авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Аллозимные спектры глюкозо-6-фосфат изомеразы у полидорид (polychaeta: spionidae) и возможные механизмы их формирования

На правах рукописи

ПАНЬКОВА Виктория Владимировна АЛЛОЗИМНЫЕ СПЕКТРЫ ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТ ИЗОМЕРАЗЫ У ПОЛИДОРИД (POLYCHAETA: SPIONIDAE) И ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИХ ФОРМИРОВАНИЯ 03.00.15 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток – 2006 2

Работа выполнена в Институте биологии моря имени А. В. Жирмунского ДВО РАН

Научный консультант: кандидат биологических наук Манченко Геннадий Петрович

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН доктор биологических наук Булгаков Виктор Павлович доктор биологических наук Балакирев Евгений Станиславович

Ведущая организация: Институт биологических проблем севера ДВО РАН

Защита состоится 28 ноября 2006 г. в 11 часов на заседании диссертаци онного совета Д 005.008.01 при Институте биологии моря имени А. В.

Жирмунского ДВО РАН Адрес: 690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, Факс: (4232) 31-09- Е-mail: [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии моря имени А. В. Жирмунского ДВО РАН

Автореферат разослан 18 октября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук М. А. Ващенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изоферменты – множественные молеку лярные формы одного и того же фермента, давно и успешно используют ся в качестве маркеров генов в различных областях биологии и медицины.

Наиболее широкое применение они нашли в популяционной генетике для исследования генетической изменчивости природных популяций и видов.

Ключевым моментом в использовании изоферментов как маркеров генов является ясная генетическая интерпретация результатов ферментного электрофореза. Однако, в литературе описано много необычных изофер ментных спектров, не нашедших обоснованного и убедительного объяс нения. К числу таких случаев относится недавно описанный необычный электрофоретический спектр димерного фермента глюкозо-6-фосфат изомеразы (ГФИ) у полихеты Polydora brevipalpa (Polychaeta: Spionidae) (Manchenko, 2001). Анализ таких спектров, трудных для традиционной ин терпретации, представляется важным и своевременным.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключа лась в выяснении молекулярных механизмов формирования изофермент ных спектров ГФИ у полидорид (Polychaeta: Spionidae).

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать изоферментные спектры ГФИ у десяти видов поли дорид (Polychaeta: Spionidae).

2. Исследовать сопряженность экспрессии изофермента ГФИ-2 с по лом у десяти видов полидорид.

3. Исследовать тканеспецифичность экспрессии изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2.

Научная новизна работы. Проведено электрофоретическое иссле дование изоферментных спектров глюкозо-6-фосфат изомеразы (ГФИ) у десяти видов полидорид родов Polydora и Dipolydora (Polychaeta: Spioni dae), ранее не исследованных в этом отношении. Установлено, что у всех исследованнных видов полидорид экспрессируется два изофермента (ГФИ-1 и ГФИ-2), один из которых (ГФИ-2) экспрессируется только у сам цов. Проведено исследование тканеспецифичности экспрессии изофер ментов ГФИ. Показано, что изофермент ГФИ-1 экспрессируется преиму щественно в соматических тканях у особей обоих полов и в незначитель ных количествах в диплоидных сперматогенных клетках самцов. Изофер мент ГФИ-2 экспрессируется в диплоидных сперматогенных клетках сам цов. Установлен факт гибридизации изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 у всех исследованных видов. Показано, что у каждого из исследованных видов полидорид, среди особей, экспрессирующих оба изофермента, преобла дают те, которые имеют идентичные аллозимные спектры ГФИ-1 и ГФИ-2.

Впервые сделана оценка доли таких особей у 10 исследованных видов.

Впервые получены данные, свидетельствующие в пользу гипотезы о том, что альтернативный сплайсинг (АС) способен генерировать изофер менты, которые на электрофоретических гелях могут быть неотличимы от классических изоферментов, определяемых разными генными локусами.

Теоретическая и практическая ценность работы. Полученные данные, говорящие о том, что изоферменты ГФИ полидорид генерируются АС, послужат важной предпосылкой для формулирования положений но вой концепции изоферментов, учитывающей важную роль АС в их генери ровании. Это составит основу для ясной генетической интерпретации электрофоретических данных и подтвердит для изоферментов статус на дежных генных маркеров.

Апробация работы и публикации. Основные положения работы докладывались на IV Региональной конференции по актуальным пробле мам морской биологии и экологии (Владивосток, 2001);

Международной конференции: «Evolution, Genetics, Ecology and Biodiversity» (MAPEEG) (Владивосток, МБС «Восток», 2001), VII Дальневосточной молодежной школе – конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Вла дивосток, МЭС ТИБОХ, 2003) и ежегодных научных конференциях Инсти тута биологии моря (Владивосток, 2004, 2006). По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 209 ссылок. Дис сертация изложена на 108 страницах, содержит 4 таблицы и 43 рисунка.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю Г.П. Манченко за руководство, помощь и под держку при выполнении работы, В.И. Радашевскому за помощь в сборе материала и определении видов, А.И. Пудовкину и В.А. Брыкову за цен ные замечания и рекомендации при написании и оформлении работы, а также всему коллективу Лаборатории генетики ИБМ ДВО РАН.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Были исследованы выборки особей десяти видов полихет родов Polydora и Dipolydora семейства Spionidae (Таблица 1). Все виды были со браны в заливе Восток (залив Петра Великого) Японского моря в период с 2001 по 2006 год, за исключением P. limicola и P. cornuta, которые были собраны в бухте Золотой Рог (Амурский залив (залив Петра Великого)) в 2004 году.

Особей P. brevipalpa, D. bidentata и D. carunculata собирали из разби тых раковин гребешка Mizuhopecten yessoensis;

P. glycymerica – из рако вин Glycymeris yessoensis;

P.calcarea, P. manchenkoi и D. commensalis – из раковин Cryptonatica janthostoma, заселенных раками-отшельниками. Осо бей P. сornuta и D. cardalia извлекали из илистых трубочек, собранных на глубине 3-4 м, на заиленных песчаных грунтах, в районе МБС Восток ИБМ ДВО РАН. Исследованная выборка P. limicola собрана из обрастаний, сформировавшихся на судах, простоявших не менее 6 месяцев в бухте Золотой Рог. Пол червей определялся путем визуального исследования содержимого их гонад под бинокуляром.

Таблица 1. Виды полидорид и число исследованных особей.

Вид Число исследованных особей 1. Polydora brevipalpa 2. P. calcarea 3. P. сornuta 4. P. glycymerica 5. P. limicola 6. P. manchenkoi 7. Dipolydora bidentata 8. D. cardalia 9. D. carunculata 10. D. commensalis Для электрофореза использовали стандартную аппаратуру (Короч кин и др., 1977). При исследовании состава изоферментных спектров и ха рактера аллозимной (аллельной) изменчивости ГФИ, в качестве образцов для электрофореза использовали гомогенаты целых особей. Для опреде ления тканеспецифичности экспрессии изоферментов ГФИ использовали препараты соматических тканей (головная часть, не несущая гонад), а также препараты половых продуктов самцов и самок, которые собирали из зрелых (наполненных) гонад путем их надрыва и сбора текучей спермы или яйцеклеток вместе с морской водой с помощью пипетки. Сперму и яй цеклетки отделяли от морской воды центрифугированием при 12000 g в течение 1 мин.

Электрофорез проводили в горизонтальном блоке 14% крахмального геля (195 х 140 х 3 мм) при температуре 3-4 Со и силе тока 10-15 mA. Для геля, а также для катодного и анодного отсеков электрофоретической ка меры, использовали модифицированную непрерывную трис-ЭДТА боратную буферную систему (pH 8,4) (Manchenko, 2003, p. 550). Длитель ность электрофореза составляла 12-13 часов. По окончании электрофо реза блок геля разрезали пополам на две пластины толщиной 1,5-2 мм.

Нижний срез окрашивали на ферментативную активность, используя про являющую смесь для фермента глюкозо-6-фосфат изомеразы (К.Ф.

5.3.1.9;

ГФИ) (Manchenko, 2003).

Для оценки значимости различий между видами по доле идентичных фенотипов ГФИ-1 и ГФИ-2 и выявления однородных групп видов по этому признаку использовали стандартный X-критерий (Урбах, 1964):

, где Nij – фактическое число i-ых фенотипов j-го вида, – ожидаемое их число при справедливости нулевой гипотезы.

РЕЗУЛЬТАТЫ Электрофоретические исследования изоферментных и аллозимных спектров ГФИ показали, что:

1) У всех исследованных видов электрофоретический спектр ГФИ представлен двумя изоферментами – ГФИ-1 и ГФИ-2. ГФИ-1 экспрессиру ется у всех особей, а ГФИ-2 только у самцов. Таким образом, у самок спектр ГФИ представлен только изоферментами ГФИ-1, а у самцов ГФИ- и ГФИ-2. (см. рис.1, А).

2) У всех исследованных видов изоферменты ГФИ-1 и ГФИ-2 демон стрируют аллозимную изменчивость, типичную для димерных ферментов.

Аллозимные спектры гомозигот представлены одной зоной, а спектры ге терозигот – тремя.

3) Исследование тканеспецифичности экспрессии изоферментов ГФИ у самцов пяти видов полидорид (P. brevipalpa, P. calcarea, P.

glycymerica, D. bidentata, D. commensalis) показало, что изофермент ГФИ- экспрессируется преимущественно в соматических тканях и в незначи тельных количествах в сперматогенных клетках самцов. Изофермент ГФИ-2 экспрессируется только в сперматогенных клетках, где он практи чески полностью замещает изофермент ГФИ-1. (рис.1, А, Б). Трехполос ные спектры изофермента ГФИ-2 у гетерозиготных самцов, свидетельст вуют о том, что аллельные изоформы этого фермента формируют гиб ридные молекулы, а следовательно, их экспрессия сопряжена в простран стве и времени. Это в свою очередь свидетельствует о том, что экспрес сия изофермента ГФИ-2 происходит в диплоидных сперматогенных клет ках (сперматогониях или сперматоцитах I), где в каждой отдельной клетке экспрессируются продукты обоих аллелей (Панькова и Манченко, 2003).

Если бы изофермент ГФИ-2 экспрессировался в гаплоидных клетках (сперматоцитах II, сперматидах, или сперматозоидах), то экспрессия раз ных аллелей была пространственно разобщена на клеточном уровне, и гибридных аллозимов не формировалось. Однако мы не исключаем, что ГФИ-2, синтезируемый в диплоидных клетках остается функциональным и в сперматозоидах.

Одинаковая тканеспецифичность экспрессии изофермента ГФИ-2 у всех пяти исследованных в этом отношении видов полидорид, которые относятся и к роду Polydora и Dipolydora, дает основания утверждать, что (Б) (А) () ГФИ- Гибриды ГФИ-1/ГФИ- СТАРТ ГФИ- (+) Рис. 1. Зимограммы ГФИ Polydora brevipalpa (А) и P. calcareа (Б), демонстри рующие тканеспецифичность экспрессии изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 и фор мирование гибридов ГФИ-1/ГФИ-2.

(А): Дорожки 1, 2 – препараты одной самки: 1 – соматические ткани (го ловная часть не несущая гонад), 2 – яйцеклетки. Дорожки 3, 4 – препараты од ного самца: 3 – соматические ткани, 4 – сперма. Дорожки 59 – ;

10, 11 –.

(Б): Дорожка 1. Дорожки 2, 3 – препараты одного самца: 2 – соматиче ские ткани (головная часть, не несущая гонад), 3 – сперма. Дорожки 4, 5 – пре параты другого самца: 4 – соматические ткани, 5 – сперма.

у всех видов этих двух родов изофермент ГФИ-2 экспрессируется в дип лоидных сперматогенных клетках.

Анализ тканеспецифичности экспрессии изоферментов ГФИ-1 у са мок показал, что и в соматических тканях и в яйцеклетках у них экспресси руется изофермент ГФИ-1 (рис.1, А).

4) У всех исследованных видов в электрофоретических спектрах ГФИ, выявляемых у особей, экспрессирующих оба изофермента, обнару живаются межизоферментные гибриды ГФИ-1/ГФИ-2. Спектры гибридных изоферментов подвержены качественной и количественной индивидуаль ной изменчивости, что, вероятно, определяется состоянием гонад самцов (рис.1, Б).

5) Большинство особей каждого из исследованных видов демонстри ровали согласованную аллозимную изменчивость изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 (имели идентичные аллозимные спектры изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 (рис.2)), и только редкие особи демонстрировали несогласованную аллозимную изменчивость (имели разные аллозимные спектры (рис.3)).

Доля особей с идентичными аллозимными спектрами варьирует от 55 – 100% (Табл. 2). X-тест показал, что различие между видами по доле идентичных фенотипов ГФИ-1 и ГФИ-2 очень существенно: X (df = 9) = 348.4, p 0.001. По этой доле исследованные виды разделяются на три однородные группы (Табл. 3).

Таблица 2. Доля идентичных аллозимных фенотипов ГФИ-1 и ГФИ-2 у 10 видов полихет.

Количество Доля особей с Вид Количество особей с иден- идентичными особей с ГФИ-1 тичными спек- аллозимными и ГФИ-2 трами ГФИ-1 и спектрами ГФИ-2. ГФИ-1 и ГФИ- Polydora brevipalpa 542 535 98% P. calcarea 172 98 57% P. сornuta 16 14 88% P. glycymerica 39 36 92% P. limicola 31 17 55% P. manchenkoi 33 33 100% Dipolydora bidentata 57 56 98% D. cardalia 24 24 100% D. carunculata 48 48 100% D. commensalis 125 125 100% (А) () СТАРТ ГФИ- ГФИ- (+) () (Б) СТАРТ ГФИ- ГФИ- (+) Рис. 2. Зимограммы ГФИ Dipolydora carunculata (А) и D. cardalia (Б), демонстри рующие согласованность аллозимной изменчивости изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2. (А): Дорожки 127, 2831 ;

(Б): Дорожки 13, На зимограммах видно, что у каждого из исследованных самцов D. carun culata и D. cardalia аллозимные спектры ГФИ-1 идентичны аллозимным спек трам ГФИ-2. Если изофермент ГФИ-1 имеет гомозиготный фенотип, то ГФИ- имеет точно такой же гомозиготный фенотип (см. например, А: дорожки 1–5;

Б:

дорожки 4–6). Если ГФИ-1 имеет гетерозиготный фенотип, то ГФИ-2 имеет точ но такой же гетерозиготный фенотип (см. например, А: дорожки 6, 8, 11, 12;

Б:

дорожки 7, 8).

() СТАРТ (А) ГФИ- гибриды ГФИ- (+) (Б) (В) () ГФИ- гибриды СТАРТ ГФИ- (+) Рис. 3. Зимограммы ГФИ, демонстрирующие несогласованность аллозимной изменчивости изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 у Dipolydora bidentata (А), P. cal carea (Б) и P. brevipalpa (В).

(А): Дорожки 17, (Б): Дорожки 1, 2, 46, 8 P. calcarea;

3,7 P. manchenkoi. P. calcarea и P. manchenkoi являются близнецовыми видами, которые неотличимы по внеш ним признакам, поэтому они представлены на одной зимограмме.

(В): Дорожки 1, 2, На зимограммах видно, что некоторые из самцов D. bidentata, P. calcarea и P. brevipalpa имеют разные аллозимные спектры изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2.

Изофермент ГФИ-1 имеет гомозиготный фенотип, а ГФИ-2 – гетерозиготный (А:

дорожка 10;

Б: дорожка 5;

В: дорожка 4), или наоборот (Б: дорожки 4, 6, 8).

Таблица 3. Три группы видов полихет, различающихся по доле идентичных фе нотипов ГФИ-1 и ГФИ-2.

Усредненная доля особей с идентичными аллозимными Вид спектрами ГФИ-1 и ГФИ- (результаты X теста на гомогенность) P. calcarea 56, 7% P. limicola (X (df = 1) = 0,05 X.0,5 (1) = 3.84) P. сornuta 90, 9 % P. glycymerica (X (df = 1) = 0,32 X.0,5 (1) = 3.84) P. brevipalpa P. manchenkoi D. bidentata 99, 0 % D. сardalia (X (df = 5) = 3,24 X.0,5 (df = 5) = 11,07) D. carunculata D. commensalis ОБСУЖДЕНИЕ 1. Трудности интерпретация изоферментных спектров ГФИ полидо рид с применением общепринятой концепции изоферментов.

Выявленные электрофоретические спектры ГФИ у полидорид можно попытаться объяснить, придерживаясь традиционной интерпретации. При этом представляется разумным рассмотреть две модели генетического контроля: 1) один генный локус ГФИ, продукты которого претерпевают по сттрансляционную модификацию, 2) два независимых генных локуса ГФИ-1 и ГФИ-2. Однако, как первая, так и вторая интерпретации встреча ются со значительными трудностями.

1) Один генный локус ГФИ.

Согласованная аллозимная изменчивость изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 у 100% особей может быть объяснена, исходя из представления, что оба изофермента являются продуктами одного гена, т.е. один из них (ГФИ-1) является первичным изоферментом, а другой (ГФИ-2) – вторич ным изоферментом, возникшим в результате посттрансляционной моди фикации молекул первичного изофермента ГФИ-1. Однако эта интерпре тация маловероятна, поскольку: во-первых, изоферменты ГФИ-1 и ГФИ- разделены на геле необычно большим расстоянием. При использующихся условиях проведения электрофореза это расстояние составило 2-4 см.

Такое большое электрофоретическое различие в подвижности ГФИ-1 и ГФИ-2 нехарактерно для ситуации посттрансляционного происхождения изофермента ГФИ-2. Как правило, первичные и вторичные изоферменты отстоят друг от друга на расстоянии, обусловленном различием молекул в единицу заряда. Такое расстояние соответствует минимальному расстоя нию между электрофоретически выявляемыми аллельными вариантами фермента – аллозимами и, как правило, не превышает 0,5 см.

Во-вторых, между изоферментами ГФИ-1 и ГФИ-2 выявлялись гиб ридные молекулы, чего не должно бы быть – богатый опыт электрофоре тических исследований свидетельствует о том, что первичные и вторич ные изоферменты олигомерных ферментов никогда не образуют гибри дов. Это соответствует общепринятому мнению, что посттрансляционные модификации происходят уже после ассоциации субъединиц в олигомер ные каталитически активные молекулы (Harris, Hopkinson, 1976) и что оли гомерные молекулы, однажды образовавшись, уже никогда не диссоции руют и не реассоциируют in vivo снова (Serov et al., 1979).

В-третьих, против того, что ГФИ-1 и ГФИ-2 являются первичным и вторичным изоферментами, свидетельствует разная тканевая и половая специфичность их экспрессии. Согласно общепринятой концепции изо ферментов первичные и вторичные изоферменты, определяемые одним геном, выявляются в одних и тех же клетках и одновременно, поскольку посттрансляционным модификациям подвергается только часть молекул первичного изофермента (Uy and Wold, 1977;

Poly, 1997).

2) Два независимых генных локуса ГФИ-1 и ГФИ-2.

Эта модель не может дать убедительного объяснения возникнове нию и сохранению согласованной аллозимной изменчивости в двух неза висимых генных локусах у подавляющего большинства особей каждого из исследованных видов. Вероятность этого чрезвычайно мала, и практиче ски нереальна для большого числа аллелей в каждом из генных локусов, даже если допустить их тесное сцепление.

Кроме того, если придерживаться традиционной интерпретации, то создается впечатление, что у близких видов полидорид система ГФИ мо жет иметь разные генетические механизмы. У одних видов система изо ферментов ГФИ представлена одним генным локусом, у других – двумя.

При этом генетические основы системы изоферментов ГФИ оказываются одинаковыми у видов разных родов (Polydora и Dipolydora), и в то же вре мя принципиально разными у видов одного и того же рода. Трудно найти объяснение тому, как в процессе эволюции двух групп близких видов для детерминации одинаковой системы изоферментов, характеризующихся одинаковой дифференциальной экспрессией, могли возникнуть две раз ные генетические системы.

Таким образом, полученные результаты не могут найти удовлетво рительного объяснения с позиций общепринятой концепции изофермен тов.

2. Альтернативный сплайсинг – механизм, способный генерировать изоферментные спектры ГФИ, наблюдаемые у полидорид.

Трудности интерпретации полученных нами данных по изофермент ным спектрам ГФИ у полидорид на основании общепринятой концепции изоферментов дали нам основание предположить, что в этом случае мы имеем дело с изменчивостью, обусловленной действием механизма АС.

Хорошо известно, что АС является одним из основных генераторов бел ковых изоформ у эукариот. Благодаря АС с одного структурного гена, об ладающего экзон-интронной структурой, может считываться несколько структурно (Andreadis et al., 1987;

Schmucker et al., 2000) и функционально (Kriventseva et. al.;

2003) отличающихся белковых изоформ. Альтернатив Использование альтернативных сайтов инициации и терминации транс крипции также может приводить к появлению структурно отличающихся изо форм одного и того же белка, за счет изменения его 5’ и 3’ концов, соответст венно. Однако, учитывая то, что и альтернативная инициация (множественные сайты инициации) и альтернативная терминация (множественные сайты поли аденилирования) транскрипции, протекают в тесной связи с АС и принципиаль но не отличаются от него по своему действию на структуру и электрофоретиче ские свойства белковых изоформ, а также принимая во внимание, что некото рые авторы (Andreadis et al., 1987) рассматривают их в качестве событий АС, в данной работе они рассматриваются вместе и объединены общим названием – АС.

ные изоформы одного белка, как правило, характеризуются дифференци альной экспрессией во внутриклеточном и тканевом пространстве орга низма, а также во времени его онтогенеза (Lopez, 1998, Graveley, 2001;

Maniatis and Tasic, 2002). К настоящему времени имеются эксперимен тальные данные об участии АС в экспрессии 270 ферментов Metazoa (Манченко и Панькова, неопубликованные данные). Многие из этих генов кодируют ферменты, которые вовлечены в электрофоретический анализ и их изоферменты широко используются в качестве генных маркеров. В об щей сложности события АС описаны для 85 таких ферментов, что состав ляет 20% всех ферментов, для которых разработаны методы получения зимограмм (Manchenko, 2003). Таким образом, изоферменты каждого пя того фермента, исследуемого электрофоретически, могут быть продуктом АС.

Согласованная и несогласованная аллозимная изменчивость изо ферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 может быть объяснена различным уровнем по лиморфизма в последовательностях конститутивных и альтернативных экзонов гена ГФИ (Manchenko, 2001). Под альтернативным экзоном мы понимаем любой кодирующий участок пре-мРНК, который вовлечен в ме ханизм АС. В одном случае альтернативный экзон является обычным эк зоном, и после прохождения всех стадий сплайсинга и созревания мРНК входит в состав мРНК, соответственно – транслируется в часть белковой молекулы. В другом случае, в процессе сплайсинга альтернативный экзон может удаляться как интрон. В результате он не входит в состав мРНК и не транслируется. Конститутивные экзоны – кодирующие участки пре мРНК, которые всегда входят в состав мРНК. Согласованная аллозимная изменчивость изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 будет наблюдаться в том случае, если в процесс АС вовлечен электрофоретически мономорфный экзон. Как можно видеть из рисунка 4 (А) в процессе АС молекул пре мРНК гена ГФИ образуется две формы молекул мРНК (мРНК ГФИ-1 и мРНК ГФИ-2) – альтернативные изоформы мРНК, определяющие соот ветственно изоферменты ГФИ-1 и ГФИ-2. Одна из форм (мРНК ГФИ-2) со держит альтернативный экзон, другая (мРНК ГФИ-1) нет. Отсутствие электрофоретически мономорфного альтернативного экзона в молекулах аллельных мРНК ГФИ-1, изменяет заряд соответствующих аллельных изоферментов ГФИ-1 на одинаковую величину и их электрофоретическая Рис. 4. Схема, отображающая влияние мономорфного (А) и полиморфно го (В) альтернативных экзонов на характер аллозимной изменчивости изофер ментов ГФИ-1 и ГФИ-2. Конститутивные экзоны показаны черными прямоуголь никами, альтернативные экзоны – серыми. Интроны изображены в виде сплош ной линии, соединяющей экзоны. Треугольником () отмечены экзоны, несущие замещения, обуславливающие различия аллельных изоформ фермента (алло зимов) (см. описание в тексте).

подвижность относительно друг друга не меняется. Поэтому изоферменты ГФИ-1 и ГФИ-2 имеют одинаковые аллозимные спектры (рис. 4А).

Несогласованная аллозимная изменчивость будет наблюдаться в том случае, если в процесс АС вовлечен электрофоретически полиморф ный экзон в гетерозиготном состоянии (рис. 4В). На рисунке видно, что в состав молекул мРНК ГФИ-2 входит полиморфный альтернативный экзон, поэтому изофермент ГФИ-2 имеет гетерозиготный фенотип. Различия ал лельных вариантов изофермента ГФИ-2 обусловлены замещениями, при сутствующими в альтернативном экзоне. В молекулах мРНК ГФИ-1 таких замещений нет, т.к. в них отсутствует альтернативный экзон, поэтому изофермент ГФИ-1 имеет гомозиготный фенотип. Таким образом, изо ферменты ГФИ-1 и ГФИ-2 имеют разные аллозимные спектры.

Рис. 5. Схема, отображающая влияние полиморфных альтернативного и конститутивного экзонов на характер аллозимной изменчивости. Конститутив ные экзоны показаны черными прямоугольниками, альтернативные экзоны – серыми. Интроны изображены в виде сплошной линии, соединяющей экзоны.

Треугольником () отмечены экзоны, несущие замещения, обуславливающие различия аллельных изоформ фермента (аллозимов). (см. описание в тексте).

В том случае если полиморфным является не только альтернатив ный экзон, но и конститутивные экзоны, особь будет демонстрировать разные гетерозиготные фенотипы по изоферментам ГФИ-1 и ГФИ-2 (рис.

5). На рисунке видно, что отличия аллельных изоформ ГФИ-2 обусловле ны замещениями и в альтернативном, и в конститутивном экзонах, тогда как различия аллельных изоформ ГФИ-1 – только замещениями в консти тутивном экзоне. Отсутствие полиморфного альтернативного экзона в мо лекулах мРНК-ГФИ-1 приводит к изменению заряда аллельных изоформ фермента ГФИ-1 и их электрофоретической подвижности относительно друг друга. Поэтому аллозимные спектры изоферментов ГФИ-1 и ГФИ- будут разными (рис. 5).

Имеются данные, что альтернативные экзоны, как правило, пред ставляют собой более короткие последовательности по сравнению с Рис. 6. Схема, отображающая влияние полиморфного конститутивного экзона на характер аллозимной изменчивости. Конститутивные экзоны показаны чер ными прямоугольниками, альтернативные экзоны – серыми. Интроны изобра жены в виде сплошной линии, соединяющей экзоны. Треугольником () отме чены экзоны, несущие замещения, обуславливающие различия аллельных изоформ фермента (аллозимов). Из схемы видно, что если полиморфным яв ляется только конститутивный экзон изоферменты ГФИ-1 и ГФИ-2 будут иметь идентичные аллозимные спектры. Это объясняется тем, что молекулы мРНК ГФИ-1 и мРНК ГФИ-2 отличаются по признаку наличие/отсутствие альтернатив ного экзона, который является мономорфным и не влияет на характер аллозим ной изменчивости (см. обсуждение выше).

конститутивными экзонами (Stamm et al., 2000). У высших эукариот сред ний ген с экзон-интронной структурой имеет 5-6 экзонов, из которых, как правило, только один является альтернативным (Fedorova and Fedorov, 2003). Из этого следует, что по своему общему размеру конститутивные экзоны среднего гена в несколько раз превышают размер его альтерна тивного экзона. Следовательно, если вероятность возникновения нуклео тидных замещений одинакова и в конститутивных, и в альтернативных эк зонах, то замещения чаще будут затрагивать именно конститутивные эк зоны. Таким образом, среди конспецифичных особей будут преобладать те, которые имеют идентичные аллозимные спектры альтернативных изоферментов (рис. 6). Это подтверждается результатами, полученными для димерной глицерол-3-фосфат дегидрогеназы дрозофилы (Wright and Shaw, 1969;

Bewley et al.,1974;

Cook et al., 1988) и тетрамерной пируватки назы грызунов (Peters et al., 1981;

Noguchi et al., 1986). Анализ данных, по лученных независимыми исследованиями, показал, что в двух этих случа ях изоферменты, демонстрирующие согласованную аллозимную изменчи вость, генерируются АС. При этом, как и в нашем случае, изоформы пиру ваткиназы формируют гибридные молекулы. Все приведенные выше дан ные свидетельствуют в пользу гипотезы о происхождении изофермента ГФИ-2 у полидорид в результате альтернативного сплайсинга молекул пре-мРНК, считываемых с одного гена Gpi.

Необычно большое расстояние на зимограммах между ГФИ-1 и ГФИ 2 легко объясняется значительными структурными различиями, ожидае мыми для изоферментов, генерируемых АС. Показано, что 80% всех со бытий АС у человека являются событиями разноразмерного АС, который приводит к образованию белковых изоформ, существенно отличающихся по своим размерам и молекулярной массе (Mironov et al., 1999;

Stamm et al., 2000). Такие структурные различия альтернативных изоформ белка должны обуславливать их ярко выраженные электрофоретические разли чия, что и наблюдается в нашем случае.

Тканеспецифичная экспрессия изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 также может быть объяснена участием АС в экспрессии гена ГФИ. Многочислен ные примеры свидетельствуют о том, что, как правило, альтернативные изоформы белка характеризуются дифференциальной экспрессией. Сре ди этих примеров есть и такие, которые демонстируют специфичную экс прессию альтернативных изоформ ферментов в сперматогенных клетках (Manky, 1997). К ним относятся ДНК-лигаза III (Manky, 1997) и аденозин деаминаза мыши (Meng et al., 1997), гексокиназа мыши (Mori et al., 1998) и человека (Andreoni et al., 2000).

АС также легко объясняет наличие гибридов между изоферментами ГФИ-1 и ГФИ-2. Гибридизация полипептидов ГФИ, синтезируемых на об лигатных и альтернативных мРНК, вполне возможна, если такие матрицы образуются в одних и тех же клетках, в одних и тех же компартментах, а структурные различия синтезируемых полипептидов не препятствуют их олигомеризации. Ярким примером способности альтернативных изоформ формировать гибриды служит гибридизация изоферментов пируваткиназы крысы (Noguchi et al., 1986).

Таким образом, предположение об участии АС в генерировании изоферментных спектров ГФИ легко снимает все трудности, связанные с интерпретацией их генетического контроля.

3. Возможное ретропозонное происхождение изофермента ГФИ-2.

Известны примеры, когда в сперме животных обычные ферментные формы часто замещены уникальными изоформами, часть которых гене рируется АС (Mori et al., 1998, Manky, 1997), а часть определяется незави симыми генами, представляющими собой безинтронные ретротранспозо ны (Hendriksen et al., 1997). Если кДНК, скопированная с процессирован ной мРНК с помощью обратной транскриптазы, вставляется в ядерный ге ном, в область промотора, специфичного для сперматогенных клеток, то возникает функциональный безинтронный ген, экспрессируемый в сперме.

В связи с этим мы не исключаем возможность того, что в случае незави симой аллозимной изменчивости изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 P. calcarea и P. limicola, характерной для изоферментов, определяемых разными ге нами, мы имеем дело с ситуацией, когда изофермент ГФИ-2 определяется независимым структурным геном ретропозонного происхождения. Хотя более вероятным представляется наличие одного гена ГФИ полидорид, экспрессия которого сопряжена с механизмом АС.

ВЫВОДЫ 1. У всех десяти исследованных видов полидорид (Polydora brevipalpa, P. calcarea, P. сornuta, P. glycymerica, P. limicola, P. manchenkoi, Di polydora bidentata, D. cardalia, D. carunculata, D. commensalis (Poly chaeta: Spionidae)) у самцов выявлено два изофермента ГФИ – ГФИ 1 и ГФИ-2, у самок – только один ГФИ-1.

2. Изофермент ГФИ-1 у всех исследованных видов экспрессируется в соматических тканях, а ГФИ-2 – в сперме.

3. У всех исследованных видов полидорид выявлены гибридные зоны между изоферментами ГФИ-1 и ГФИ-2, что свидетельствует о том, что изофермент ГФИ-2 не может иметь посттрансляционное проис хождение. Об этом же свидетельствует и большое электрофорети ческое различие между изоферментами ГФИ-1 и ГФИ-2.

4. Согласованная полиаллельная аллозимная изменчивость изофер ментов ГФИ-1 и ГФИ-2 у большинства особей у всех исследованных видов полидорид свидетельствуют против того, что эти изофермен ты определяются разными генными локусами.

5. Своеобразие спектров ГФИ полидорид – согласованная аллозимная изменчивость двух гибридизующихся изоферментов у большинства исследованных особей наряду с наличием редких особей с несогла сованной аллозимной изменчивостью и разная тканеспецифичность экспрессии этих изоферментов – может быть объяснено участием альтернативного сплайсинга в экспрессии одного гена ГФИ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Manchenko G.P., Pankova V.V. Sex-linkage of a gene responsible for the ex pression of alternative isozyme of glucose-6-phosphate isomerase in Polydora brevi palpa (Polychaeta: Spionidae) // GFI Bull. 2001. Vol. 34. P. 55.

2. Pankova V.V., Manchenko G.P. Individual variation of sets of hybrid isozymes of glucose-6-phosphate isomerase in Polydora brevipalpa (Polychaeta: Spionidae) // Evolution, Genetics, Ecology and Biodiversity: Abstr. Intern. Confer. (MAPEEG), Vladivostok-Vostok Marine Biological Station, 2001. P. 21.

3. Панькова B.B., Манченко Г.П. Исследование альтернативных изофермен тов глюкозо-6-фосфат изомеразы Polydora brevipalpa (Polychaeta: Spionidae) // IV Региональная конференция по актуальным проблемам экологии, морской био логии и биотехнологии: Тезисы докладов: Владивосток: Изд-во ДВГУ, 2001. С.

92-94.

4. Панькова B.B., Манченко Г.П. Ген, ответственный за экспрессию спермий специфичного изофермента ГФИ-2 Polydora brevipalpa (Polychaeta: Spionidae), локализуется в псевдоаутосомальной области половых хромосом // VII Дальне восточная молодежная школа – конференция по актуальным проблемам химии и биологии: Тезисы докладов: Владивосток: ДВО РАН, 2003, с. 41.

5. Панькова B.B., Манченко Г.П. Сцепление генов, ответственных за опреде ление пола и экспрессию спермий-специфичного изофермента глюкозо-6 фосфат изомеразы, у полихеты Polydora brevipalpa // Генетика. 2003. Т. 39, № 8.

С. 1106-1110.

6. Manchenko G.P., Radashevsky V.I., Pankova V.V. Obligatory and male specific GPI isozymes of Polydora limicola (Polychaeta: Spionidae) form unexpected hybrids in females // GFI Bull. 2003. Vol. 36. P. 34.

7. Pankova V.V., Pudovkin A.I., Manchenko G.P. Allozymic variation determined by alternatively spliced exon of the GPI gene in Polydora brevipalpa (Polychaeta:

Spionidae) // GFI Bull. 2004. Vol. 37. P. 30.

8. Pankova V.V., Radashevsky V.I., Manchenko G.P. Coordinated allozyme varia tion of two hybridizing isozymes of glucose-6-phosphate isomerase in polydorids (Polychaeta: Shionidae) // GFI Bull. 2005. Vol. 38. P. 27.

Radashevsky V.I. and Pankova V.V. The morphology of two sibling sympatric 9.

Polydora species (Annelida: Spionidae) from the Sea of Japan // The Journal of Ma rine Biological Association of United Kindom» (JMBA). 2006. V. 86. P. 245-252.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.