Биохимическое исследование преальбумина спермоплазмы при заболеваниях репродуктивной системы мужчин
На правах рукописи
ЛУЦКАЯ АДЕЛЯ МУКМИНОВНА БИОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕАЛЬБУМИНА СПЕРМОПЛАЗМЫ ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ МУЖЧИН 03.01.04 – Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Москва – 2012 ~1~
Работа выполнена на кафедре общей и биоорганической химии ГБОУ ВПО АГМА Минздравсоцразвития России
Научный консультант:
доктор медицинских наук, профессор Николаев Александр Аркадьевич
Официальные оппоненты:
Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой биохимии лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздравсоцразвития России Терентьев Александр Александрович Доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой биохимии медицинского факультета РУДН Чернов Николай Николаевич
Ведущая организация: ФГБУ «НИИ урологии» Минздравсоцразвития России.
Защита диссертации состоится «19» октября 2012 года в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8, Медицинский факультет.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.
Автореферат разослан «_» сентября 2012 года.
Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук, профессор Е. В. Лукашева ~3~
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Заболевания репродуктивной системы мужчин имеют в настоящее вре мя устойчивую тенденцию к росту во всем мире [Тер-Аванесов Г. В., 2008;
Nieschlag E. et al., 2010]. Проблема заболеваний мужской репродуктивной сис темы не является только медицинской и имеет демографические, а также соци ально-психологические аспекты [Божедомов В. А., 2006;
Oehninger S. C. et al., 2011]. Для пациентов не редко более сильным стрессом является даже не само заболевание, а осознание факта наличия дисфункции органов репродуктивной системы [Михайличенко В. В. и др., 2009;
Connors L. H. et al., 2011].
Качество жизни данной категории больных значительно ухудшается, у пациентов падает творческий потенциал, развивается эмоциональная астения, снижается интерес к жизни в целом, так как состояние репродуктивного здоро вья имеет для мужчин огромное психо-эмоциональное значение [Тиктинский О.
Л., 2003;
Agarwal A. et al., 2009]. В то же время мужчинам, страдающим заболе ваниями репродуктивной системы, как правило, требуется достаточно длитель ная терапия до полной реконвалесценции [Евдокимов В. В. и др., 2011].
Своевременная и точная диагностика заболеваний репродуктивной сис темы и развития их возможных осложнений позволяет в ряде случаев значи тельно ускорить процесс лечения, избежать длительного периода медицинской и социально-психологической реабилитации.
Одним из перспективных направлений является лабораторная диагно стика, основанная на исследовании биохимического состава эякулята на уровне индивидуальных белков [Петрунин Д. Д., 1999;
Липатова Н. А. и др., 2007;
Baker D. J. et al., 2006]. Изменение молекулярного состава опережает развитие струк турно-функциональных нарушений на клеточном и тканевом уровне [Николаев А. А., 2000;
Wilson D. et al., 2008;
Nieschlag E. et al., 2010]. Диагностика на этом этапе развития патологического процесса позволяет проводить терапию с боль шей эффективностью и часто предупредить дальнейшее развитие патологиче ского процесса до выраженного нарушения функций.
В то же время некоторые белки спермоплазмы, в частности преальбу мин, остаются практически неизученными с точки зрения медицинской биохи мии [Duncan M. W. et al., 2007;
Kruger T. F. et al., 2009], хотя с высокой вероят ностью можно предположить наличие большого практического потенциала для лабораторной диагностики при определении этих белков в спермоплазме.
Цель исследования:
Разработка биохимических диагностических и прогностических методов на основе изучения преальбумина спермоплазмы человека в норме и при воспа лительных заболеваниях репродуктивной системы.
Основные задачи исследования:
Разработать метод выделения и очистки преальбумина из спермоплазмы.
1.
Разработать метод количественного определения преальбумина в спермо 2.
~4~ плазме.
Провести экспериментальное исследование биологических функций пре 3.
альбумина в сперме.
Количественно исследовать преальбумин, альбумин, С-реактивный белок 4.
и 2-макроглобулин в спермоплазме здоровых фертильных мужчин и мужчин с воспалительными заболеваниями предстательной железы и ор ганов мошонки.
На основании исследования уровня преальбумина в спермоплазме разра 5.
ботать биохимические способы диагностики воспалительных заболеваний при лейкоспермии.
Научная новизна исследования:
Впервые установлено, что спермоплазменный преальбумин при воспа лительных заболеваниях органов мужской репродуктивной системы имеет более высокую концентрацию, чем в норме.
Впервые доказано, что повышение уровня преальбумина в спермоплаз ме при воспалении органов репродуктивной системы происходит независимо от выраженности лейкоцитоза в эякуляте.
Впервые выявлена взаимосвязь уровня преальбумина в спермоплазме и двигательных характеристик сперматозоидов.
Впервые установлена способность преальбумина повышать выживае мость сперматозоидов при их повреждении пероксидом водорода.
Практическая значимость работы:
Разработан биохимический способ топической диагностики воспали тельных заболеваний при лейкоспермии.
Разработан биохимический способ диагностики воспалительных заболе ваний мужской репродуктивной системы при нормальном уровне лейкоцитов в эякуляте.
Разработан биохимический способ прогноза развития астенозооспермии при воспалительных заболеваниях органов мужской репродуктивной системы.
Внедрение результатов работы в практику Разработанные способы диагностики внедрены в практическую работу:
клинико-диагностической лаборатории Центра планирования семьи и репродук ции (г. Астрахань), кафедры общей и биоорганической химии ГБОУ ВПО «АГМА Минздравсоцразвития России», Астраханского областного кожно венерологического диспансера, диагностической лаборатории «ДИАМЕД экспресс» ООО МФВФ «Техномед» (г. Астрахань), ООО МФ «Здоровье плюс» (г. Астрахань), ЧМК «Мужская консультация» ИП Выборнов С. В. (г. Астра хань), ООО МФ «Семья» (г. Астрахань), ЧМК «Гинекологический кабинет» ИП Калинина О. А. (г. Астрахань).
Основные положения, выносимые на защиту Уровень преальбумина в спермоплазме коррелирует с двигательными харак теристиками сперматозоидов.
~5~ Уровень преальбумина в спермоплазме отражает вероятность развития асте нозооспермии при воспалительных заболеваниях предстательной железы и органов мошонки.
При воспалительных заболеваниях органов мужской репродуктивной систе мы происходит повышение уровня преальбумина в спермоплазме.
Преальбумин повышает жизнеспособность сперматозоидов при их повреж дении пероксидом водорода.
Апробация работы Результаты работы представлены и доложены на:
Ежегодных итоговых научных конференциях Астраханской государст венной медицинской академии в 2002-2012 годах (г. Астрахань);
Ежегодной Всероссийской конференции «Национальные дни клиниче ской лабораторной диагностики» в 2004, 2008 и 2009 годах (г. Москва);
Международных научно-практических конференциях «Эколого биологические проблемы Волжского региона и Северного Прикаспия» в 2003 2011 годах (г. Астрахань);
Международных научно-практических конференциях «Здоровье и Об разование XXI Век» в 2003-2006 годах (г. Москва);
IX International Scientific Conference «Family Health In The XXI Century» in 2005 year (China, Dalyan).
Публикации По материалам диссертации опубликовано 22 научные работы, в том числе 12 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 14 – в периодических изданиях, 6 – в материалах конференций, 2 – в сборниках научных трудов.
Объем и структура диссертации Диссертационная работа изложена на 119 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы собственных исследова ний, заключения и выводов. Список литературы включает 261 источник, в том числе, 48 отечественных и 213 иностранных авторов. Диссертация содержит таблиц и 16 рисунков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе были исследованы образцы эякулятов у 221 мужчины с раз личной фертильностью. В том числе образцы эякулятов 179 мужчин с воспали тельными заболеваниями предстательной железы и органов мошонки.
Для исследования спермограмм были использованы стандартные мето дики в соответствии с рекомендациями ВОЗ.
Хранение образцов биологического материала до исследования прово дили при температуре 24°С.
В работе использовали коммерческие наборы и реактивы фирм: «High Technology Inc.» (США), «AssayPro» (США), «Sigma-Aldrich» (США), «Вектор ~6~ Бест» (Россия), «НиарМедик» (Россия), «Лабдиагностика» (Россия), «BioRad» (Франция).
Определение общего белка проводили биуретовым методом по конеч ной точке, определение альбумина проводили по конечной точке с использова нием бромкрезолового зеленого, определение С-реактивного белка проводили методом иммунотурбидиметрии с латексным усилением. Измерения проводили на полуавтоматическом биохимическом анализаторе «BioChem SA» (фирма «High Technology Inc.», США).
Определение 2-макроглобулина проводили методом иммунофермент ного анализа. Для измерения оптической плотности использовали планшетный спектрофотометр АИФР-01 «Униплан» (фирма «Пикон», Россия).
Для проведения статистического анализа, обработки результатов иссле дования в работе было использовано лицензионное программное обеспечение фирм «Microsoft», «Statsoft», «Cambridgesoft», «Abbyy», «Adobe», «Corel».
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Выделение и очистка спермоплазменного преальбумина Исследование белков спермоплазмы начали с проведения электрофореза в агаровом геле. Окраску электрофореграмм проводили в растворе амидочерно го.
Полученную электрофореграмму конвертировали в цифровой формат с использованием сканера планшетного типа.
Количественная оценка электрофореграмм была выполнена с примене нием специализированной компьютерной программы «ПН 5108 вер. 3.05» (сви детельство об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2003612170 от 17 сентября 2003 года).
На электрофореграмме белков спермоплазмы человека было выявлено наличие достаточно выраженной фракции, имеющей подвижность, превышаю щую электрофоретическую подвижность альбуминов (рисунок 1).
Рисунок 1. Электрофореграмма белков спермоплазмы человека и ее анализ с применением программы «ПН 5108» (Alb – альбумин).
~7~ Для дальнейшего изучения фракции преальбуминов мы использовали препаративный электрофорез в агаровом геле. После накопления достаточного количества материала – агаровые полоски измельчали, размораживали и в даль нейшем использовали для подкожной иммунизации кроликов. Для получения антисыворотки против спермоплазменного преальбумина с достаточным титром антител требовалось не менее 5 реиммунизаций.
Полученная антисыворотка не реагировала с альбумином человека, с трансферрином человека, со скаферрином человека, с простатической кислой фосфатазой человека, с церулоплазмином человека. Частичная иммунохимиче ская идентичность наблюдалась с преальбумином (транстиретином) человека.
Выделение и очистку спермоплазменного преальбумина проводили в четыре этапа (рисунок 2).
Цельный Супернатант эякулят Сперма здоровых фертильных мужчин Центрифугирование, Центрифугирование, 1300 g, 15 мин. 1850 g, 15 мин.
Супернатант Фракции, Ионообменная Гель содержащие хроматография, фильтрация, Осадок преальбумин DEAE-Sepharose Sephadex G- CL-6B, Superfine, колонка колонка Осаждение, 2,5 см 2,5 см (NH4)2SO4, 50% насыщения Аффинная Фракции, Фракции, хроматография, содержащие содержащие heparin преальбумин преальбумин Sepharose Очищенный препарат CL-6B, спермоплазменного колонка преальбумина 3,0 см Рисунок 2. Схема выделения и очистки спермоплазменного преальбумина.
Выделение преальбумина (таблица 1) начинали с фракционирования ~8~ сульфатом аммония при 50% насыщении.
~9~ Таблица 1.
Очистка преальбумина из спермоплазмы человека.
преальбумина, мг Общий белок, мг преальбумин, мл Степень очистки Общий объем, содержащий Количество Стадия очистки Выход, % Спермоплазма 87 5576 267 100 Осаждение 30 3936 258 96,6 1, сульфатом аммония Гель-фильтрация, 300 794 212 79,4 5, Sephadex G-100 Superfine Ионообменная хроматография, 400 455 179 67,0 8, DEAE-Sepharose CL-6B Аффинная хроматография, 10 87 80,5 30,1 19, heparin-Sepharose CL-6B При данных условиях преальбумин выпадал в осадок. После ресуспен дирования осадок подвергали гель-фильтрации на Sephadex G-100 Superfine.
Фракции, содержащие преальбумин, сливали, замораживали и хранили при тем пературе –20°С. После накопления достаточного объема проводили ионообмен ную хроматографию на DEAE-Sepharose CL-6B. Элюцию проводили линейным градиентом от 0 до 1,0 М NaCl.
Фракции, содержащие преальбумин, сливали, замораживали и хранили при –20°С. На завершающей стадии очистки проводили аффинную хроматогра фию на heparin-Sepharose CL-6B.
Для подтверждения чистоты полученного препарата спермоплазменного преальбумина проводили диск-электрофорез. По данным электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом натрия, полученный нами препарат спермоплазменного преальбумина имел молекулярную массу около 43 кДа, изоэлектрическую точку 4,9, что отличается от аналогичных характеристик транстиретина.
Экспериментальное исследование биологических функций спермоплазменного преальбумина Для экспериментального исследования были использованы спермато зоиды здоровых мужчин (n=11) в возрасте от 21 до 27 лет (средний возраст 24,6±1,7 лет) с подтвержденной фертильностью, а также препарат преальбумина выделенный и очищенный нами из спермоплазмы по описанной выше методике.
Схема эксперимента приведена на рисунке 3.
~ 10 ~ Рисунок 3. Схема экспериментального исследования биологических эффектов спермоплазменного преальбумина.
~ 11 ~ При проведении эксперимента достоверных различий между подвижно стью сперматозоидов в контроле-1 и контроле-2 (при любых концентрациях аль бумина в диапазоне от 1 мг/мл до 8 мг/мл) выявлено не было.
В то же время в опытной группе (концентрация преальбумина 8 мг/мл) двигательная активность сперматозоидов оказалась достоверно (р0,01) сни женной по сравнению с контролями. Количество сперматозоидов с поступатель ным движением (категория a+b) в опытной группе было в 2 раза более низким, чем в контрольных группах.
Причем снижение произошло в основном за счет сперматозоидов с бы стрым поступательным движением (категория a) – более чем в 2,3 раза по срав нению с контролями.
Скорость сперматозоидов в опытной группе по сравнению с контроль ными группами была существенно ниже (в среднем на 0,8 мм/мин) (таблица 2).
Таблица 2.
Биологическая активность спермоплазменного преальбумина.
После 30 минут инкубации Двигательные Контроль-2 Опыт Контроль- характеристики (с альбуми- (с преальбу (с жидко сперматозоидов ном, мином, стью Гиние) 8 мг/мл) 8 мг/мл) Поступательное движение 78,0 78,4 39,0* (категория a+b), % Быстрое поступательное 63,0 62,4 27,0* движение (категория a), % Медленное поступательное 12,0# 15,0 16, движение (категория b), % Непоступательное 6,0 3,6 18,0* движение (категория c), % Неподвижные (категория d), % 16,0 18,0 43,0* Скорость, мм/мин 2,2 2,2 1,4* # Примечание: * – различия с контролем 1 и 2 достоверны, р0,01;
– различия с контро лем 1 и 2 не достоверны.
При снижении концентрации преальбумина выраженность двигатель ных нарушений сперматозоидов уменьшалась. При концентрации преальбумина равной 6 мг/мл, различия между опытной группой и контрольными группами становились незначительными, а при концентрации 5 мг/мл различия в двига тельных характеристиках сперматозоидов в опыте и контролях отсутствовали.
Нами была предпринята попытка конкретизировать механизм действия спермоплазменного преальбумина на сперматозоиды. Для этого следующая се ~ 12 ~ рия экспериментов была проведена на демембранизированных сперматозоидах (рисунок 4).
Рисунок 4. Схема экспериментального исследования влияния спермоплазменно го преальбумина на двигательные характеристики демембранизированных спер матозоидов.
~ 13 ~ Для демембранизации использовали выделенные в градиенте перколла сперматозоиды, которые затем обрабатывали демембранизирующей смесью.
Затем контрольные и опытные образцы инкубировали 30 минут при температуре 37°С. Измерение двигательных характеристик сперматозоидов проводили по стандартным общепринятым методам до начала эксперимента и после проведе ния инкубации.
Полученные в ходе проведения эксперимента результаты приведены в таблице 3.
Таблица 3.
Биологическая активность спермоплазменного преальбумина.
После 30 минут инкубации Контроль-1 Контроль-2 Опыт (интактные (демембра- (демембрани Двигательные спермато- низирован- зированные характеристики зоиды и ные сперма- сперматозои сперматозоидов преальбу- тозоиды и ды и преаль мин, альбумин, бумин, 8 мг/мл) 8 мг/мл) 8 мг/мл) Поступательное движение (ка 60,8 # 38,6* 58, тегория a+b), % Быстрое поступательное дви 44 # 26,4* 40, жение (категория a), % Медленное поступательное 16,8 # 12,2* 18, движение (категория b), % Непоступательное 10,2 # 17,4* 8, движение (категория c), % # Неподвижные (категория d), % 44* 29 2,1 # Скорость, мм/мин 1,4* 2, Примечание: * – различия с опытом достоверно, р0,01;
# – различия с опытом не досто верно.
Согласно полученным данным, двигательные характеристики демем бранизированных сперматозоидов под воздействием спермоплазменного пре альбумина (опыт) практически не изменятся (по сравнению с контролем-2).
Вероятно, действие преальбумина, приводящее к снижению подвижно сти сперматозоидов, направлено на изменение свойств мембраны и/или реализу ется за счет взаимодействия с поверхностными рецепторами мембраны сперма тозоидов.
Одной из частых причин нарушения подвижности является повышение ригидности мембран сперматозоидов [Nakagawa K., et al., 2004;
Buffone M. G., et al., 2008].
Общепризнанным способом оценки ригидности мембран сперматозои ~ 14 ~ дов, является HOS-test (тест на гипоосмотическое набухание сперматозоидов) [Руководство ВОЗ, 2001]. Применение этого теста было взято за основу при про ведении следующего эксперимента (рисунок 5).
~ 15 ~ Рисунок 5. Схема экспериментального исследования влияния спермоплазменно го преальбумина на проницаемость мембран сперматозоидов.
~ 16 ~ Набухшие сперматозоиды идентифицировали по типичным морфологи ческим изменениям их хвостов (формы b-g в соответствии с классификацией ВОЗ [Руководство ВОЗ, 2001]). Для получения среднего процента дважды под считывали число набухших клеток на 200 исследованных сперматозоидов.
Полученные результаты представлены в виде гистограммы (рисунок 6).
Как видно из полученных данных, воздействие преальбумина приводит к повы шению ригидности мембран сперматозоидов, что и может объяснять снижение двигательных характеристик сперматозоидов, которые мы наблюдали в преды дущих опытах.
Сперматозоиды с морфологическими изменениями хвоста типа b-g, % Контроль-1 Контроль-2 Опыт Экспериментальные группы Рисунок 6. Результаты теста на гипоосмотическое набухание сперматозоидов (различие между опытом и контролем-1 достоверно, р0,01;
различие между опытом и контролем-2 достоверно, р0,01).
При воспалении наблюдается повреждение клеточных мембран сперма тозоидов в результате активации процесса перекисного окисления липидов [Le big J. et al., 2005;
Kao S.-H. et al., 2008].
Одним из ведущих факторов повреждения мембран сперматозоидов яв ляется пероксид водорода. Представляло интерес оценить эффект воздействия пероксида водорода (в конечной концентрации 0,25% [Kruger T. F. et al., 2009]) на интактные и обработанные преальбумином сперматозоиды (рисунок 7).
После воздействия пероксида водорода в контрольной группе произош ло ожидаемое снижение количества жизнеспособных сперматозоидов (до 12%).
После воздействия пероксида водорода среди сперматозоидов, предва рительно обработанных спермоплазменным преальбумином (опыт), количество жизнеспособных сперматозоидов оказалось более чем в 2,5 раза больше (33%), чем в контроле (рисунок 8).
~ 17 ~ сперматозоиды жидкость Гиние Сперма здоровых фертильных мужчин Центрифугирование в градиенте перколла 5 мкл ОПЫТ КОНТРОЛЬ 15 мкл 15 мкл Жидкость Гиние Жидкость Гиние 5 мкл 5 мкл Альбумин Преальбумин 37 С 00:30: Раствор пероксида водорода Анализ жизнеспособности Инкубация, 30 мин., 37 С сперматозоидов Повреждение мембран сперматозоидов 37 С 00:05: Анализ жизнеспособности Инкубация, 5 мин., 37 С сперматозоидов Рисунок 7. Схема экспериментального исследования влияния пероксида водо рода на сперматозоиды ингибированные спермоплазменным преальбумином.
То есть, спермоплазменный преальбумин, вероятно, является протекто ром клеточной мембраны сперматозоидов в условиях воздействия пероксида водорода.
~ 18 ~ Рисунок 8. Результаты оценки жизнеспособности сперматозоидов по методу Блома (до воздействия пероксида водорода различие между контролем и опытом не достоверно;
после воздействия пероксида водорода различие между контро лем и опытом достоверно, р0,01).
Определение преальбумина, альбумина, С-реактивного белка и 2-макроглобулина в спермоплазме здоровых фертильных мужчин Нами были обследованы эякуляты 42 здоровых мужчин от 19 лет до лет (средний возраст 27,0±3,5 лет) с подтвержденной фертильностью. У всех мужчин при исследовании эякулята по протоколу ВОЗ [Nieschlag E. et al., 2010], заключение по спермограмме было – «нормозооспермия».
Далее нами было проведено исследование концентрации преальбумина (для количественного определения спермоплазменного преальбумина нами ис пользовался метод радиальной иммунодиффузии по Манчини) и некоторых дру гих белков спермоплазмы, а именно альбумина, С-реактивного белка и 2 макроглобулина.
По нашим данным в спермоплазме здоровых фертильных мужчин уро вень общего белка составлял от 54,40 г/л до 69,00 г/л, что сопоставимо с уровнем белков в сыворотке крови. Средние значения концентраций определенных нами в спермоплазме белков сгруппированы в таблице 4.
Таблица 4.
Концентрация преальбумина и некоторых белков в спермоплазме здоровых фер тильных мужчин (n=42).
2 С Характери- Общий Преаль- Альбу- Реактив- Макро стики белок, г/л бумин, г/л мин, г/л ный бе- глобулин, лок, мг/л мг/л Средняя 64,13 3,08 14,72 1,73 9, концентрация ±3,42 ±0,63 ±1,01 ±0,52 ±0, ~ 19 ~ Исследование эякулятов мужчин с воспалительными заболеваниями предстательной железы и органов мошонки Всего нами были обследованы 179 мужчин с воспалительными заболе ваниями предстательной железы и органов мошонки в возрасте от 21 года до лет (средний возраст 28,5±3,8 лет).
В группе с верифицированным диагнозом хронический простатит (код по МКБ-10: N41.1) было обследовано 133 мужчины в возрасте от 20 лет до лет (средний возраст 28,0±3,8 лет). У всех пациентов было проведено определе ние в спермоплазме концентрации преальбумина, а также альбумина, С реактивного белка, 2-макроглобулина и общего белка.
У всех пациентов проводилось исследование эякулята – спермограмма.
По результатам спермограммы и с учетом анамнестических данных мужчины были подразделены на две основные группы: фертильные с нормозоосперией и субфертильные с патозооспермией. В группе фертильных мужчин с нормозоос пермией было 25 пациентов в возрасте от 21 года до 42 лет (средний возраст 28,8±4,7 лет). Группа субфертильных мужчин с патозооспермией включала пациентов в возрасте от 20 лет до 46 лет (средний возраст 27,9±3,5 лет). В свою очередь в группе субфертильных мужчин были выделены четыре подгруппы в зависимости от типа патозооспермии: 1) олигозооспермия (n=34), 2) астенозоос пермия (n=24), 3) тератозооспермия (n=13), 4) олигоастенотератозооспермия (n=37).
Средние значения концентраций исследуемых белков в образцах спер моплазмы фертильных и субфертильных больных хроническим простатитом представлены в таблице 5. Как видно из полученных данных, тип патозооспер мии существенно не влияет на уровень общего белка, а также на уровни альбу мина, С-реактивного белка и 2-макроглобулина. Из особенностей можно отме тить только достоверное повышение в спермоплазме уровня преальбумина при астенозооспермии (таблица 5).
В группе с верифицированным диагнозом орхит, эпидидимит и эпиди димо-орхит (код по МКБ-10: N45.9) было обследовано 46 мужчин в возрасте от 21 года до 41 года (средний возраст 29,7±3,5 лет).
У всех пациентов с воспалительными заболеваниями органов мошонки было проведено исследование эякулята. С учетом результатов спермограммы и анамнестических данных мужчины были разделены на две основные группы:
фертильные с нормозооспермией и субфертильные с патозооспермией. Группу фертильных мужчин с нормозооспермией составили 9 пациентов в возрасте от 23 лет до 36 лет (средний возраст 29,2±2,2 лет). Группа субфертильных пациен тов с патозооспермией включала 37 мужчин в возрасте от 21 года до 41 года (средний возраст 29,1±3,8 лет). Все они были разделены на четыре подгруппы в соответствии с типом патозооспермии: 1) олигозооспермия (n=11), 2) астенозо оспермия (n=7), 3) тератозооспермия (n=6), 4) олигоастенотератозооспермия (n=13).
~ 20 ~ Таблица 5.
Концентрация преальбумина и некоторых белков в спермоплазме фертильных и субфертильных мужчин, страдающих хроническим простатитом.
2 С Общий Преаль- Аль Заключение Реактив- Макро белок, бумин, бумин, ный бе- глобулин, по спермограмме г/л г/л г/л лок, мг/л мг/л 61,48# 3,83# 12,02# Нормозооспермия 12,38* 5,45* (n=25) ±7,02 ±0,89 ±1,70 ±4,18 ±0, 60,15# 4,61# 12,02# Олигозооспермия 14,62* 4,20* (n=34) ±5,78 ±0,72 ±1,51 ±3,93 ±0, 60,21# 12,20# Астенозооспермия 7,22* 14,41* 4,68* (n=24) ±7,07 ±0,73 ±1,86 ±1,86 ±0, 61,54# 4,18# 12,13# Тератозооспермия 15,0* 4,02* (n=13) ±5,42 ±0,95 ±1,74 ±3,05 ±1, 59,84# 12,05# Олигоастенотерато- 5,88* 16,6* 3,40* зооспермия (n=37) ±5,94 ±0,65 ±2,03 ±4,0 ±0, Примечание: * – различие с группой здоровых фертильных мужчин достоверно, р0,01;
# – различие с группой здоровых фертильных мужчин не достоверно.
Тип патозооспермии не оказывал существенного влияния на уровень общего белка, а также на уровни альбумина и С-реактивного белка. Следует от метить некоторое повышение в спермоплазме уровня преальбумина при нару шении подвижности сперматозоидов, а также снижение (почти в 2 раза) уровня 2-макроглобулина (таблица 6).
Таблица 6.
Концентрация преальбумина и некоторых белков в спермоплазме фертильных и субфертильных мужчин с воспалительными заболеваниями органов мошонки.
2 С Общий Преаль- Аль Заключение Реактив- Макро белок, бумин, бумин, ный бе- глобулин, по спермограмме г/л г/л г/л лок, мг/л мг/л 62,11# 4,06# 12,5# Нормозооспермия 15,0* 3,27* (n=9) ±4,54 ±0,81 ±2,51 ±4,2 ±0, 60,91# 12,32# Олигозооспермия 5,22* 15,55* 2,63* (n=11) ±7,01 ±1,14 ±1,76 ±6,14 ±0, 62,43# 13,27# Астенозооспермия 7,91* 21,66* 2,51* (n=7) ±4,82 ±1,15 ±1,82 ±7,11 ±0, 62,17# 13,65# Тератозооспермия 5,07* 16,66* 2,65* (n=6) ±6,11 ±0,72 ±1,53 ±3,74 ±0, 63,54# 13,22# Олигоастенотерато- 7,02* 17,85* 2,05* зооспермия (n=13) ±6,56 ±1,19 ±2,18 ±4,55 ±0, Примечание: * – различие с группой здоровых фертильных мужчин достоверно, р0,01;
# – различие с группой здоровых фертильных мужчин не достоверно.
~ 21 ~ Биохимический способ топической диагностики воспалительных заболеваний при лейкоспермии При лейкоспермии, то есть при концентрации лейкоцитов, превышаю щей один миллион в одном миллилитре эякулята, в ряде случаев, трудно провес ти топическую диагностику воспалительного процесса ex tempore [Fedder J., 2004;
Sikka S. C. et al., 2008]. Особенно при достаточно распространенных мало симптомных или бессимптомных формах течения заболеваний [Дмитриев Г. А. и др., 2007;
Toth A., 2004;
Nieschlag E. et al., 2010]. В таких случаях экспресс диаг ностика, основанная на исследовании биохимического состава спермоплазмы, оказывается весьма актуальной.
Первичный анализ полученных данных позволил выделить два белка, а именно преальбумин и 2-макроглобулин, являющихся наиболее перспективны ми для топической диагностики при лейкоспермии. С учетом этого нами был предложен способ диагностики, основанный на одновременном определении в спермоплазме концентрации преальбумина и 2-макроглобулина с расчетом со отношения между ними по следующей формуле:
где КТД – коэффициент топической диагностики, преАЛБ – концентрация преальбумина в спермоплазме в мг/л, 2МГ – концентрация 2-макроглобулина в спермоплазме в мг/л.
Расширенный анализ способа топической диагностики воспалительных заболеваний при лейкоспермии основанный на определении коэффициента то пической диагностики (КТД), показал, что оптимальные пороговые значения коэффициента топической диагностики равны 500 и 2500. То есть при воспали тельных заболеваниях предстательной железы КТД принимает значения от до 2500, а при воспалительных заболеваниях органов мошонки значение КТД превышает 2500.
При данных пороговых значениях специфичность способа составила 87,5%, чувствительность – 90,7%, эффективность – 90,0%, прогностическое зна чение положительного результата – 96,3%, прогностическое значение отрица тельного результата – 72,4%.
Биохимический способ диагностики воспалительных заболеваний мужской репродуктивной системы при нормальном уровне лейкоцитов в эякуляте Наличие воспалительных заболеваний мужской репродуктивной систе мы при исследовании спермы устанавливают, как правило, по концентрации лейкоцитов превышающей 106 в 1 мл [Keck C. et al., 2005;
Villarroel V. et al., 2008]. Но в ряде случаев воспалительный процесс протекает без повышения концентрации лейкоцитов в сперме [Nieschlag E. et al., 2010]. Для лабораторной диагностики воспалительных заболеваний мужской репродуктивной системы, на наш взгляд, представляют большой интерес способы диагностики воспалитель ного процесса не зависящие от уровня лейкоцитов, но обладающие достаточной ~ 22 ~ специфичностью.
Первичный анализ полученных данных позволил выделить два белка спермоплазмы, а именно преальбумин и С-реактивный белок, являющихся наи более перспективными для диагностики воспалительных заболеваний мужской репродуктивной системы.
На основании полученных данных нами был разработан способ диагно стики основанный на одновременном определении в спермоплазме концентра ции преальбумина и С-реактивного белка. При конструировании способа диаг ностики оказалось, что удобнее использовать ранжированные значения, а не аб солютную концентрацию С-реактивного белка в спермоплазме.
С учетом проведенного ранжирования формула для выявления воспале ния органов мужской репродуктивной системы на основе биохимического ис следования спермоплазмы приобрела следующий вид:
где КДВ – коэффициент диагностики воспаления, преАЛБ – абсолютное значение концентрации преальбумина в спермо плазме в мг/л, СРБ – значение ранга концентрации С-реактивного белка в спермоплаз ме.
Расширенный анализ способа топической диагностики воспалительных заболеваний при лейкоспермии основанный на определении коэффициента ди агностики воспаления (КДВ), показал, что оптимальное пороговое значение ко эффициента диагностики воспаления равно 4500. То есть значение КДВ равное или превышающее 4500, свидетельствует о наличие воспалительного процесса в органах мужской репродуктивной системы.
При выбранном пороговом значении специфичность способа составляет 97,6%, чувствительность – 92,1%, эффективность – 93,2%, прогностическое зна чение положительного результата – 99,3%, прогностическое значение отрица тельного результата – 74,5%.
Мы хотели бы подчеркнуть, что предлагаемый биохимический способ диагностики позволяет выявить воспаление органов мужской репродуктивной системы даже при нормальном уровне лейкоцитов в сперме, что значительно расширяет возможности своевременной постановки точного диагноза.
Биохимический способ прогноза развития астенозооспермии при воспалительных заболеваниях органов мужской репродуктивной системы Нами было выявлено, что уровень преальбумина, как правило, выше в эякулятах с нарушением двигательных характеристик сперматозоидов. Для под тверждения взаимосвязи между уровнем преальбумина в спермоплазме и двига тельными характеристиками сперматозоидов (содержание сперматозоидов с ак тивной подвижностью (категории a+b), содержание неподвижных сперматозои дов (категория d), скорость сперматозоидов (мм/мин)) было выполнено исследо вание и корреляционный анализ 34 образцов эякулятов мужчин с воспалитель ными заболеваниями органов репродуктивной системы.
~ 23 ~ Полученные нами данные корреляционного анализа представлены в таблице 7.
Таблица 7.
Коэффициенты линейной корреляции двигательных характеристик спермато зоидов и уровня преальбумина в спермоплазме.
Двигательные характеристики Коэффициент Уровень сперматозоидов коррелирующие линейной значимости с уровнем преальбумина корреляции Сперматозоиды с активной r=0,757 p0, подвижностью (категории a+b) Неподвижные сперматозоиды r=0,683 p0, (категория d), Скорость сперматозоидов r=0,646 p0, Проведенный корреляционный анализ позволил установить достовер ную взаимосвязь между уровнем преальбумина в спермоплазме и подвижностью сперматозоидов.
Для разработки биохимического способа прогноза развития астенозоос пермии при воспалительных заболеваниях органов мужской репродуктивной системы нами был проведен дальнейший анализ, который позволил установить, что уровень преальбумина в спермоплазме отрицательно коррелирует с возрас том (коэффициент корреляции r=0,409, уровень значимости p0,01), что необ ходимо было учитывать.
Анализ полученных данных позволил сконструировать формулу для прогнозирования развития астенозооспермии при воспалительных заболеваниях мужской репродуктивной системы, где учитывалась поправка на возраст паци ента, а влияние других факторов частично нивелировалось за счет введения от ношения к уровню белка (альбумина), имеющего достаточно стабильный уро вень в спермоплазме вне зависимости от характера патологии.
В окончательном варианте формула для прогнозирования развития ас тенозооспермии при воспалительных заболеваниях органов мужской репродук тивной системы имела следующий вид:
где ПКА – прогностический коэффициент развития астенозооспермии, преАЛБ – абсолютное значение концентрации преальбумина в спермо плазме в г/л, ВП – возраст пациента (полных лет), АЛБ – абсолютное значение концентрации альбумина в спермоплазме в г/л.
Расширенный анализ предлагаемого способа прогноза развития астено зооспермии показал, что оптимальное пороговое значение прогностического ~ 24 ~ коэффициента равно 0,49. То есть значение ПКА равное или превышающее 0,49, свидетельствует о высоком риске развития астенозооспермии при воспалитель ных заболеваниях органов мужской репродуктивной системы.
Нами были обследованы пациенты с воспалительными заболеваниями предстательной железы и/или органов мошонки. Из них был отобран 31 пациент в возрасте от 21 года до 42 лет (средний возраст 29,1±4,1 лет) с нормозооспер мией. У этой группы пациентов кроме стандартной спермограммы было прове дено определение в спермоплазме преальбумина и альбумина, а затем рассчитан прогностический коэффициент астенозооспермии (ПКА). На основании значе ния ПКА превышающего 0,49 у 7 пациентов был сделан прогноз высокого риска развития нарушений двигательных характеристик сперматозоидов.
Повторно характеристики спермограммы у пациентов оценивали через год. Наличие нарушения двигательных характеристик сперматозоидов у пациен тов с ПКА, превышающий пороговое значение (0,49), расценивали как истинно положительный результат. Отсутствие признаков астенозооспермии у пациентов с ПКА, превышающий пороговое значение (0,49), расценивали как ложно поло жительный результат. Сохранение нормозооспермии у пациентов с ПКА, не превышающий пороговое значение (0,49), расценивали как истинно отрицатель ный результат. Развитие астенозооспермии у пациентов, имеющих ПКА ниже порогового значения (0,49), относили к ложно отрицательным результатам. По лученные данные приведены в таблице 8.
Таблица 8.
Результаты проверки эффективности биохимического способа прогноза разви тия астенозооспермии на основании проведения спермограммы через один год.
Интерпретация полученных Количество полученных результатов проверки результатов Истинно положительный результат Ложно положительный результат Истинно отрицательный результат Ложно отрицательный результат Таким образом, при пороговом значении КДВ равном 4,9, предлагаемый биохимический способ прогноза развития астенозооспермии имеет достаточно высокие характеристики (специфичность – 95,6%, чувствительность – 75,0%, эффективность – 90,3%, прогностическое значение положительного результата – 85,7%, прогностическое значение отрицательного результата – 91,6%), что по зволяет рекомендовать его при формировании групп риска развития нарушения двигательных характеристик сперматозоидов при воспалительных заболеваниях органов мужской репродуктивной системы.
~ 25 ~ ВЫВОДЫ Спермоплазменный преальбумин имеет молекулярную массу 43 кДа, изо 1.
электрическую точку 4,9, выявляется в спермоплазме здоровых фертиль ных мужчин в 100% случаев и имеет среднюю концентрацию 3,08±0, г/л (от 1,10 г/л до 4,50 г/л).
С-реактивный белок выявляется менее чем в 20 % образцов спермоплаз 2.
мы здоровых фертильных мужчин (максимальная концентрация 3, мг/л), но более чем в 75 % образцов спермоплазмы больных хроническим простатитом (максимальная концентрация 60,10 мг/л).
Уровень 2-макроглобулина в спермоплазме у мужчин с воспалительны 3.
ми заболеваниями органов мошонки в среднем в 2 раза ниже, чем у здо ровых фертильных мужчин.
Спермоплазменный преальбумин в 2,5 раза повышает выживаемость 4.
сперматозоидов в условиях воздействия на них пероксида водорода.
Уровень преальбумина в спермоплазме является маркером воспаления 5.
органов репродуктивной системы, причем более чувствительным и спе цифичным, чем уровень лейкоцитов в эякуляте. При воспалении органов мошонки уровень преальбумина в спермоплазме в среднем выше, чем при воспалении предстательной железы.
Практические рекомендации Определение в спермоплазме преальбумина и 2-макроглобулина позво 1.
ляет при их соотношении от 500 до 2500 диагностировать хронический простатит, а при их соотношении 2500 и выше диагностировать воспали тельные заболевания органов мошонки.
Определение в спермоплазме преальбумина и С-реактивного белка позво 2.
ляет при значении произведения концентрации преальбумина и ранга С реактивного белка равном или превышающем 4500 диагностировать вос паление органов мужской репродуктивной системы даже при пороговом или нормальном уровне лейкоцитов в сперме.
Определение при воспалительных заболеваниях органов мужской репро 3.
дуктивной системы в спермоплазме преальбумина и альбумина позволяет при значении отношения (произведения концентрации преальбумина на десятичный логарифм возраста пациента) к концентрации альбумина рав ном или превышающем 0,49 прогнозировать развитие астенозооспермии.
~ 26 ~ Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1) Николаев А. А., Луцкий Д. Л., Ложкина Л. В., Луцкая А. М. Уровень ингиби тора тиоловых протеиназ при различных формах субфертильности у мужчин.
// Труды АГМА Т.24(XLVIII). – Астрахань, 2002. – С. 74–76.
2) Гайнуллина Л. Х., Луцкая А. М., Ефимова А. В., Луцкий Д. Л. Комплексное исследование эякулята при бесплодии у собак. // Труды АГМА Т.28(LII). – Астрахань, 2003. – С. 150–152.
3) Луцкий Д. Л., Николаев А. А., Луцкая А. М. Уровень спермоплазменного ингибитора тиоловых протеиназ при субфертильности у мужчин. // Мат. IV междунар. науч.-практич. конф. «Здоровье и Образование XXI Век». – Моск ва, 2003. – С. 414–415.
4) Выборнов С. В., Луцкая А. М., Зульбалаева Д. Ф., Николаев А. А., Луцкий Д.
Л. Нарушение гликозилирования лактоферрина при урогенитальных мико плазмозах. // Фундаментальные исследования. – 2004. – № 2. – С. 173–174.
5) Луцкий Д. Л., Николаев А. А., Луцкая А. М., Выборнов С. В. Особенности протеома спермы при хроническом урогенитальном трихомонозе. // Фунда ментальные исследования. – 2004. – № 2. – С. 174–175.
6) Луцкая А. М., Николаев А. А., Ефимов Т. В., Луцкий Д. Л., Плосконос М. В.
Использование программы для ЭВМ «ПН 5108» при количественной оценке электрофореза белков. // Мат. VII междунар. конф. «Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря». – Астрахань, 2004. – С. 63–65.
7) Николаев А. А., Луцкий Д. Л., Николаев А. А., Луцкая А. М. Патохимические основы нарушения вязкости эякулята. // Клиническая лабораторная диаг ностика. – 2004. – № 9. – С. 86–87.
8) Луцкая А. М., Николаев А. А., Луцкий Д. Л. Метод оценки межмолекуляр ных взаимодействий в системе «белок-ксенобиотик». // Мат. V междунар. на уч.-практич. конф. «Здоровье и Образование XXI Век». – Москва, 2004. – С.
272–273.
9) Луцкая А. М., Николаев А. А., Луцкий Д. Л. Количественная оценка межмо лекулярных взаимодействий в системе «белок-антибиотик». // Мат. VIII меж дунар. конф. «Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского мо ря». – Астрахань, 2005. – С. 186–187.
10) Луцкий Д. Л., Тюрина А. А., Луцкая А. М., Николаев А. А., Гончарова Л. А.
Региональные особенности этиологических факторов заболеваний, передаю щихся половым путем в Нижнем Поволжье. // Мат. VI междунар. науч. практич. конф. «Здоровье и Образование XXI Век». – Москва, 2005. – С. 478– 479.
11) Николаев А. А., Луцкая А. М., Луцкий Д. Л., Думченко В. В. Иммунохимиче ская идентификация ингибина-В спермоплазмы человека. // Фундаменталь ные исследования. – 2005. – № 2. – С. 29–30.
12) Луцкий Д. Л., Николаев А. А., Луцкая А. М. Морфологические изменения сперматозоидов при трихомониазе. // Успехи современного естествознания. – 2005. – № 12. – С.83–84.
~ 27 ~ 13) Луцкая А. М., Луцкий Д. Л., Николаев А. А. Определение сывороточного преальбумина и орозомукоида при острых аднекситах. // Современные нау коемкие технологии. – 2006. – № 7. – С. 55–56.
14) Луцкая А. М., Осипова М. У., Луцкий Д. Л. Методы исследования транс портной функции белков. // Мат. VII междунар. науч.-практич. конф. «Здоро вье и Образование XXI Век». – Москва, 2006. – С. 309–310.
15) Луцкий Д. Л., Зульбалаева Д. Ф., Луцкая А. М. Динамика уровня лактофер рина во влагалищной жидкости. // Клиническая лабораторная диагности ка. – 2008. – № 9. – С. 64–65.
16) Луцкий Д. Л., Выборнов С. В., Луцкая А. М., Гончарова Л. А., Махмудов Р.
М. Влияние химических факторов на состояние мужской репродуктивной системы. Часть I. Металлы. // Проблемы репродукции. – 2009. – Т. 15, № 6.
– С. 48–54.
17) Луцкий Д. Л., Выборнов С. В., Луцкая А. М., Гончарова Л. А., Махмудов Р.
М. Влияние химических факторов на состояние мужской репродуктивной системы. Часть II. Органические растворители и пестициды. // Проблемы репродукции. – 2009. – Т. 15, № 6. – С. 54–59.
18) Луцкий Д. Л., Выборнов С. В., Луцкая А. М., Гончарова Л. А., Махмудов Р.
М. Влияние химических факторов на состояние мужской репродуктивной системы. Часть III. Токсиканты в сперме. Экологические и промышленные полютанты в спермоплазме. // Проблемы репродукции. – 2009. – Т. 15, № 6.
– С. 59–64.
19) Луцкий Д. Л., Махмудов Р. М., Луцкая А. М. Исследование эякулята и его компонентов в диагностике воспалительных заболеваний мужской репродук тивной системы. // Проблемы репродукции. – 2011. – Т. 17, № 1. – С. 83–87.
20) Луцкий Д. Л., Махмудов Р. М., Луцкая А. М. Исследование эякулята и его компонентов в диагностике воспалительных заболеваний мужской репродук тивной системы: белки, антиспермальные антитела. // Проблемы репродук ции. – 2011. – Т. 17, № 2. – С. 84–88.
21) Луцкий Д. Л., Махмудов Р. М., Луцкая А. М. Исследование эякулята и его компонентов в диагностике воспалительных заболеваний мужской репродук тивной системы: ферменты, простасомы. // Проблемы репродукции. – 2011.
– Т. 17, № 3. – С. 82–84.
22) Луцкий Д. Л., Махмудов Р. М., Луцкая А. М. Исследование эякулята и его компонентов в диагностике воспалительных заболеваний мужской репродук тивной системы: клеточный состав, патогены. // Проблемы репродукции. – 2011. – Т. 17, № 5. – С. 77–82.
~ 28 ~ Биохимическое исследование пральбумина спермоплазмы при заболеваниях репродуктивной системы мужчин Луцкая Аделя Мукминовна (Россия) В данной работе было проведено изучение преальбумина спермоплазмы человека. Было экспериментально исследовано влияние спермоплазменного пре альбумина на двигательные характеристики демембранизированных человече ских сперматозоидов. Было установлено, что спермоплазменный преальбумин может повышать жизнеспособность сперматозоидов. Проведено исследование уровня спермоплазменного преальбумина при воспалительных заболеваниях предстательной железы и органов мошонки. Было установлено, что риск разви тия астенозооспермии был высокий при хронических воспалительных заболева ниях органов репродуктивной системы мужчин, протекающих с повышенным уровнем преальбумина в спермоплазме. В работе предложен способ топической диагностики воспалительных заболеваний органов мужской репродуктивной системы, основанный на определении в спермоплазме преальбумина и 2 макроглобулина.
Biochemical studies seminal plasma prealbumin at diseases of reproductive system of men Adelya Lutskay (Russia) The study of prealbumin of human seminal plasma was executed in this work.
Influences of prealbumin of seminal plasma were experimentally investigated on mo tility demembranated human spermatozoa. It was set that prealbumin of seminal plas ma can increase viability of spermatozoa. Research of level of prealbumin of seminal plasma was conducted at the inflammatory diseases of prostate and organs of scrotum.
It was found that the risk of asthenozoospermia was higher in chronic inflammatory diseases of the male reproductive system that occur with increased levels of prealbu min in the seminal plasma. In this work proposed a method of topical diagnosis of inflammatory diseases of the male reproductive system based on the definition in the seminal plasma prealbumin and 2-macroglobulin.
~ 29 ~ ЛУЦКАЯ АДЕЛЯ МУКМИНОВНА БИОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕАЛЬБУМИНА СПЕРМОПЛАЗМЫ ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ МУЖЧИН АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Подписано в печать 10.09. 2012 г. Тираж 100 экз. Заказ № 3293.
Издательство ГБОУ ВПО АГМА Минздравсоцразвития России 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121.