Влияние пептида глицил-пролина на секреторную функцию желудка при иммобилизационном стрессе
На правах рукописи
ТОМОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА ГЛИЦИЛ-ПРОЛИНА НА СЕКРЕТОРНУЮ ФУНКЦИЮ ЖЕЛУДКА ПРИ ИММОБИЛИЗАЦИОННОМ СТРЕССЕ 03.00.13 – физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Томск – 2006
Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Томского государственного университета
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Гриднева Вера Ивановна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Васильев Владимир Николаевич кандидат биологических наук, с.н.с. Ласукова Татьяна Викторовна Ведущая организация ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН
Защита состоится 30 марта 2006 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 212.267.10 при Томском государственном университете (634050, г. Томск, Ленина, 36).
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Томского государ ственного университета (634050, г. Томск, пр. Ленина, 34).
Автореферат разослан «28» февраля 2006 г.
Учёный секретарь диссертационного совета _/ Е.Ю. Просекина / Актуальность проблемы. Изменения моторной и секреторной функций желудочно-кишечного тракта, по современным представлениям, являются обя зательным компонентом реакции организма на стрессорное воздействие (Гуска Н.И., 1990;
Перцов С.С., 1995;
Пшенникова М.Г., 1999;
Фурдуй Ф.И., 1990;
Martinez-Augustin O., Sanches de Medina F.Jr., Sanches de Medina F., 2000). Ещё Г. Селье избрал эту систему одним из индикаторов стресса, а желудок – одним из его главных органов–мишеней. Стрессорные реакции желудка являются не обходимым условием приспособления организма к изменениям в окружающей среде (Селье Г., 1960).
В настоящее время известно, что в формировании компенсаторно приспособительных реакций со стороны желудочно-кишечного тракта в ответ на стресс и нарушение гомеостаза участвуют такие регуляторные пептиды, как энкефалины, эндорфины, серотонин, дофамин, АКТГ (Георгадзе А.К. и др., 1990;
Жукова Т.В. и др., 1994;
Зверков И.В. и др., 1987;
Корякина Л.А., Серова Л.И., 1989;
Павлова В.И., 1990;
Просекина Е.Ю., 2001;
Тимошин С.С., и др., 1990;
Циммерман Я.С., Ведерников В.Е., 1998;
Beaulieu S., Paolo T., Barden N., 1985;
Mehta C.S., Strada S.J., 1994;
Nigel W. Bunnett, 2005). Активное изучение регуляторных пептидов привело к радикальному переосмыслению механизмов регуляции гомеостаза (Хавинсон В.Х., Малинин В.В., 2002). Выяснилось, что во многих случаях воздействие на физиологические процессы оказывают не це лые молекулы, а их небольшие фрагменты – олигопептиды (Морозов В.Г. и др., 2000;
Хавинсон В.Х., Малинин В.В., 2002). В этом аспекте большой интерес представляют малоизученные пептиды, которые были выявлены сравнительно недавно - глипролины (Ашмарин И.П. и др., 1998, 2002;
Бакаева З.В. и др., 2004). К настоящему моменту, к семейству глипролинов относят Pro-Gly (PG), Gly-Pro (GP), Pro-Gly-Pro (PGP), Gly-Pro-Gly-Gly (GPGG) и некоторые другие пептиды (Ашмарин И.П. и др., 1998, 2002). Пролинсодержащие пептиды обла дают уникальным спектром физиологической активности: влияют на анальге тические реакции (Абрамова М.А. и др.,1997;
Ray A.K., Dey P.K., 1982), изме няют удельную активность ферментов утилизации нейромедиаторов (Доведова Е.Л. и др., 1998), модулируют активность самих медиаторов (Бабская Н.Е., Ашмарин И.П., 1998), усиливают лимфоток брыжейки крыс, препятствуют раз витию стрессогенных нарушений микроциркуляции русла брыжейки крыс (Жуйкова С.Е., 2003;
Смирнова Е.А., 2004), изменяют поведение крыс, вызван ное воздействием стресса (Копылова Г.Н. и др., 2004). PGP, PG, GP обладают эффективным протекторным и лечебным противоязвенным действием (Абра мова М.А. и др., 1996;
Ашмарин И.П. и др., 2002;
Бакаева З.В., Самонина Г.Е., 2005;
Samonina G. et al., 2000).
Анализ литературы показал малочисленность и неоднозначность имею щихся данных о протекторном действии пролинсодержащих пептидов на сли зистую оболочку желудка. Отсутствует информация о влиянии глипролинов на комплекс показателей желудочной секреции в условиях стимуляции деятельно сти желудка при стрессе. Крайне малочисленна информация об участии про линсодержащих пептидов в защитных реакциях желудка. Отсутствуют данные о регуляции этими пептидами секреции слизи. Вплоть до настоящего времени не до конца изучены механизмы действия глипролинов и многие вопросы ос таются открытыми. Не рассматривались особенности влияния дипептидных де риватов, которые образуются при гидролизе PGP и GPGG под действием про лилпептидаз, на секреторную активность желудка. Не изучался вопрос о воз можности глипролинов модулировать эффекты парасимпатической и сипмати ческой нервных систем. Поэтому выше сказанное объясняет интерес данной научной работы к изучению действия пролинсодержащих пептидов на секре торную функцию желудка, стимулированную карбахолином, в условиях иммо билизационного стресса (ИС).
Цель исследования: изучить влияние дипептида GP на секреторную ак тивность желудка при ИС.
Для достижения цели последовательно решались следующие задачи:
1. Оценить особенности действия пролинсодержащих пептидов PGP и GP на секреторную активность желудка крыс и собак на фоне действия карбахоли на.
2. Изучить влияние временного интервала между введением физиологиче ского раствора и карбахолина на секрецию желудка крыс после ИС.
3. Исследовать особенности влияния ИС на желудочную секрецию собак с исходно различными уровнями секреторной активности желудка.
4. Изучить особенности действия пептидов PGP, GP на секреторную актив ность желудка при иммобилизации и определить их зависимость от реакции желудка на стрессорное воздействие и режима дозирования пептида.
Научная новизна и практическая значимость. В работе впервые прове дён анализ действия пролинсодержащих пептидов (PGP, GP) на секреторную активность желудка, стимулированную карбахолином с использованием моде ли ИС. Показано, что характер ответа сочетанного действия пептидов PGP и GP с карбахолином и антистрессорная активность этих глипролинов в отношении слизистой оболочки желудка (СОЖ) определялись: 1) структурной формой глипролинов, 2) интервалом времени между введением стимулятора и пептида, 3) исходным уровнем секреторной активности желудка, 4) моментом введения пептида относительно действия ИС. Впервые установлено, что временной ин тервал между введением физиологического раствора и карбахолина после ИС приводит к разным проявлениям стресс–реакции у крыс со стороны секреции желудка. Кроме того, отличия в реакции на стресс были зарегистрированы у собак с различными исходными уровнями желудочной секреции. Впервые об наружены способности пептидов PGP и GP изменять концентрацию кортико стероидов в крови животных, что может являться одним из возможных меха низмов обеспечения глипролинами адаптивных реакций со стороны желудка в ответ на действие стресса. Данная работа вносит вклад в развитие представле ний о механизмах пептидергической регуляции секреторной функции желудка в физиологических условиях и при действии стресса. Результаты работы рас крывают и расширяют представление о роли системы пептидных регуляторов в механизмах адаптации СОЖ к стрессорному воздействию и располагают к по иску лекарственных средств на основе данных пептидов. Основные положения работы могут быть использованы в качестве теоретической основы для при кладных исследований в научно – практических учреждениях, занимающихся проблемами профилактики и коррекции функционального состояния организма при воздействии на него длительной иммобилизации.
Результаты исследований используются в теоретических курсах «Трофо логия», «Эндокринология», «Основы межклеточной и внутриклеточной сигна лизации», «Регуляторные пептиды», «Физиология человека и животных», чи таемых на кафедре физиологии человека и животных Томского госуниверсите та.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Пролинсодержащие пептиды могут модулировать холинергические влияния на желудочную секрецию в нормальных физиологических условиях и в условиях ИС.
2. Дипептид GP – структурный компонент PGP, обладает самостоятельной физиологической активностью в отношении желудочной секреции по сравне нию со своим предшественником. Его эффект зависит от временного интервала между инъекциями дипептида и карбахолина, исходного уровня секреции же лудка, направленности изменения секреции желудка под действием стресса и режима дозирования пептида.
Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались на научных съёздах и конференциях: «Физиология организмов в нормальном и экстремальном состояниях» (Томск, 2001), IV съезд Физиологов Сибири (Ново сибирск, 2002), «Старт в науку» (Томск, 2002), «Биолого-почвенный факультет:
прошлое, настоящее и будущее» (Томск, 2003), XIX съезд физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004), V Сибирский физиологиче ский съезд (Томск, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из кото рых 5 работ в рецензируемых журналах.
Объём и структура работы. Диссертация изложена на 159 страницах ма шинописного текста и состоит из списка сокращений, введения, обзора литера туры, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 253 отечественных и 83 зарубежных источников. Работа иллюст рирована 17 рисунками и 16 таблицами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Острый эксперимент был выполнен на 80 крысах – самцах, линии Вис тар, массой 180 – 240 г, выращенные в питомнике “Рассвет” объединения “Вирион”. Для сбора желудочного сока всех животных подвергали операции по наложению лигатур на пилорический отдел желудка. За 24 часа до начала опе рации животных лишали пищи. Операцию проводили под кратковременным эфирным наркозом, и после завершения через 90 минут крысам вводили пепти ды и стимулятор желудочной секреции. По окончании времени секреции, крыс декапитировали, извлекали желудок и содержимое подвергали анализу. Хро нический эксперимент был выполнен на 7 беспородных собак – самцах, мас сой 16 – 22 кг, оперированных под нембуталовым наркозом с образованием фистулы желудка по Басову (Лопухин Ю.М., 1971). Эксперимент начинали че рез 30 дней после операции. Стимуляцию желудочного сокоотделения осу ществляли внутримышечным введением карбахолина (“Reanal”, Венгрия), за пускающего процесс желудочно-кишечной секреции, крысам в дозе 25 мкг/кг, собакам – в дозе 6 мкг/кг (Кузнецов А.П., 1985;
Смелышева Л.Н., 1994). Вы званная секреция у крыс продолжалась 45 минут, являясь оптимальным проме жутком времени для получения объёма секрета соответствующего объёму же лудка (Бесядовский Р.А., 1978). Вызванная секреция у собак продолжалась 2, часа с момента введения стимулятора желудочной секреции, сок собирали 30 – минутными пробами, что давало возможность оценить влияние пептида на ди намику желудочной секреции. Использовали пептиды PGP (производства ла боратории регуляторных пептидов Института Молекулярной Генетики РАН, Москва) и GP (производства “Senn Chemicals”, Schweiz). PGP в дозе 1 мг/кг, GP в дозе 1 мг/кг крысам вводили внутрибрюшинно в объёме 1 мл на 200 г массы животного. Собакам GP вводили внутривенно в дозе 70 мкг/кг. Модель стрес са. При изучении реакций желудка в экстремальных условиях в качестве стрес сора применяли апробированную Г. Селье (1936) модель, ставшую классиче ской, нервно-мышечного напряжения – иммобилизация в течение определён ного промежутка времени однократно (Селье Г., 1979). Иммобилизацию крыс осуществляли фиксацией животного за конечности на операционном столике на спине в течение 18 часов. ИС у собак создавали помещением животных на 18 часов в узкие клетки из деревянных реек, максимально ограничивающие их движение. Оценку интенсивности стресс – реакции осуществляли с помощью таких критериев, как изменение уровня кортикостероидов в плазме крови флуориметрическим методом (Панков Ю.А., Усватова И.Я., 1965), а также со держания общего числа лейкоцитов и их отдельных морфологических форм в периферической крови животных (Горизонтов П.Д. и др., 1983;
Гольдберг Е.Д.
и др., 1990;
1996). О секреторной функции судили по объёму желудочного со ка, активности Н+ (Канищев П.А., Коваленко Л.Г., 1977), темпу секреции ак тивных Н+ (Мыш В.Г., 1987), протеолитической активности желудочного сока (метод Ансона и Мирского в модификации А.М. Уголева, 1969) и фукозе, коли чество которой является маркером для оценки слизеобразующей функции же лудка (Гребенёв А.Л. и др.;
Коротько Г.Ф., 1971;
Dicshe N., Shettles L., 1948).
Крыс как модельный объект использовали в следующих сериях опытов:
1. Контроль - исследовали желудочную секрецию при введении фи зиологического раствора и карбахолина (n = 14).
2. Исследовали желудочную секрецию при введении PGP одновре менно с карбахолином (n = 10). Эффект пептида регистрировали через 45 минут 3. Исследовали желудочную секрецию при введении GP одновремен но с карбахолином (n = 10), где через 45 минут регистрировали эффект пептида.
4. Исследовали желудочную секрецию при введении GP за 30 минут до карбахолина (n = 10), где регистрировали эффект пептида через 75 минут с момента его введения.
5. Исследовали желудочную секрецию при введении физиологическо го раствора одновременно с карбахолином после иммобилизации (n = 8).
6. Исследовали желудочную секрецию при введении физиологическо го раствора за 30 минут до карбахолина после иммобилизации (n = 7).
7. Исследовали желудочную секрецию при введении PGP одновре менно с карбахолином после ИС (n = 8). Эффект пептида регистрировали через 45 минут с момента его введения.
8. Исследовали желудочную секрецию при введении GP одновремен но с карбахолином после ИС (n = 7). Эффект пептида регистрировали через минут с момента его введения.
9. Исследовали желудочную секрецию при введении GP за 30 минут до карбахолина после ИС (n = 7). Эффект пептида регистрировали через 75 ми нут с момента его введения.
Собак как модельный объект использовали в следующих сериях опытов:
1. Контроль - исследовали желудочную секрецию при введении фи зиологического раствора и карбахолина (n = 38).
2. Исследовали желудочную секрецию при одновременном введении GP с карбахолином (n = 29). Эффект пептида регистрировали 2,5 часа.
3. Исследовали стимулированную карбахолином желудочную секре цию при введении физиологического раствора собакам после и до ИС (n = 34).
4. Исследовали одновременное введение GP с карбахолином после ИС (n = 28). Эффект пептида регистрировали 2,5 часа.
5. Исследовали желудочную секрецию при введении GP до воздейст вия ИС (n = 28). Эффект пептида регистрировали по истечению 20 часов с мо мента его введения в течение 2,5 часов.
Всего в рамках данной работы выполнено 14 серий экспериментов, по ставлено 80 опытов в остром эксперименте и 150 хронических опытов, прове дён анализ более 4,5 тысяч проб.
Статистические процедуры проводились с помощью прикладного пакета STATISTICA 5.5. Вычислялись среднее значение анализируемого показателя (M), стандартная ошибка среднего (m) и критерий значимости, относительно которого определялся достигаемый уровень значимости (p). Статистический анализ достоверности различий между выборками проводили с использованием критерия Mann-Whitney U test и критерия Стьюдента (t). Значимыми считались различия при p 0,05 (Лакин Г.Ф., 1990).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ Предположения о вероятной модуляции пролинсодержащими пептидами холинергических влияний, высказываемые Н.Е. Бабской, И.П. Ашмариным (1998) определили использование в работе в качестве стимулятора секреции желудка синтетического аналога ацетилхолина – карбахолина.
Введение PGP на фоне действия карбахолина вызывало увеличение объёма желудочного сока на 59 %, темпа секреции Н+ практически в 2,5 раза, протео литической активности в 5 раз и количества фукозы на 123 % (р0,05) в желу дочном секрете крыс (рис. 1). При введении в организм PGP, часть его остается неизменной в течение длительного времени (5 часов), а часть деградирует на метаболиты PG и GP (Ашмарин И.П. и др., 1998;
Золотарев Ю.А. и др., 2003).
Введение GP на фоне карбахолина не изменяло объем желудочного сока, темп секреции Н+, вместе с тем, снижало концентрацию Н+ на 36 %, увеличивало протеолитическую активность желудочного сока в 3 раза и уменьшало количе ство фукозы на 27 % (р0,05). Таким образом, дипептид GP обладает самостоя тельной физиологической активностью по сравнению со своим предшествен ником PGP в отношении стимулированной желудочной секреции.
Известно, что GP обнаруживает свою активность по истечению 60-ти, 90 та минут опыта после его введения (Самонина Г.Е. и др., 2001) и достаточно долго существует в плазме крови (Золотарев Ю.А. и др., 2003), поэтому пред ставилось интересным рассмотреть эффективность действия GP на стимулиро ванную желудочную секрецию, увеличив время регистрации эффекта пептида.
Дипептид вводили за 30 минут до инъекции стимулятора, что давало возмож ность продлить время регистрации эффекта пептида до 75 минут и сохранить время желудочной секреции (45 минут), по истечению которого получали оп тимальный объём желудочного сока (Бесядовский Р.А. и др., 1978).
% * 500 Контроль * * * * * * * ** PGP (45 мин) GP (45 мин) GP (75 мин) Рис. 1 Влияние пептидов PGP и GP на секреторную функцию желудка крыс, стимулированную карбахолином Примечания: 1 – активность Н+;
2 – темп секреции Н+;
3 – протеолитическая активность;
4 – объём желудочного сока;
5 – содержание фукозы;
* - отличия от носительно контроля значимы при p0,05.
При введении GP за 30 минут до инъекции карбахолина наблюдали сниже ние объёма желудочного секрета на 24 %, кислотности на 41 % и темпа секре ции Н+ в 2 раза (р0,05) в желудочном секрете крыс (рис. 1). Таким образом, эффект полученный на 75 минуте регистрации действия пептида отличен от то го, который был получен на 45 минуте.
Для подтверждения возможных особенностей изменения желудочной сек реции во времени регистрации эффекта GP дальнейшим этапом в исследовани ях было рассмотрение влияния пептида на секреторную активность желудка собак в динамике соковыделения, исключив временной фактор в сочетаниях инъекций GP и карбахолина.
В контрольных опытах у собак была обнаружена значительная вариабель ность показателей секреторной активности желудка, что позволило разделить животных на две группы. Для собак первой группы характерна высокая секре торная активность желудка, что проявилось в значительном объёме желудочно го сока с высоким темпом секреции Н+, протеолитической активностью и со держанием фукозы в желудочном секрете. Во вторую группу отнесены живот ные со сниженной секреторной активностью желудка и соответственно с низ кими значениями показателей секреции по сравнению с первой группой (табл.
1). Результаты анализа желудочного содержимого в контрольных группах жи вотных сопоставимы с результатами в работах В.И. Гридневой (2004), А.Н.
Иордан (1998), Н.А Кривовой с соавт. (2002), Е.Ю. Просекиной (2001), Т.А.
Сошниковой (2001), Ярымовой И.А. (2003), K. Somarumdaram (1985). Различия между группами в характере секреторного ответа на введение стимулятора кар бахолина являются отражением «индивидуальной нормы» (Гриднева В.И., 2004), что обусловлено конституциональными особенностями гуморальной ре гуляции и структуры желудочных желез (Дорофеев Г.И., Успенский В.М., 1984;
Успенский В.М., 1981, 1982).
Таблица Контрольные показатели секреторной активности желудка у собак Первая группа собак Вторая группа собак с Показатели с исходно высокой исходно низкой секре секрецией желудка, цией желудка, M ± m M ± m (n = 23) (n = 15) Суммарный объём секрета, мл 98,9 ± 7,34 70,5 ± 7,53 * Концентрация H+, мкмоль/мл 65,1 ± 5,86 64,2 ± 2, Темп секреции Н+, ммоль/2,5ч 7,9 ± 1,13 3,8 ± 0,37 * Пептическая активность, ммоль 7,6 ± 1,71 0,7 ± 0,15 * Содержание фукозы, мкмоль 22,4 ± 4,06 10,5 ± 1,72 * Примечания 1 N – объем выборки, соответствующий количеству опытов 2 M ± m - среднее ± стандартная ошибка среднего 3 *-отличие относительно первой группы статистически значимо (p0,05) Изменения показателей секреторной функции желудка собак после введе ния дипептида определялись исходным уровнем секреторной активности орга на животных. У собак с исходно высокой секреторной активностью желудка введение GP на фоне карбахолина вызывало лишь увеличение объёма желудоч ного сока на 80 % (рис. 2). Тогда как, у собак с исходно низкой секреторной ак тивностью желудка пептид в сочетании с карбахолином увеличивал объём же лудочного сока на 33 %, протеолитическую активность на 171 % и содержание фукозы на 49 %, но уменьшал концентрацию Н+ на 15 % (р0,05).
аН+ % 300 * темп Н+ 250 прот. ак-ть Контроль * объём сока ** фукоза * собаки 1-ой группы собаки 2-ой группы Рис. 2 Влияние пептида GP на секреторную функцию желудка у собак с ис ходно различными уровнями желудочной секреции, стимулированной карбахоли ном Примечания: 1 и 2 группы – собаки с исходно высокой и низкой секреторной активностью желудка соответственно;
* - отличия относительно контроля значи мы при p0,05.
При введении GP в динамике соковыделения отмечены изменения на про тяжении всего эксперимента (2,5 часа), что можно продемонстрировать на при мере протеолитической активности желудочного сока у собак с исходно низкой секреторной активностью желудка (рис. 3А). Необходимо отметить, что у собак этой группы GP вызывал как увеличение на 30 минуте опыта темпа секреции Н+, так и его уменьшение на 90 минуте эксперимента (рис. 3Б). Данный факт можно считать доказательством в пользу неоднозначности влияния дипептида на изменение продукции соляной кислоты в динамике наблюдения эффекта GP.
Сохранение эффекта на 90 минуте, хотя и противоположного первой пробе, по видимому, как упоминалось уже в работе С.Е. Жуйковой (2003), говорит о воз можном запуске каскадных реакций. Вдобавок, такое отсроченное действие GP (во много раз больше продолжительности жизни любого пептида) может быть обусловлено синтезом собственных пептидов.
0,7 * 1,8 * Темп секреции Н+, 0, активность, ммоль Протеолитическая 1, 0,5 * 1, * ммоль * 1, 0, * 0,3 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 30 60 90 120 150 30 60 90 120 Б А Время эксперимента, мин Время эксперимента, мин Рис. 3 Изменения протеолитической активности (А) и темпа секреции водо родных ионов (Б) в динамике у собак с исходно низкой секреторной активностью желудка после введения GP Примечания: сплошная линия – карбахолин+физиологический раствор, пунктирная - карбахолин+GP;
* - отличия относительно контроля значимы при p0,05.
Согласно литературным данным пролинсодержащие пептиды проявляют неоднозначное противоязвенное действие в отношении повреждений СОЖ, обусловленных центральными (стрессорная модель язвообразования) или пе риферическими (этаноловая и индометациновая модели) механизмами (Абра мова М.А. и др., 1998). GP оказывает протекторный эффект лишь при стрессор ной модели язвообразования (Абрамова М.А. и др., 1998;
Золотарев Ю.А. и др., 2003).
Используемая в эксперименте модель длительного (18 часов) и непре рывного ИС является многокомпонентным стрессирующим фактором (Судаков К.В., 1988;
Скурихин Е.Г., 1997). Контроль, за степенью стрессированности животных показал, что применяемая модель ИС вызывала изменение уровня катаболических гормонов, которое определялось временем введения физиоло гического раствора относительно карбахолина у крыс и исходным уровнем гормонов у собак.
При введении крысам, претерпевшим ИС, физиологического раствора на фоне карбахолина зарегистрировали уменьшение концентрации кортикостеро на в плазме крови (с (0,5 ± 0,02) мкмоль/л до (0,2 ± 0,005) мкмоль/л, p0,05), а при введении физиологического раствора за 30 минут до карбахолина отметили увеличение концентрации гормона (с (0,5 ± 0,02) мкмоль/л до (0,8 ± 0,10) мкмоль/л, p0,05). У собак с исходно низкой концентрацией глюкокортикоидов после ИС содержание гормонов увеличилось в 4,3 раза (с (0,3 ± 0,04) мкмоль/л до (1,2 ± 0,04) мкмоль/л, p0,05). Тогда как, у собак с исходно высокой концен трацией катаболических гормонов иммобилизация вызывала увеличение корти костероидов в 2,5 раза (с (0,6 ± 0,08) мкмоль/л до (1,6 ± 0,08) мкмоль/л, p0,05).
У крыс и собак уровень концентрации кортикостероидов в плазме крови кон трольных опытов соответствовал видовой норме (Бесядовский Р.А. и др., 1978;
Горизонтов П.Д. и др., 1983). Среди признаков характеризующих стресс–реак цию в работе отмечены выраженный нейтрофильный лейкоцитоз (за счёт сег ментоядерных форм у крыс, собак первой группы и палочкоядерных форм у второй группы собак), эозинопения и лимфопения. Из всех морфологических форм лейкоцитов число лимфоцитов составило менее 20 % у эксперименталь ных животных, что, по мнению Л.Х. Гаркави с соавт. (1998), характерно для ре акции типа стресс и отличает её от реакции активации и тренировки. Суммар ное количество лейкоцитов у крыс после ИС увеличивалось в 3,5 раза при вве дении физиологического раствора одновременно с карбахолином ( с (3579 ± 168)109/л до (12840 ± 826)109/л, p0,05) и в 2,5 раза при введении физиологи ческого раствора за 30 минут до стимулятора секреции желудка ( с (3579 ± 168)109/л до (8694 ± 835)109/л, p0,05). Суммарное количество лейкоцитов у собак обеих групп после иммобилизации увеличилось на 95% (с (10061 ± 577,0)109/л до (19617 ± 570,0) 109/л, p0,05).
Таким образом, используемая модель ИС вызывала изменения уровня кор тикостероидов, количества лейкоцитов и их морфологических форм в перифе рической крови, соответствующие комплексу реакций, описанных в работах А.А. Виру (1981), П.Д. Горизонтова (1983), П.П. Голикова (1988), Е.Д. Гольд берга (1990;
1996), Л.А. Колесниковой и И.Н. Оськиной (2003), Т.В. Ласуковой (1991), Ю.Б. Лишманова, Л.Н. Маслова (1994), А.И. Робу (1982). Зависимость величины и направленности наблюдаемых изменений картины крови от инъек ций физиологического раствора, а также индивидуальных характеристик после ИС находит подтверждение в работах Т.А. Замощиной (1997), Н.К. Поповой и др. (1996), Л.А. Колесниковой, И.Н. Оськиной (2003), Bohus et al. (1993), L.
Conti and S. Foote (1995). По всей вероятности это связано с исходно различной функциональной активностью гипофизарно-надпочечниковой системы живот ных.
Наряду с неоднозначными изменениями показателей системы крови в дан ных экспериментах были обнаружены и разнонаправленные изменения в секре торной активности желудка, как у крыс, так и у собак после действия стресса.
Угнетение секреторных процессов желудка наблюдали у крыс, которым вводи ли физиологический раствор одновременно с карбахолином после ИС: снижа лись объём желудочного сока, кислотность и темп секреции Н+ (табл. 2). У со бак с исходно высокой секреторной активностью желудка иммобилизация так же вызывала значимое снижение объема секрета, кислотности желудочного со ка и протеолитической активности (табл. 3). Напротив, повышение объёма же лудочного сока, темпа секреции Н+, протеолитической активности и содержа ния фукозы регистрировали у крыс, которым вводили физиологический раствор за 30 минут до карбахолина после ИС (табл. 2). У собак с исходно низкой сек реторной активностью желудка стресс стимулировал кислотно-пептический фактор и образование фукозы (табл. 3).
Таблица Влияние иммобилизации на секреторную активность желудка крыс Показатели Контроль – Стресс 1 - введение Стресс 2 - введение секреции желудка введение ФР и ФР одновременно с ФР за 30 минут до карбахолина, карбахолином после карбахолина после M ± m (n = 14) ИС, M ± m (n = 8) ИС, M ± m (n = 7) Объём желудочного сока, мл 4,6 ± 0,33 2,5 ± 0,27 * 7,4 ± 0,58 * Концентрация Н+, 64,7 ± 8, мкмоль/мл 62,2 ± 3,91 2,4 ± 2,20 * Темп секреции Н+, 485,9 ± 89,84 * мкмоль/45 мин 269,2 ± 39,17 2,5 ± 0,27 * Протеолитическая 582,7 ± 96,09 * активность, мкмоль 90,9 ± 16,40 81,7 ± 13, Содержание фукозы, 9,5 ± 0,69 * мкмоль 4,4 ± 0,44 5,1 ± 0, Примечания 1 ФР – физиологический раствор 2 ИС – иммобилизационный стресс 3 N – объем выборки, соответствующий количеству опытов 4 M ± m - среднее ± стандартная ошибка среднего 5 * - отличие относительно контроля статистически значимо при p 0, 6 - отличие относительно серии стресс 1 статистически значимо при p 0, Полученные данные свидетельствуют о том, что ИС вызывал у крыс и со бак дифференцированные по характеру реакции со стороны секреторной актив ности желудка. Основываясь на данных литературы, можно предположить, что разнонаправленные эффекты на действие стресса у крыс и собак говорят о ка чественно различных состояниях животных после иммобилизации. Подтвер ждением чему, по мнению Л.Х. Гаркави с соавт. (1998), служит и разная сте пень повышения или снижения показателей системы крови (концентрация кор тикостероидов, лейкограмма).
Таблица Изменения желудочной секреции у собак с разными исходными уровнями секреторной активности желудка после ИС Показатели Уровень Контроль – введение Введение ФР и карба желудочной секреции секреции ФР и карбахолина, M холина после ИС, M ± ± m (n1 = 23, n2 = 15) m (n1 = 19, n2 = 15) Суммарный объём Высокий 98,8 ± 7,33 68,9 ± 9,27 * сока, мл Низкий 70,5 ± 7,53 86,1 ± 7, Концентрация Н+, Высокий 65,1 ± 5,86 43,7 ± 6,39 * мкмоль/мл Низкий 64,2 ± 2,74 83,6 ± 2,76 * Темп секреции Н+, Высокий 7,9 ± 1,13 5,4 ± 0, ммоль/2,5 часа Низкий 4,1 ± 0,47 5,6 ± 0, Протеолитическая ак- Высокий 7,6 ± 1,71 1,7 ± 0,26 * тивность сока, ммоль Низкий 0,7 ± 0,15 1,5 ± 0,29 * Содержание фукозы, Высокий 22,4 ± 4,06 18,0 ± 4, мкмоль Низкий 10,5 ± 1,72 17,9 ± 3,11 * Примечания 1 ФР – физиологический раствор 2 N1, n2 – количество опытов в группах у собак с исходно высоким и низким уровнями желудочной секреции соответственно 3 M ± m - среднее ± стандартная ошибка среднего 4 * - отличие относительно контроля статистически значимо при p 0, В ходе выяснения действия пролинсодержащих пептидов PGP и GP на секреторную активность желудка, качественно различную у эксперименталь ных животных после иммобилизации, отмечен ряд интересных особенностей.
Введение PGP одновременно с карбахолином крысам после иммобилизации увеличивало объём желудочного сока, концентрацию и темп секреции Н+, ко торые были снижены действием стресса. Кроме того, повышалась протеолити ческая активность желудочного сока, и увеличивалось содержание фукозы в желудочном секрете (рис. 4).
Контроль % 300 *# ИС * 250 ИС + PGP(45) * ИС+GP(45) # # ## ** ** ## ## * * * 0 показатели секреции аН+ темп Н+ протеолит. объём жел. кол-во акт-ть сока фукозы Рис. 4 Влияние введения PGP и GP на фоне карбахолина после ИС на же лудочную секрецию крыс Примечания: 1 – активность Н+;
2 – темп секреции Н+;
3 – протеолитическая активность;
4 – объём желудочного сока;
5 – содержание фукозы;
*, # - отличия относительно контроля и серии «ИС» значимы при p0,05.
Введение пептида GP одновременно с карбахолином после ИС усиливало ферментативную активность желудочного сока наряду с увеличением объёма секрета, кислотности и темпа секреции Н+, сниженных действием стресса (рис.
4). Отличия в эффектах пептидов PGP и GP заключались в том, что увеличение темпа секреции Н+, которое было снижено действием ИС, под влиянием GP было значительно выше (значение показателя ближе к контрольному значе нию), чем при использовании PGP, а изменения содержания фукозы после вве дения GP не происходило. Действие пептидов PGP и GP было противополож ным направленности действия иммобилизации: объем желудочного секрета восстанавливался, кислотность и темп секреции Н+ росли, но были значимо ниже контрольных значений. Однако, протеолитическая активность при введе нии пептидов PGP и GP крысам после ИС значимо превосходила как значения серии «ИС», так и контрольные значения.
Введение GP за 30 минут до карбахолина крысам, подвергнутым иммоби лизации вызывало уменьшение объёма желудочного секрета, концентрации и темпа секреции Н+, протеолитической активности сока, которые были увеличе ны действием стресса (рис. 5). Сниженные влиянием пептида величины кон центрации Н+ и темпа их секреции оказались примерно в 2 раза меньше вели чин контрольных значений, тогда как протеолитическая активность значимо превышала уровень исходной активности.
Фон % * ИС 600 ИС+GP(75) *# * * * # # *# *# 0 показатели аН+ темп Н+ протеолит. объём жел. кол-во секреции акт-ть сока фукозы Рис. 5 Влияние введения GP за 30 минут до карбахолина после ИС на же лудочную секрецию крыс Примечания: 1 – активность Н+;
2 – темп секреции Н+;
3 – протеолитическая активность;
4 – объём желудочного сока;
5 – содержание фукозы;
*, # - отличия относительно контроля и серии «ИС» значимы при p0,05.
В опытах по изучению желудочной секреции на собаках была установлена роль GP как агента предотвращающего нарушение стресса, так и агента, кото рый способен восстановить нарушенные иммобилизацией показатели секре торной активности желудка.
Введение GP после ИС собакам с исходно высокой секреторной активно стью желудка приводило к увеличению объёма секрета, кислотности, снижен ных действием иммобилизации, а также к росту темпа секреции Н+ (рис. 6). В данной группе собак объём секрета, темп секреции Н+, содержание фукозы по сле введения пептида соответствовали контрольным величинам, тогда как ки слотность и протеолитическая активность желудочного сока не достигали кон трольных значений.
% 300 Контроль ИС 250 ИС+GP GP+ИС # *# *# # ## # # * * ** показатели аН+ темп Н+ протеолит. объём жел. кол-во секреции акт-ть сока фукозы Рис. 6 Влияние пептида GP при ИС на секреторную активность желудка собак с исходно высоким уровнем секреции.
Примечания: 1 – активность Н+;
2 – темп секреции Н+;
3 – протеолитическая активность;
4 – объём желудочного сока;
5 – содержание фукозы;
ИС+GP – вве дение пептида после ИС;
GP+ИС – введение пептида перед ИС;
*, # - отличия относительно контроля и серии «ИС» соответственно значимы при p0,05.
Превентивное иммобилизации введение GP собакам с исходно высокой секреторной активностью желудка увеличивало объём секрета, кислотность и темп секреции Н+, протеолитическую активность, содержание фукозы, значе ния которых достигали контрольного уровня, тем самым, препятствуя развитию стрессорных нарушений. Однако, объём желудочного сока у этих собак после введения пептида перед иммобилизацией превышал контрольный уровень по истечению стресса (рис. 6).
Введение GP после ИС собакам с исходно низкой секреторной активно стью желудка привело к снижению кислотности сока, содержания фукозы, уве личенных иммобилизацией, а также к уменьшению объёма секрета и темпа сек реции Н+ (рис. 7). У собак данной группы значения объёма секрета, темпа сек реции Н+ и содержания фукозы при введении дипептида после ИС соответство вали контрольным значениям. Однако, в этой группе животных кислотность и протеолитическая активность значимо превышали контрольные величины.
% 400 Контроль ИС * ИС+GP # 300 GP+ИС *** * * * * # *#* # # # 0 показатели аН+ темп Н+ протеолит. объём жел. кол-во секреции акт-ть сока фукозы Рис. 7 Влияние пептида GP при ИС на секреторную активность желудка собак с исходно низким уровнем секреции Примечания: 1 – активность Н+;
2 – темп секреции Н+;
3 – протеолитическая активность;
4 – объём желудочного сока;
5 – содержание фукозы;
ИС+GP – вве дение пептида после ИС;
GP+ИС – введение пептида перед ИС;
*, # - отличия относительно контроля и серии «ИС» соответственно значимы при p0,05.
Предварительное иммобилизации введение GP собакам с исходно низкой секреторной активностью желудка не изменяло агрессивные факторы желудоч ного секрета (темп секреции протонов, кислотность и протеолитическую ак тивность сока), которые оставались на уровне стрессорных значений, однако, увеличивало объём желудочного сока и содержание фукозы (защитные факто ры СОЖ). В данной группе собак все выбранные показатели секреции превы шали контрольные значения по истечению действия иммобилизации (рис. 7).
Таким образом, пролинсодержащие пептиды PGP и GP способны модули ровать холинергические влияния на желудочную секрецию в нормальных фи зиологических условиях и в условиях ИС. Дипептид GP – структурный компо нент PGP, обладает самостоятельной физиологической активностью в отноше нии желудочной секреции по сравнению со своим предшественником. Его эф фект зависит от временного интервала между инъекциями дипептида и карба холина, исходного уровня секреции желудка, направленности изменения секре ции желудка под действием стресса и режима дозирования пептида (постстрес сорное или превентивное стрессу введение пептида).
Реципрокное влияние стресса и пептида GP на желудочную секрецию крыс и собак говорит о способности последнего ограничивать стрессовые реакции и, возможно, о принадлежности GP к стресс-лимитирующим системам. Суть тако го ограничения стрессорной реакции под влиянием GP может заключаться в изменении активности глюкокортикоидной функции надпочечников, нарушен ной действием стресса. Данное предположение основано на полученных ре зультатах. Так, введение GP одновременно с карбахолином после стрессорного воздействия у крыс вызывало значимое увеличение уровня кортикостероидов в плазме крови, уменьшенных действием иммобилизации (с (0,22 ± 0,005) мкмоль/л до (0,78 ±0,054) мкмоль/л, p0,05). Введение GP за 30 минут до кар бахолина не вызывало значимых изменений концентрации кортикостерона в плазме крови крыс. И в первом и во втором случаях уровень кортикостерона в плазме крови крыс значимо превосходил исходное значение (контроль). Между уровнем гормона в серии, когда GP вводили одновременно с карбахолином по сле иммобилизации и уровнем кортикостерона в серии, когда GP вводили за минут до карбахолина после ИС не было значимых различий. Постстрессорное введение GP собакам с исходно высокой и низкой уровнями желудочной секре ции привело к уменьшению концентрации кортикостероидов в плазме крови, увеличенных под влиянием ИС (соответственно с (1,2 ± 0,04) мкмоль/л до (0,9 ± 0,03) мкмоль/л и с (1,6 ± 0,07) мкмоль/л до (1,1 ± 0,08) мкмоль/л, p0,05). Пред варительное действию иммобилизации введение GP не способствовало измене нию стрессорного увеличения концентрации кортикостероидов у собак с ис ходно высокой секреторной активностью желудка, тогда как у собак с исходно низким секреторным потенциалом значимо снижало увеличивающийся при стрессе уровень гормона (с (1,6 ± 0,07) мкмоль/л до (1,2 ± 0,08) мкмоль/л, p0,05).
На основании полученных результатов и данных литературы (Абрамова М.А. и др., 1998;
Бабская Н.Е., Ашмарин И.П., 1998;
Доведова Е.Л. и др., 1998;
Жуйкова С.Е., 2003;
Byun H.G., Kim S.K., 2002) в модулирующем действии PGP и GP в отношении секреторной функции желудка в нормальных физиологиче ских условиях и при стрессе могут участвовать как центральные, так и перифе рические механизмы регуляции.
1) Пептиды PGP и GP могут осуществлять свои эффекты, во-первых, че рез влияние непосредственно на ткани желудка. Во-вторых, пептиды могут способствовать синтезу собственных пептидов, по физико-химическим свойст вам близких к изучаемым, которые, возможно, и изменяют секреторную актив ность. В третьих, эффекты PGP и GP могут осуществляться через метаболиты, образующиеся при деградации пептидов.
2) Возможно эффекты пролинсодержащих пептидов связаны с их способ ностью активировать серотонинергическую систему, увеличивать содержание дофамина и норадреналина, снижать удельную активность моноаминоксидазы Б и ацетилхолинестеразы, а также увеличивать удельную активность моноами ноксидазы А в структурах мозга.
3) Не исключается способность PGP и GP корректировать функциональ ную активность желудка посредством включения холинергических механизмов и/или модулирующего влияния на эффекты ацетилхолина.
4) Сохранение эффекта действия пептидов в течение трёх часов после вве дения, несмотря на значительное уменьшение его концентрации в крови, по видимому, говорит о возможном запуске каскадных реакций, которые изменя ют уровень стрессорных нарушений желудочной секреции в зависимости от исходной секреторной активности органа.
5) Изменение секреторной активности желудка под действием GP у экспе риментальных животных, которые подвергались стрессорному воздействию, по-видимому, может быть обусловлено способностью пептидов изменять уро вень глюкокортикоидных гормонов.
ВЫВОДЫ 1. Дипептид GP - структурный компонент трипептида PGP, обладает само стоятельной физиологической активностью в отношении желудочной секреции и зависит от временного интервала между введениеми пептида и стимулятора секреции желудка: а) введение GP крысам одновременно с карбахолином уменьшало кислотность и содержание фукозы, но увеличивало протеолитиче скую активность желудочного сока;
б) введение GP за 30 минут до карбахолина снижало объём желудочного сока, кислотность и темп секреции водородных ионов у крыс.
2. Характер влияния GP на секреторную активность желудка собак опре делялся исходным уровнем желудочной секреции. У собак с исходно высоким уровнем секреции желудка пептид вызывал увеличение только объёма желу дочного сока, тогда как у собак с исходно низкой секрецией рост объёма сока сопровождался снижением кислотности, увеличением протеолитической ак тивности и содержания фукозы.
3. Одновременное введение физиологического раствора и карбахолина по сле иммобилизации угнетало секреторную активность желудка крыс, а введе ние физиологического раствора за 30 минут до инъекции карбахолина её сти мулировало. Иммобилизационный стресс способствовал ослаблению секретор ной функции желудка у собак с исходно высоким уровнем желудочной секре ции и усилению кислотно-пептического фактора и образования фукозы у собак с исходно низкой секреторной активностью желудка.
4. PGP и GP уменьшали постстрессорные нарушения секреторной активно сти желудка крыс и собак. Степень и направленность их воздействия определя лись особенностями структуры пептидов и постстрессорных нарушений секре ции желудка. Введение пептидов стимулировало желудочную секрецию, ослаб ленную действием стресса, и снижало повышенную влиянием иммобилизации секреторную активность желудка.
5. Эффект GP, введённый перед иммобилизацией зависел от исходного уровня желудочной секреции животных. Дипептид обладал противострессор ным действием у собак с исходно высокой секреторной активностью желудка и препятствовал развитию стрессорных нарушений. В группе собак с исходно низким уровнем желудочной секреции введение GP перед иммобилизацией не оказывало противострессорного действия, но усиливало защитные факторы слизистой оболочки желудка.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Гриднева В.И., Еськова Т.А. (Томова Т.А.), Самонина Г.Е., Копылова Л.Н. Влияние амилина и PGP на секреторную и экскреторную функцию желуд ка крыс // Физиология организмов в нормальном и экстремальном состояниях:
Сб. стат. Всерос. конф. 18–19 декабря 2001.-Томск, 2001.С.193–197.
2. Гриднева В.И., Просекина Е.Ю., Еськова Т.А. (Томова Т.А.) Исследо вание действия регуляторных пептидов на секреторную активность желудка // Физиология организмов в нормальном и экстремальном состояниях: Сб. стат.
Всерос. конф. 18 – 19 декабря 2001. - Томск, 2001. С. 190 – 193.
3. Еськова Т.А. (Томова Т.А.) Регуляция желудочной секреции посредст вом пролинсодержащего пептида после иммобилизационного стресса // 4-й съезд физиологов Сибири: Тез. докл. – Новосибирск, 2002. С. 88.
4. Гриднева В.И., Еськова Т.А. (Томова Т.А.), Мленик О.Н. Выяснение роли глипролинов в секреторном ответе желудка крыс после стрессорного воз действия // Вестник Томского государственного университета. – 2003. – № 8. – С. 51 – 53.
5. Еськова Т.А. (Томова Т.А.), Гриднева В.И. Корригирующее действие дипептида Gly-Pro на секреторную активность желудка // Российский физиоло гический журнал имени И.М. Сеченова. – 2004. – Т. 90, № 8. – С. 10.
6. Еськова Т.А. (Томова Т.А.) Модуляция пептидом Gly-Pro секреторной активности желудка собак после стресса // Электронный журнал «Исследовано в России».–2004.- № 3.– С. 1466-1474.
7. Томова Т.А. Роль Gly-Pro в формировании адаптационных реакций же лудка к стрессорному воздействию // Бюллетень сибирской медицины. – 2005. – Т. 4, Прил. 1. – С. 11.
8. Томова Т.А. Превентивное и постстрессорное влияние Gly-Pro на сек реторную активность желудка // Экспериментальная и клиническая фармаколо гия. – 2006. - Т. 69, № 2. – С.36 – 38.