Ответные реакции микроорганизмов на одновременное воздействие нескольких стрессорных факторов: гипо- и гиперосмотических условий, гипоксии, неблагоприятных значений рн
На правах рукописи
ШЕЛЕМЕХ ОКСАНА ВЛАДИМИРОВНА Ответные реакции микроорганизмов на одновременное воздействие нескольких стрессорных факторов: гипо- и гиперосмотических условий, гипоксии, неблагоприятных значений рН Специальность 03.00.07. – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Москва 2008
Работа выполнена в лаборатории нефтяной микробиологии Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор В.К. Плакунов
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Г.И. Эль-Регистан доктор биологических наук, профессор Н.Б. Градова
Ведущая организация:
кафедра биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова
Защита диссертации состоится «24» ноября 2008 года в 15-00 часов на заседании диссертационного совета Д.002.224.01 в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117332, г. Москва, Проспект 60-летия Октября, д. 7, к. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С.Н.Виноградского РАН.
Автореферат размещен на сайте: http://www.inmi.ru/dissovet.php Автореферат разослан « » _2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук: Т.В. Хижняк
Общая характеристика работы
Актуальность темы. В «экстремальных» условиях среды микроорганизмы, как правило, подвергаются влиянию не одного, а нескольких стрессовых факторов, действующих одновременно или последовательно. Например, термофильные микроорганизмы подвергаются не только тепловому воздействию, но часто также высокой концентрации солей или кислой реакции среды.
Между тем, в многочисленных исследованиях последствий экстремальных воздействий, как правило, стрессовые факторы используют по отдельности, создавая условия «моностресса». Широко известны работы, посвященные таким стрессовым факторам, как гипертермия [Тэнси и Брок, 1981, Hottiger et al, 1987;
Collinson and Dawes, 1992;
Mutoh et al, 1995;
Mojica et al, 1997;
Kilstrup et al, 1997;
Macario et al, 1999 и т.д.], факторам, вызывающим окислительный стресс [Fridovich, 1975;
Wilkins et al, 1978;
Гаенко с соавт., 1985;
Imlay et al, 1988;
Jamieson, 1995;
Tran et al, 1993], гипо- или гиперосмотическим воздействиям [Larsen, 1962;
Brown and Simpson, 1972;
Shindler, 1976;
Lukas et al, 1990;
Van Zyl et al, 1990;
Galinski and Truper, 1994] и др.
Однако, последствия воздействия на метаболизм единичных стрессовых факторов могут существенно отличаться от последствий, вызываемых одновременным их воздействием. Последнее явление пока еще изучено недостаточно. Наибольшее внимание уделяется таким сочетаниям, как гипертермия и неоптимальные концентрации NaCl [Кунтиков и Горленко, 1998;
Leblanc et all, 2000;
Periago et all, 2002a, 2002b], углеродное голодание, гипертермия и осмотические стрессоры [Mccann, 1993;
Murata, 1999;
Herbert and Foster, 2001], осмотические стрессоры и H2O2 [Hartke et all, 1995;
Browne and Dowds, 2001], воздействие ультрафиолетового излучения и углеродное голодание [Srinivasan and Kjelleberg, 2001] и др. Изучение же механизмов адаптации к совместному действию стрессоров находится на начальной стадии. Весьма распространенным сочетанием стрессовых факторов в естественных условиях обитания микроорганизмов является высокое осмотическое давление (в частности, избыток NaCl) и недостаток кислорода. Исследования в этом направлении были начаты в лаборатории нефтяной микробиологии ИНМИ РАН [Арзуманян с соавт., 2000]. Настоящая диссертация является продолжением и развитием этого направления.
Очевидно, что изучение влияния гипоксии и повышенных концентраций NaCl на микроорганизмы, выделенные из различных экосистем, а также механизмов адаптации к такому воздействию представляет большой научный интерес.
Цель и задачи исследования. Целью данного исследования явилось изучение последствий и механизмов адаптации к одновременному воздействию гипо- или гиперосмотического шока и гипоксии (или неблагоприятного рН) у микроорганизмов, изолированных из экотопов, где, как правило, эти стрессовые агенты являются факторами внешней среды.
Задачи исследования:
1. Изучение зависимости скорости роста микроорганизмов от повышенного содержания NaCl в условиях нормоксии и гипоксии.
2. Изучение влияния NaCl на дыхание микроорганизмов, выращенных в условиях нормоксии и гипоксии.
3. Изучение влияния комбинированного действия NaCl и гипоксии на ферменты, защищающие клетку от окислительного стресса (каталазу и супероксиддисмутазу).
4. Изучение изменений состава дыхательной цепи у микроорганизмов в условиях гипоксии и гиперосмотического шока.
5. Изучение возможности противодействия гипоосмотическому шоку у экстремально галофильных бактерий.
Научная новизна. Впервые детально изучены рост и дыхательная активность ряда эукариотных (Candida lipolytica, Rhodotorula aurantiaca, Candida rhagii, Debaryomyces hansenii) и прокариотных (Rhodococcus erythropolis, Shewanella sp., Halobacterium salinarum) микроорганизмов в условиях одновременного воздействия двух стрессовых факторов: гипо- или гиперосмотического шока и гипоксии (или неблагоприятного рН).
Впервые продемонстрировано ингибиторное действие соли на активность ферментов, защищающих клетку от окислительного шока (каталазы, супероксиддисмутазы), а также обнаружено в условиях гипоксии явление активации (индукции) каталазы, менее чувствительной к ингибиторному действию соли.
Впервые обнаружено явление переключения на альтернативные дыхательные механизмы, менее чувствительные к соли, в условиях одновременного воздействия гиперосмотического шока и гипоксии, на примере дыхательной цепи Debaryomyces hansenii.
Впервые обнаружено защитное действие протонов в условиях гипоосмотического шока на примере растущей культуры Halobacterium salinarum.
Научно-практическая значимость. Полученные результаты уточняют, а в ряде случаев раскрывают, механизмы защитных реакций микроорганизмов в условиях одновременного воздействия стрессовых факторов, характерных для их природных экотопов. Результаты работы позволяют дать рекомендации по более эффективному применению микроорганизмов в системах биологической очистки и повышения нефтеизвлечения в экстремальных условиях.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на школе - конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), 21st International Specialized Symposium on Yeasts "Biochemistry, Genetics, Biotechnology and Ecology of Non-conventional Yeasts (NCY)". (Lviv, Ukraine. August 2001), 1-м Съезде микологов России (Москва, 2002), XV Международной зимней молодёжной научной школе (Москва, 10-14 февраля 2003), 1-м Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 20-21 февраля 2003), 23rd International Specialised Symposium on Yeasts "Interactions between Yeasts and other Organisms" (Budapest, Hungary. 26 - 29 August. 2003). 1-м Международном конгрессе по биотехнологии, Москва, 2003;
Int. Symposium for subsurface Microbiology. ISEB XVIII. 2005.;
Всероссийская молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2005.
Публикации. По теме диссертации, опубликовано 11 печатных работ, из них экспериментальных статей и обзоров, а также 6 тезисов.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на _ страницах машинописного текста и содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы и список литературы (_источников). Текст проиллюстрирован _ рисунками и таблицей.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность руководителю работы д.б.н.. проф. Плакунову В.К., а также моим соавторам д.б.н., проф.
С.С.Беляеву, д.б.н. В.Г.Арзуманян, и к.б.н. О.В.Гейдебрехту за консультации и помощь в работе, к.б.н. Е.П.Лукашеву за помощь при регистрации дифференциальных спектров цитохромов.
Работа проводилась при частичном финансировании в рамках проекта РФФИ 01-04-48275, подпроекта “Биотехнология повышения нефтеизвлечения” ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения", Государственных контрактов с Минпромнауки РФ № 43.106.11.0009 и № 43.073.11.2515 и Проекта МАС РФФИ, 01-04-48275, 2003 г.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты и методы исследования Объектами исследования были 8 штаммов про- и эукариотных микроорганизмов: Halobacterium salinarum (штамм S9) получена от prof. D.
Oesterhelt (Институт Макса Планка, Германия);
Shewanella sp. CN32 получена от Dr. Belyaev A.S. (Nat.Lab.,Oak-Ridge, USA);
Rhodococcus erythropolis выделен из пластовых вод Бондюжского нефтяного месторождения (Татарстан), получена от к.б.н. Е. И. Милехиной (ИНМИ РАН). Candida( Yarrowia) lipolytica (штамм 367 3), получена как и предыдущая культура. Rhodotorula aurantiaca (штамм 786), выделена из соленой воды Сакского лимана (Крым). Malassezia sp. (штамм 607), выделена с поверхности кожи здорового человека, получена из коллекции Института вакцин и сывороток им. Мечникова. Candida rhagii (ВКМ Y-2339), выделена из активного осадка на нефтехимическом заводе г. Ангарск, получена из ВКМ. Debaryomyces hansenii (ВКМ Y-116), выделена из муки семян хлопка, получена из ВКМ.
Методы культивирования и анализа. Дрожжевые и бактериальные культуры поддерживали на глюкозо-пептон-дрожжевом агаре [Yarrow, 1998], pH 5.4 для дрожжей (поддерживали с помощью калий-фосфатного буфера, 1,1 мМ);
рН 7,0 – 7,2 для бактерий, а Malassezia sp. – на модифицированной агаризованной среде Диксона [Guillot et al, 1996]. В среды, на которых культивировали дрожжи, добавляли антибиотик цифран (ципрофлоксацин) (0,2 мг/мл) для подавления случайного роста бактерий. H. salinarum выращивали и поддерживали на модифицированной пептонной среде состава (г/л дистиллированной воды):
пептон «Oxoid» (Англия) – 10;
MgSO4x7H2O – 20;
KCl – 2;
трехзамещенный цитрат натрия – 3;
NaCl – 200;
рН – 7,2.
Культивирование микроорганизмов проводили во флаконах объемом 100 мл, содержащих 20 мл жидкой среды на качалке при скорости вращения 150 об/мин, температуре 26-270С (кроме галобактерий). Галобактерии выращивали при 37 380С. Для контроля кислотности сред использовались рН-метры: рН-340 или PICCOLO HI 1290.
При аэробном культивировании микроорганизмы выращивали под ватными пробками. Для создания микроаэробных условий флаконы закрывали резиновыми пробками, проколотыми шприцевыми иглами диаметром 0,8 мм с неплотными ватными шариками. При микроаэробном выращивании среду во флаконах предварительно барботировали аргоном. Содержание кислорода в газовой фазе на начальном этапе культивирования не превышало 1-2 %.
Применение сульфитного метода определения интенсивности аэрации [Егоров, 1976] показало, что степень аэрации в микроаэробных условиях составляет около 1% от аэробных условий. Контроль чистоты культур осуществлялся в световом бинокулярном микроскопе CARLZEISS JENA и путем высева на твердые среды.
Рост культур измеряли по сухой биомассе, оптической плотности, содержанию белка и углерода. Измерение условной оптической плотности (светопоглощение + светорассеяние) проводили при длине волны () 540 нм на нефелометре КФК 2-УХЛ 4.2. Определение содержания белка проводили по методу Лоури [Lowry et al, 1951]. Определение содержания органического углерода проводили по модифицированному методу Паникова [Паников с соавт, 1988]. Качественное и количественное содержание аминокислот определяли методом тонкослойной хроматографии [Плакунов и Волкова, 1991] и на аминокислотном анализаторе.
Определение активности каталазы проводили манометрическим методом [Хазиев, 1976]. Для опытов использовали 4-х суточные отмытые суспензии клеток. В опытах с очищенным ферментом вносили 80 мU/мл каталазы [E.C.1.11.1.6;
ICN].
Потребление кислорода клетками определяли амперометрическим методом [Шольц, Островский, 1965] на полярографе LP-7 c хлорсеребряным и платиновым электродами. Рабочий объём ячейки составлял 2 мл. Суспензии клеток дрожжей (4-х суточные) готовили непосредственно перед измерением.
Клеточную биомассу центрифугировали при 7000 об/мин, ресуспендировали в калий-фосфатном буфере, содержащем количество NaCl, соответствующее среде культивирования, и выдерживали 15 мин. для уравновешивания концентрации соли внутри и вне клеток. Измерение проводили в калий-фосфатном буфере, содержащем 1% глюкозы (C. lipolytica, C. rhagii, Rh. aurantiaca, D. hansenii) или 1% бычьей желчи, 1% Tween 40, 0,1% аспарагина (Malassezia sp.), в присутствии изучаемых концентраций NaCl или без добавления NaCl. Азид натрия и салицилгидроксамовую кислоту (СГК) вносили до конечных концентраций 2 мМ и 4 мМ соответственно.
Определение концентрации кислорода в газовой фазе над культурами проводили на газовом хроматографе CS 3300, объем пробы составлял 200 мкл.
Дифференциальные спектры цитохромов (восстановленная дитионитом форма минус форма, окисленная перекисью водорода или воздухом) при комнатной температуре снимали на двулучевом спектрофотометре HITACHI-557, сопряженным с компьютером. Скорость сканирования – 60 нм/мин. Для уменьшения светорассеяния к суспензии, содержащей 0.05-0.2 г клеток/мл (в пересчете на сухую биомассу), добавляли 20% сахарозы.
Низкотемпературные дифференциальные спектры получали с использованием модифицированного спектрофотометра на базе Unicam SP.1800, снабженного специальным сосудом Дьюара, размещенным вплотную к фотоумножителю. К суспензии добавляли глицерин до концентрации 50% и замораживали в жидком азоте. Затем суспензии давали оттаять до просветления и вновь замораживали в жидком азоте. Скорость сканирования 60 нм/мин.
Графическую визуализацию спектров осуществляли при помощи программы «Origin 7.5» с использованием процесса «Smoothing, FTP filter». Положение максимумов устанавливали при помощи инструмента «Pick peaks».
Статистическая достоверность результатов основана на использовании результатов типичных опытов, полученных из 5-7 статистических повторностей.
В необходимых случаях коэффициенты корреляции, стандартное отклонение и др. статистические параметры рассчитывали по методам, заложенным в Microsoft Excel, пользуясь пособием Платонова [Платонов, 2000].
Уточнение систематического положения изучаемых микроорганизмов Родовую и видовую идентификацию дрожжей Candida (Yarrowia) sp. и Rhodotorula sp. осуществляли классическими методами путем проведения культуральных, морфо-цитологических и физиолого-биохимических тестов [Бабьева и Голубев, 1979, Yarrow, 1998] с использованием компьютерной программы “Yeast identification program. Version 4” [Barnett et all, 1996].
Результаты идентификации подтверждали методом ПЦР генов рибосомной РНК, осуществленным на базе Венгерской национальной коллекции микроорганизмов (Будапешт) [Lieckfeldt et all, 1993].
Результаты и их обсуждение Воздействие на изучаемые микроорганизмы двух стрессовых факторов:
гипоксии и осмотического шока.
В литературе мы не обнаружили сведений, касающихся последствий одновременного воздействия на аэробные микроорганизмы гипоксии и осмотического стресса. Хотя имеются отдельные данные, характеризующие отношение к солям изучаемых нами микроорганизмов, мы сочли необходимым уточнить эти показатели для конкретных использованных штаммов и в конкретных условиях наших экспериментов. Полученные результаты представлены на рис. 1-4. Рост каждой культуры измеряли в динамике, и на графике представлены данные, соответствующие фазе замедления активного роста (достижения максимальной биомассы).
Поскольку ряд изучаемых микроорганизмов в природных условиях часто обнаруживается в экотопах с пониженным содержанием кислорода, а в лаборатории их обычно культивируют в аэробных условиях, мы исследовали влияние разных уровней аэрации на степень галофильности (галотолерантности) данных культур.
Рис.1. Рост микроорганизмов в аэробных условиях с перемешиванием при разных концентрациях NaCl.
1 – Shewanella sp. CN32, 2 – Rhodococcus erythropolis, 3 – Candida lipolytica, 4 - Halobacterium salinarum S Для сохранения масштаба рисунка данные для Y. lipolytica уменьшены в 10 раз.
Согласно общепринятой классификации [Кашнер, 1981], Shewanella sp. CN32 и Rh. erythropolis следует рассматривать как слабых галофилов (оптимальная концентрация NaCl для роста составляет 1-3%), C. lipolytica является галотолерантом, а H. salinarum – экстремальным галофилом (оптимальная концентрация NaCl – 20%).
Рис. 2. Рост Shewanella sp. CN32 при разных режимах аэрации и концентрациях NaCl.
1 – культура в аэробных условиях с перемешиванием, 2 – культура в аэробных условиях без перемешивания (стационарная), 3 – культура в микроаэробных условиях.
Здесь и на рисунках 3-4 контролем служили культуры, выращиваемые при тех же режимах аэрации, но без добавления NaCl.
Shewanella sp. CN32 относится к факультативным анаэробам, и ее рост в аэробных условиях с перемешиванием сопровождается последующим лизисом клеток, а без перемешивания культура, достигнув стационарной фазы, может сохраняться достаточно долго. Рост в микроаэробных условиях протекает со скоростью в 1,5-2 раза меньшей, чем с перемешиванием, однако за 72-96 ч культура достигает такой же плотности, что и в условиях интенсивной аэрации.
При этом степень ее галофильности повышается настолько (оптимальная концентрация NaCl составляет 5-6%, рис.2), что эту культуру уже можно рассматривать как умеренного галофила.
Rh. еrythropolis является облигатным аэробом, и его рост в анаэробных условиях невозможен. Переход от перемешиваемой культуры к стационарной заметно снижает скорость роста, а в микроаэробных условиях культура растет почти в 10 раз медленнее, чем при перемешивании. Однако, оптимальная концентрация NaCl в микроаэробных условиях по сравнению с условиями интенсивной аэрации повышается столь заметно (от 1 до 5%, рис.3), что эту культуру, как и предыдущую, следует относить не к слабым, а к умеренным галофилам.
Рис. 3. Рост Rhodococcus erythropolis при разных режимах аэрации и концентрациях NaCl.
1 – культура в аэробных условиях с перемешиванием, 2 – культура в аэробных условиях без перемешивания (стационарная), 3 – культура в микроаэробных условиях.
Рис. 4. Рост Candida lipolytica при разных режимах аэрации и концентрациях NaCl.
1, 2 – культура в аэробных условиях с перемешиванием, 3, 4 – культура в микроаэробных условиях.
1, 3 – на 9-е сутки роста 2, 4 – на 4-е сутки роста Дрожжи C. lipolytica относятся к типичным аэробам и галотолерантам. В условиях перемешивания культура способна расти до концентрации NaCl, равной 15%. В стационарных, и особенно, микроаэробных условиях скорость ее роста уменьшается в 10 раз, однако при этом не только повышается галотолерантность (до 20% NaCl), но и появляется зависимость роста от концентрации соли, т.е. культура приобретает свойства галофила (с оптимумом роста при 10% NaCl), причем этот эффект не зависит от возраста культуры (рис.4).
Интересные результаты были получены с культурой H. salinarum S9. Этот экстремально галофильный микроорганизм растет в средах с концентрацией NaCl, близкой к насыщению (34%, рис.1). Однако и в этом случае галофильность культуры в стационарных и микроаэробных условиях несколько увеличивается.
Хотя оптимальной остается концентрация NaCl, равная 20%, различия в росте при 20% и 25% NaCl сглаживаются, и при концентрациях до 30% относительная скорость роста при снижении аэрации выше, чем при перемешивании. В последнем случае, из-за сравнительно небольшого эффекта, а также, чтобы избежать артефактов за счет изменения мутности суспензии при изменении объема клеток, рост характеризовали не только показателем оптической плотности, но и содержанием белка. Аналогичные контрольные эксперименты по содержанию сухой биомассы или белка клеток в отдельных пробах были проведены и с другими изучаемыми культурами. Все они подтвердили результаты, полученные при измерении оптической плотности культур.
Таким образом, можно сделать вывод о достаточно широкой распространенности явления зависимости галофильности (галотолерантности) микроорганизмов от парциального давления кислорода. Это явление обнаруживается как у слабых, так и экстремально галофильных бактерий, а также у представителей галотолерантных дрожжей.
Что касается биохимических основ обнаруженного феномена, то в силу его сложности (в подобную системную регуляцию обычно вовлекается множество метаболических звеньев) трудно ожидать, что он может быть объяснен каким либо одним механизмом. Это обстоятельство заставило нас провести разносторонние исследования для выявления механизмов данного явления.
Ранее в нашей лаборатории были получены данные о том, что NaCl подавляет дыхание у некоторых бактерий, вызывает окислительный шок и переключает метаболизм на пути, менее зависимые от кислорода (Арзуманян с соавт. 2000).
Поскольку при воздействии на микробную клетку факторов, приводящих к окислительному стрессу, во многих случаях наблюдается изменение синтеза защитных ферментов (каталазы, супероксиддисмутазы), были проведены исследования активности каталазы у дрожжей C. lipolytica, Rh. aurantiaca, Malassezia sp., C. rhagii и D. hansenii, выращенных в аэробных и микроаэробных условиях при разных концентрациях NaCl.
В качестве контроля (100%) использовали активность каталазы клеток, выращенных без добавления NaCl в среду культивирования, измеренную без внесения NaCl в среду инкубации. На рис. 5 приведены данные для D. hansenii.
Рис.5. Активность каталазы Debaryomyces hansenii при аэробном (А) и микроаэробном (Б) выращивании при разных концентрациях NaCl (% к контролю).
Контроль – активность каталазы у культуры, выращенной и тестированной без NaCl.
1 -Остаточная активность каталазы: культуру выращивали без добавления NaCl, измерение проводили в присутствии 5, 10 или 15% NaCl;
2 - реальная активность каталазы: среда инкубации при определении активности фермента содержала такое же количество NaCl, как и среда культивирования;
3 - потенциальная активность каталазы: активность каталазы культур, выращенных при 5, 10 или 15% NaCl, определяли в отсутствие соли.
Хотя синтез каталазы сильно подавляется с повышением уровня NaCl, как в аэробных, так и в микроаэробных условиях, у дрожжей, у которых степень галофильности (галотолерантности) заметно повышается в микроаэробных условиях (C. lipolytica, C. rhagii, D. hansenii), индуцируется (или активируется) каталазная активность, позволяющая противостоять окислительному стрессу.
Дополнительные эксперименты, проведенные с чистым препаратом каталазы, показали, что NaCl хотя и подавляет активность фермента, но этот эффект выражен значительно слабее, чем в случае дрожжевых клеток. Это с высокой степенью вероятности указывает на существование не только прямого ингибиторного действия NaCl на активность этого фермента, но и опосредованного эффекта, обусловленного, например, изменением конформации или энергизации клеточных мембран (плазмалеммы или вакуолярной мембраны).
Эксперименты, проведенные с H. salinarum, показали, что активность и другого защитного фермента – супероксиддисмутазы – подавляется солью. Точная количественная оценка этих экспериментов затруднена наличием у H. salinarum S9 нескольких типов супероксиддисмутаз, однако, общая тенденция изменений показывает, что с увеличением концентрации соли активность этих ферментов падает на 50-80% Хотя соль подавляет активность супероксиддисмутаз как в аэробных, так и в микроаэробных условиях, в последнем случае рост микроорганизма возможен в связи с низким содержанием кислорода.
Таким образом, одной из причин повышения галофильности (т.е. снижения ростингибирующего действия соли) микроорганизмов при переходе в микроаэробные условия может быть ослабление токсичного действия кислорода за счет уменьшения его парциального давления в окружающей среде. Это позволяет противодействовать дефициту защитных ферментов, создаваемому присутствием соли.
Эффект снижения уровня кислорода дополняется индукцией (или активацией) защитных ферментов (каталазы) в микроаэробных условиях.
Другая возможность возрастания галофильности в микроаэробных условиях, как предполагали ранее [Арзуманян с соавт. 2000], состоит в повышении внутриклеточного пула низкомолекулярных продуктов метаболизма, которые могут выполнять функции осмопротекторов за счет подавления их окисления при недостатке кислорода. Как показали наши эксперименты (рис. 6), количество внутриклеточных растворимых органических веществ у Rh.erythropolis и C.
lipolytica возрастает в микроаэробных условиях по сравнению с аэробными в 1,3 1,5 раз, причем особенно значительно увеличивается количество аминокислот (главным образом аспарагиновой кислоты, а также пролина и лизина).
А. Рис. 6. Содержание свободных аминокислот в клетках Candida lipolytica, выращенных без Б добавления NaCl (серые столбики), а н ин дин валин н н ин зин нин мин аг ин серин ин ин ин сл. к.
онин л из и ейци алани гл иц л ейц арг ин про л треон также при 4% гисти тиро л -ала гл ута аспар мети ном а изо -л (черные столбики) и фени j-ами 8% (белые столбики) NaCl.
Культура выращена в аэробных (А) и Б. микроаэробных (Б) условиях. Ось ординат – содержание аминокислот, % н ин ди н в а ли н относительно н ин н зи н с е ри н мин аг и н нин ин ин ин он и н сл. к л из и а ла н и ейци гл и ц л ей ц а рг и н п ро л т ре он ги с т и т и ро контроля без NaCl.
л -а л а гл ут а а с па р мети н ом а и з о -л фени j -а м и Мы предположили, что существует и третий механизм, основанный на так называемой «кислородной регуляции» метаболизма в условиях перехода от аэробиоза к микроаэробиозу. Суть феномена состоит в том, что организмы подвергаются стрессовым воздействиям как при переходе от аэробных условий (нормоксии) к микроаэробным (гипоксии) и далее к анаэробным (аноксии), так и при обратной последовательности событий. Естественно, что такие процессы сопряжены с массированной регуляцией экспрессии многих генов. Эти гены можно подразделить на две большие категории: «гены аэробиоза», экспрессия которых максимальна в аэробных условиях, и «гены гипоксии», которые максимально экспрессируются в микроаэробных или анаэробных условиях [Kwast, 1998].
Объектом более детального исследования нами изменений системы аэробного дыхания при комбинированном стрессовом воздействии (гипоксия + осмотический шок) послужил дрожжевой организм Debaryomyces hansenii, многие физиологические функции которого хорошо изучены.
Большинство представителей дрожжей D. hansenii относятся к типичным умеренным галофилам с оптимумом роста при концентрации солей 4-6% (0.8-1. М) [Prista, 2005]. В наших экспериментах культивирование этого микроорганизма в микроаэробных условиях существенно расширяло диапазон концентраций NaCl, в котором возможен рост данной культуры (рис. 7).
Рис 7. Зависимость роста D.
hansenii в аэробных (1) и микроаэробных (2) условиях от содержания NaCl.
Хотя при лимитировании кислорода скорость роста и максимальный уровень накопления биомассы снижались, эти показатели практически не зависели от концентрации соли до 18% (около 3.0 М) NaCl, тогда как в аэробных условиях рост существенно замедлялся при 10-12% (около 1.5- 2 М) NaCl.
Измерение интенсивности дыхания клеток D. hansenii, осуществляли для культур, выращенных в аэробных и микроаэробных условиях, без добавления NaCl в среду, а также при наличии соли в оптимальной (6%) и в явно неблагоприятной концентрации (15%) (таблица).
Скорость дыхания клеток Debaryomyces hansenii и влияние на нее ингибиторов.
Степень Степень Совместное Скорость Условия ингибирования ингибирования ингибирование:
дыхания эксперимента* азидом, % СГК, % азид + СГК, % нг-ат.О/мин.ед.ОП Рост в аэробных условиях 66 480 37.8 30 69. 6 15 190 28.5 29 73. 60 450 32.4 37.2 Рост в микроаэробных условиях 66 400 57.3 16 59. 6 15 390 58.5 12.6 60. 60 405 61 11.6 61. Рост в аэробных условиях 00 340 34.7 44.3 73. 0 15 90 23.5 41.5 68. 15 15 250 37.7 27.5 71. 15 0 510 48.6 22.3 71. Рост в микроаэробных условиях 00 240 60.3 10.3 65. 0 15 230 60.3 10.5 15 15 390 59.8 11.5 56. 15 0 450 60.7 5 Примечание. В таблице приведены средние данные 3-4 повторностей опытов.
*Первая цифра - содержание NaCl в ростовой среде;
вторая цифра - содержание NaCl в инкубационной среде при измерении скорости дыхания.
Клетки, выращенные при оптимальном содержании соли (6%) в аэробных условиях, обнаружили высокую скорость дыхания (вариант 6 6, таблица).
Избыток NaCl (15%) в инкубационной среде приводил к подавлению дыхания (вариант 6 15), как и в случае других, исследованных нами микроорганизмов.
Выращивание без добавления NaCl (вариант 0 0) несколько снижало скорость дыхания. В этом варианте выращивания процесс дыхания сохранял чувствительность к избытку NaCl (вариант 0 15). Скорость дыхания клеток культуры, выращенной при избытке соли (15%) в среде (вариант 15 0), характеризовалась показателями, близкими к варианту 6 0, но существенно снижалась в присутствии 15% NaCl в инкубационной среде (вариант 15 15).
Выращивание в микроаэробных условиях приводило к некоторому подавлению дыхания, но существенно уменьшало его чувствительность к избытку NaCl (например, вариант 6 15 для микроаэробных условий).
Эти данные указывали на некоторые изменения в системе дыхания при одновременном воздействии гипоксии и осмотического шока. Для выяснения природы этих изменений были применены ингибиторы дыхания: ингибитор цитохром-с-оксидазы азид натрия (который дает более стабильные результаты, чем цианид калия), а также салицилгидроксамовая кислота – ингибитор альтернативной цианидустойчивой оксидазы.
Оказалось, что действие ингибиторов дыхания обнаруживает сложную картину, которая не поддается однозначной интерпретации (таблица). Однако, с учетом имеющихся в литературе данных эти результаты в наилучшей степени можно объяснить, допустив, что у данного микроорганизма существует, по крайней мере, три типа аэробных дыхательных цепей, которые могут функционировать одновременно, но с разной скоростью, в зависимости от условий выращивания культуры.
1) В аэробных условиях при оптимальной концентрации NaCl (6%) функционируют как дыхательная цепь с участием цитохромоксидазы (азид и цианидчувствительная или «классическая» дыхательная цепь, КДЦ), о чем свидетельствует ингибирование азидом на 30-40%, так и азид- и цианидустойчивая, или «альтернативная» дыхательная цепь (АДЦ) (ингибирование дыхания СГК на 30-40%). Неполное ингибирование дыхания при совместном использовании ингибиторов (азид + СГК) указывает на возможное функционирование третьей, дополнительной, дыхательной цепи (ДДЦ), которая будет рассмотрена далее.
2) В условиях гипоксии (при выращивании культуры в микроаэробных условиях) (при оптимальной концентрации 6% NaCl) возрастает роль КДЦ (ингибирование азидом составляет около 60%) и снижается роль АДЦ (ингибирование СГК составляет 11-16%). Подавление дыхания при совместном действии ингибиторов остается неполным.
3) Гипоосмотический шок в результате выращивания культуры без добавления NaCl в аэробных условиях не вызывает заметного изменения чувствительности дыхательной цепи к ингибиторам. Гипоосмотический шок в микроаэробных условиях приводит к преимущественному функционированию КДЦ (степень ингибирования азидом – 60%) и несколько снижает ингибиторный эффект в варианте азид+СГК.
4) Наконец, гиперосмотический шок (15% NaCl при выращивании культуры) в условиях гипоксии приводит к явному преобладанию дыхания, обеспечиваемого КДЦ (ингибирование азидом около 60%).
Поскольку действие ингибиторов не является абсолютно специфичным, для более точной характеристики механизмов дыхания при различных сочетаниях стрессовых воздействий необходимо было получить данные о составе дыхательной цепи в указанных вариантах опытов.
Рис 8. Дифференциальные спектры цитохромов (область 400-700 нм) клеток D.hansenii, выращенных в присутствии 6% NaCl в аэробных (1) и микроаэробных (2) условиях. На врезке в увеличенном виде представлены спектры в области 490-570 нм.
Анализ дифференциальных спектров цитохромов показал, что наибольшие изменения проявляются у вариантов, выращенных в микроаэробных условиях (гипоксия), по сравнению с аэробными вариантами (нормоксия). Эти выводы можно проиллюстрировать следующими примерами.
На рис.8 показаны дифференциальные спектры клеток D. hansenii, выращенных в аэробных и микроаэробных условиях при оптимальном содержании соли (6%). Можно видеть, что гипоксия вызывает сдвиги в спектрах поглощения (в районе -максимумов) в длинноволновую область, а также изменение соотношения цитохромов b и c (что нагляднее представлено на врезке).
При действии гипо- или гиперосмотического шока в аэробных условиях изменений цитохромного состава по сравнению с оптимальным уровнем соли не наблюдается.
Совместное воздействие осмотического шока и гипоксии вызывает такой же эффект, как и сама по себе гипоксия.
В связи с тем, что в спектрах, полученных при комнатной температуре, происходит наложение максимумов поглощения цитохромов b и с, для выявления и идентификации изменившихся цитохромных компонентов были использованы низкотемпературные дифференциальные спектры. Результаты представлены на рис.9.
548. 552.5 Рис. 9.
Низкотемпературные 555. дифференциальные спектры цитохромов (область 490-570 нм) клеток D. hansenii, 529. выращенных в аэробных (а) и микроаэробных (б) условиях в присутствии 6% NaCl.
549. 554. 520.5 Следует отметить, что полное совпадение числовых значений максимумов поглощения цитохромов с классическими образцами возможно только после получения этих белков в изолированном гомогенном состоянии. При измерении спектров целых клеток наблюдается отклонение числовых величин в ту или иную сторону в зависимости от величины светорассеяния измеряемой суспензии и многих других факторов. Например, в низкотемпературных спектрах происходит сдвиг максимумов поглощения на 1-4 нм в коротковолновую область. Мы старались использовать клетки в нативном состоянии, избегая обработки (в том числе и выделения митохондрий), которая может привести к потери лабильных компонентов. Поэтому при дальнейшем обсуждении мы будет оперировать округленными числовыми значениями максимумов поглощения.
Таким образом, в клетках, выращенных в аэробных условиях при оптимальном содержании соли (6%), обнаруживается присутствие цитохромов следующих классов (рис. 9а):
1) классического цитохрома с с максимумом -полосы около 550 (548.5 – 549.5) нм, а также цитохрома с1 (-полоса около 553 нм). Оба цитохрома имеют максимумы -полосы около 520 нм и -полосы около 415 нм.
2) цитохрома типа b с максимумом -полосы около 555 нм. Хотя в литературе описан цитохром с5 с близким максимумом, однако до сих пор он был обнаружен лишь в клетках Azotobacter [Moore, 1987]. К тому же, связанная с данным цитохромом -полоса имеет максимум при 530 нм (а полоса при 430 нм), что характерно именно для цитохромов b. Поэтому данный компонент можно рассматривать как классический цитохром b, входящий в bc1-комплекс. «Плечо» около 560 нм, скорее всего, соответствует другому типу цитохрома b.
Выращивание в условиях гипоксии приводит к заметному сдвигу в соотношении цитохромов b и c (рис. 9б), прежде всего за счет резкого увеличения относительного количества цитохрома b555.
Цитохромоксидазная часть дыхательной цепи лучше всего может быть охарактеризована дифференциальными спектрами в области 590-640 нм (рис.
10).
Рис.10.
Дифференциальные спектры цитохромов (область 590-640 нм) клеток D. hansenii, выращенных в 620 присутствии 6% 627.5 NaCl в аэробных (а) и микроаэробных (б) условиях.
622 627. В дифференциальных спектрах культур, выращенных как в аэробных, так и в микроаэробных условиях, обнаруживаются три -максимума, расположенных около 600, 620 и 630 нм. Максимум при 600 нм, по-видимому, соответствует митохондриальной цитохром-с-оксидазе аа3, хотя у дрожжей C. parapsilosis описана также цитохромоксидаза, аналогичная по спектру бактериальному цитохрому а1, имеющая -максимум при 590 нм [Guerin et al., 1986].
Сложнее идентифицировать максимумы при 620 и 630 нм. При регистрации дифференциальных спектров цитохромов дрожжей авторы крайне редко используют область, выходящую за пределы 610 нм, поскольку максимум полосы классической цитохромоксидазы расположен около 605 нм. По литературным данным, спектральными характеристиками, близкими к найденным нами у D. hansenii, обладают цитохром-bd-убихинолоксидаза E. coli (-максимум около 630 нм) [Junemann et al., 1995], а также цитохром cd1 ( максимум около 620 нм), обнаруженный у ряда денитрификаторов, в том числе у Paracoccus denitrificans, близкого по составу дыхательной цепи к митохондриям [De Gier et al., 1994].
Хотя точную природу обнаруженных у D. hansenii цитохромных компонентов можно будет установить только после изолирования и изучения их гемов, предварительное рассмотрение спектров показывает, что в условиях гипоксии заметно изменяется соотношение компонентов с максимумами при 620 и 630 нм, причем в пользу увеличения количества последнего (рис 10б).
Общее заключение, по данному разделу работы, которое следует из анализа полученных нами и литературных данных, можно сформулировать следующим образом.
В настоящее время накапливается все больше свидетельств в пользу того, что регуляция процесса переноса электронов под влиянием изменений внешней среды, выходящих за пределы так называемых «оптимальных» условий (или, иначе говоря, при действии стрессовых факторов), осуществляется не путем полного «переключения» с одной электронтранспортной цепи на другую (как упрощенно принимали ранее), а путем изменения соотношения одновременно функционирующих дыхательных механизмов.
Множественность путей транспорта электронов в дыхательных системах дрожжей убедительно продемонстрирована на примере C. parapsilosis [Milani et al., 2001]. У этих дрожжей в процессе дыхания одновременно функционируют четыре цепи переноса электронов, в которых участвует три типа конечных оксидаз: альтернативная цианидустойчивая оксидаза, классическая цитохром-с оксидаза, а также дополнительная цитохром-с-оксидаза, ингибируемая только высокими концентрациями цианида (10 мМ).
Учитывая все эти данные, можно предложить для D. hansenii следующую схему процесса переноса электронов и влияния на него изучаемых стрессовых факторов и ингибиторов (рис. 11). Мы считаем необходимым предложить такую схему, поскольку она дает полезный материал для планирования дальнейших исследований, хотя и остается во многом спекулятивной.
СГК Цианидрезистентная оксидаза О Азид Доноры Пул Цитохромы b555, c1,c О Цитохром-c-оксидаза электронов убихинонов Цитохромы b560, c О Цитохромоксидаза О Убихинол-цитохромоксидаза Рис. 11. Схема цепей переноса электронов у D. hansenii. 1 - классическая дыхательная цепь (КДЦ);
2 – альтернативная цианидрезистентная дыхательная цепь (АДК);
3 – дополнительные дыхательные цепи (ДДК). Пунктиром показаны места действия ингибиторов.
У этого организма, по-видимому, функционируют три (или, скорее, четыре) цепи переноса электронов, как оказалось при изучении действия ингибиторов дыхания (таблица). Все они получают электроны от общего пула восстановленного(ых) убихинона(ов).
КДЦ включает классические митохондриальные цитохромы с550, с1552 и, вероятно, b555. Завершается эта цепь цитохром-с-оксидазой типа аа3600, чувствительной к низким концентрациям азида.
АДЦ также относится к классическому типу и не включает цитохромов.
Компонентом, чувствительным к СГК, обычно является убихинолоксидаза.
Остальной поток электронов нечувствителен к действию СГК и азида и может опосредоваться одной (или двумя) ДДЦ.
Состав ДДЦ остается наименее определенным, но, скорее всего, один путь включает вместо цитохрома b555 цитохром b560, а в качестве конечной оксидазы выступает компонент, близкий к цитохрому cd1620.
Другой путь определяется наличием компонента с максимумом поглощения при 630 нм, что может предполагать участие в переносе электронов цитохрома типа bd630 (получающего электроны непосредственно от пула восстановленных убихинонов), также практически нечувствительного к СГК и азиду.
В аэробных условиях при оптимальном уровне соли (6%) удельный вклад этих систем примерно одинаков (таблица), что позволяет использовать широкий круг доноров электронов. Гипоосмотический шок мало влияет на дыхание и соотношение компонентов дыхательных цепей. Возможно, это связано с тем, что «фоновое» содержание соли в питательной среде (около 0,3%) достаточно для обеспечения основных физиологических потребностей. Гиперосмотический шок в аэробных условиях также достоверно не изменяет удельный вклад этих систем в дыхание (таблица).
В микроаэробных условиях (в состоянии гипоксии), с одной стороны, должны активироваться системы дыхания с повышенным сродством к кислороду. При этом возрастает роль КДЦ, что выражается не только в увеличении степени ингибирования азидом, но и в резком повышении удельного содержания цитохрома b555 (таблица, рис. 9б). С другой стороны, можно ожидать индукции (или активации) ДДЦ, особенно той из них, которая непосредственно использует пул восстановленного убихинона, в связи с тем, что в условиях гипоксии степень восстановленности этого компонента увеличивается. Поскольку эти системы оказываются малочувствительными к NaCl, организму удается преодолевать последствия гиперосмотического шока, что выражается в повышении степени галофильности микроорганизмов, обнаруженном нами ранее.
Защитное действие протонов от гипоосмотического шока у H. salinarum.
Ранее было описано явление, характерное для галофильных бактерий и получившее условное название "галодеадаптация" (под которым подразумевается комплекс процессов, позволяющих бактериям приспособиться к условиям с низкой соленостью) по аналогии с классическим понятием "галоадаптации" (т. е. приспособления к условиям с высокой соленостью) [Матвеева с соавт., 1990]. Оказалось, что стабилизация клеток галобактерий может быть достигнута при замене катионов натрия на протоны, после чего клетки галобактерий выдерживают даже промывание дистиллированной водой [Плакунов, Кокоева, 1994]. Поскольку влияние pH на степень осмочувствительности галобактерий ранее изучали только в острых опытах, представляло интерес выяснение возможности существования такого же эффекта в растущих культурах этих организмов.
При всех значениях pH максимум скорости роста H. salinarum наблюдался при 20% NaCl. Однако при снижении концентрации соли, культуры, выращиваемые при разных pH, вели себя по-разному. При pH 7.0 и особенно при pH 8.0 наблюдалось резкое падение скорости роста (в последнем случае в 5 6 раз при 15% NaCl), тогда как при pH 6.0 скорость роста при 15% NaCl почти не отличалась от оптимальной, наблюдаемой при 20% NaCl.
Еще более наглядно этот эффект проявляется при сравнении относительных скоростей роста при каждой концентрации NaCl, выраженных в процентах от скорости роста той же культуры при оптимальном pH 7.0 (рис. 12).
Рис. 12. Зависимость относительной скорости роста Н.salinarum S9 от pH среды при разных концентрациях NaCl 1 -15,2% ;
2 - 18,5%;
3 - 20%. Контроль культура при той же солености, но при pH 7.0.
В этом случае вблизи pH 6.0 проявляется четкий максимум относительной скорости роста культуры при содержании в среде 15% NaCl, тогда как при других концентрациях соли максимум относительной скорости роста остается вблизи pH 7.0. Таким образом, подкисление среды, т.е. увеличение в ней концентрации протонов, действительно оказывает стабилизирующее действие на рост культуры Н. salinarum при сниженном содержании солей.
Полученные результаты заставляют по-новому оценить возможность существования экстремально галофильных архей в пластовых флюидах нефтяных месторождений Волжско-Камского региона, локализованных в отложениях верхнего девона, откуда эти организмы были выделены [Звягинцева с соавт., 1998]. Как показано в нашей работе, близкие к анаэробным условия, характерные для нефтяных месторождений, способствуют возрастанию способности галобактерий переносить повышенную соленость (до насыщения в расчете на NaCl). С другой стороны, слабокислая среда, обусловленная накоплением жирных кислот при окислении компонентов нефти, должна способствовать выживанию галобактерий при гипоосмотическом шоке. Таким образом, сочетание этих экстремальных условий (дефицит кислорода и кислая среда), как это ни парадоксально, должно способствовать выживанию галобактерий в очень широком диапазоне солености, что может обеспечить их участие в метаболических превращениях продуктов деградации нефти.
Выводы:
1. Установлено, что при повышенной солености, выходящей за пределы физиологической нормы для изучаемых микроорганизмов (т.е. при гиперосмотическом шоке), снижение парциального давления кислорода (гипоксия) оказывает защитное действие, приводящее к возрастанию степени галофильности (галотолерантности) данных микроорганизмов (Rhodococcus erythropolis, Shewanella sp., Candida lipolytica, Rhodotorula aurantiaca, Candida rhagii, Debaryomyces hansenii). Антагонизм указанных стрессовых факторов (повышенной концентрации солей и гипоксии), характерных для ряда экотопов (в том числе, для некоторых нефтяных месторождений), объясняет возможность существования и функционирования в этих условиях слабо галофильных (галотолерантных) микроорганизмов.
2. Изучены биохимические механизмы антагонизма гипоксии и гиперосмотического шока, и показано, что в их основе лежит принцип множественного взаимодействия регуляторных механизмов, когда один из стрессовых факторов вызывает изменение метаболизма, компенсирующее отрицательное воздействие другого стрессового фактора. Примерами могут служить обнаруженные нами повышение внутриклеточного пула осмопротекторных веществ в результате подавления дыхания при гипоксии, индукция или активация в условиях гипоксии ферментов (каталазы), а также альтернативных дыхательных цепей, менее чувствительных к ингибиторному действию солей.
3. Изучена природа изменений цитохромного состава дыхательной системы D.
hansenii под влиянием данных стрессовых факторов и предложена схема, предполагающая одновременное функционирование трех (или четырех) цепей переноса электронов: классической дыхательной цепи с участием цитохром-с оксидазы, альтернативной дыхательной цепи, включающей цианид- и азидустойчивую оксидазу, а также дополнительных дыхательных цепей, включающих оксидазы, устойчивые к соли, азиду и СГК. Таким образом, природа антагонистических взаимоотношений гипоксии и гиперосмотического шока в данном случае заключается в перераспределении потока электронов между чувствительными и нечувствительными к соли дыхательными системами, активируемыми (индуцируемыми) в микроаэробных условиях.
4. Обнаружен еще один случай антагонизма стрессовых факторов: повышенной концентрации протонов и гипоосмотического шока в растущих культурах галобактерий, в результате чего понижение рН предотвращает лизис этих микроорганизмов при снижении концентрации солей в среде.
Список работ, опубликованных по материалам диссертации:
Экспериментальные статьи и обзоры 1. Арзуманян В. Г., Воронина Н. А., Гейдебрехт О. В., Маслова О. В., Плакунов В.
К., Беляев С. С. Антагонистическое взаимодействие стрессорных факторов при росте микроорганизмов в условиях, имитирующих параметры их природных экотопов // Микробиология. 2002. Т. 71. № 2. С. 160-165.
2. Шелемех О.В., Плакунов В.К., Беляев С.С. Защитная роль протонов при гипоосмотическом стрессе у экстремально галофильной археи, Halobacterium salinarum // Микробиология. 2002. Т. 71. № 6. С. 858-859.
3. Heidebrecht O.V., Shelemekh O.V., Plakunov V.K., Arzumanyan V.G., Belyaev S.S.
Viability and metabolic activity of microorganisms under conditions emulating natural habitats // Biotechnology and the environment including biotechnology. 2004. Nova Science Publishers, Inc. New York. P. 161-170.
4. Плакунов В.К., Гейдебрехт О.В., Шелемех О.В. Множественный стресс у микроорганизмов: зло или благо? (обзор). Труды ИНМИ РАН. Вып. XII. 2004.
М: Наука. С. 361-375.
5. Шелемех О.В., Гейдебрехт О.В., Плакунов В.К., Беляев С.С. «Кислородная регуляция» состава дыхательной цепи дрожжей Debaryomyces hansenii при множественном стрессе // Микробиология. 2006. Т. 75. № 4. С. 562- Тезисы докладов 6. Гейдебрехт О.В., Шелемех О.В., Арзуманян В.Г. Роль внешней липидной оболочки в галопротекции облигатно липофильных дрожжей рода Malassezia // XV Международная зимняя молодёжная научная школа. Москва, Россия. 10- февраля 2003.
7. Arzumanian V. G., Heidebrecht O. V., Shelemekh O. V. Outer lipid layer of lipophilic yeast Malassezia and its role in halotolerance // 23rd International Specialised Symposium on Yeasts "Interactions between Yeasts and other Organisms" Budapest, Hungary. 26-29 August 2003.
8. Гейдебрехт О.В., Шелемех О.В., Арзуманян В.Г. Взаимосвязь галотолерантности дрожжей рода Malassezia с наличием внешней липидной оболочки // 1-й Всероссийский конгресс по медицинской микологии. Москва, Россия. 20- февраля 2003. Том 1. С. 9. Плакунов В.К., Шелемех О.В., Беляев С.С. Антагонизм стрессорных факторов при их одновременном действии на нефтеокисляющие микроорганизмы // 2-й Московский. международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Тезисы докладов. Москва. 2003. Ч. 2. С. 260-261.
10. Belyaev S., Heidebrecht O., Shelemekh O., Plakunov V. Influence of extreme environment on oil-oxidizing microorganisms // Int. Symposium for subsurface Microbiology. ISEB XVIII. 2005. P. 63.
11. Шелемех О.В., Гейдебрехт О.В., Плакунов В.К. Варьирование состава дыхательной цепи нефтеокисляющих микроорганизмов в условиях, моделирующих условия их природных экотопов. 1-я Межд. молодежная школа конференция. Москва. 2005. Тезисы докладов. С. 113-114.