использованы IC50, оцененные при Eh = 0 мВ (IC50(0), Табл. 3). Кроме того, для большинства МА значение коэффициента Хилла было отличным от единицы, что свидетельствует о существовании неблокирующих участков связывания МА. Поэтому в значение IC50(0) была внесена поправка, рассчитанная по формуле Kd=IC50(0)*(2p-1-1)-1, учитывающая взаимодействие МА с неблокирующими участками связывания (Табл. 4).
Анализ значений Kd показал, что:
Таблица 4. Значения величин IC50(0), р и 1) НОВ и БЕНЗ имеют приблизительно оценка Kd МА.
равные значения Kd, которые на два порядка IC50(0), ниже Kd тетраэтиламмония. На основании МА р Kd, мМ мМ этого сделан вывод, что решающую роль ТЕТР 1. 0.6±0.2 0.9±0. непосредственно во взаимодействии МА с БЕНЗ 0. 1.31±0.05 0.73±0. их участком связывания в NMDA-канале НОВ 0. 1.9±0.3 1.5±0. играет ароматический радикал, а заряд НОВА 0. 2.3±0.4 2.3±0. аминогруппы способствует диффузии ЛИД 1. молекул МА к их участку связывания (8±2)*10 (12±3)* внутри канала при отрицательных QX-314 1. (6±2)*10 (8±3)* мембранных потенциалах, однако в L30 1. (15±5)*10 (21±7)* связывании, по всей видимости, не ЭТ 1. 16±7 (4±2)* принимает участия.
2) Kd аминобензоатов (НОВ, НОВА, БЕНЗ, ТЕТР) на один-два порядка превосходят Kd ксилидинов (ЛИД, ЭТ, QX-314 и L30). Это может быть объяснено существованием у ксилидинов метильных групп в ортоположении бензольного кольца, которые ограничивают ориентацию карбонильного атома кислорода перпендикулярно плоскости бензольного кольца, что препятствует тесному контакту ароматического радикала с участком связывания МА в NMDA-канале, и, таким образом, подтверждает его важную роль во взаимодействии МА с NMDA-каналами.
3) Kd ЛИД в 3 раза превосходит Kd ЭТ, который имеет большее алкильное окружение вокруг концевого атома азота. На этом основании сделан вывод о существовании гидрофобного взаимодействия между алкильными цепями алифатической аминогруппы МА и участком связывания МА в канале.
4) В отличие от того, что имеет место при блокаде Na+-каналов, в случае блокады NMDA каналов Kd НОВ и НОВА различались незначительно. Это указывает на отсутствие специфического взаимодействия между полярной (амидной или эфирной) связью и участком связывания МА в NMDA-канале.
ВЫВОДЫ 1. Методом "пэтч-кламп" в конфигурации "целая клетка" установлено, что при наружном воздействии на пирамидные нейроны гиппокампа крысы местные анестетики и их структурные производные (бензокаин, тетракаин, новокаин, этидокаин, лидокаин, новокаинамид, L30 и QX-314) блокируют ионные токи через NMDA-каналы в диапазоне концентраций 10 мкМ – 10 мМ.
2. Механизмом блокады протонируемыми МА и постоянно заряженным QX-314 является закупорка ионной поры канала. При этом протонируемая (или постоянно заряженная в случае QX-314) группировка большинства МА проникает глубоко в ионную пору канала и располагается вблизи селективного фильтра. Исключение составляет ТЕТР, протонируемая аминогруппа которого при блокаде NMDA-каналов остается близко к наружному краю мембранного поля.
3. Закупорка ионной поры NMDA-каналов МА не нарушает нормальной работы воротного механизма канала и диссоциации комплекса канал-агонист. Исключение составляют QX- и ЛИД, которые в некоторой степени препятствуют десенситизации канала и/или распаду комплекса канал-агонист.
4. Ведущую роль непосредственно во взаимодействии МА с их участком связывания внутри NMDA-канала играет ароматический радикал этих соединений. Кроме того, существует более слабое гидрофобное взаимодействие между алкильными цепями алифатической аминогруппы МА и участком связывания этих соединений в канале. Заряд аминогруппы способствует диффузии молекул МА к их участку связывания внутри канала при отрицательных мембранных потенциалах, однако его вклад непосредственно во взаимодействие МА с участком связывания мал. И, наконец, в отличие от того, что имеет место при блокаде Na+-каналов, взаимодействие МА с NMDA-каналами слабо зависит от типа полярной (амидной или эфирной) связи промежуточной цепи.
5. Зависимость блокады NMDA-каналов протонируемыми МА и постоянно заряженным QX-314 от мембранного потенциала является результатом непосредственного взаимодействия между зарядом блокатора и электрическим полем мембраны, а не связана с изменением свойств канала при сдвиге мембранного потенциала.
6. Наряду с блокирующим участком внутри ионной поры канала, МА ксилидинового ряда (ЛИД, ЭТ, QX-314 и L30) имеют второй блокирующий участок, расположенный вне мембранного поля.
7. Сравнение величин IC50 МА при блокаде Na+- и NMDA-каналов показывает, что в условиях клинического применения некоторых МА (НОВ, БЕНЗ и НОВА) следует учитывать возможность побочной блокады NMDA-каналов.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ 1. Колесникова Т.В., Кошелев С.Г., Ходоров Б.И. Механизмы блокады NMDA-каналов местными анестетиками. // Биологические мембраны. 2005. – Том 22. № 6. С. 451-475.
2. Kolesnikova T.V., Koshelev S.G., Khodorov B.I. Local anesthetics as a tool for the study of biophysical properties of NMDA channels. Proceedings of Young Physiologists Symposium. September 8-9, 2002. –Leeds, UK. – P. 11.
3. Колесникова Т.В., Ходоров Б.И. Действие местных анестетиков на ионные токи через NMDA-каналы нейронов гиппокампа крысы. // Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук. XLIV научная конференция московского физико-технического института.
Труды конференции. Часть IV. 23-30 ноября 2001 г. - Москва-Долгопрудный. – С.32.
4. Kolesnikova T. V. Criterion for the Blocker Interaction with Closed NMDA Channels. // 8th International Dahlem Symposium “Cellular Signal Recognition and Transduction”, Proc. June 18 21, 2003. - Berlin, Germany. –P.02.
5. Kolesnikova T., Khodorov B. Local Anesthetics May Help to Disclose Structural Properties of the NMDA Receptor Ion Pore. // Transport Mechanism Across Cell Membranes: Channels and Pumps. Proceedings. International workshop in cell Physiology 13-17 October, 2004. – St.
Petersburg, Russia. – P. 38.
6. Колесникова Т.В., Ходоров Б.И. Местные анестетики помогают охарактеризовать структурные особенности ионной поры НМДА канала. // Третий Российский Конгресс по Патофизиологии. Тез. докл. 9-12 ноября 2004 г. – М. – С. 139-140.
7. Колесникова Т.В., Ходоров Б.И. Местные анестетики помогают охарактеризовать биофизические свойства ионной поры НМДА канала // Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук. XLVII научная конференция московского физико технического института. Труды конференции. Часть IV. 26-27 ноября 2004 г. - Москва Долгопрудный. – С.95.