Разработка системы генетической трансформации ряски малой (lemna minor l.)
На правах рукописи
ГАЙДУКОВА Софья Евгеньевна РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ РЯСКИ МАЛОЙ (LEMNA MINOR L.) 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
МОСКВА - 2011
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Центр «Биоинженерия» РАН
Научный консультант: Кандидат биологических наук Камионская Анастасия Михайловна Научный консультант: Доктор биологических наук Равин Николай Викторович
Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор Соловьев Александр Александрович Кандидат биологических наук Фадеев Виталий Сергеевич Институт Цитологии и генетики СО РАН
Ведущая организация:
Защита диссертации состоится “_” _ 2011 года в _ часов на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 при РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, Тимирязевская ул., Ученый совет РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.
С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева
Автореферат разослан «» _2011 года, и размещен на сайте Университета www.timacad.ru
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Л.С. Большакова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы.
Одним из наиболее ярких и убедительных достижений современной биотехнологии стало создание и бурное развитие новой области мировой экономики — биофармацевтической промышленности и промышленности биоматериалов, направленной на производство принципиально нового класса лекарств — рекомбинантных белков медицинского назначения и уникальных материалов Различные интерфероны, эритпропоэтины, факторы роста, антитела, вакцинные белки, промышленные ферменты, доступные ранее лишь в аналитических количествах, входят теперь в перечень жизненно-важных медицинских препаратов, производятся в объемах до нескольких тонн в год, и прочно вошли в повседневную практику современной медицины, пищевой и фармацевтической промышленности (Higo K. et al., 1993;
Zhu Z. et al., 1994;
Matsumoto S. et al., 1995).
Одним из перспективных направлений биотехнологии в настоящее время является создание растений – биореакторов, способных продуцировать рекомбинантные белки. Системы, производящие подобные белки, на основе растений могут быть безопасной и экономически конкурентоспособной альтернативой традиционным системам экспрессии, - культурам клеток микроорганизмов и животных. Так в отличие от бактериальных систем, в растениях возможно осуществление посттрансляционных модификаций, которые в ряде случаев являются необходимым этапом получения функционального белка (Terashima M. et al., 1999). Кроме того, получение рекомбинантных белков в системах на основе растительных клеток являются более безопасными в виду отсутствия рисков переноса инфекционных заболеваний, поскольку растения и человек не имеют общих патогенов (Scheller J. et al., 2004). Это является значительным преимуществом перед системами экспрессии на основе культур клеток млекопитающих.
Lemna minor (ряска малая) – однодольное покрытосеменное растение семейства Рясковые. Благодаря своей способности к быстрому, причем вегетативному размножению, позволяющему увеличивать биомассу вдвое за 36 часов и высокой доли белка в биомассе, ряска представляет интерес как потенциальная биофабрика для производства рекомбинантных белков, таких как вакцинные белки, сывороточный альбумин, гемоглобин и коллаген и др (Stomp A.M., 2005).
Растения Lemna можно выращивать в асептически закрытых емкостях с контролируемыми условиями культивирования. Для роста растениям необходимы лишь вода, неорганические питательные вещества и CO2.
(Edelman M. et al., 1998).
Таким образом, искусственная и полностью закрытая среда культивирования в сочетании с быстрым ростом, высоким содержанием белка в биомассе и преимущественно вегетативным способом размножением делают такую систему уникальной и легко контролируемой. Следовательно, система экспрессии, созданная на основе Lemna, обладает огромным потенциалом и преимуществами перед существующими системами экспрессии в связи с тем, что представляет собой новый тип эукариотической растительной высокопродуктивной системы для получения рекомбинантных белков.
Создание такой системы экспрессии возможно только с использованием методов генетической инженерии, которые для Lemna minor до сих пор остаются малоэффективными и трудоёмкими.
Все сказанное выше показывает актуальность разработки системы генетической трансформации растений ряски малой с целью создания растений-продуцентов рекомбинантных белков.
Цели и задачи исследования.
Целью настоящей работы являлось изучение регенерационной и трансформационной способности растений ряски малой (Lemna minor) и разработка эффективной системы генетической трансформации. Применение данной системы позволит создать трансгенные растения ряски, экспрессирующие рекомбинантные белки медицинского назначения.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
1. Определить оптимальную комбинацию регуляторов роста растений и тип экспланта с целью получения регенерации с частотой, подходящей для разработки системы генетической трансформации.
2. Подобрать условия эффективного селективного отбора трансформированной ткани.
3. Оптимизировать параметры проведения агробактериальной трансформации растений ряски малой.
4. Получить трансгенные растения ряски малой, несущие ген bar.
5. Провести молекулярный анализ полученных растений.
Научная новизна. Подобраны условия для культивирования, индукции каллусообразования и регенерации растений из каллуса для популяции Lemna minor, распространенной в водоемах Московской области. Показано, что наиболее эффективный эксплант для каллусообразования — целый интактный листец.
На основе подобранных условий была разработана система генетической трансформации с использованием Agrobacterium tumefaciens.
Получены трансгенные растения ряски со стабильной экспрессией гетерологичного гена bar.
Практическая значимость полученных результатов. Разработанные системы регенерации и трансформации могут быть применены для получения трансгенных растений Lemna minor с генами, кодирующими терапевтически ценные белки.
Апробация работы Материалы диссертации были представлены на 10-ой и 11-ой Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых (Пущино, 2006, Пущино, 2007);
на Российско-польском симпозиуме (Москва, 2008);
на IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008);
на Международной конференции «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Звенигород, 2008);
на молодежном симпозиуме V го Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано одиннадцать печатных работ, в том числе одна статья в ведущем рецензируемом научном журнале.
Структура и объем работы. Диссертация включает: введение;
обзор литературы;
описание материалов и методов исследования;
результаты и их обсуждение;
выводы;
список литературы.
Работа изложена на 108 страницах машинописного текста, содержит таблиц, 14 рисунков. Список использованной литературы содержит источник, в том числе 191 на иностранных языках.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалом для работы служили растения Lemna minor, собранные в водоемах Московской области. Растительный материал культивировали на питательных средах: Мурасиге и Скуг, Хоагланд, Шенк и Хилдебрандт, Гамборг (Murashige T. et al., 1962;
Hoagland D.R. et al., 1938;
Schenk R.U. et al., 1972;
Gamborg O.L. et al., 1968).
Для трансформации растений ряски использовали штамм Agrobacterium tumefaciens GV3101 (Helens R. et al., 2000), содержащий бинарный вектор pBar UBI. Этот вектор содержит в пределах Т-ДНК области под контролем промотора pUbi1 (Christensen A. et al.,1996) кукурузы ген bar (Падегимас Л. и др., 1993), обуславливающий устойчивость к гербицидам на основе фосфинотрицина (Рисунок 1).
LB Tnos Pubi RB BAR intron PstI PstI, BamHI Рисунок 1 — Структура т-ДНК-вектора, использованного для получения трансгенных растений ряски В опытах по транзиетной экспрессии использовали супервирулентный штамм EHA105 (Hood E., 1993), содержащий векторную конструкцию pGFP (Фолимонов А.С.). Данная конструкция содержит маркерный ген gfp, находящийся под контролем 35S промотора и NOS-терминатора В качестве эксплантов для трансформации использовали фрагменты морфогенного каллуса. Экспланты инкубировали с разведенной культурой A. tumefaciens в течение 10, 20 или 30 минут, затем переносили на стерильную фильтровальную бумагу и далее — на чашки Петри со средой Хогланд с ацетосирингоном (200 µM) для со-культивации. Инокуляцию эксплантов с полученной агробактериальной культурой проводили в жидкой питательной среде AB, разбавленной средой MS в соотношении 1:4 с добавлением целлита (для увеличения количества поранений на единицу площади экспланта) при постоянном помешивании 160 об/мин, в течение 10, 20, 30 мин. Затем экспланты подсушивали на стерильной фильтровальной бумаге и перекладывали на твердую среду. Со-культивацию проводили на агаризованной среде Хоагланд в течение 3 суток в темноте.
Интеграцию гетерологичных последовательностей в геном ряски малой определяли методом ПЦР. Наличие экспрессии гена bar (фосфинотрицин ацетил-трансфераза – ФАТ) определяли с помощью Trait LL Lateral Flow Test Kit (Strategic Diagnostics Inc.). Для проведения Саузерн блот-гибридизации (Southern, 1975) использовали одноцепочечный меченый [а-32P] ATP зонд.
Статистическую обработку данных проводили с использованием методики подсчета стандартного отклонения и доверительного интервала (ДИ) с заданным значением достоверности 95%.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ Получение асептического материала. Наличие асептического растительного материала является необходимым условием для проведения экспериментов in vitro. Уже на первых этапах нашей работы мы столкнулись с трудностью обеззараживания растительного материала, так как используемые нами растения ряски, взятые из природных условий Московской области, были сильно загрязнены. При помещении таких растений на стерильную питательную среду наблюдали стремительный рост бактериальной и грибной инфекций. В основе же приведенных методик асептической обработки растений и эксплантов ряски лежит использование различных концентраций гипохлорита натрия (Clorox, Purex и др.) (Huebert D.V. et al.,1990). Нами были протестированы 4 варианта сочетаний и экспозиций стерилизующих агентов на предмет пригодности их для получения асептических растений ряски.
Максимальный выход асептических растений наблюдали при использовании композиции 4% гипохлорит натрия в течение 4 минуты и 70% этанол в течение 30 секунд. При обеззараживании данным способом выход асептических растений, составил в среднем 65-70%. Применение дополнительных пассажей с использованием противогрибковых компонентов (фунгицид «Топаз») или замена гипохлорита натрия на 0,002%-ый раствора мирамистина оказались неэффективными, выход асептических растений не превышал 40%. Применение предварительного культивирования листецов (за несколько дней до проведения процедуры асептизации) на минеральной питательной среде с минимальным содержанием органических веществ (лишь 0,2% сахарозы), в результате чего может быть замедлен рост микроорганизмов (Hillman W.S. et al., 1961) оказался неэффективным. На второй день после помещения растений на минеральную среду наблюдали развитие бактериальной и/или грибной инфекции, препятствующие дальнейшему росту растений.
Таблица 1 - Результаты опыта по определению оптимального варианта обеззараживания исходного растительного материала Число обеззараженных % обеззараженных № Число растений, шт.
растений, шт. растений 1 254 5,5±1,3 22,0±5, 2 254 8,3±1,5 33,0±5, 3 254 17,0±0,8 68,0±3, 4 254 4,5±0,6 18,0±2, Необходимо отметить, что не все обеззараженные растения сохраняли жизнеспособность и способность к размножению. Это вероятно связано с высокой степенью чувствительности клеток эпидермального слоя ряски к различным видам стерилизующих агентов (Таблица 2).
Таблица 2 - Жизнеспособность асептизированных растений Число обеззараженных растений, % обеззараженных растений, давших № давших потомство, шт. потомство 1 1,3±0,5 5,0±2, 2 3,0±5,8 12,0±3, 3 12,8±0,9 51,0±3, 4 1,8±0,9 7,0±3, Таким образом, вариант стерилизации растений ряски в 4%-ном гипохлорите натрия (4 мин) и в 70%-ном спирте (30 с) оказался наиболее эффективным, так как при этом наблюдали более высокий выход обеззараженных и жизнеспособных растений, чем при использовании других композиций. Полученные обеззараженные растения были введены в культуру in vitro и использованы в экспериментах по оптимизации параметров регенерации и трансформации.
Подбор состава питательной среды для культивирования.
Эффективность проведения экспериментов in vitro зависит от подобранных условий, в том числе от используемого типа питательной среды. Были протестированы питательные среды – Мурасиге и Скуг, Гамборг, Шенк и Хилдебрандт, Хоагланд для выявления наиболее оптимального типа среды, позволяющего получать наибольший коэффициент размножения растений, который можно будет использовать в трансформационном процессе.
Количественный учет вновь образующихся растений был крайне затруднён из за высокой скорости их размножения, поэтому критерием для выбора оптимальной среды служила кратность увеличения массы растений. Через недели культивирования наблюдали увеличение биомассы растений в среднем в 3 раза на средах Мурасиге и Скуг (МС), Шенк и Хилдебрандт, Гамборг и в 5 раз на среде Хоагланд (Таблица 3).
Таблица 3 - Результаты опыта по подбору оптимальной питательной среды для культивирования листецов ряски Тип среды Исходный вес Вес растительного Коэффициент размножения* растительного материала через материала, мг недели, мг Гамборг 75 247,5±18,0 3,30±0, Mурасиге и 75 253,5±12,8 3,38±0, Cкуг Шенк и 75 211,5±13,5 2,82±0, Хилдебрандт Хоагланд 75 381,0±17,3 5,08±0, * - отношение массы растительного материала через 14 дней культивирования к исходной массе материала.
Таким образом, наибольший коэффициент размножения растений ряски был отмечен на среде Хоагланд, состав которой отличался самым низким содержанием микро- и макроэлементов из всех тестируемых типов сред.
Полученные результаты, вероятно, связаны с тем, что ряске как водному растению, привыкшему к минимальному содержанию питательных веществ в водной среде обитания, наиболее подходит среда с невысокими концентрациями солей. В дальнейшей работе все эксперименты проводили с использованием среды Хоагланд.
Определение оптимальных концентраций селективных агентов.
Известно, что эффективность генетической трансформации растений зависит от возможности осуществления конечного этапа — получения из клеток и тканей полноценных растений. Однако сам процесс трансформации и последующее продолжительное культивирование трансгенных многоклеточных тканей в условиях клеточной селекции значительно снижает морфогенную способность клеток. Поиск оптимальной концентрации селективного агента, которая позволит избежать появления химерных растений и в то же время не будет отрицательной влиять на последующий морфогенез, является важнейшим этапом получения трансгенных растений.
Чтобы в дальнейшем иметь возможность расширить спектр использования генетических конструкций, мы использовали различные селективные агенты и определяли их рабочие концентрации.
В качестве эксплантов в опытах использовали целые интактные растения (листецы), так как в случае использования для этой цели фрагментов каллуса, статистический анализ результатов был бы затруднен.
Рисунок 2- Листецы ряски малой на среде содержащей 8 мг/л фосцинотрицина (слева) и без селективного агента (справа) через 6 недель культивирования Рисунок 3 - Листецы ряски малой на среде содержащей 100 мг/л канамицина (слева) и без селективного агента (справа) через 6 недель культивирования Рисунок 4 – Транзиентная экспрессия гена gfp на 3 сутки при использовании в качестве экспланта целого (слева) и половины листеца (справа) гиалиновая нить Рисунок 5 - Увеличение размера гиалиновой нити через 3 недели от начала культивирования Рисунок 6 - Морфогенный каллус Lemna minor Рисунок 7 - Смесь каллусных культур (12 недель с момента индукции) Рисунок 8 - Регенерация листецов из каллуса Рисунок 9 – Транзиентная экспрессия маркерного гена gfp фрагментов каллуса Различия в действии селективных агентов проявлялись в этиолировании листецов, замедлении темпа их пролиферации и уменьшении размеров дочерних листецов (Рисунок 2, 3).
Учет погибших и выживших растений проводили каждые 2 недели.
Оптимальными концентрациями были признаны те концентрации, при использовании которых наблюдали 100% гибель листецов в течение исследуемого периода (Таблица 4).
Таблица 4. Результаты опытов по определению рабочей концентрации селективных агентов Селективный Концентрация (мг/л) % погибших растений агент 2 недели 4 недели 6 недель селекции селекции селекции Глифосат (gly) 2,0 20,0±5,5 25,0±3,3 58,0±3, 4,0 32,0±5,5 46,0±8,0 69,0±3, 8,0 42,0±2,3 67,0±3,3 79,0±4, 16,0 47,0±3,8 76,0±2,8 Гигромицин 0,2 16,8±3,7 32,0±2,0 67,0±3, (hyg) 0,5 27,8±4,6 47,1±2,2 79,0±3, 1,0 47,1±2,2 63,2±2,2 86,0±2, 2,0 52,9±2,2 76,1±2,2 4,0 64,1±1,9 94,2±2,8 8,0 72,1±2,0 100 Канамицин (km) 50 34,0±2,0 53,0±3,8 81,0±3, 100 44,0±2,8 70,0±2,3 200 73,3±3,3 100 Фосфинотрицин 0,5 0 25,0±3,8 51,0±3, (ppt) 1,0 0 33,0±2,0 61,0±3, 2,0 0 41,0±3,8 74,0±2, 4,0 32,0±3,2 48,0±3,2 87,0±2, 8,0 49,0±3,8 73,0±2,0 Таким образом, были определены рабочие концентрации селективных агентов – 16 мг/л глифосата, 2 мг/л гигромицина, 100 мг/л канамицина и 8 мг/л фосфинотрицина. Полученные результаты по определению рабочих концентраций для различных селективных агентов были успешно применены и при работе с фрагментами каллуса.
Определение оптимального типа экспланта для агробактериальной трансформации на основе транзиентной экспрессии маркерного гена. Для подбора оптимальных параметров агробактериальной трансформации ряски был использован вектор, содержащий репортерный ген gfp, экспрессию которого легко детектировать в трансформированных тканях.
Автофлюоресценция клеток ряски нами не была выявлена, что делало возможным использование данного гена для оптимизации параметров трансформации.
Для трансформации использовали штамм A. tumefaciens EHA105 и экспланты двух типов — листецы с поранением в меристематической зоне и половинки листецов, так как предполагалось получить регенеранты за счет прямого соматического эмбриогенеза миную каллусную культуру. Оценку наличия/отсутствия экспрессии маркерного гена проводили через 3 суток после окончания со-культивации. При этом наблюдали единичные точки свечения обоих типов эксплантов (Рисунок 4), что подтверждает возможность агробактериальной трансформации ряски, однако ее эффективность была крайне низкой. К тому же, регенерация происходила не из светящихся клеток.
Компетентность к трансформации культуры in vitro растений Lemna minor была подтверждена детекцией транзиентной экспрессии гена gfp (Рисунок 4).
В первой серии опытов по трансформации конструкцией pBar UBI в качестве эксплантов использовали также как и в опытах с маркерным геном gfp листецы или их половинки. Однако трансгенных растений получить не удалось, несмотря на происходящую регенерацию, что, по всей видимости, связано с низкой частотой переноса Т-ДНК из агробактерии в клетки меристемы. В связи с чем, в дальнейшем было решено использовать в качестве экспланта для трансформации каллус.
Изучение влияния состава питательной среды, типа экспланта и регуляторов роста растений на процесс каллусообразования. Индукция каллусообразования и регенерация растений является генотип-зависимым процессом, но также зависит и от взаимодействия различных факторов, в том числе от состава питательной среды, типа экспланта и различных типов и концентраций регуляторов роста растений. Имеются сведения о влиянии условий культивирования на эффективность каллусообразования. Стефаниак и коллеги пришли к выводу, что повышенная температура (25°С) и темнота стимулируют процесс каллусообразования (Stefaniak B. et al., 2002). Однако Фрик с соавторами получал каллус у L. minor при непрерывном освещении (Frick H. et al., 1994). По мнению Мун и Стомп свет – необходимый фактор формирования каллуса у L. gibba, несмотря на то, что в экспериментах лишь 10% эксплантов формировали каллус (Moon H.K. et al., 1997). Преимущество повышенных температур (25-28°С) для индукции каллуса у L. gibba также продемонстрировали Чанг и Чиу (Chang W.C. et al., 1976). В своих экспериментах по индукции каллусообразования мы тестировали интервал температур от 18°С до 27°С и различные условия освещения. В наших опытах при отсутствии освещения наблюдалась гибель всех эксплантов.
Оптимальными условиями были определены 22-25°С и фотопериод 16 ч день/8 ч ночь.
Так как ряска – одно из редуцированных покрытосеменных растений, выбор экспланта для получения каллуса довольно ограничен. По мнению Стефаниака нанесение поранения листецам необходимо для индукции каллуса у L. minor и приводит к высокому уровню формирования каллуса до 89,11% (Stefaniak B. et al., 2002).
Для определения типа экспланта, наиболее компетентного к каллусообразованию, использовали: целое интактное растение, половинки листецов и разрезанные вдоль либо поперек центральной жилки (вдоль или поперек не имеет значения, так как важным фактором является повреждение меристематической зоны) листецы с поранением в меристематической зоне.
Для каждого типа экспланта определяли оптимальную комбинацию ростовых регуляторов с целью получения наибольшей частоты каллусообразования.
На основе анализа литературных данных (Edelman M. et al., 2003;
Li J. et al., 2004;
Moon H.K. et al., 1997) была разработана схема эксперимента, содержащая девять комбинаций наиболее эффективных для индукции образования каллуса регуляторов роста — 2,4-D и BAP (Таблица 5). Во всех вариантах была использована среда Хоагланд и три типа эксплантов.
Во всех вариантах через четыре недели культивирования вегетативное размножение прекращалось и начиналось формирование каллуса. При этом наблюдалось видоизменение листецов, которое проявлялось в увеличении их размера, изменении формы и цвета. Гиалиновая нить, связывающая дочерние растения с материнским, заметно увеличивалась в размерах через 2-3 недели, что являлось одним из визуальных критериев начала формирования каллусной ткани (Рисунок 5), собственно образование каллуса наблюдалось через 11 12 недель от начала культивирования.
При использовании всех типов эксплантов наблюдали образование каллуса (Рисунок 6) с частотой от 12% до 83% (Таблица 5). В основном образовывалась смесь каллусных культур, состоящая из образований белого неморфогенного и зеленого морфогенного каллусов (Рисунок 7).
Каллусообразование морфогенного каллуса с наибольшей частотой (83%) происходило в варианте №5, при добавлении в питательную среду 2 мг/л БАП и 20 мг/л 2,4-Д и при использовании в качестве экспланта целого интактного растения.
Таблица 5. Результаты эксперимента по изучению влияния состава среды и типа экспланта на эффективность каллусообразования Кол-во эксплантов (%), образующих каллус листец с Варианты опыта* целое интактное поранением в половинки листецов растение (листец) меристематической области 10 мг/л 2,4-Д, 66,0±5,1 54,0±2,3 32,0±2, 1 мг/л БАП 10 мг/л 2,4-Д, 74,0±3,9 59,0±3,8 39,0±1, 2 мг/л БАП 10 мг/л 2,4-Д, 54,0±2,3 45,0±2,0 21,0±1, 3 мг/л БАП 20 мг/л 2,4-Д, 69,0±4,9 60,0±3,2 32,0±2, 1 мг/л БАП 20 мг/л 2,4-Д, 81,0±2,0 73,0±3,8 55,1±2, 2 мг/л БАП 20 мг/л 2,4-Д, 48,0±3,2 42,0±2,3 25,0±2, 3 мг/л БАП 30 мг/л 2,4-Д, 68,0±4,5 55,5±2,0 32,0±2, 1 мг/л БАП 30 мг/л 2,4-Д, 76,0±3,2 61,0±3,8 35,9±3, 2 мг/л БАП 30 мг/л 2,4-Д, 50,0±2,3 42,0±1,6 14,4±2, 3 мг/л БАП Среди тестируемых эксплантов наиболее предпочтительно использование целых интактных растений.
Регенерация листецов из морфогенного каллуса. Для регенерации однодольных растений из каллуса используют различные среды, как с регуляторами роста растений, так и без них. Выбор зависит от генотипа растения и состава среды, используемого для каллусообразования. Мун и Стомп получили регенерацию растений L. gibba из каллуса на безгормональной среде (Moon H.K. et al., 1997). Поскольку для индукции каллусообразования мы использовали среду с достаточно высоким содержанием регуляторов роста растений, для получения растений-регенерантов фрагменты каллуса поместили на среду без регуляторов роста растений. Через неделю после переноса каллуса ряски на безгормональную среду наблюдали начало регенерации многочисленных листецов (Рисунок 8). На каждом фрагменте каллуса образовывалось от 2 до 8 растений.
Растения ряски, полученные нами через непрямой органогенез, не отличались по морфологическим характеристикам (цвет и размер) от контрольных растений.
Определение оптимальных параметров агробактериальной трансформации фрагментов каллуса на основе транзиентной экспрессии маркерных генов. Во время проведения экспериментов по трансформации фрагментов каллуса были протестированы следующие параметры агробактериальной трансформации: 1) влияние продолжительности пре культивации (промежуток времени от момента поранения экспланта до инокуляции с агробактерией);
2) продолжительность инокуляции;
3) время со культивации с агробактерией.
Таблица 6. Влияние типа экспланта, продолжительности инокуляции и со-культивации на частоту экспрессии gfp Пре- Продолжительность Продолжительность Частота транзиентной культивация со-культивации, инокуляции, мин экспрессии, % эксплантов сутки 10 2 7,0±3, 3 7,0±4, 4 18,0±5, 20 2 35,0±3, Без пре 3 43,0±8, культивации 4 35,0±10, 30 агробактериальный зарост 10 2 9,0±2, 3 23,0±9, 4 21,0±10, 20 2 46,0±10, Пре культивация 3 40,0±3, 24 часа 4 39,0±9, 30 агробактериальный зарост Поскольку в данном эксперименте мы использовали маркерный ген, было предложено эффективность трансформации условно прировнять к частоте транзиентной экпрессии.
В результате экспериментов были определены оптимальные параметры для трансформации эксплантов ряски (Таблица 6). Было показано, что нет необходимости в проведении стадии пре-культивации, так как нет существенных различий в эффективности трансформации независимо от длительности инокуляции.
Была определена оптимальная продолжительность инокуляции, которая составила 20 мин (эффективность трансформации 24,7-56,4%), в то время как, при продолжительности 10 мин. эффективность варьировала от 3,2 до 31,3%, а при 30 минутах наблюдалась гибель эксплантов от агробактериального заражения. Наибольшая эффективность трансформации 51,7 % и 56,4% достигается при продолжительности со-культивации эксплантов с агробактерией в течении 3 суток и 2 суток соответственно (Рисунок 9). Однако во втором случае предшествует стадия пре-культивации длящаяся сутки, что нивелирует различия в продолжительности протокола трансформации. Таким образом, разработанный протокол трансформации включает в себя собственно инокуляцию 20 минут и со-культивацию 3 суток.
Получение трансгенных растений с геном bar. Далее по разработанному протоколу были проведены эксперименты по трансформации каллуса Lemna minor конструкцией, несущей ген bar. В результате проведения опытов по трансформации, из первоначально взятых в каллусообразование листецов, было получено 27 фосфинотрицин-устойчивых растений.
Устойчивые растения анализировали методом ПЦР на присутствие/отсутствие гена bar (Рисунок 10). В результате анализа было показано наличие искомого гена в геноме 13 растений ряски.
350 п.н.
Рисунок 10 - Электрофоретический анализ результатов ПЦР в 1%-м агарозном геле. 1 маркер молекулярной массы (GeneRulerTM DNA Ladder Mix, Fermentas);
2 – ПЦР в отсутствие ДНК-матрицы;
3 – в качестве матрицы использовали ДНК, выделенную из не трансформированного растения;
4-17 – ДНК регенерантов ряски;
18 – ДНК плазмиды pBar UBI.
Полученный результат можно объяснить химерностью полученных растений, т.е. часть нетрансгенных клеток и тканей выживала за счет трансгенных, что можно объяснить диффузией фермента ФАТ.
контрольная полоса тестовая полоса Рисунок 11 - Анализ экспрессии гена bar фермента фосфинотрицин-N-ацетил трансферазы (pat) с помощью TRAIT LL Lateral Flow Test kit. 1 - контрольное (нетрансформированное) растение;
2-4 - трансформированные растения (наличие 1-ой контрольной полосы свидетельствует о корректном прохождении анализа, наличие 2 – ой тестовой полосы свидетельствует об экспрессии гена bar).
Экспрессия гетерологичного гена была подтверждена при помощи экспресс-системы Lateral Flow Test (Рисунок 11) в 12 из 13 ПЦР положительных растений. Мониторинг наличия и экспрессии гена bar в поколениях при вегетативном размножении полученных трансгенных растений показал стабильное наследование целевого гена.
Рисунок 12. Схема Т-ДНК вектора и результаты Саузерн блот анализа. А - Структура Т-ДНК-вектора, использованного для получения трансгенных растений ряски. LB и RB - левая и правая границы Т-ДНК, соответственно;
Pubi – промотор Ubi1 гена кукурузы;
BAR – ген фосфинотрицинацетилтрансферазы из Streptomyces hygroscopicus;
Tnos – терминатор гена нопалинсинтазы;
Intron - интрон Ubi1 гена кукурузы;
PstI, BamHI – места узнавания эндонуклеаз рестрикции. Положение фрагмента, использованного для синтеза зонда, указано черным прямоугольником. B - Результаты Саузерн блот анализа.1– маркер молекулярного веса GeneRuler DNA Laders (Fermentas);
2 – ДНК контрольного растения, обработанная BamHI, 3 – ДНК трансгенного растения, обработанная BamHI, 4 – ДНК контрольного растения, обработанная PstI, 5 – ДНК трансгенного растения, обработанная PstI.
Одно из полученных растений (№ 3) было проанализировано с помощью Саузерн-блоттинга. Полученные результаты (Рисунок12В) подтверждают факт интеграции целевого гена bar в геном L. minor, в проанализированном растении имеется две копии трансгенной вставки.
ВЫВОДЫ 1. Определены оптимальные условия получения каллуса — питательная среда Хоагланд, комбинация регуляторов роста: 2,4-Д в концентрации 20 мг/л и БАП в концентрации 2 мг/л.
2. Определены рабочие концентрации четырех селективных агентов для отбора трансформированной ткани растений Lemna minor: фосфинотрицин – 8 мг/л, глифосат – 16 мг/л, канамицин – 100 мг/л, гигромицин 2 мг/л;
продолжительность селективного отбора не менее 6 недель.
3. Показано, что оптимальным типом экспланта для проведения агробактериальной трансформации Lemna minor является каллус.
4. Показано, что наибольшая частота транзиентной эспрессии гена gfp (46,0±10,4%) достигается при продолжительности инокуляции эксплантов с агробактерией в течение 20 минут. Эффективность трансформации на уровне 43,0 ±8,7% была отмечена при продолжительности со-культивации фрагментов каллуса с агробактерией в течение 3 суток.
5. Используя разработанный протокол трансформации каллуса Lemna minor конструкцией, несущей ген bar, было получено 13 трансгенных растений. В ходе молекулярного анализа (ПЦР) был подтвержден трансгенный статус данных растений и экспрессия гетерологичного гена в 12 из них.
6. Определено количество копий гена bar в геноме трансгенного растения Lemna minor №3. Показано встраивание двух копий гена.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Гайдукова С.Е., Ракитин А.Л., Равин Н.В., Скрябин К.Г., Камионская А.М. Разработка системы генетической трансформации ряски малой Lemna minor. Экологическая генетика, 2008, том VI, выпуск 4, с. 20-28.
2. Гайдукова С.Е., Белоусова М.Б., Камионская А.М., Скрябин К.Г.
Изучение регенеративной способности водных однодольных растений на примере Lemna minor. Материалы Третьего Московского международного конгресса «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы». Москва, 2005.
С. 240-241.
3. Гайдукова С.Е., Камионская А.М. Изучение регенеративной способности ряски малой Lemna minor. 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино, 2006. С. 362-363.
4. Гайдукова С.Е., Камионская А.М. Разработка системы генетической трансформации ряски, Lemna minor. Материалы четвертого съезда Общества Биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. Пущино, 2006.
С. 51.
5. Гайдукова С.Е. Агробактериальная трансформация ряски малой, Lemna minor. 11-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино, 2007. С. 189.
6. Гайдукова С.Е., А.М. Камионская, К.Г. Скрябин. Разработка системы генной трансформации ряски, Lemna minor. Четвертый Московский международный конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы».
Москва, 2007. С. 226.
7. Гайдукова С.Е., Камионская А.М. (2007) Разработка системы генной трансформации ряски, Lemna minor. VII Молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». Москва, 2007. С. 15-16.
8. Гайдукова С.Е. Оптимизация параметров генетической трансформации растений ряски малой Lemna minor. Пятый Московский международный конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы».
Москва, 2009. С. 312-313.
9. Гайдукова С.Е. Трансгенные растения ряски малой — биофабрики для производства лекарств. Тезисы IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». Звенигород, 2008. С. 88-89.
10. Гайдукова С.Е. Оптимизация протокола генетической трансформации растений ряски малой, Lemna minor. Международная конференция «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях». Звенигород, 2008. С. 14.
11. Гайдукова С.Е. Оптимизация параметров генетической трансформации растений ряски малой, Lemna minor. V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва, 2009. Часть II. С. 368.