Мутанты вируса оспы коров с делециями генов ввк-семейства
На правах рукописи
КОЛОСОВА Ирина Валерьевна МУТАНТЫ ВИРУСА ОСПЫ КОРОВ С ДЕЛЕЦИЯМИ ГЕНОВ ВВК-СЕМЕЙСТВА 03.01.03 – молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Кольцово - 2011
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Щелкунов С.Н.
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Локтев В.Б.
доктор биологических наук, профессор Зенкова М.А.
Ведущая организация:
Учреждение Российской академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (г. Новосибирск).
Защита состоится «11» марта 2011 г. в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при ФГУН Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора по адресу:
ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559;
тел. 8 (383) 336-74-28.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
Автореферат разослан «10» февраля 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Трошкова Г.П.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования Поксвирусы, объединенные в семейство Poxviridae, характеризуются самыми крупными размерами вирионов и генома среди вирусов животных, отличаются от вирусов многих других семейств тем, что их жизненный цикл проходит в цитоплазме клеток (Moss, 1996). Наиболее активно в данном семействе изучают вирусы рода Orthopoxvirus, поскольку он содержит патогенные для человека вирусы натуральной оспы (ВНО), оспы обезьян (ВОО), оспы коров (ВОК) и осповакцины (ВОВ) (Маренникова и Щелкунов, 1998;
Fenner et al., 1989). Особое место в этих исследованиях занимает изучение структурно-функциональной организации генома данных вирусов.
Полагают, что поксвирусы в процессе эволюции включили в состав своей ДНК нуклеотидные последовательности, кодирующие различные белки клетки, которые в первую очередь необходимы для модулирования иммунных реакций организма на вирусную инфекцию, обеспечивая тем самым преодоление данными вирусами различных защитных систем хозяина (Маренникова и Щелкунов, 1998;
Alcami and Koszinowski, 2000). Кроме того, в составе генома ортопоксвирусов выявлены гены, продукты которых гомологичны представителям семейств белков клетки, не участвующие напрямую в процессах иммуномодуляции, а регулирующие такие процессы, как клеточный цикл, формирование цитоскелета и т.п. (Shchelkunov et al., 1993;
Senkevich et al., 1993). Такие функции, возможно, выполняют белки семейства ВВК, входящего в суперсемейство kelch-подобных белков (Adams et al., 2000).
Белки, кодируемые этими генами, вовлечены в процессы стабилизации и динамики актиновых филаментов, участвуют в образовании цитоскелета, не только в связанном с актином виде, но и самостоятельно, играют роль в регуляции генной экспрессии, деградации белков с участием протеасом, а также выполняют разнообразные функции в других аспектах жизнедеятельности клетки и организма и важны для их функционирования (Xue and Cooley, 1993;
Laezza et al., 2007;
Greenberg et al., 2008;
Yu et al., 2008).
В настоящее время известно, что поксвирусы являются единственным семейством в царстве Vira, в составе генома которых выявлены наборы генов ВВК-белков. Несмотря на многочисленность ВВК-генов у ортопоксвирусов функция их до сих пор остается невыясненной.
Цели и задачи исследования Целью настоящей работы является введение направленных делеций в выбранные ВВК-гены ВОК, штамм GRI-90, и изучение свойств созданных мутантов в системах in vitro и in vivo.
В процессе работы решались следующие задачи:
1. Проведение компьютерного анализа видоспецифических различий генов ортопоксвирусов, кодирующих ВВК-белки.
2. Получение и анализ шести векторных плазмид для интеграции/делеции в целевые гены ВОК: pA57R, pB9R, pB19R, pC18L, pG3L, pD11L.
3. Получение клонового варианта ВОК и создание на его основе рекомбинантных мутантов с единичными и множественными делециями генов, кодирующих ВВК-белки.
4. Изучение влияния делеций ВВК-генов на биологические свойства полученных вирусов в системах in vitro и in vivo.
Научная новизна и практическая значимость работы Изучение функций генов ВВК-семейства ортопоксвирусов является важной фундаментальной задачей. Впервые на основании выполненного сравнения геномных последовательностей ВОК, ВОО, ВНО, и ВОВ обнаружено, что ВОК содержит 6 генов семейства ВВК, ВОВ – 3, ВОО – 1, а в геноме ВНО все эти гены делетированы или мутационно разрушены.
Впервые получены и охарактеризованы шесть рекомбинантных плазмид интеграции для последовательного введения направленных делеций в гены семейства ВВК: D11L, C18L, G3L, A57R, B9R и B19R штамма GRI-90 ВОК.
Впервые созданы 18 мутантов ВОК с делециями как единичных генов D11L, C18L, G3L, A57R, B9R или B19R, так и двух, трех, четырех, пяти и шести генов семейства ВВК, при этом рекомбинанты с множественными (больше одной) делециями были получены с различными сочетаниями удаляемых генов.
Показано, что гены этого семейства не являются существенными для репродукции ВОК.
Впервые обнаружено, что у мутантов ВОК с последовательными делециями от одного до четырех генов D11L, C18L, G3L и A57R, кодирующих ВВК-белки, наблюдаются следующие эффекты в зависимости от числа инактивированных генов: изменяется спектр чувствительных культур клеток, мутанты ВОК, утратившие три гена, имеют сниженную способность размножаться в перевиваемой культуре клеток почки собаки (MDCK), а мутанты по четырем генам утрачивают такую способность;
в культуре клеток CV-1 мутанты по четырем генам ВВК при температуре 37°С формируют бляшки меньшего размера по сравнению с исходным ВОК, а при инкубации при повышенной температуре (39,5°С) продукция таких мутантов в 100 раз ниже по сравнению с исходным ВОК;
мутанты по трем и четырем генам ВВК формируют на ХАО КЭ оспины значительно меньшего размера и с меньшим содержанием вируса по сравнению с исходным ВОК;
удаление четырех генов ВВК приводит к достоверному снижению вирулентности ВОК при интраназальном заражении мышей линии BALB/c.
Практическая значимость данной работы состоит в том, что выявленный эффект аттенуации вируса при делетировании генов семейства ВВК может быть применен при получении безопасных вакцин новейшего поколения на основе ВОВ. Метод временной доминантной селекции, использованный в данной работе, в настоящее время применяется нами для создания высоко аттенуированных вариантов ВОВ с целью получения живых противооспенных вакцин нового поколения.
Положения, выносимые на защиту Гены семейства ВВК не являются существенными для репродукции ВОК.
Инактивация генов семейства ВВК у ВОК приводит к следующим эффектам:
1) изменяется круг чувствительных культур клеток, мутанты ВОК, утратившие три гена (D11L, C18L, G3L), имеют сниженную способность размножаться в культуре клеток MDCK, а мутанты по четырем генам (D11L, C18L, G3L, A57R) утрачивают такую способность;
2) мутанты с делециями четырех генов ВВК в культуре клеток CV-1 при температуре 370С формируют бляшки меньшего размера по сравнению с исходным ВОК, а при инкубации в течение 72 ч после инфицирования при температуре 39,50С, продукция таких мутантов в 100 раз ниже по сравнению с исходным вирусом (р0,05);
3) мутанты по трем и четырем генам ВВК формируют на ХАО КЭ оспины меньшего размера - их диаметр составляет 0,96±0,38 мм и 0,84±0,27 мм, соответственно, а исходного ВОК - 2,1±0,33 мм, с меньшим содержанием в них вируса: титр в тройных мутантах составляет 2х105 БОЕ/оспина, в четверных – 1,6х105 БОЕ/оспина, по сравнению с исходным вирусом, титр которого определяли как 2х106 БОЕ/оспина (р0,05);
4) удаление четырех генов ВВК приводит к достоверному снижению вирулентности ВОК при интраназальном заражении мышей линии BALB/c. Для исходного вируса величина LD50 составляла 1,1х105 БОЕ/мышь, в то время как для мутантного клона она равна 8,7х105 БОЕ/мышь (р0,05).
Публикации и апробация работы По материалам диссертации опубликованы 6 статей в журналах списка, рекомендованного ВАК.
Результаты работы были представлены на на международных и российских научных конференциях:
XIIIth International Poxvirus and Iridovirus Symposium (Montpellier, France, 2000);
XVth International Poxvirus and Iridovirus Conference (Oxford, England, 2004);
III международная конференция “Фундаментальные науки – медицине” (Новосибирск, Россия, 2007);
XIVth International Congress of Virology (Istanbul, Turkey, 2008).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, содержит 37 рисунков, 11 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, 9 разделов результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 17 отечественных и 186 иностранных источников.
Личный вклад автора Получение клонированного варианта ВОК, рекомбинантных мутантов с делециями генов, кодирующих ВВК-белки, ПЦР анализ полученных вирусов, выполнен лично автором. Схема получения плазмид интеграции разработана С.В. Серегиным. Автором получены и охарактеризованы три плазмиды интеграции. Работы по изучению оспин, индуцируемых делеционными вариантами ВОК на ХАО КЭ, и оценка степени патогенности полученных ВОК при интраназальном заражении мышей проводили совместно с Г.В. Кочневой и Т.А. Лупан. Микроскопические исследования выполнены Е.И. Рябчиковой и О.С. Тарановым при участии автора в подготовке исходных материалов. Компьютерный анализ генов, кодирующих ВВК-белки, проведен совместно с А.В. Тотмениным, И.В. Бабкиным и Д.В. Антонец.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Сравнительный компьютерный анализ генов, кодирующих ВВК белки, в геномах поксвирусов Гены ВВК-семейства были найдены у представителей семейства Poxviridae, в геноме которых соответствующие OРТ локализованы в вариабельных концевых участках (рис. 1).
Рис. 1. Схема расположения ОРТ ВВК-белков в левой (А) и правой (В) концевых видоспецифичных областях генома ортопоксвирусов (ВОК: CPV-GRI, ВОО: MPV-ZAI, ВНО: VAR-IND, ВОВ: VAC-COP).
Стрелками обозначены направление ОРТ, названия которых приведены над стрелками. Тонкими линиями обозначены районы делеций в ДНК одних вирусов относительно других В результате выполненного компьютерного анализа нами обнаружено, что ВОК кодирует шесть белков рассматриваемого семейства размером около 500 а.к. каждый со взаимной идентичностью по аминокислотной последовательности в интервале 22-26 %. ВОВ кодирует лишь три полноразмерных ВВК-белка (C2L, F3L и A55R), которые высоко гомологичны соответствующим белкам вируса оспы коров (99,4, 97,9 и 98,6% идентичности, соответственно), ВОО - один (C9L, 97,3% идентичности с G3L ВОК-GRI), а у ВНО все потенциальные рамки трансляции (ОРТ) разрушены в результате множественных мутаций или делеций и поэтому выявляются лишь короткие ОРТ, являющиеся нефункциональными фрагментами генов вируса предшественника (табл. 1).
Таблица Сравнение ОРТ генов ВВК у ортопоксвирусов ВОК-GRI 90 ВОВ-COP ВНО-IND ВОО-ZAI Длина, Длина, Длина, Длина, OРТ OРТ OРТ OРТ a.к. a.к. a.к. a.к.
D11L D13L 201 D16L D17L C18L 512 C2L D18L D13.5L D19L G3L 485 F3L 480 C7L 179 C9L J7R A57R 564 A55R J8R 172 B1R B9R 501 B10R B18R B22R B19R 557 B23R B24R Все шесть ВВК-белков ВОК-GRI содержат в своем составе N-концевой ВТВ-домен, промежуточный BACK-домен и С-концевой Кelch-домен. Был проведен сравнительный анализ выравненных с использованием программы Clustal X версия 1.83 аминокислотных последовательностей доменов: BTB, BACK и Kelch ВВК-белков разных штаммов ортопоксвирусов. Следует отметить, что ВВК-гены обнаруживают низкую взаимную гомологию и это может обуславливать различные структурно-функциональные свойства кодируемых белков.
Показано, что только в ОРТ A57R ВОК-GRI имеется пять классических kelch-мотивов, но наблюдаются нарушения в первом из них, у G3L и B9R четыре kelch-мотива, у C18L в С-концевом четвертом мотиве вместо дуплицированного находится единичный глицин. У B19R и D11L имеются три kelch-мотива, но в случае D11L - первый kelch-мотив нарушен. Полное нарушение kelch-мотива у белков ВОК-GRI B9R, C18L, G3L и B19R произошло лишь в С-концевых повторах Кelch-доменов, что, по-видимому, не приводит к нарушению «-пропеллерной» структуры, в которую могут укладываться сохранившиеся kelch-мотивы (Adams et al., 2000). Таким образом, ВВК-белки ВОК различаются не только по аминокислотной последовательности, но могут заметно отличаться по архитектуре «-пропеллерного» домена, который может состоять из трех-пяти циркулярно расположенных слоев/лопастей.
Несмотря на многочисленность ВВК-белков у ортопоксвирусов, функция их до сих пор остается невыясненной. Возможная роль изучаемых генов заключается в определении круга хозяев и/или возможности персистенции вируса в организме животного, поскольку малопатогенный для человека и имеющий наиболее широкий круг чувствительных к нему животных ВОК кодирует самый многочисленный набор ВВК-белков, в то время как у ВНО, высокопатогенного для своего единственного хозяина - человека, в организме которого отсутствует персистенция этого вируса, все гены ВВК-семейства мутационно разрушены.
Получение клонового варианта ВОК Важно отметить, что проводимые до последнего времени исследования по выявлению функций генов, были выполнены на ВОВ, природный резервуар и происхождение которого не установлены (Маренникова и Щелкунов, 1998). В связи с этим представляло интерес исследовать свойства генов ВВК-белков у ортопоксвирусов, выделенных из природных источников. На наш взгляд, наиболее интересен в этом отношении ВОК, который имеет наибольшее количество ВВК-генов в составе генома и, по совокупности свойств может рассматриваться в качестве прародителя других видов ортопоксвирусов, патогенных для человека (Сафронов и др., 1999;
Shchelkunov et al., 2002), в том числе и ВОВ (Downie, 1970). ВОК может достаточно адекватно использоваться для выявления и изучения генов, определяющих его свойства in vivo, так как этот вирус имеет очень широкий круг хозяев, в том числе и мелких лабораторных животных (Маренникова и др., 1984;
Маренникова и Щелкунов, 1998).
Для работы нами был выбран штамм GRI-90, выделенный в 1990 году в Москве от ребенка 4,5 лет, заразившегося от больного крота. Этот штамм имеет хорошо известную короткую пассажную историю (Маренникова и др., 1996).
На первом этапе было проведено клонирование исходного штамма ВОК GRI-90 для того, чтобы избежать возможной внутриштаммовой гетерогенности вируса при отборе индивидуальных рекомбинантных клонов. Методом бляшек были отобраны 9 индивидуальных клонов, ДНК которых подвергли рестрикционному анализу с использованием эндонуклеазы рестрикции HindIII наряду с ДНК исходного штамма ВОК GRI-90. Для дальнейшей работы выбрали три клоновых варианта ВОК, не отличающиеся по рестрикционной картине ДНК от исходного штамма GRI-90.
Последующий визуальный анализ оспин на ХАО КЭ показал, что через 48 ч инкубации все оспины, образованные клоновыми вариантами, имели одинаковый размер (около 2 мм в диаметре) и характерный красный цвет. В это же время родительский штамм ВОК вызывал образование гетерогенных по размеру (от 0,5 до 3 мм в диаметре) оспин, среди которых наряду с красными встречались и белые, несколько более крупные оспины, число которых не превышало 2%. Такой феномен описан для многих природных изолятов ВОК (Archard et al., 1984).
Сравнительное изучение патогенности выбранного клона № (обозначенного ВОК-5) и исходного ВОК GRI-90 на нелинейных белых мышах не выявило заметных различий. Рассчитанная по методу Кербера ЛД50 (Лакин, 1990) для клонового варианта составила 5,6х104 БОЕ/мышь, а для исходного ВОК – 7,6х104 БОЕ/мышь. Исходя из полученных данных, для дальнейшей работы был отобран клон ВОК-5, с которым и были проведены эксперименты по встройке созданных нами плазмид интеграции, обеспечивающих направленную делецию генов ВВК ВОК.
Конструирование плазмид интеграции для направленной делеции ВВК-генов Для получения вирусов с направленно введенными делециями генов, кодирующих ВВК-белки, нами был выбран метод временной доминантной селекции (Falkner and Moss, 1988;
Falkner and Moss, 1990). Для реализации этого подхода создается плазмида интеграции, которая несет как доминантный селективный маркер (ген gpt E.coli под контролем 7.5К-промотора ВОВ), расположенный вне протяженных областей гомологии с ДНК вируса, так и последовательности генома ВОК, фланкирующие делетируемый ген (рис. 2).
Ген gpt E.coli кодирует фермент ксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазу (XGPRT), который может синтезироваться в клетках млекопитающих и способен восстанавливать метаболизм пуриновых нуклеотидов, блокируемый микофеноловой кислотой (MPA) (Хеймс и Хиггинс, 1987;
Щелкунов, 1997). В результате единичного кроссинговера плазмиды интеграции и вирусной ДНК образуется рекомбинантный вирусный геном, содержащий как ген gpt, так и протяженные повторяющиеся последовательности, представляющие собой сегмент вирусного генома с целевой делецией и этот же сегмент без делеции (рис. 3). Такая генетическая конструкция нестабильна и может существовать лишь под селективным давлением. При снятии селективных условий происходит внутримолекулярная рекомбинация по областям гомологии, в результате которой образуется два вида вирусов - с делецией и без нее, причем выщепляется вся плазмидная часть вместе с селективным маркером, что позволяет получать в дальнейшем двойные, тройные и т.д. рекомбинантные вирусы по различным участкам генома, используя эту же методику селекции.
Рис. 2. Схема получения гибридной плазмиды интеграции на примере pA57R.
L и R – фрагменты генома ВОК, фланкирующие делетируемый ген слева и справа, соответственно. Стрелками и цифрами над ними обозначены праймеры для ПЦР pA57R A57R A57R A57R Рис. 3. Схема получения рекомбинантных ВОК с направленно делетированным геном A57R. L’ и R’ – области генома ВОК, гомологичные соответствующим фрагментам L и R гибридной плазмиды интеграции pА57R Конструирование плазмид вышеописанного типа осуществляли в несколько этапов. На первом этапе была получена плазмида pUCgpt на основе pUC19 и pMGCgpt на основе pMGC20, содержащие ген gpt E. coli, под контролем 7,5К-промотора ВОВ. Структура клонированного EcoRI-EcoRI фрагмента ДНК плазмиды pMGCgpt была подтверждена секвенированием по методу Максама и Гилберта (Maxam and Gilbert, 1980).
Затем получали плазмиды с делециями по каждому из шести генов семейства ВВК. Для этого из банка клонированных фрагментов ВОК, ранее полученного в нашей лаборатории (Рязанкина и др., 2000), выбрали плазмиды pCB64, pCB5, pCB3, pCH226, pCMS4 и pCЕ13, содержащие соответственно ОРТ A57R, C18L, D11L, G3L, B9R и B19R с фланкирующими их областями.
Эти плазмиды использовали в качестве матриц при проведении ПЦР.
Олигонуклеотидные праймеры рассчитывали таким образом, чтобы делеция целевого гена не приводила к нарушению прилегающих к нему ОРТ.
В результате, были получены целевые плазмиды интеграции pA57R, pC18L, pD11L, pG3L, pB9R и pB19R, обеспечивающие возможность получения рекомбинантных ВОК с направленно делетированными генами A57R, C18L, D11L, G3L, B9R и B19R семейства ВВК-белков. Структура данных плазмид была подтверждена детальным рестрикционным анализом.
Получение мутантов ВОК с направленно делетированными генами, кодирующими ВВК-белки Общая схема получения делеционных вариантов ВОК приведена на рис. (на примере гена A57R). Используемый метод трансфекции и селекции обеспечивает выход делеционных вариантов ВОК с частотой свыше 50% (Falkner and Moss;
1990). Нами были проведены эксперименты по трансфекции зараженных клонами ВОК клеток CV-1, выбранными плазмидами интеграции.
После четырех-шести пассажей в условиях селекции, вирус клонировали под агарозным покрытием методом бляшек. Для этого вирусную суспензию трижды обрабатывали ультразвуком в течение 30 с, титровали на монослое клеток CV- и выделяли клоны, используя 2-х кратную поддерживающую среду ДМЕМ с 2% агарозой. Далее эти клоны подращивали в неселективных условиях и реклонировали как описано выше. После проведения трансфекции, селекции и клонирования отбирали по 10-24 предполагаемых делеционных мутантов каждого вида (одинарные – удален один ВВК-ген, двойные – удалено два гена, тройные – три гена, четверные – четыре гена и т.д.). Монослой клеток CV- заражали этими вирусными клонами с множественностью 0,1-1 БОЕ на клетку, инкубировали 1 ч при 37C. Через 1-2 суток, при появлении ЦПД, поддерживающую среду удаляли, клетки промывали физиологическим раствором, затем разрушали их двукратным замораживанием-оттаиванием и выделяли вирусную ДНК согласно методике (Esposito et al., 1981).
В качестве контроля эффективности трансфекции и селекции при получении вариантов ВОК с множественными делециями генов ВВК параллельно проводили эксперимент по получению варианта ВОК или с одинарной делецией этих генов, или делетировали тот же ген у варианта ВОК с другим, но меньшим набором делеций.
ПЦР-анализ выделенной вирусной ДНК проводили, используя пары праймеров для предварительного анализа, в этом случае оба праймера находились внутри фланкирующих фрагментов ВОК (L и R). Для подтверждения делеции в вирусной ДНК, были рассчитаны праймеры, один из которых лежал внутри левого фрагмента, полученного при клонировании, а другой располагался за правым клонированным фрагментом на геноме ВОК.
В результате работы нами были получены 18 рекомбинантных вариантов ВОК с делециями генов, кодирующих ВВК белки:
делеция 1 гена: A57R;
B9R;
B19R;
D11L;
C18L;
G3L делеция 2 генов: A57RB9R;
D11LG3L;
G3LC18L делеция 3 генов: A57RB9RB19R;
D11LG3LC18L делеция 4 генов: A57RB9RB19RD11L;
A57RB9RB19RC18L;
B9RD11LG3LC18L;
B19RD11LG3LC18L;
A57RD11LG3LC18L делеция 5 генов: A57RB9RB19RC18LD11L делеция 6 генов: A57RB9RB19RC18LD11LG3L.
По два-три независимых клоновых варианта каждого типа были наработаны, определен их титр, выделена ДНК и проведен детальный ее анализ с помощью ПЦР. В качестве примера приведена электрофореграмма полученных в ПЦР-анализе фрагментов ДНК, которая подтвердила наличие делеций во всех шести генах ВОК A57RB9RB19RC18LD11LG3L), кодирующих ВВК-белки (рис. 4).
A57R(0;
2) B19R(0;
1) B9R(0;
2) C18L(0;
2) D11L(0;
2) G3L(0;
1) ВОК 61 101 151 ВОК 61 101 151 ВОК 61 101 151 М ВОК 61 101 151 ВОК 61 101 151 ВОК 61 101 Рис. 4. ПЦР анализ мутантных по шести генам ВВК выбранных клонов ВОK. Электрофореграмма разделения фрагментов ДНК ВОК, полученных в результате ПЦР в 1% агарозном геле. 61, 102, 151 – мутатнтные клоны;
BОК – исходный клон ВОК-5;
M – 1Kb ДНК маркер. Сверху над квадратными скобками указаны используемые праймеры на соответствующий анализируемый ген Все полученные делеционные варианты образовывались с высокой частотой, являлись жизнеспособными и стабильно сохраняли генотип в течение нескольких пассажей (клонирование, реклонирование, подращивание). Таким образом, были получены мутанты ВОК с направленно нарушенными всеми шестью генами, кодирующими ВВК-белки, что подтвердило предположение о том, что данные гены не являются существенными для репродукции ортопоксвирусов на культуре клеток CV-1.
Изучение биологических свойств мутантных вариантов ВОК Используемая в данной работе методология обратной генетики позволяет надеяться на выявление свойств ВВК-генов при сравнительном изучении исходного вируса и его мутантов с направлеными делециями. В виду того, что ВОК имеет широкий круг хозяев и ВВК-гены представлены у него самым большим среди поксвирусов количеством, актуальным является изучение мутантов с одновременными множественными делециями этих генов. С этой целью, из полученной в предыдущем разделе коллекции мутантных ВОК с различными комбинациями делеций ВВК-генов, нами были использованы кроме одиночных мутантов (D11L, C18L, G3L, A57R), также двойные (D11LG3L), тройные (D11LG3LC18L) и четверные (A57RD11LG3LC18L) делеционные мутанты ВОК в сравнительном исследовании их биологических свойств.
Поскольку ОРТ, обуславливающие синтез ВВК-белков, находятся в вариабельных концевых фрагментах генома ортопоксвирусов, где локализованы гены, которые определяют круг хозяев и уровень вирулентности для чувствительного хозяина, на первом этапе мы провели сравнительные исследования репродукции исходного ВОК и делеционных мутантов у которых удалены 1, 2, 3 или 4 ВВК-гена в культурах клеток и на ХАО КЭ;
определили спектр культур клеток, в которых могут размножаться эти вирусы;
провели эксперименты по оценке вирулентности в принятой лабораторной модели ВОК – мыши BALB/c (Martinez et al., 2000);
выполнили работы по определению связи BBК-генов с температурной чувствительностью вируса. Для установления особенностей взаимодействия вируса с клеткой-хозяином ставили целью сравнить характер цитопатического эффекта ВОК и его мутантов с четырьмя делециями ВВК-генов в культуре клеток CV-1. Для оценки различий в структуре оспин, образованных мутантными и «диким» вариантом ВОК на ХАО КЭ, был использован электронно-микроскопический анализ. Так как для разнообразных клеточных систем показана связь BВК белков с актиновым цитоскелетом и их участие в формировании цитоплазматических выростов (Spence et al., 2000;
Inoue et al., 2005;
Jiang et al., 2007), было проведено изучение влияния делеций четырех ВВК-генов на эти функциональные активности вируса.
Репродукция различных делеционных мутантов ВОК в первичной (ФЭК) и перевиваемой (CV-1) культурах клеток Изучение репродукции различных делеционных вариантов ВОК: клон 8 – с делецией одного гена (D11L), клон 27 – с делециями двух генов (D11LG3L), клон 73 – с делециями трех генов (D11LG3LC18L), в первичной - фибробластов куриных эмбрионов (ФЭК) и перевиваемой - почки африканской зеленой мартышки (CV-1) культурах клеток не выявило существенных отличий от родительского клона ВОК-5 (табл. 2). Все мутанты хорошо размножались в тестируемых культурах клеток.
Таблица Репродукция различных вариантов ВОК в первичной (ФЭК) и перевиваемой (CV-1) культурах клеток Титр вируса1, Log10БОЕ/мл Вирус Культура клеток CV-1 ФЭК Время после инфекции Время после инфекции (часы) (часы) 24 48 24 ВОК-5 6,3±0,3 7,0±0,2 6,1±0,3 6,8±0, Одинарный мутант (клон 8) 6,2±0,2 6,9±0,3 6,0±0,2 6,4±0, Двойной мутант (клон 27) 6,1±0,2 7,1±0,2 6,3±0,3 6,6±0, Тройной мутант (клон 73) 5,4±0,5 7,0±0,2 6,2±0,3 6,6±0, Титры вируса представлены как среднеарифметические значения ± стандартное отклонение. Стандартное отклонение рассчитано с использованием независимого критерия Стьюдента для уровня значимости р0,05.
Динамика роста мутантов ВОК в культуре клеток CV- В данной части работы более подробно изучили динамику развития исходного ВОК-5 и мутантных клонов ВОК - 216, 337 с делециями четырех генов (A57RD11LG3LC18L), кодирующих ВВК-белки. Для этого, монослой культуры клеток CV-1, полученный на 6-ти луночных планшетах, инфицировали вирусами с множественностью заражения 0,01 БОЕ/кл. Время после инфекции составляло 12, 24, 36, 48, 60 и 72 часа. На каждом временном этапе определяли титр вируса. В работе использовали два независимых мутантных клона ВОК для исключения внутриклоновой гетерогенности.
Полученные результаты (рис. 6) показывают, что кривые развития вирусов в культуре клеток CV-1 не различаются. Это указывает на то, что делеция даже четырех генов ВВК не влияет на репродуктивные функции ВОК в изученной культуре клеток.
титр (log10 БОЕ/мл ) В ОК 3 "216" "337" 0 12 24 36 48 60 в ремя (часы ) Рис. 5. Сравнительный анализ размножения исходного ВОК (ВОК-5) и делеционных клонов 216 и 337 (A57RD11LG3LC18L) на монослое культуры клеток CV-1, инфицированных множественностью заражения 0, БОЕ/кл Сравнение цитопатического эффекта ВОК и его делеционных мутантов в культуре клеток CV- Культура клеток CV-1 высокочувствительна к заражению ВОК и его мутантами с делецией ВВК-генов. Нами было отмечено, что бляшки, формируемые делеционными клонами 216 и 337 (A57RD11LG3LC18L) заметно меньше по диаметру, чем бляшки ВОК-5. Небольшие цитопатические фокусы регистрировались уже через 24 ч после заражения монослоя клеток CV 1 как мутантантными клонами, так и ВОК-5: клетки округлялись и отслаивались. Через 48 ч формировались видимые бляшки. ВОК-5 вызывал более выраженное повреждение монослоя;
бляшки, индуцированные мутантами 216 и 337, выглядели существенно мельче. Они имели сильно изрезанные контуры, что не позволило провести прямое определение их размеров. Для сравнения цитопатического эффекта ВОК и вариантов с делециями четырех ВВК-генов использовали измерение оптической плотности окрашенных бляшек, включая и центральные, и периферические зоны.
Величина оптической плотности одной бляшки составила 0,18 ± 0,02 (ВОК-5) и 0,33 ± 0,03 (четверные мутанты – 337 и 216), что свидетельствует о снижении цитопатического эффекта мутантов на монослой клеток CV-1.
Рис. 6. Морфология бляшек, сформированных в сплошном монослое культуры клеток CV-1 вирусом оспы коров дикого типа (ВОК-5) (Aa, B) и четверными мутантами 216 (Ab, C) и 337 (Ac). Окраска кристаллическим фиолетовым через 48 ч. после заражения с множественностью 50± БОЕ/лунку. Инкубация при 37°C. Длина масштабной линии соответствует мм (A) and 500 µм (B, C) Таким образом, выявленное снижение цитопатического эффекта является одним из проявлений делеции BBК-генов при инфекции in vitro и, по видимому, приводит к более продолжительному сохранению зараженных клеток на подложке и, соответственно, к более длительному периоду репродукции вируса. Возможно, это обстоятельство обеспечивает равный уровень наработки дочернего вируса мутантами и исходным ВОК на культуре клеток CV-1.
Рост мутантов ВОК при повышенной температуре Исследование такого интегрального признака вирулентности, как предельная температура размножения вируса (Fenner et al., 1989), также выявило различия между мутантными вариантами и исходным штаммом ВОК.
Были проведены эксперименты по культивированию ВОК-5, а также мутантных клонов с делециями двух генов (клон 27), трех генов (клоны 73, 52), четырех ВВК-генов (клоны 216 и 337) при пермиссивной (37C) и непермиссивной (39,5C) температурах. Монослой культуры клеток CV-1, полученный на 6-ти луночных планшетах, заражали вирусами с множественностью 0,1 БОЕ/кл. Сорбцию вируса проводили при соответствующих температурах (37С и 39,5С). Через 48 ч, инфицированные клетки разрушали путем двукратного замораживания – оттаивания, а вышедший в результате этого в среду вирус титровали. Изучение кинетики накопления ВОК в клетках CV-1 в пермиссивных условиях (37°C) в течение 12, 24, 36, 48, 60 и 72 часов не выявило значительных различий между ВОК-5 и четверными мутантами. Однако при инкубации в течение 72 ч в непермиссивных условиях (39,5°C) продукция вариантов ВОК с делециями четырех генов ВВК была достоверно в 100 раз ниже в сравнении с исходным ВОК-5 (рис. 7). Таким образом, нами показано, что делеция ВВК-генов обуславливает температуро-чувствительный фенотип, ведущей к аттенуации ВОК при повышении температуры среды. Интересно, что ВНО, у которого BBК-гены отсутствуют, имеет минимальную в семействе Poxviridae величину предельной температуры формирования оспин на ХАО КЭ (37,5-38,5oС). Для ВОО (один BBК-ген) этот показатель составляет 39,0-39,5oС, для ВОВ (три BBК-гена) он равняется 41oС (Маренникова и Щелкунов, 1998) Рис. 7. Рост исходного вируса оспы коров (ВОК, клон 5), а также вариантов ВОК с делецией двух («27»), трех («52» и «73») и четырех («216» и «337») ВВК-генов при культивировании в пермиссивных (370С) и непермиссивных (39,50С) условиях, p0, Сравнительная оценка чувствительности различных культур клеток к делеционным мутантам ВОК Для оценки спектра чувствительных культур клеток для разных вариантов ВОК нами было использовано 11 линий клеток различного происхождения: CV-1, клетки почки макаки-резус (LLCMK-2), клетки карциномы шейки матки человека (HeLa), клетки легкого человека (MRC-5), фибробласты легкого эмбриона человека (Л-68), клетки почки свиньи (РК-15), клетки почки собаки (MDCK), клетки почки взрослого нормального быка (MDBK), клетки почки кролика (RK-13), клетки остеосаркомы человека (HOS), клетки кожно-мышечной ткани эмбрионов мышей (3T3). Разные культуры клеток были инфицированы исходным неклонированным ВОК, исходным клоном ВОК-5, на основе которого получали варианты с направленными делециями, и мутантными вирусами: клоном - 73, имеющим одновременные делеции трех генов (C18LD11LG3L) и клонами - 216, 337 с одновременными делециями четырех генов ВВК (C18LD11LG3LА57R).
Результаты экспериментов суммированы в таблице 3.
Таблица Сравнительная оценка чувствительности культур клеток к различным вариантам вируса оспы коров Время Рост вируса, титр Log10БОЕ/мл)вирус Культура после Исходный Клон Клон клеток инфекции неклонир. ВОК-5 Клон 216 (часы) ВОК 24 6,2±0,2 6,1±0,2 5,4±0,5 6,3±0,2 6,2±0, CV- 48 6,9±0,3 7,13±0,2 7,0±0,2 7,4±0,3 7,2±0, 24 5,5±0,3 5,1±0,2 5,0±0,4 4,4±0,2 4,2±0, L- 48 6,6±0,2 6,9±0,3 6,8±0,2 6,5±0,3 6,8±0, 24 6,4±0,2 6,3±0,2 5,7±0,4 5,8±0,3 5,9±0, HOS 48 7,1±0,2 7,1±0,3 7,4±0,2 7,2±0,2 6,8±0, 24 4,5±0,2 4,4±0,3 3,8±0,3 3,6±0,1 4,3±0, LLCMK- 48 5,4±0,2 5,3±0,2 5,3±0,3 4,8±0,2 4,7±0, 24 2,3±0,3 1,0±0,2 2,3±0,3 1,0±0,2 1,0±0, MDBK 48 1,0±0,2 1,0±0,2 1,0±0,2 1,0±0,2 1,0±0, 24 5,7±0,2 5,6±0,3 5,1±0,2 5,3±0,1 6,0±0, RK- 48 7,0±0,1 6,7±0,2 6,7±0,1 6,7±0,2 6,9±0, 24 6,4±0,2 6,4±0,3 6,0±0,3 6,5±0,4 6,4±0, HeLa 48 7,2±0,3 7,3±0,2 6,8±0,3 7,3±0,2 7,3±0, 24 4,5±0,2 3,8±0,4 3,6±0,2 1,1±0,2 1,1±0, MDCK 48 5,0±0,3 5,1±0,2 4,4±0,2 1,0 2,5±0, 24 5,0±0,4 5,4±0,2 4,6±0,3 4,7±0,3 4,3±0, MRC- 48 7,0±0,2 7,1±0,3 6,9±0,2 6,9±0,2 6,5±0, 24 5,0±0,2 4,8±0,2 4,1±0,4 4,0±0,4 3,8±0, 3T 48 5,7±0,3 5,7±0,2 4,6±0,2 - 4,5±0, 24 5,7±0,3 5,0±0,4 4,5±0,4 4,4±0,3 PK- 48 6,5±0,4 6,2±0,4 5,8±0,3 5,9±0,2 6,3±0, Титры вируса представляли как среднеарифметические значения ± стандартное отклонение. Стандартное отклонение рассчитано с использованием независимого критерия Стьюдента для уровня значимости р0,05.
Поскольку динамика размножения одинарных и двойных делеционных мутантов во всех культурах клеток не отличалась от вируса дикого типа, данные не включили в таблицу. Было показано, что репродукция родительского клона ВОК-5 во всех культурах клеток не отличалась от исходного неклонированного природного изолята. Обнаружилось, что все тестируемые варианты ВОК, в том числе и вирус «дикого» типа, слабо или практически не размножаются в культуре клеток MDBK. Видимо, это можно будет использовать в будущем в качестве дифференциального признака при идентификации ВОК. Выявлено отставание репродукции (24 часа инкубации) четверных и, в некоторых случаях, тройных мутантов в культурах клеток 3Т3 и MRC-5. В культуре L-68 четверные мутанты размножаются достоверно хуже «диких вариантов» ВОК. Показано, что в культуре клеток MDCK через 48 ч после инфекции тройные мутанты размножаются достоверно хуже исходных вирусов, а четверные мутанты способность размножаться на них утратили.
Таким образом, гены ВВК могут быть важны в определении круга хозяев вируса и/или тканевого тропизма.
Сравнительное изучение оспин, формируемых на ХАО КЭ делеционными мутантами ВОК Адекватной моделью для исследования интегральных биологических характеристик является способность различных вариантов ВОК вызывать образование оспин (развитие очагов локального поражения) на ХАО КЭ, их визуальный, вирусологический и микроскопический анализ. Размеры и внешний вид оспин варьируют в зависимости от вида вируса и входят в ряд классификационных признаков ортопоксвирусов (Marennikova et al., 1964).
Микроскопическая структура оспин определяется интенсивностью размножения вируса и степенью пролиферативной, инфильтративной и деструктивной реакций, которые являются формообразующими факторами, обусловливающими характерную морфологию оспин того или иного поксвируса (Ryabchikova et al., 1990).
Визуальный анализ оспин, индуцированных на ХАО через 48 ч после инфицирования исходным клоном 5, одинарными и двойными делеционными мутантами ВОК, не выявил заметных различий. Выраженные различия морфологии оспин были обнаружены между ВОК-5 и тройными, и четверными мутантами. Исходный ВОК-5 вызывает образование на ХАО КЭ крупных красных оспин диаметром 2,1±0,33 мм, тогда как оспины, индуцированные тройными (C18LD11LG3L) и четверными (C18LD11LG3LА57R) мутантами, имеют беловатый цвет и существенно меньшие размеры (P0,05), их диаметр составляет 0,96±0,38 мм и 0,84±0,27 мм, соответственно.
Рис. 8. Оспины на ХАО куриных эмбрионов, образуемые 1 – ВОК-5 GRI 90, 2 и 3– вирусами с делецией двух (2), трех (3) и четырех (4) ВВК-генов В таблице 4 приведена количественная оценка содержания вирусов в отдельных оспинах, образованных делеционными мутантами ВОК.
Таблица Количественная оценка (выход) вирусного материала, полученного из отдельных оспин на ХАО КЭ Вирусный штамм Log10БОЕ/оспина ВОК-5 6,3±0, 27 (двойной мутант) 6,6±0, 52 (тройной мутант) 5,8±0, 73 (тройной мутант) 5,3±0, 216 (четверной мутант) 5,1±0, 337 (четверной мутант) 5,2±0, Доверительный интервал ± SD был определен в трех независимых экспериментах с уровнем значимости P0, Как видим, «урожай» вируса в оспинах, образованных четверными мутантами, достоверно ниже аналогичных характеристик родительского штамма. Количество вируса в оспинах, образованных тройными мутантами, варьирует в большей степени, однако, также существенно ниже вируса дикого типа. «Урожай» вируса в оспинах, образованных двойным мутантом, не отличается от родительского штамма ВОК.
Микроскопическое исследование оспин Светооптическое изучение полутонких срезов выявило ярко выраженные различия в строении оспин, индуцированных на ХАО КЭ исходным вирусом ВОК-5 и четверными мутантами C18LD11LG3LА57R - 216 и 337. Было показано, что в оспинах, образованных мутантами 216 и 337, область центрального некроза не выражена, число слоев эпителия не превышает трех пяти даже в центре оспины, что свидетельствует о нарушении пролиферации эпителиальных клеток в зоне размножения вируса. В центре оспины находится зона деструкции, содержащая полость, ограниченную поверхностными слоями эпителия, в которой локализуются единичные разрушенные клетки. Оспины исходного вируса оспы коров имеют четкую форму диска. Эпителий хориона в зоне оспины многослойный, количество слоев клеток увеличивается от периферии к центру, достигая 13-15. Воспалительно-клеточная реакция не выражена как в оспинах, индуцированных исходным вирусом, так и мутантами.
Сравнение клеток, зараженных четверными мутантами и исходным вирусом, показало, что репродукция мутантов приводит к формированию меньшего числа зрелых вирионов, а во многих клетках репродукция останавливается на стадии сборки незрелых вирионов. Вместе с тем, при размножении мутантов происходит образование значительного числа внеклеточных «одетых» вирионов, что обуславливает диссеминацию вируса в соединительную ткань оспины.
Анализ полученных на оспинах данных показывает, что параметры морфогенеза четверных мутантов и исходного вируса не различаются, т.е.
делеция четырех копий генов не приводит к нарушению формирования вирусных частиц. Однако параметры инфекции мутантами и исходным вирусом значительно различаются на клеточном и тканевом уровне, и эти различия, по всей видимости, обусловлены развитием патологических изменений в инфицированных клетках. Можно предположить, что продукты экспрессии ВВК-генов необходимы для «сбалансированного» использования клеточных систем репродуцирующимся вирусом. Отсутствие этих продуктов приводит к нарушению функций клеток, и, как следствие, к снижению воспроизводства вируса, чем, возможно, и обусловлено уменьшение размера и вирусного содержания оспин, образованных делеционными мутантами ВОК, и снижение их вирулентности для BALB/c мышей, показанной ниже.
Эксперименты на лабораторных мышах Определение LD Вирулентность мутантных вирусов оценивали по величине LD50 при интраназальном заражении мышей линии BALB/c. Группы по 8-10 мышей были интраназально инфицированы десятикратными разведениями вирусов в диапазоне доз от 104 до 107 БОЕ в 30 мкл физиологического раствора.
Контрольной группе вводили аналогичное количество физиологического раствора. Мышей наблюдали на протяжении 21 суток. Признаки заболевания проявлялись уже на 3-4 сутки после инокуляции. Симптомами являлись:
выраженное нарушение дыхания, повышенная температура, отсутствие аппетита. Число падших и выживших животных регистрировали в течение всего эксперимента. LD50 рассчитывали по методу Кербера. Для исходного вируса ВОК-5 LD50 составляла 1,1х105, в то время как для мутантных клонов 216 и 337 (C18LD11LG3LА57R) она была равна 4,8х105 и 8,7х105, соответственно. Результаты представленые в таблице 5, показывают, что по мере удаления большего числа ВВК-генов вирулентность снижается и для четверного мутанта достоверно отличается от исходного вируса.
Таблица Вирулентность ВОК, штамм GRI-90, и делеционных мутантов при интраназальном заражении BALB/c мышей Вирусные клоны Log10 LD50 (БОЕ/мышь)* ВОК-5 5,03±0, 27 (двойной мутант) 4,59±0, 73 (тройной мутант) 5,58±0, 216 (четверной мутант) 5,68±0, 337 (четверной мутант) 5,94±0, * Доверительный интервал ± SD был определен в трех независимых экспериментах с уровнем значимости P0, Для того чтобы выжить в организме хозяина, вирусы эволюционировали, используя ряд сложных механизмов, направленных на уклонение от хозяйского антивирусного иммунного ответа (Tortorella et al., 2000;
Finlay and McFadden, 2006). Было высказано предположение о том, что поксвирусные ВВК-белки выполняют ряд функций в ходе инфекции, возможно за счет взаимодействия с цитоскелетом или во время убиквитинизации (Wilton et al., 2008). Поскольку члены семейства поксвирусов, в большинстве случаев, кодируют по несколько BBK-белков, то возможно, подобно клеточным аналогам, могут функционировать и как куллин-3-субстратспецифичные адаптеры (Zhang et al., 2009). Более того, было показано, что два ВВК-белка, кодируемых генами EVM150 и EVM167 ВЭ, взаимодействуют с куллином-3 и что BTB-домен EVM150 и EVM167 является необходимым и достаточным для этого взаимодействия (Wilton et al., 2008). Возможно, снижение вирулентности является следствием того, что делеция ВВК-генов приводит к нарушению механизмов преодоления вирусом защитных реакций организма животных.
Связь ВВК-белков ВОК с актиновым цитоскелетом клетки и их участие в формировании цитоплазматических выростов Связь ВВК-белков с актиновым цитоскелетом и участие в формировании цитоплазматических выростов показаны для разнообразных клеточных систем (Furukawa et al., 2003;
Spence et al., 2000). При изучении мутантов ВОК с делецией четырех ВВК-генов в культуре клеток CV-1 были выявлены следующие изменения: сократилось не только число инфицированных клеток с отростками, но и длина отростков. Проведенные исследования показали, что клетки CV-1, зараженные ВОК-5 и мутантами по четырем генам ВВК 216 и 337, сохраняли полигональную форму в течение 15-22 ч после инфекции и имели размеры 40 x 50 µm, высоту в области ядра 2–2,5 µm. Вирусные антигены выявлялись в зараженных клетках в виде глыбок и гранул. Актиновый цитоскелет в большинстве зараженных клеток сохранялся лишь как редкие стресс-тяжи и полосы по линии прикрепления к подложке. Клетки с длинными цитоплазматическими отростками обнаруживались в монослое клеток CV- через 22 ч после заражения исходным ВОК-5. Длина отростков составляла 40 120 µм, тогда как толщина не превышала 0,5 µм. Как правило, одна клетка имела 1-2 отростка. Вирусные антигены выявлялись не только в теле клетки, но и по всей длине отростков, содержащих также актиновые микрофиламенты.
Электронная микроскопия подтвердила наличие вирусных структур в отростках, содержащих в основном зрелые вирионы. Следовательно, репродукция ВОК в клетках культуры CV-1 сопровождалась актин-связанным формированием длинных цитоплазматических отростков, несущих вирусные частицы. При репродукции четверных мутантов в культуре клеток CV-1 также формировались цитоплазматические отростки, однако они были существенно короче (20 – 60 µм). При инфекции мутантами из 300 зараженных клеток отростки регистрировались в 63, тогда как при репродукции ВОК 127 клеток из 300 имели отростки, несущие вирусные антигены.
Таким образом, проведенные исследования обнаруживают изменения, связанные с делецией ВВК-генов ВОК и указывают на то, что действие продуктов, синтезированных этими генами, как правило, зависит от числа удаляемых генов ВВК-семейства. Кроме того, несомненно, важна роль ВВК белков ВОК в поксвирусной инфекции и распространении вируса от клетки к клетке.
ВЫВОДЫ 1. На основании сравнения геномных нуклеотидных последовательностей вирусов оспы коров, осповакцины, оспы обезьян и натуральной оспы идентифицированы все ортопоксвирусные гены семейства ВВК и выявлены видоспецифичные отличия вирусов: ВОК содержит 6 генов данного семейства, ВОВ – 3, ВОО – 1, а в геноме ВНО все эти гены делетированы или мутационно нарушены.
2. Получены шесть рекомбинантных плазмид интеграции для последовательного введения направленных делеций в гены семейства ВВК вируса оспы коров штамм GRI-90.
3. Создана коллекция из 18 мутантов вируса оспы коров с делециями единичных ВВК-генов D11L, C18L, G3L, A57R, B9R или B19R, а также двух, трех, четырех, пяти и шести генов этого семейства. Показано, что ВВК-гены ВОК не является существенным для репродукции вируса в культуре клеток CV - 1.
4. При изучении мутантов ВОК, у которых последовательно делетированы от одного до четырех генов ВВК-семейства (D11L, C18L, G3L, A57R), обнаружено, что в зависимости от числа делетированных генов наблюдаются следующие эффекты:
а) изменяется круг чувствительных культур клеток. Мутанты ВОК, с делецией трех ВВК-генов, достоверно хуже размножаются в культуре клеток почки собаки (MDCK), чем исходный ВОК через 48 ч после инфицирования, а мутанты по четырем генам утрачивают эту способность (p0,05);
б) в культуре клеток CV-1 мутанты по четырем генам ВВК при температуре 370С формируют бляшки достоверно меньшего размера по сравнению с исходным ВОК, а при инкубации при повышенной температуре (39,5 0С) в течение 72 ч, продукция таких мутантов в 100 раз ниже по сравнению с исходным ВОК (p0,05);
в) мутанты по трем и четырем генам ВВК формируют на ХАО КЭ оспины меньшего размера - их диаметр составляет 0,96±0,38 мм и 0,84±0,27 мм, соответственно, а у исходного ВОК - 2,1±0,33 мм. Содержание вируса в них также отличается: титр в тройных мутантах составляет 2х105 БОЕ/оспина, в четверных – 1,6х105 БОЕ/оспина, в то время как в исходном вирусе - 2х БОЕ/оспина (p0,05);
г) удаление четырех генов ВВК приводит к достоверному снижению вирулентности ВОК при интраназальном заражении мышей линии BALB/c. Для исходного вируса оспы коров LD50 составляла 1,1х105 БОЕ/мышь, в то время как для мутантного клона - 8,7х105 БОЕ/мышь (p0,05).
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации 1. Shchelkunov S., Totmenin A., Kolosova I. Species-specific differences in organization of orthopoxvirus kelch-like proteins // Virus Genes. – 2002. – V. 24. № 2. – P. 157-162.
2. Щелкунов С.Н., Тотменин А.В., Колосова И.В., Сандахчиев Л.С.
Видоспецифичные различия в организации генов kelch-подобных белков ортопоксвирусов, патогенных для человека // Докл. Акад. Наук. - 2002. - т. 383.
- № 2. - С. 271-275.
3. Тотменин А.В., Колосова И.В., Щелкунов С.Н. Изучение ортопоксвирусных генов, кодирующих kelch-подобные белки. I. Анализ видоспецифичных различий по структурной организации // Молекул. биология.
- 2002. - т. 36. - № 4. - С. 610-616.
4. Колосова И.В., Серегин С.В., Кочнева Г.В., Рябчикова Е.И., Бессмельцева Е.В., Бабкина И.Н., Соленова Т.Е., Бабкин И.В., Щелкунов С.Н. Изучение ортопоксвирусных генов, кодирующих kelch-подобные белки. II. Создание вариантов вируса оспы коров с направленными делециями генов // Молекул.
биология. – 2003. - т. 37. - №4. - С. 585-594.
5. Kochneva G., Kolosova I., Maksyutova T., Ryabchikova E., Shchelkunov S.
Effects of deletions of kelch-like genes on cowpox virus biological properties // Arch.
Virol. – 2005. - V. 150. - № 9. - P. 1857-1870.
6. Кочнева Г.В., Таранов О.С., Лупан Т.А., Юдин П.В., Рубцов Н.Б., Байбородин С.И., Колосова И.В., Щелкунов С.Н., Дроздов И.Г., Рябчикова Е.И.
Изучение влияния делеции BTB/kelch-генов вируса оспы коров на некоторые характеристики инфекции in vitro // Вопросы вирусологии. – 2009. - №1. - С. 28 32.
Материалы научных конференций 7. Totmenin A.V., Seregin S.V., Kolosova I.V., Shchelkunov S.N. Orthopoxviral proteins of the kelch repeat superfamily. – In: XIIIth International Poxvirus and Iridovirus Symposium. Montpellier, France. Sept. 2-6, 2000. P. 36.
8. Kochneva G.V., Kolosova I.V., Maksyutova T.E., Ryabchikova E.I., Shchelkunov S.N. Effects of deletions of kelch-like genes on cowpox virus biological properties. In: XVth International Poxvirus and Iridovirus Conference. Keble College, Oxford, England. Sept. 3-8, 2004. P. 137.
9. Кочнева Г.В., Таранов О.С., Лупан Т.А., Юдин П.В., Колосова И.В., Щелкунов С.Н., Рябчикова Е.И. Влияние делеции генов семейства kelch вируса оспы коров на структурную реорганизацию инфицированных клеток. III международная конференция “Фундаментальные науки – медицине”.
Новосибирск, Россия. Сент. 2-8, 2007. С. 61.
10. Kochneva G., Ryabchikova E., Kolosova I., Sivolobova G., Yudin P., Taranov O., Lupan T., Shchelkunov S. Comparative studies of cowpox and mousepox virus mutants with deletions of BTB/kelch genes. XIV International Congress of Virology.
Istanbul, Turkey. Aug. 10-13 2008. P. 342.
Список сокращений а.к. – аминокислота (аминокислотный остаток) ВОК – вирус оспы коров ВОВ – вирус осповакцины ВНО – вирус натуральной оспы ВОО – вирус оспы обезьян ВЭ (ВОМ) – вирус эктромелии (вирус оспы мышей) КЭ – куриные эмбрионы МРА – микофеноловая кислота ООЕ – оспинообразующая единица ОРТ – открытая рамка трансляции ПЦР – полимеразная цепная реакция ХАО – хорионаллантоисные оболочки ЦПД – цитоплазматическое действие ВВК-белки (гены) - ВTB/ВACK/Кelch-белки (гены) Благодарности Автор выражает искреннюю признательность руководителю работы д.б.н., профессору С.Н. Щелкунову и глубокую благодарность своим коллегам, в тесном сотрудничестве с которыми была выполнена диссертационная работа:
к.б.н. С.В. Серегину, к.б.н. Е.А. Уваровой, Т.Е. Максютовой, С.Н. Якубицкому, к.б.н. Г.В. Кочневой, Т.А. Лупан, д.б.н., профессору Е.И. Рябчиковой, к.м.н.
О.С. Таранову, к.б.н. А.В. Тотменину, к.б.н. И.В. Бабкину и Д.В. Антонец.
Особую благодарность автор приносит д.б.н., профессору В.Б. Локтеву, к.х.н.
Л.Н. Яшиной и д.м.н. Е.М. Малковой за внимательное прочтение и обсуждение материалов диссертации, ценные замечания и рекомендации, а также к.б.н.
В.П. Мишину, к.б.н. С.В. Серегину, к.б.н. И.Н. Бабкиной и к.б.н. Г.В. Кочневой за критическое рассмотрение и обсуждение результатов работы.