Картирование и анализ генов и функционально значимых последовательностей генома человека
На правах рукописи
КЛИМОВ Евгений Александрович КАРТИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ ГЕНОВ И ФУНКЦИОНАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА Специальность 03.02.07 – «генетика»
АВТОРЕФЕРАТ
на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва – 2010 г
Работа выполнена в лаборатории сравнительной генетики животных Учреждения Российской академии наук Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Галина Ефимовна СУЛИМОВА
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Евгений Иванович РОГАЕВ доктор биологических наук Наталия Николаевна МАЗУРЕНКО доктор биологических наук Антон Александрович БУЗДИН
Ведущая организация:
Медико-генетический научный центр РАМН
Защита состоится «21» октября 2010 г. в часов на заседании диссертационного Совета Д 002.214.01 при Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Губкина, д. 3.
факс (499) 132-8962, электронная почта [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института общей генетики им. Н.И.
Вавилова РАН, Москва, ул. Губкина, д.3.
Автореферат разослан «_» _ 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета к.б.н. Т.А. Синельщикова СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ APOT – амплификация онкогенных транскриптов вируса папилломы (Amplification of Papillomavirus Oncogenes Transcripts) BC – карцинома молочной железы (Breast Carcinoma) CpG-островки – (G+C)-богатые участки генома, обогащенные динуклеотидами CG EST – эксрессирующиеся нуклеотидные последовательности (Expressed Sequence Tag) FISH – флуоресцентная in situ гибридизация (Fluorescence in situ Hybridization) RCC – карцинома почки (Renal Cell Carcinoma) RH – радиационные гибриды (Radiation Hybrids) SAGE – серийный анализ экспрессии генов (Serial Analysis of Gene Expression) SNP – однонуклеотидный полиморфизм ДНК (Single Nucleotide Polymorphism) STS – участки, идентифицируемые по нуклеотидным последовательностям (Sequence Tagged Site) TSG - ген-супрессор опухолевого роста (Tumor Suppressor Gene) YAC – искусственные хромосомы дрожжей (Yeast Artificial Chromosomes) ВПЧ – вирус папилломы человека Danio rerio – рыбка, модельный объект в эмбриологии и генетике (рус. – Данио рерио, англ. – zebrafish) МЧРА – метил-чувствительный рестрикционный анализ ОТ – обратная транскрипция ПЦР – полимеразная цепная реакция РВ-ПЦР – полимеразная цепная реакция в реальном времени АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Картирование генома человека и локализация генов на хромосомах человека на протяжении последнего десятилетия ХХ века было одним из основных направлений геномики. К началу ХХI века были построены интегрированные карты всех хромосом человека, картировано более генов. Тотальное секвенирование генома человека, казалось бы, снимало необходимость продолжения работ по картированию генома человека. Тем не менее, оставались задачи, которые быстрее и проще можно решить с помощью картирования: независимое подтверждение корректности геномных контигов, выявление мест локализации близкородственных генов (или псевдогенов), выявление мест возможной локализации новых генов человека с помощью универсальных маркеров генов.
Особый интерес представляет тонкое физическое картирование и последующий структурно-функциональный анализ участков хромосом человека, вовлеченных в развитие заболеваний. Несомненную важность представляют локусы хромосом и гены, вовлеченные в процессы канцерогенеза. В развитии злокачественной опухоли важную роль играют генетические и эпигенетические процессы, необходимость детального изучения которых является основным моментом для понимания механизмов канцерогенеза. При этом основной упор необходимо делать на изучение активности продуктов конкретных генов и их ансамблей в процессе канцерогенеза. Одним из основных подходов в выявлении онкогенов и TSG может быть сравнение транскрипционной активности генов в нормальных и опухолевых тканях.
Особую нишу занимают опухоли, вызываемые внешними агентами.
Для рака шейки матки известен основной трансформирующий агент – ДНК содержащий вирус папилломы человека, выявляемый в 99% опухолей данной локализации. В данном случае интерес представляет уже взаимодействие вирусного и клеточного геномов. Показано, что ДНК вируса может интегрировать в геном клетки хозяина, однако следствия этого процесса не были ясны: куда происходит интеграция? является ли она инициирующим опухоль механизмом или нет? как происходит взаимодействие интегрированной ДНК вируса и ближайшего окружения генома клетки?
Основной задачей современной молекулярной генетики является изучение структуры и функции генов. На 2004 год было полностью охарактеризовано примерно 7000 генов человека, т.е. экспериментально не подтверждена функция около 70% кодирующих белок генов.
Экспериментальное определение функций предсказанных генов является необходимым моментом и включает в себя подтверждение экзон интронной структуры, анализ тканеспецифичности экспрессии и проверку участия исследуемых генов в процессе развития заболеваний.
ЦЕЛЬЮ исследования являлось тонкое физическое картирование маркирующих гены человека последовательностей ДНК (NotI-STS маркеры и EST, места интеграции экспрессирующейся ДНК ВПЧ тип 16) и анализ картированных генов и последовательностей генома человека, прилегающих к местам встраивания ВПЧ тип 16. В соответствии с поставленной целью основные задачи исследования заключались в следующем:
1. Картирование NotI-STS-маркеров хромосомы 3 человека и подтверждение возможности использования данного типа маркеров как универсальных маркеров генов млекопитающих (на примере человека).
2. Анализ транскрипционной активности картированных генов хромосомы 3 человека в опухолях.
3. Картирование и анализ мест интеграции вируса папилломы тип 16 в геном человека. Выявление механизмов терминации транскрипции интегрированной ДНК ВПЧ16.
4. Картирование EST.
5. Анализ структуры и тканеспецифичности экспрессии картированных генов человека и их гомологов у модельных организмов.
6. Оценка частот аллелей генов человека CCK, CCK1R, CCK2R и CCR5 в российских популяциях. Создание адекватной тест-системы для выявления двух мутаций в гене CCR5.
ОБЪЕКТАМИ ИССЛЕДОВАНИЯ были человек и модельные организмы:
крыса, мышь и рыба Danio rerio.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.
1. Физические NotI-карты являются эффективным инструментом для верификации протяженных геномных контигов и идентификации новых генов человека. NotI-STS-маркеры следует рассматривать как универсальные маркеры генов.
2. Интеграция вируса папилломы человека происходит в любые участки генома клетки хозяина. Терминация транскрипции интегрированной ДНК вируса осуществляется за счет близлежащих клеточных сигналов полиаденилирования.
3. Изменение экспрессии генов RHOA, SEMA3B, RARB, GPX1, DAG1, NBEAL2, CKAP2, W91914 и H51703 в опухолях различной локализации является надежным тестом для определения их роли в процессах развития опухоли.
4. Картированные и охарактеризованные нами гены NBEAL2 и ABLIM консервативны по своей структуре и функции у млекопитающих.
Ген WASF4 имеется только у человека и приматов, что свидетельствует о недавнем его появлении в геноме млекопитающих.
5. Созданная нами тест-система для одновременного определения мутаций CCR5del32 и CCR5m303 в гене CCR5 человека является эффективным инструментом для определения генетической устойчивости к заражению М-тропным вариантом ВИЧ.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.
В ходе выполнения данной работы впервые методом RH-картирования построена тонкая физическая карта 3p21-p22, включающая 60 NotI-STS маркеров.
Впервые проведено точное физическое картирование (RH- и in silico картирование) мест интеграции ДНК вируса папилломы человека тип 16.
Показано, что интегрированный вирус использует клеточные сайта терминации траскрипции.
Впервые выявлены механизмы активации транскрипции онкогена RHOA в опухолях: за счет умножения копий гена и посредством деметилирования CpG-островков промоторного района.
Впервые показано снижение уровня транскрипции гена SEMA3B при светлоклеточном почечноклеточном раке, а также при раке толстой кишки и эпителиальном раке яичников.
Впервые описана структура генов человека CKAP2, ABLIM2, WASF4 и гена Nbeal2 крысы. Для генов Ablim2 и Nbeal2 крысы показана тканеспецифичность экспрессии.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.
NotI-STS-маркеры можно с высокой эффективностью использовать в качестве универсальных маркеров генов. Применение данного типа маркеров эффективно при картировании еще не изученных геномов, а построенные с их помощью карты позволят не только с высокой вероятностью идентифицировать гены, но и проводить оценку корректности совмещения геномных контигов при секвенировании генома.
В качестве теста для выявления онкогенов и генов-супрессоров опухолевого роста эффективно оценивать изменения экспрессии генов в опухолях различной локализации. Использование данного подхода позволяет быстро отбирать гены, участвующие в развитии заболевания, не только при изучении молекулярных основ канцерогенеза, но и при других системных заболеваниях человека.
Разработана эффективная тест-система для одновременного определения двух мутаций (CCR5del32 и CCR5m303) в гене CCR5 человека и их цис транс-положения. Данные мутации обуславливают генетическую устойчивость обследуемых к инфицированию вирусом иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ1).
СТРУКТУРА РАБОТЫ.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на международной конференции «Проблемы радиационной генетики на рубеже веков» (Москва, 2000);
на втором съезде ВОГиС (Санкт-Петербург, 2000);
на международной конференции по геному человека (HGM’2000) (Ванкувер, 2000);
на итоговых конференциях «Геном человека» (Черноголовка, 1999, 2000;
Москва, 2001);
на Пущинских конференциях молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2001;
2002;
2003;
2004;
2005;
2006);
на второй российской конференции молодых ученых «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2001);
на международной конференции «Биоинформатика регуляции и структуры генома (BGRS’2002)» (Новосибирск, 2002);
на международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (Москва, 2002);
на международных конференциях «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, 2003;
2006);
на V съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005);
на 2-й Российской конференции по фундаментальной онкологии (Санкт-Петербург, 2006);
«Фундаментальные науки – медицине» (Москва, 2006);
на конференции молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике, посвященной 120 летию со дня рождения Н.И. Вавилова (Киев, 2007);
на Съезде генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина и V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009).
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 244 страницах и иллюстрирована 35 таблицами и 52 рисунками. Список цитируемой литературы содержит 295 источника, из них 27 на русском и 268 на английском языке.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 79 печатных работ, в том числе 1 патент и 17 работ в рецензируемых журналах (из них 13 – в отечественных и 4 в международных), из них два обзора в отечественных журналах.
Работа выполнена при финансовой поддержке ПП ФЦНТП “Геном человека” (грант 89’99), а также РФФИ (грант 00-15-97777) и ФЦП “Интеграция” (проект 2.1-А0077), грантов Президента РФ «Поддержка ведущих научных школ» (НШ-827.2003.4, НШ-10122.2006.4, НШ 3914.2008.4) и «Поддержка молодых ученых» (МК-963.2005.4), гранта INTAS (03-51-4983), гранта программы Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине».
Основные материалы. В работе использованы нуклеотидные последовательности NotI-клонов хромосомы 3 человека [Kashuba et al., 1999;
Zabarovsky et al., 1994a;
Zabarovsky et al., 1994b], зарегистрированных в GenBank. Картирование проводили с использованием коммерческой панели радиационных гибридов GeneBridge 4 RH-Panel («Research Genetics, Inc.», USA). Образцы опухолевой и прилежащей гистологически нормальной ткани собраны и клинически охарактеризованы в РОНЦ РАМН. Использовали ткани только тех больных, которые до операции не получали лучевую или химиотерапию.
Все опухоли классифицированы в соответствии с TNM-классификацией Международного противоракового союза (UICC, версия 2002 г. [UICC TNM classification of malignant tumours, 2002]) и типированы гистологически на основании классификации Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) [World Health Organization. International histological classification of tumours, 2003 & 2004]. Для отбора образцов с высоким содержанием опухолевых клеток проводили дополнительный гистологический анализ микросрезов (толщина 3-5 мкм), окрашенных эозином и гематоксилином. Отбирали образцы с содержанием опухолевых клеток не менее 70%. Образцы тканей хранили при -70°С. Образцы тотальной РНК из крови больных лейкозом: хронический лимфолейкоз, стадия 2 (ХЛЛ2);
хронический лимфолейкоз, стадия 3 (ХЛЛ3);
острый миелоидный лейкоз, стадия 1 (ОМЛ1);
миелодиспластический синдром, стадия 5 (МДС5);
острый лимфолейкоз, ремиссия 1 (ОЛЛ рем1);
острый миелоидный лейкоз, ремиссия 1 (ОМЛ рем1). В качестве контроля использовали лимфоциты периферической крови шести взрослых доноров.
Образцы ДНК, выделенные из цельной крови условно-здоровых жителей Москвы (198 человек) любезно предоставлены лабораторией функциональной геномики ИОГен РАН. Образцы ДНК, использованные в работе по изучению мутаций в гене CCR5, получены в Институте иммунологии РАМН.
Основные методы. Выделение ДНК, выделение РНК из тканей, синтез кДНК, ПЦР, ОТ-ПЦР, полуколичественная ОТ-ПЦР, количественная РВ ПЦР, ПЦР-ПДРФ, аллель-специфичная ПЦР, клонирование фрагментов ПЦР в ТА векторе, электрофорез в ПААГ и агарозном геле, компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, основные статистические методы, для оценки изменения экспрессии генов в опухоли по отношению к норме использовали «нормированный коэффициент» [(T N)/N], где T – уровень экспрессии гена в опухоли, а N – прилегающей в нормальной ткани (в единицах светимости продуктов ПЦР после разделения в агарозном геле с бромистым этидием).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ 1. RH-КАРТИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ NotI-STS-МАРКЕРОВ ХРОМОСОМЫ 3 ЧЕЛОВЕКА, АССОЦИАЦИЯ NotI-STS С ГЕНАМИ (в работе принимали участие Рахманалиев Э.Р., Компанийцев А.А., Мойсяк Е.В. и Удина И.Г.) 1.1. Создание STS к NotI-клонам хромосомы 3 человека и их локализация На основе нуклеотидных последовательностей ДНК из NotI прыжковых и связующих клонотек, специфичных для хромосомы человека, созданы 94 NotI-STS-маркера к 72 индивидуальным NotI-клонам.
Праймеры подбирали к нуклеотидным последовательностям, прилегающим либо к 5’-, либо к 3’-концу NotI-участка. Условия амплификации оптимизировали по концентрации ионов магния, температуре и времени отжига.
Физическое картирование NotI-STS-маркеров проводили методом RH-картирования с использованием ПЦР-скринига RH-панели GeneBridge 4. Метод RH-картирования относится к методам физического картирования с высоким уровнем разрешения. Подробно принципы метода и его преимущество перед другими методами физического катирования рассмотрены в статье [Рахманалиев Э.Р., Климов Е.А., Сулимова Г.Е.
Методы картирования геномов млекопитающих // Успехи современной биологии. 2004. Т.124. №3. С.286-302].
1.2. Определение локализации маркеров на RH-карте Для получения информации о локализации маркера на RH-карте, результаты ПЦР-скрининга RH-панели отправляли по Internet в соответствии с формами, приведенными на сервере Whitehead Institute. Для всех локализованных маркеров значение LOD score находилось в пределах от 0,00 до 2,56, т.е. не превысило значение 3, что свидетельствует о достоверности сцепления исследуемых маркеров с маркерами рабочей рамки, и, следовательно, о достоверности их локализации на RH-карте.
1.3. Совмещение RH-карты с другими типами карт и построение физической NotI-карты хромосомы 3 человека Картированные NotI-STS-маркеры зарегистрированы как RH маркеры в базе данных RHdb, поддерживаемой EMBL (http://corba.ebi.ac.uk/RHdb).
Цитогенетическая локализация NotI-STS-маркеров установлена ранее с использованием FISH [Protopopov et al., 1996;
Kashuba et al., 1999;
Protopopov et al., 2003]. Результаты локализации NotI-STS на цитогенетической карте, полученные с помощью FISH- и RH картирования, как правило, хорошо совпадали.
Использование RH-картирования позволило при уточнении локализации NotI-STS-маркеров сопоставить результаты, полученные разными методами, и установить локализацию NotI-STS-маркеров по совокупности данных по RH-, контиг- [Kashuba et al., 1999;
Kashuba et al., 1995], цитогенетическому картированию [Protopopov et al., 1996;
Protopopov et al., 2003] и позиции геномных фрагментов, идентичных нуклеотидным последовательностям анализируемых NotI-STS (картирование in silico). Порядок расположения 72 NotI-STS-маркеров на хромосоме 3 человека представлен на рисунке 1.
Таким образом, возможность интеграции построенной NotI-карты и разнообразных физических карт хромосом человека (YAC-, RH-, EST карты, карты локализации генов, геномных контигов и др.) обеспечивает наиболее эффективное использование предоставляемой ими информации.
Не выявлено гомологий двух NotI-STS (NL1-256 и NL3-005) с геномными ДНК хромосомы 3 человека. ДНК этих маркеров вообще не представлены в геномных контигах, хотя они входят в состав контига, перекрывающего область 3р21-р22 [Kashuba et al., 1999;
Kashuba et al., 1995], и в международных базах данных зарегистрированы как NotI-клоны, так и NotI–STS, созданные на их основе. Маркеры NL3-007 и NLM-084, согласно данным геномных контигов, локализованы на других хромосомах. Отмечена даже множественная локализация маркера NLM 084, но не на хромосоме 3. При этом локализация этого маркера на хромосоме 3 доказана нами методом RH-картирования. Клоны NL1-256, NL3-007 и NL3-005 входят в состав контига, перекрывающего область 3р21-р22 [Protopopov et al., 2003]. Локализация клона NL1-256 на хромосоме 3 подтверждена также с помощью RH-картирования.
Отсутствие фрагментов ДНК, идентичных маркерам NL1-256 и NL3 005, в аннотированной в январе 2005 г. нуклеотидной последовательности генома человека указывает на присутствие брешей в области локализации этих маркеров и позволяет установить точное расположение двух брешей на хромосоме 3. Более того, нуклеотидные последовательности NotI–STS маркеров и ДНК контига 3р21-р22 [Kashuba et al., 1999;
Kashuba et al., 1995], которому они принадлежат, могут быть использованы для заполнения брешей и реконструкции непрерывной геномной последовательности хромосомы 3 человека.
Рисунок 1. Интегрированная NotI-карта хромосомы 3 человека и корреляция насыщенности генами и NotI-STS-маркерами. Слева направо:
идеограмма (G-banding), WI-RH-карта, карта GM99-GB4 (расстояния выражены в cR), карта насыщения генами (NCBI, GeneMap'99), карта насыщения генами по данным [Caron et al., 2001] и карта насыщения NotI STS-маркерами (наши данные). Красным цветом выделены NotI-STS маркеры, имеющие гомологии с генами человека, синим – с мРНК и кДНК.
В квадратных скобках указана локализация гомологов (по данным FISH).
Отсутствие на момент завершения нашей работы на хромосоме человека фрагментов ДНК, идентичных маркерам NL3-007 и NLM-084, по видимому, объясняется другой причиной. Согласно геномным контигам в базе данных эти маркеры локализованы на других хромосомах, однако их принадлежность хромосоме 3 доказана несколькими независимыми методами [Kashuba et al., 1999;
Kashuba et al., 1995], что указывает на существование сегментных дупликаций в областях локализации маркеров NL3-007 и NLM-084. Фрагменты ДНК, идентичные маркеру NL3-007, присутствуют в геноме на двух хромосомах (3р22-21.33 и 12q). Маркер NLM-084, локализованный нами в области 3q28-q29, имеет множественную локализацию в геноме. В базе данных “Human Genome Resource” фрагменты ДНК, идентичные маркеру NLM-084, представлены в нескольких геномных контигах: NT_077402 (1p36.33), NT_022135 (2q14.1), NT_035235 (15q26.3), NT_011255 (19p13.3), а также в контиге NT_090211, не приписанном ни к одной из хромосом человека. Это можно объяснить тем, что полная реконструкция нуклеотидной последовательности хромосомы 3 человека и аннотация генов на этой хромосоме еще не были завершены [International Human Genome Sequencing Consortium, 2004].
Таким образом, сравнение ДНК NotI-STS с геномными последовательностями человека выявило две бреши в областях 3р21. (маркер NL1-256) и 3р21.31 (NL3-005) и сегментную дупликацию с локализацией идентичных фрагментов ДНК в областях 12q и 3р22-21. (маркер NL3-007). В области 3q28-q29 (маркер NLM-084) выявлен фрагмент, идентичные копии которого локализованы также на хромосомах 1, 2, 15 и 19. Полученные данные свидетельствуют о том, что NotI-STS маркеры могут быть с успехом использованы для выявления брешей и сегментных дупликаций в геномной последовательности ДНК человека.
1.4. Поиск гомологий NotI-STS-маркеров с генами и EST человека Как уже отмечалось ранее, сайты рестрикции эндонуклеазы NotI ассоциированы с CpG-островками, а, следовательно, и с 5’-областями генов (около 80 – 85% NotI-сайтов) [Kusuda et al., 1990;
Allikmets et al., 1994;
Забаровский и др., 1994;
Plass et al., 1995;
Домнинский и др., 1999], что позволяет предположить, что исследуемые NotI-клоны будут гомологичны известным генам человека. Поиск гомологий локализованных NotI-клонов проводили с нуклеотидными последовательностями, представленными в международных компьютерных базах данных (GenBank, EMBL, TIGR). Для поиска гомологий использовали геномные фрагменты, фланкирующие сайты рестрикции эндонуклеазы NotI с 5'- и 3'-конца, протяженностью 1000 п.н. с каждого конца и включающие в себя последовательность NotI-клонов.
NotI-STS-маркеры признавались маркерами этих генов, только когда их локализация в геноме человека совпадала с локализацией в геноме соответствующих генов. Данные по гомологичным участкам ДНК с уровнем идентичности менее 90% не рассматривали.
Выявлены значимые гомологии 70 NotI-STS (более 97% исследованных маркеров) с генами или EST. В семи случаях обнаружена гомология двух NotI-STS к разным участкам одного гена. Еще одним доказательством ассоциации NotI-сайтов с генами, служит проведенный сравнительный анализ распределения генов и NotI-сайтов на хромосоме человека. На основе результатов картирования NotI-STS-маркеров была построена карта насыщения NotI-сайтами хромосомы 3 (рис. 1). Видно, что наши данные о распределении NotI-сайтов полностью коррелируют с данными о распределении генов на хромосоме 3 человека, что еще раз подтверждает ассоциацию NotI-сайтов с генами и перспективность применения NotI-STS-маркеров для поиска и локализации новых генов.
Для более широкого представления о роли генов, имеющих гомологию с локализованными NotI-клонами, была проведена классификация этих генов по функциям кодируемых ими белков. Белки были распределены на группы в зависимости от выполняемых ими функций. Эти результаты были сопоставлены с аналогичными данными, полученными на момент выполнения нашей работы для всего генома человека [Venter et al., 2001].
Наблюдается значительная корреляция наших данных и данных Вентера с соавторами. Помимо большого количества генов с неизвестной функцией (45,5%) выделяются группы генов, кодирующих ферменты (11,4%) и ДНК-связывающие белки (13,2%), куда можно отнести и факторы транскрипции. Следовательно, распределение генов разных семейств на хромосоме 3 человека примерно соответствует распределению генов в геноме в целом. Значительно отличается только количество протоонкогенов (11,4% – наши данные и 2,9% – данные Вентера с соавторами). Это объясняется тем, что область 3p21-p22 характеризуется высокой насыщенностью онкогенами [Shriver et al., 1998;
Uzawa et al., 1998;
Frost et al., 2000;
Guo et al., 2001;
Rao et al., 2002;
Johansson et al., 2002;
Kiss et al., 2002;
Dave et al., 2002;
Acevedo et al., 2002;
Hoebeeck et al., 2007]. Таким образом, можно предположить, что NotI-STS-маркеры не являются специфичными для тех или иных групп генов и могут быть использованы для локализации генов из разных семейств.
Как показано в нашей работе, NotI-STS-маркеры можно рассматривать как универсальные маркеры генов. Они не специфичны по отношению к отдельным группам генов и могут быть применены для маркирования генов из разных семейств. Высокий консерватизм нуклеотидных последовательностей, прилегающих к NotI-сайтам, позволяет использовать их и для поиска генов у других организмов [Козырева и др., 2007], вплоть до таких отдаленных групп, как микроорганизмы [Zabarovsky et al., 2003]. NotI-STS-маркеры могут быть с успехом использованы не только в структурной, но и в функциональной геномике. Например, показана эффективность NotI-микропанелей для выявления в геноме человека нуклеотидных последовательностей, подвергшихся метилированию (или деметилированию) при различных онкологических заболеваниях [Li et al., 2002;
Dunwell et al., 2009;
Gerashchenko et al., 2009]. Этот подход, на наш взгляд, может существенно облегчить поиск и локализацию новых онкогенов и генов-супрессоров и может найти широкое применение в будущем.
2. ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ХРОМОСОМЫ ЧЕЛОВЕКА В ОПУХОЛЯХ (в работе принимали участие Каганова Н.Л. и сотрудники Лаборатории сравнительной и функциональной геномики ФГУП «ГосНИИ генетика»:
Брага Э.А., Логинов В.И., Пронина И.В., Ходырев Д.С. и др.) Насыщенность хромосомы 3 человека онкогенами [Yang et al., 2002;
Брага и др., 2004;
Chakraborty et al., 2003;
Hoebeeck et al., 2007;
Брага и др., 2008], придает высокую значимость исследованиям по созданию и характеристике маркеров генов, локализованных на этой хромосоме.
Важную роль в предварительной идентификации содержащих гены супрессоры опухолевого роста (TSG) районов на коротком плече хромосомы 3 сыграли работы по локализации участков, способных подавлять опухолевый рост. Для детального картирования районов TSG на 3p проведен анализ потери гетерозиготности с использованием плотной панели полиморфных маркеров (20-30 локусов) в обширных коллекциях парных образцов ДНК из опухолевой и гистологически нормальной ткани (50-100 пар). На 3p наблюдается перекрывание аллельных и гомозиготных делеций и участков, подавляющих рост опухолей [Брага и др., 2003].
В последнее время стало очевидным, что одним из основных механизмов инактивации TSG является эпигенетическая модификация.
Гиперметилирование CpG-островков может происходить на ранних этапах канцерогенеза и приводить к активации протоонкогенов и к инактивации TSG за счет дерегуляции их экспрессии на уровне синтеза РНК. Это, в конечном счете, приводит к малигнизации клеток, к повышенной пролиферации опухолевых клеток, к инвазии и метастазированию. Для многих TSG обнаружено метилирование CpG-островков промоторных районов в эпителиальных опухолях разных локализаций [Киселев и др., 2005].
Накоплен огромный экспериментальный и клинический материал, свидетельствующий о том, что анализ экспрессии генов в опухолевых клетках имеет решающее значение, как для верификации диагноза, так и для выбора правильной тактики лечения. Паттерн экспрессии генов может определять спектр чувствительности к различным химиопрепаратам и определять тактику лечения, проводить целенаправленный поиск новых ген-направленных противоопухолевых препаратов, верифицировать диагноз в сложных случаях, прогнозировать течение процесса.
В данной части работы нами проведен анализ транскрипционной активности в опухолевых и нормальных тканях следующих генов короткого плеча хромосомы 3 человека: RHOA, SEMA3B, RARB, GPX1 и DAG1, а также гена СКАР2, картированного в области 13q14. Наиболее подробно рассмотрены результаты анализа экспрессии генов RHOA и SEMA3B.
2.2. Транскрипционная активность, копийность и метилирование гена RHOA в опухолях Ген RHOA (Ras homolog gene family, member A) кодирует белок, относящийся к известному суперсемейству Ras-зависимых малых гуанозинтрифосфатаз (ГТФ-аз), активность которых зависит от связывания ГТФ или ГДФ [Etienne-Manneville & Hall, 2002;
Sahai & Marshall, 2002].
Белок RHOA участвует в процессах, связанных с формированием актинового цитоскелета, с адгезией и подвижностью клеток, а также с регуляцией клеточного цикла [Hall, 1998;
Vial et al., 2003;
Liberto et al., 2002;
Vidal et al., 2002].
Нам не удалось найти сообщений, касающихся метилирования этого участка и его роли в изменении транскрипции гена RHOA в опухолях. Это послужило предпосылкой для сравнения экспрессии данного гена с метилированием его промоторной зоны. Согласно анализу клонотек SAGE для гена RHOA в опухолях характерно повышение транскрипции. Однако в опухолях кишечника и кожи можно видеть обратное – снижение уровня транскрипции этого гена.
Нами была изучена его экспрессия, копийность и метилирование CpG островков в 5’-области гена. Все это сделано на единой выборке парных образцов опухолевых и нормальных тканях молочной железы, почки и яичников. На рисунке 2 представлены результаты анализа экспрессии и копийности. Видно, что увеличение экспрессии коррелирует с увеличением числа копий гена.
Рисунок 2. Профиль относительного изменения уровня транскрипции гена RHOA и относительного изменения количества его геномных копий в образцах опухолей по сравнению с образцами ДНК нормальной ткани (для наглядности на оси абсцисс представлен логарифм соотношения Т/N-1, что позволяет оценивать порядок изменений экспрессии в опухоли по отношению к норме). Уровень транскрипции и уровень копийности гена RHOA в норме приняты за 1. Исследования проведены для образцов BC ( случаев), RCC (19 случаев) и EOC (8 случаев). Все ОТ-ПЦР и мультиплексные ПЦР повторены трижды и в расчетах учтены средние величины из трех определений.
На рисунке 3 представлены результаты анализа метилирования CpG островков. Здесь также видна четкая закономерность между снижением плотности метилирования и увеличением экспрессии в опухоли по отношению к норме.
Рисунок 3. Паттерн метилирования фрагмента промоторной области гена RHOA (25 CpG-пар) в 23 парных образцах ДНК опухолей и соответствующих морфологически нормальных тканей, установленный методом МЧРА. Черный прямоугольник указывает на наличие продукта ПЦР после гидролиза данного образца ДНК соответствующей рестриктазой и на метилирование CpG-пар, содержащихся в участках рестрикции этого фермента;
белый прямоугольник означает, что продукт ПЦР отсутствует и одна или более CpG-пара в составе участков узнавания данной рестриктазы не метилированы. Наверху сгруппированы 15 случаев, для которых методом МЧРА показано снижение частоты и плотности метилирования узучаемого фрагмента в опухолях. В нижней части рисунка представлены 8 случаев повышения уровня метилирования гена RHOA в опухолях. Справа приведены данные об изменении (повышении или понижении) транскрипционной активности гена RHOA в опухолях по сравнению с нормой.
Таким образом, нами впервые получены данные о возможных путях активации транскрипции протоонкогена RHOA в опухолях как за счет умножения копий гена, так и посредством деметилирования CpG островков промоторного района.
2.2. Изменение экспрессии гена RHOA в крови больных лейкозом Так же была проанализирована экспрессия гена RHOA в крови больных лейкозом (6 образцов). Контроль – кровь 6 здоровых доноров. На рисунке 4 показан уровень экспрессии гена RHOA в образцах крови больных лейкозом и здоровых доноров (данные по здоровым индивидуумам усреднены).
Рисунок 4. Увеличение экспрессии гена RHOA в крови больных лейкозом (зеленый цвет, T, n=6) при отсутствии таковой в крови здоровых людей (голубой цвет, N, n=6). Экспрессия гены GAPDH усреднена для всех проб.
Результаты представлены исходными данными (светимость продуктов полуколичественной ОТ-ПЦР в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием).
Как видно из рисунка экспрессия у здоровых пациентов не обнаружена. Однако экспрессия гена в образцах ОМЛ и ХМЛ составляет 71% и 32% от экспрессии гена «домашнего хозяйства» GAPDH.
Полученные данные позволяют предположить, что ген RHOA может быть использован для ранней диагностики ОМЛ и ХМЛ.
2.3. Изменение уровня экспрессии гена SEMA3B в эпителиальных опухолях Продукт гена SEMA3B относится к семафоринам – это обширное семейство цитоплазматических и мембраносвязанных белков, у мыши и человека насчитывающее до 20 членов (Yazdani U. & Terman J.R., 2006).
Функции белка Sema3B связаны с подавлением онкогенеза. Он может ингибировать активацию онкобелков MET и RON [Roche & Drabkin, 2001;
Bateman et al., 1999]. Найдена положительная корреляция между частотой метилирования гена SEMA3B и прогрессией опухолей [Брага и др., 2004].
В связи с этим представлялось целесообразным оценить уровень экспрессии гена SEMA3B в опухолях разной локализации. Содержание мРНК гена SEMA3B в клеточных линиях и образцах первичных опухолей оценивали методом полуколичественной ОТ-ПЦР с использованием в качестве контроля фрагмента гена B2M.
Рисунок 5. Изменение содержания мРНК гена SEMA3B в 51 парном образце первичных опухолей почки. По оси ординат (логарифмическая шкала) отложено соотношение интенсивности полос продукта ОТ-ПЦР мРНК SEMA3B из ткани опухоли и гистологически нормальной ткани почки этого же больного. Значения интенсивности полос продукта ОТ ПЦР гена SEMA3B нормировали по интенсивности полос продукта ОТ ПЦР контрольной мРНК B2M.
Нами впервые показано изменение содержания мРНК гена SEMA3B в пяти видах рака. Обнаруженное нами снижение уровня мРНК гена при раке почки (рис. 5), раке яичников и толстой кишки (рис. 6) косвенно указывает на его возможную супрессорную функцию.
Рисунок 6. Изменение содержания мРНК гена SEMA3B в первичных опухолях толстой кишки (а) и яичника (б). По оси ординат (логарифмическая шкала) отложено соотношение интенсивностей полос продукта ОТ-ПЦР мРНК SEMA3B из ткани опухоли и гистологически нормальной ткани этого же больного. Значения интенсивности полос продукта ОТ-ПЦР мРНК SEMA3B нормировали по интенсивности полос продукта ОТ-ПЦР мРНК B2M.
Полученные нами данные расширяют спектр опухолей, в которых ген SEMA3B может действовать как ген-супрессор.
2.4. Изменение экспрессии гена SEMA3B в крови больных лейкозом Таким же образом была проанализирована экспрессия гена SEMA3B в крови больных лейкозом (6 образцов). На рисунке 7 показан уровень экспрессии гена SEMA3B в образцах крови больных лейкозом и здоровых доноров, данные по которым усреднены (n=6).
Рисунок 7. Увеличение экспрессии гена SEMA3B в крови больных лейкозом (зеленый цвет, T, n=6) при минимальной экспрессии в крови здоровых людей (голубой цвет, N, n=6). Экспрессия гена GAPDH усреднена для всех проб. Результаты представлены исходными данными (светимость продуктов полуколичественной ОТ-ПЦР в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием).
Из рисунка 7 видно, что экспрессия гена у здоровых пациентов носит следовой характер. Однако экспрессия гена в образце ОМЛ больше, чем экспрессия гена «домашнего хозяйства» GAPDH. Полученные данные позволяют предположить, что ген SEMA3B может быть использован для ранней диагностики ОМЛ.
2.5. Изменение уровня экспрессии генов RARB, DAG1, изоформы 1 гена GPX1 и гена NBEAL2 в эпителиальных опухолях Ген RARB относится к суперсемейству ядерных рецепторов, которые служат лиганд-активирующими транскрипционными факторами [Chambon, 1996]. Лигандами для рецепторов класса RAR являются ретиноиды – витамин А и его биологически активные метаболиты.
Известно, что ретиноиды способны ингибировать пролиферацию клеток и индуцировать клеточную дифференцировку. В связи с этим их используют для профилактики и терапии различных опухолей [Hong et al., 1995].
Имеется 2 изоформы гена GPX1: короткая – изоформа 1 (два экзона) и длинная – изоформа 2 (единственный интрон не удаляется из мРНК и транслируется) [NCBI GeneID: 2876]. Белок GPX1 защищает клетки от CD95-индуцированного апоптоза в культуре клеток опухоли молочной железы, его сверхэкспрессия задерживает эндотелиальный клеточный рост и увеличивает устойчивость к токсинам. Показано, что мутация в гене GPX1, приводящая к замене в а.к. последовательности (Pro198Leu), может служить молекулярным маркером для мониторинга повторного появлении рака мочевого пузыря [Zhao et al., 2005]. Также данная мутация ассоциирована с риском появления рака молочной железы и легких.
Кодирующая последовательность гена DAG1 представлена экзонами, разделенными большим интроном (Ibraghimov-Beskrovnaya et al.,1993). Дистрогликан человека экспрессируется во множестве эмбриональных и взрослых тканей. DAG1 – высоко-полиморфный ген, являющийся кандидатом для локализации мутации при аутосомно рецессивных мышечных дистрофиях. Уменьшение количества белка DAG наблюдалось в большинстве клеточных линий и опухолях толстой кишки и молочной железы и коррелировало со стадией опухоли.
Ген NBEAL2 (neurobeachin-like 2) человека картирован нами в области 3p21-22 насыщенной онкогенами и генами супрессорами опухолевого роста [Sulimova et al., 2002;
Сулимова и др., 2005]. В настоящий момент в литературе о данном гене нет никакой информации.
Результаты. Содержание мРНК данных генов в парных образцах первичных опухолей и прилегающей нормальной ткани (молочная железа, n=18;
почки, n=19;
яичники, n=8) оценивали методом полуколичественной ОТ-ПЦР с использованием в качестве контроля фрагмента гена GAPDH.
Показано достоверное увеличение количества мРНК всех генов (кроме NBEAL2) в опухолях молочной железы. Результаты приведены в сводной таблице 1.
2.6. Анализ транскрипционной активности новых белок-некодирующих генов человека W91914 и H51703 в опухолевых и нормальных тканях (работа выполнена при участии Коробейниковой Л.А.) Во втором интроне гена DUTT1 обнаружены два новых гена: W и H51703. Оба имеют полиА последовательности и небольшие открытые рамки считывания, которые не кодируют белки. Для новых последовательностей не было найдено гомологов или ортологов. Оба гена, расположенные в интроне гена DUTT1, транскрибируются в том же направлении, что и DUTT1. Была найдена связь между утратой генов W91914 и H51703 и развитием рака. Для доказательства их участия в процессах онкогенеза необходимо было изучить экспрессию в биопсиях опухолей и в нормальной ткани. Оценку транскрипционной активности генов W91914 и H51703 проводили методами полуколичественной ПЦР и количественной ПЦР в реальном времени в парных образцах опухолевых и прилегающих нормальных тканей человека: молочная железа (n=10), легкие (n=4) и почки (n=6). В качестве контроля оценивали экспрессию гена B2M. Транскрипционная активность гена H51703 обнаружена нами только в четырех образцах. Дальнейшее исследование его экспрессии не проводилось. Продукт амплификации гена W91914 наблюдался во всех исследуемых образцах. Оценка уровня экспрессии гена W91914 методом количественной ПЦР в реальном времени проводилась на тех же образцах. В качестве контроля измеряли уровень мРНК гена B2M. Нами показано увеличение его экспрессии в опухолях легких и снижение в опухолях молочной железы. Таким образом, несомненно, что гены W и H51703 причастны к развитию рака. Однако, для установления точного механизма их действия необходимы дальнейшие исследования.
2.7. Заключение В данной части работы нами оценены изменения экспрессии в норме и опухоли 8 генов, локализованных на коротком плече хромосомы, в частности, в детально картированной нами области 3р21 (RHOA, SEMA3B, RARB, GPX1, DAG1, NBEAL2, W91914 и H51703). В таблице 1 приведена обобщенная информация об изменениях экспрессии изучаемых генов.
Таблица 1. Значимые изменения экспрессии в опухолях относительно нормы («-» – экспрессия данных генов не анализировалась в данных тканях).
Только для одного гена – SEMA3B – нами показано снижение экспрессии в большинстве проанализированных опухолевых тканей. Это может служить косвенным свидетельством его роли как TSG в процессе канцерогенеза.
Для гена RHOA, наоборот, показано увеличение экспрессии во всех проанализированных опухолевых тканях. Это является подтверждением его предполагаемой голи онкогена или гена активно работающего в опухолях. Также нами впервые выявлены механизмы активации его экспрессии в опухолях путем амплификации гена и деметилирования его промоторного участка.
Для генов RARB, GPX1, DAG1 и NBEAL2 выявлено увеличение экспрессии в опухолях молочной железы. Однако наши данные не позволяют с уверенностью утверждать, что для данных генов характерна роль онкогенов.
Таким образом, оценка экспрессии генов в опухоли и норме при различных типах рака может служить начальным тестом для выявления онкогенов и генов-супрессоров опухолевого роста.
3. КАРТИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ МЕСТ ИНТЕГРАЦИИ ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ В ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА (в работе принимали участие Рахманалиев Э.Р. и Мойсяк Е.В.) Вирус папилломы человека (ВПЧ) относится к ДНК содержащим вирусам. Известно около 100 представителей ВПЧ, из которых типы 16, и им родственные ассоциированы с развитием рака шейки матки [De Villiers, 1994]. ВПЧ может существовать в клетке как в эписомальной, так и в интегрированной форме. В случае интеграции вирус теряет собственный сайт полиаденилирования. До последнего времени оставалось неизвестным, где происходит терминация транскрипции ДНК вируса при ее интеграции в геном человека. Более подробно классификации вирусов папилломы, структура вирусного генома и механизмы трансформирующего действия вирусных онкогенов, а также роль интеграция ДНК вируса в геном клетки в прогрессии рака шейки матки рассмотрены в обзоре «Интеграции вирусов папилломы человека в геном клетки хозяина и патогенез рака шейки матки» [Климов Е.А. // Успехи современной биологии. 2010. Т.130. №4. С.381-389].
Физическое картирование на хромосомах человека мест интеграции ДНК вируса и их in silico анализ имеют большое значение для понимания того, как интегрированный вирусный геном может нарушать генетическую программу клетки. Целью данной части работы были точная физическая локализация мест встраивания ВПЧ16 в хромосомы человека и характеристика in silico геномных последовательностей, прилегающих к местам встраивания вирусной ДНК, транскрибируемой в клетках плоскоклеточного рака шейки матки.
Результаты и их обсуждение В работе были изучены последовательности генома человека, прилегающие к местам встраивания вируса папилломы человека тип (ВПЧ16) с 3’-конца (маркеры INT). Эти последовательности были ранее выделены с помощью метода АРОТ и секвенированы в лаборатории молекулярной биологии вирусов НИИ канцерогенеза Российского онкологического научного центра им. Н. Н. Блохина, РАМН. Локализацию маркеров INT проводили двумя методами: RH-картированием и картирование in silico.
В одном случае обнаружена множественная локализация INT маркера, поиск по базе данных EST показал сходство с мРНК многокопийного гена рибосомального белка, копии которого представлены на разных хромосомах. Полученные результаты по локализации мест интеграции и их подробному анализу не выявили никаких закономерностей – вблизи сайтов интеграции не было обнаружено функциональных последовательностей (участков прикрепления ДНК к ядерному матриксу, повторяющихся элементов генома) и только 3 места интеграции вируса из 12 расположены вблизи сайтов ломкости хромосом.
Рисунок 8. Физическая локализация маркеров INT (красные бенды на идиограммах) в районах хромосом, насыщенных генами. Слева направо:
идиограмма (G-banding), транскрипционная карта, опубликованная в журнале «Science» [Caron et al., 2001], карта насыщения генами, размещенная на сервере GeneMap’99.
Однако если рассматривать транскрипционную активность локусов, в которые происходит интеграция видно, что все они содержат активно работающие гены и отличаются высоким уровнем транскрипционной активности (рис. 8). Это, по всей видимости, облегчает интеграцию ДНК вируса в деконденсированные участки хромосом и последующую транскрипционную активность интегрированного вирусного генома, что, в свою очередь, приводит к развитию опухоли.
При анализе мест интеграции выявлено, что в 75% процентах проанализированных нами случаев вирус встраивается в последовательности генов, а в остальных 25% вблизи генов. Как видно из таблицы 2, места интеграции равномерно распределены между интронами и экзонами.
Таблица 2. Гомологии маркеров INT и прилегающих последовательностей с генами. Наличие сигнала полиаденилирования в геноме клетки-хозяина с 3' конца от интегрированного вируса.
Присутствие и Локализация расположение сайта INT Acc N db Ген в месте интеграции POLYA сигнал геномный локус SCAN поли(А)* контиг Между генами RAD51L1 и 254 AJ431608 – (+)** 638 14q23.2 NT_ RPL12P 259 AJ431609 ABLIM2 (интрон 15) + 903 4p16.1 NT_ 431 AJ431610 LOC387934 и LOC647279 + 166 13q22.1 NT_ 407 AJ431611 Между генами CLTB и UBXD8 + 225 5q35.3 NT_ 290 AJ431612 WASF4 (терминальный экзон) – (+)** 1612 Xp11.23 NT_ 505 AJ431614 FER1L3 (терминальный экзон) + 1894 10q24 NT_ 466 AJ431617 FNDC6 (экзоны 4 и 5) + 3q22.3 NT_ (1270)*** 477 AJ431615 SEMA3A (интрон 4) + 1724 7p12.1 NT_ Между генами LOC200583 и 421 AJ431618 + 1048 2q22.3 NT_ LOC 475 AJ431619 RTN4IP1 (интрон 4) + 839 6q21 NT_ 423 AJ431620 GLS (терминальный экзон) + 2070 2q32.3 NT_ * расстояние от точки встраивания вирусного генома до сигнала полиаденилирования генома хозяйской клетки, п.н.
** последовательности, способные терминировать транскрипцию, найдены визуально.
*** в скобках указан размер предполагаемой «слитой вирус-клеточной» РНК с учетом вырезания интрона 4 гена FNDC6. Участок, терминирующий транскрипцию, найден в интроне 5 гена.
Все кДНК, гомологичные маркерам INT и прилегающим геномным последовательностям, представлены в базах данных в большом количестве (5-20 клонов), что указывает на высокий уровень их экспрессии, и получены из различных органов и тканей человека, как в норме, так и при патологиях (включая и опухолевые образования).
Мы считаем, что интеграция ДНК вируса в клеточный геном происходит случайно, но преимущественно в активно работающие деконденсированные участки хромосом. Результаты более поздних работ демонстрируют, что сама по себе интеграция ДНК ВПЧ не является необходимым механизмом для развития РШМ и не приводит к геномной нестабильности или критическим мутациям [Wentzensen et al., 2002;
Melsheimer et al., 2004;
Wentzensen et al., 2004;
Vinokurova et al., 2008].
Следует отметить, что за рамками анализа остались также нетранскрибируемые интегрированные вирусные последовательности, доля которых в клетке может варьировать [Van Tine et al., 2001]. Но поскольку решающим фактором для иммортализиции клеток является активность вирусных генов Е6 и Е7, предполагается, что нетранскрибируемая интегрированная ДНК ВПЧ сама по себе не участвует в развитии опухоли [Zur Hausen, 1999;
Szarka et al., 2000;
Киселев и др., 2001].
Для ответа на вопрос где происходит терминация транскрипции интегрированной ДНК вируса были проанализированы прилегающие с 3’ конца к местам интеграции последовательности генома человека. С использованием соответствующих программ и визуальным анализом нуклеотидных последовательностей были выявлены сигналы полиаденилирования на расстоянии до 2000 п.н., причем в некоторых случаях данные поли-А сайты принадлежат генам, в которые произошла интеграция вируса (табл. 2).
Полученные данные показывают, что транскрипция интегрированной ДНК вируса продолжается до ближайшей последовательности генома клетки, способной терминировать транскрипцию. Таким образом, подтверждена гипотеза о возможности использования для терминации транскрипции интегрированной ДНК ВПЧ16 близлежащих сигналов полиаденилирования генома клетки хозяина.
4. RH-КАРТИРОВАНИЕ ЭКСПРЕССИРУЮЩИХСЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА (в работе принимали участие Рахманалиев Э.Р., Компанийцев А.А., Мойсяк Е.В., Кунижева С.С. и Удина И.Г.) Методом RH-картирования были достоверно картированы пять EST.
Нами подтверждена локализация маркеров CLL-5 и Leu1 в области 13q14. с помощью RH-картирования. Локализация в геноме человека трех EST B10164, 18F5R и S16R установлена впервые: в областях 5q14, 11р15 и 1p36, соответственно.
Мозгоспецифическая последовательность Hfb1 локализована нами на хромосоме 5 человека. Детальный анализ структуры последовательности геномного клона из космидной библиотеки хромосомы 5, а также исследование транскриптов мРНК мозга методом ОТ-ПЦР позволили установить, что данная последовательность – часть неописанного ранее экзона гена комплексина 2, кодирующего 3’ нетранслируемый конец соответствующей мРНК.
5. АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ И ТКАНЕСПЕЦИФИЧНОСТИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ЧЕЛОВЕКА И ИХ ГОМОЛОГОВ У МОДЕЛЬНЫХ ОРГАНИЗМОВ Предпосылкой для инициации структурно-функционального анализа данных генов стало отсутствие на момент начала работ информации об их структуре и функции, в базах данных были представлены только неполные транскрипты этих генов. Функция их белковых продуктов оставалась не ясна, а для ее уточнения необходимо было провести детальное изучение структурной организации и транскрипционной активности. Появление черновых вариантов геномов модельных организмов (крыса, мышь и рыба Danio rerio) позволило провести поиск ортологов изучаемых генов и привлечь их для анализа тканеспецифичности экспрессии и выявления консервативности структурной организации.
5.1. Структура и органоспецифичность экспрессии гена Nbeal2 крысы (работа выполнена при участии Бояринцевой И.С.) Ген NBEAL2 (neurobeachin-like 2) человека картирован нами в области 3p21-22 [Sulimova et al., 2002;
Сулимова и др., 2005]. В настоящий момент в литературе о данном гене нет никакой информации. Нами проведен анализ структуры и органоспецифичности экспрессии гена Nbeal2 крысы.
Экзон-интронная структура гена Nbeal2 крысы построена путем выравнивания представленных в базе данных мРНК с геномной последовательностью. Нами идентифицировано 55 экзонов. С помощью программ предсказано 2 промотора и 1 сайт инициации транскрипции.
Среди факторов транскрипции имеется NRSF (Neuron-restrictive silencer factor), ограничивающий экспрессию генов нейрональными клетками.
Ближайший от стоп-кодона сайт полиаденилирования находится на расстоянии 6590 п.н. Доменная структура белка Nbeak2 крысы (3 домена:
Neurobeach, Beach и WD40) полностью сходна со структурой белков человека и мыши. Белки с подобной структурой обнаруживаются у собаки, коровы, курицы, рыбы Danio rerio и дрозофилы. Аналогичные домены имеет в своем строении и белок, участвующий в лизосомальном транспорте у всех эукариот.
Результаты определения тканеспецифичности экспрессии гена Nbeal2 представлены в виде диаграммы, где экспрессия данного гена отложена на шкале в единицах светимости пробы. Наибольшая экспрессия была выявлена в отделах мозга, органах половой системы, легких, надпочечниках, а также селезенке и глазе (рис. 9).
Рисунок 9. Диаграмма, отображающая транскрипционную активность Nbeal2 крысы. В качестве контроля – средняя активность гена GAPDH во всех анализированных тканях.
5.2. Структура гена CKAP2 человека и анализ его экспрессии в опухоли и норме (работа выполнена при участии Рахманалиева Э.Р. и Разумновой Г.И.) Ген СКАР2 (ранее LB1) был выявлен при детальном изучении области 13q14, часто перестраиваемой при в клетках В-клеточных лимфом диффузного типа [Капанадзе и др., 1997;
Баранова и др., 2004].
Картирован ген в области 13q14.3 [Удина и др., 2001] Продуктом гена СКАР2 является цитоплазматический белок, который связывается с фибриллами цитоскелета (cytoskeleton associated protein 2) [Maouche-Chrtien et. аl., 1998]. Однако информации о точной структуре гена не было. В связи с этим нам представлялось необходимым детализировать экзон-интронную структуру и выявить промоторную область гена CKAP2. Ген содержит экзонов, а также все структурные элементы, присущие генам эукариот.
Структура гена CKAP2, установленная нами, зарегистрирована в базе данных EMBL под номером AJ429398. Полученные нами данные могут быть использованы при изучении экспрессии гена CKAP2 в норме и в различных опухолях с целью выяснения его роли в процессах онкогенеза.
Позднее другими авторами для гена СКАР2 было показано наличие двух изоформ мРНК короткой (S изоформа) и длинной (F изоформа). Разница в длине изоформ возникает за счет ранней терминации транскрипции (после 6-го экзона) в случае S изоформы [Chang-Dae et аl., 2003]. В ранее проведенных работах [Maouche-Chrtien еt аl., 1998, Bae еt аl., 2003] оценка экспрессии гена проводилась совместно для S и F изоформы, поэтому для подтверждения участия гена СКАР2 в процессах развития опухолей нам представлялось необходимым изучение экспрессии каждой изоформы.
В опухолях молочной железы (n=10) и яичников (n=5) имеет место увеличение количества F-изоформы мРНК гена, в опухолях почки (n=20) изменения, по-видимому, носят случайный характер. Статистически достоверных отличий в экспрессии S-изоформы в норме и опухолях молочной железы, яичников и почки не обнаружено (табл. 1). По нашим данным количество мРНК изоформы S значительно меньше, чем изоформы F. Это может быть связано с разной функциональной значимостью изоформ мРНК гена CKAP2. Также нами была проанализирована экспрессия гена в крови больных лейкозом и здоровых доноров (рис. 10).
В 5 (из 6) образцах крови больных лейкозом было показано наличие изоформы F мРНК гена CKAP2, тогда как в норме эта изоформа мРНК в крови отсутствует. Изоформа S, напротив, присутствует в образцах крови здоровых доноров, хотя и в значительно меньшем количестве, чем в крови больных. Таким образом, наличие изоформы F мРНК гена CKAP2 в крови может служить одним из маркеров лейкоза.
Рисунок 10. Изменение экспрессии изоформ F и S мРНК гена CKAP2 в крови больных лейкозом (n=6) и здоровых людей (норма, данные усреднены, n=6). Результаты представлены исходными данными (светимость продуктов полуколичественной ОТ-ПЦР в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием).
5.3. Структура гена ABLIM2 человека и модельных организмов (работа выполнена при участии Рахманалиева Э.Р. и Рудько О.И.) Мы картировали сайт интеграции ВПЧ16 в первом интроне гипотетического гена человека KIAA1808 (ABLIM2) [Klimov et al., 2002].
Далее представлены результаты детального анализа экзон-интронной структуры и экспрессии гена ABLIM2 человека, крысы и мыши.
Построение экзон-интронной структуры проводили на основании имевшейся в базе данных мРНК гипотетического гена KIAA (AB058711) и геномного контига NT_006307. Проведенный нами детальный анализ позволил выявить 20 экзонов гена ABLIM2. Все экзоны гена фланкированы каноническими сайтами сплайсинга (…ag-exon-gt…).
Экспериментальную проверку экзон-интронной структуры гена ABLIM проводили методом ОТ-ПЦР с праймерами к различным экзонам гена.
Продукты амплификации секвенировали чтобы избежать возможных ошибок. Также было выявлено наличие двух изоформ мРНК гена ABLIM2.
Изоформа а состоит из последовательностей 20 экзонов, а изоформа б – из последовательностей 18 экзонов (отсутствуют экзоны 16 и 17). Обе изоформы зарегистрированы в EMBL database (изоформа а – AJ748601, изоформа б – AJ748600). Промоторная область и содержащиеся в ней сайты связывания факторов транскрипции, были определены и проанализированы с помощью серии программ.
Поиск нуклеотидных последовательностей, гомологичных мРНК гена ABLIM2 человека, позволил выявить сходные мРНК крысы, мыши и рыбы Danio rerio. Экзон-интронная структура гена Ablim2 крысы и мыши была построена и экспериментально проверена по той же схеме, что и для человека. В геноме мыши Ablim2 находится в области 5B2 (контиг NT_039302), а в геноме крысы в области 14q21 (контиг NW_047429).
Для крысы и мыши также было показано наличие альтернативного сплайсинга: две изоформы – а и б, как у человека. Последовательности гена зарегистрированы в EMBL database: мышь – AJ748602 (изоформа а) и AJ748603 (изоформа б), крысы – AJ703892 (изоформа а) и AJ (изоформа б). Ген крысы зарегистрирован в Rat Genome Database под названием Ablim2 (RGD_ID:1298516). Обе изоформы гена крысы зарегистрированы в Rat Genome Database: изоформа а – RGD_ID: (Symbol: Ablim2_v1) и изоформа б – RGD_ID:1298519 (Symbol:
Ablim2_v2).
Сравнение экзон-интронной структуры гена ABLIM2 человека, крысы и мыши показало значительное сходство. Как видно из таблицы 3, число и длина экзонов совпадают у всех трех организмов. Исключение составил экзон 10, одинаковый у крысы и мыши, но отличающийся у человека. Здесь произошла делеция одного триплета, по-видимому, не влияющая на функциональную активность белка. 5’-UTR гена была одинакова у крысы и мыши, но почти в 2 раза короче у человека. Для всех организмов было показано наличие сайта полиаденилирования на расстоянии 682 (684 для мыши) нуклеотида от стоп-кодона. Эти данные были подтверждены экспериментально. Старт транскрипции у крысы был подтвержден методом ОТ-ПЦР с использованием праймера к началу первого экзона.
Нуклеотидные отличия в длине экзонов у рыбы всегда кратны трем, то есть открытая рамка считывания не сбивается. Исключение составляют экзоны 15 и 18, однако в сумме разница их длины также кратна трем.
Таблица 3. Количество и длина экзонов гена ABLIM2 человека, грызунов и рыбы. Экзоны 16 и 17 отсутствуют в изоформе б. Отличающиеся по длине экзоны человека и грызунов выделены зеленым. Отличия длин экзонов у рыбы выделены синим.
Экзоны Человек Крыса Мышь Рыба 65 127 127 26* 5’-UTR 10 10 10 1.
144 144 144 2.
184 184 184 3.
116 116 116 4.
127 127 127 5.
94 94 94 6.
88 88 88 7.
59 59 59 8.
78 78 78 9.
147 150 150 10.
121 121 121 11.
102 102 102 12.
54 54 54 13.
53 53 53 14.
139 139 139 15.
62 62 62 16.
55 55 55 17.
8 8 8 18.
81 81 81 19.
114 114 114 20.
682 682 684 510* 3’-UTR * - размеры 5’ и 3’-UTR предсказаны с использованием компьютерных программ Промоторные области крысы и мыши имели гомологию 95%.
Сравнение промоторных областей человека, крысы и мыши выявило сходное расположение сайтов связывания ТФ. У человека имелось два сайта связывания для NRSF (Neural-restrictive-silencer-factor), один из которых находился перед старт-кодоном. Данный ТФ ограничивает экспрессию нейрон-специфичных генов в других клетках. У крысы и мыши сайт связывания для NRSF один и он также находился перед старт кодоном. Помимо NRSF у всех трех организмов имелся сайт связывания для ТФ WT1. Учитывая наличие сайтов связывания для двух репрессоров нейрональных генов, можно предположить, что экспрессия гена ABLIM ограничена нейронами.
Белок ABLIM2 содержит четыре LIM-домена в N-концевой области и С-концевой VHP-домен, что указывает на его участие в процессах развития и функционирования клеток. LIM-домен предположительно имеет ДНК связывающую функцию [Perez-Alvarado et al., 1994]. VHP домен участвует во взаимодействии с актином [Rana et al., 1993;
Doering et al., 1996].
Рисунок 11. Доменная организация белков ABLIM2 человека (HS), крысы (RN), мыши (MM) и рыбы Danio rerio (DR).
Аминокислотные последовательности белка ABLIM2 человека, мыши, крысы и рыбы имеют высокий процент сходства, а доменная структура белков имеет полное сходство (рис. 11). Этот свидетельствует в пользу консервативности функции данного белка.
Для определения тканеспецифичности экспрессии была использована панель РНК, выделенной из различных органов и тканей крысы. Для ее скрининга использовали праймеры к 2 и 11 экзонам и праймеры к 13 и 20 экзонам. Наибольшая экспрессия гена Ablim2 была обнаружена в отделах мозга и в глазу. В остальных тканях наблюдались следовые количества мРНК (рис. 12).
Рисунок 12. Электрофореграмма ОТ-ПЦР с праймерами: A) к экзонам 13 и 20. (Видно наличие фрагмента длинной 552 п.н. – изоформа а, и фрагмента длинной 435 п.н. – изоформа б. B) к экзонам 2 и 11. Gapdh – контрольный ген. C) Диаграмма, отображающая транскрипционную активность Ablim2 крысы. В качестве контроля – средняя активность гена GAPDH во всех анализированных тканях.
Во всех тканях крысы были обнаружены обе формы мРНК гена Ablim2 (см. рис. 12 a и b). Таким образом, сделанные на основе анализа промоторной области выводы о нейрон-специфичности экспрессии гена полностью подтвердились (рис. 12 с). Исходя из полученных нами данных, можно утверждать, что белок ABLIM2 необходим для нормального функционирования нейронов.
5.4. Ген WASF4 – новый член семейства генов WAS (в работе принимал участие Рахманалиев Э.Р.) Ген WASF4 человека картирован нами на хромосоме Х и принадлежит к семейству генов, кодирующих WAS-белки (Wiskott-Aldrich syndrome). Белки этого семейства играют важную роль в полимеризации актина и реорганизации цитоскелета. Данное семейство включает 5 генов человека: WASF1 (6q21-q22), WASF2 (1p36.11-p34.3), WASF3 (13q12), WAS (Xp11.4-p11.21) и WASL (7q31.3). Все белки, кодируемые данными генами, имеют сходную доменную структуру.
С помощью компьютерных программ нами было выявлено 3 экзона гена WASF4 и промоторный участок, содержащий сайты связывания для основных факторов транскрипции, а также старт транскрипции. Все экзоны фланкированы каноническими сайтами сплайсинга (…ag-exon gt…).
Предполагаемый аминокислотный продукт изучаемого гена (543 а.к.) имеет высокий уровень сходства (89%) с белком человека WASF2 ( а.к.) и такую же доменную структуру, что позволяет считать эти белки гомологами, принадлежащими к одному семейству.
Выравнивание аминокислотных последовательностей WASF4 и трех белков WASF человека и мыши показывает, что WASF4 ближе всего к WASF2 человека, который, по всей видимости, и является его предшественником. В пользу этой гипотезы, свидетельствует отсутствие последовательности WASF4 в геномах рыб, грызунов, собаки и др. Однако, у шимпанзе и макаки обнаруживаются участки генома, гомологичные экзонам 2 и 3 гена WASF4 человека (табл. 4).
Таблица 4. Длина экзонов и интронов гена WASF4 человека и шимпанзе, процент гомологии.
Экзон 1 Интрон 1 Экзон 2 Интрон 2 Экзон 3* Человек 18 558 304 4391 Шимпанзе 18 510 304 4378 % сходства 25.9% 68.1% (фрагмент 99.1% 75.8%** 95.5% 314 п.н. – 99%) * - до стоп-кодона включительно (ТАА) ** - в интроне шимпанзе имеется участок неизвестной последовательности (N507) 3’-UTR не сравнивалась, у шимпанзе имеется участок неизвестной последовательности (N1239) Наличие схожих последовательностей только в геноме приматов позволяет предположить, что последовательность гена WASF4 появилась недавно. Её появление, скорее всего, может быть связано с интеграцией части процессированной кДНК гена WASF2 в область Xp11.2.
Остается не выясненным вопрос о транскрипционной активности гена WASF4. Нам не удалось показать экспрессию гена WASF4 в тканях человека (молочная железа, почка, легкое, яичник, шейка матки, кровь).
Возможно, его экспрессия ограничена определенным временным отрезком и/или тканями/клетками, которые мы не анализировали.
6. АНАЛИЗ ЧАСТОТ АЛЛЕЛЕЙ ГЕНОВ CCK, CCK1R, CCK2R И CCR Гены ССК и ССR5 локализованы на хромосоме 3 человека областях 3р22.1 3р21.31, соответственно. Наш интерес к этим генам обусловлен их участием в патогенезе двух социально значимых заболеваний: панические расстройства (CCK) и СПИД (CCR5).
6.1. Анализ частот аллелей генов CCK, CCK1R, CCK2R в случайной выборке жителей Москвы (работа выполнена при участии Коробейниковой Л.А.) С тех пор как были обнаружены паникогенные свойства холецистокинина, гены нейропептида ССK и его рецепторов CCK1R, ССK2R, а также мутации в них, активно изучаются. Предполагается, что гены нейропептида холецистокинина (ССK) и его рецепторов (CCK1R и ССK2R), а также мутации в них вовлечены в развитие панических расстройств. Однако их роль в патогенезе этого заболевания до сих пор не ясна. Поэтому несомненный практический интерес представляет анализ частот аллелей генов холецистокининэргической системы человека у жителей мегаполисов.
Нами были оценены частоты встречаемости семи SNP, расположенных в генах холецистокинина и его рецепторов, методом ПЦР ПДРФ на случайной выборке жителей Москвы, этническая принадлежность индивидуумов не учитывалась. Объем исследованной выборки 198 человек, выборка разнородна по половозрастному составу (107 женщин и 91 мужчина в возрасте от 18 до 57 лет). Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы Arlequin 3.11. Определенные нами частоты встречаемости полиморфных вариантов генов представлены в таблице 5.
Таблица 5. Исследованные SNP в генах ХЦК-системы и полученные значения частот.
Таким образом, нами впервые определены частоты семи SNP в генах ХЦК-системы человека в случайной выборке жителей Москвы.
Полученные нами данные в дальнейшем будут использованы в качестве группы сравнения в ассоциативных исследованиях с привлечением выборки индивидуумов, страдающих паническими расстройствами для определения степени вовлеченности исследуемых замен в патогенез патологической тревожности.
6.2. Ген CCR (в работ принимали участие Апрятин С.А. и Рахманалиев Э.Р.) Одним из факторов естественной резистентности к инфицированию М-тропным вариантом ВИЧ1 являются мутации CCR5del32 и CCR5m303 в гене ССR5 человека. Мутация CCR5del32 представляет собой делецию в пары нуклеотидов (мутация CCR5del32) в позиции 794-825 открытой рамки считывания гена ССR5 (chemokine (C-C motif) receptor 5) [Dean et al., 1996;
Liu et al., 1996;
Samson et al., 1996]. Мутация CCR5m303 является однонуклеотидной заменой (трансверсия) тимина на аденин в позиции открытой рамки считывания гена ССR5, которая приводит к появлению стоп-кодона и прекращению синтеза белка [Quillent et al., 1998;
Ometto et al., 1999;
Voevodin et al., 1999;
Beretta et al., 2000;
Wang et al., 2003].
При наличии любой из этих мутаций, ВИЧ1 не может использовать рецептор CCR5 в качестве корецептора для проникновения в клетку, поскольку транслируется функционально неактивный рецептор. Случаи гомозиготного состояния мутаций CCR5del32 и CCR5m303, а также присутствие обеих мутаций у одного индивидуума в гетерозиготном состоянии в транс-положении обеспечивают защиту от инфицирования ВИЧ1 при половом пути передачи. Гетерозиготные по CCR5del индивидуумы не защищены от инфицирования ВИЧ, однако, по некоторым данным в случае заражения у таких пациентов ВИЧ-инфекция прогрессирует медленнее по сравнению с индивидуумами, не несущими мутаций CCR5del32 [Гришаев и др., 1999].
Информация о присутствии мутаций CCR5del32 и CCR5m303 в гене CCR5 человека позволяет прогнозировать течение заболевания и возможность заражения вирусом иммунодефицита человека в группах риска.
6.2.1. Сравнение частот мутации CCR5del32 в гене CCR5 человека у русских, тувинцев, а также в группах ВИЧ-инфицированных индивидуумов Целью данной части работы было типирование инфицированных и здоровых индивидуумов, жителей Москвы, Мурманска и тувинцев на наличие мутации CCR5del32 и сравнение частот этой мутации у ВИЧ серонегативных представителей разных этнических групп, а также у ВИЧ серопозитивных пациентов, инфицированных половым (М-тропными вариантами ВИЧ-1) и парентеральным (Т-тропными вариантами ВИЧ-1) путями.
На основании полученных результатов был проведен сравнительный анализ частоты мутации CCR5del32 в исследуемых группах. Частота аллельного варианта CCR5del32 в гене CCR5 человека составила 7,8% в группе русских и 2,0% в группе тувинцев. Ни в одной из двух исследованных популяций не было обнаружено гомозигот по мутации ССR5del32. Примерно одинаковая частота аллеля CCR5del32 в группах ВИЧ-инфицированных и неинфицированных лиц (7,94% и 6,11%, соответственно) говорит о том, что гетерозиготный генотип не является протективным при половом пути передачи ВИЧ-инфекции. В группе ВИЧ серонегативных индивидуумов выявлено два гомозиготных образца CCR5del32/CCR5del32, тогда как в группе ВИЧ-позитивных ни одного гомозиготного образца обнаружено не было. Частота аллеля CCR5del32 в группе индивидуумов инфицированных половым путем составила 6,45%, тогда как в группе инфицированных парентеральным путем – 8,73%.
Однако, различия в частотах статистически недостоверны (2=0,29, p=0,78). В группе с неопределенным путем инфицирования частота аллеля CCR5del32 составила 7,69%. Ни в одной группе не было обнаружено гомозигот ССR5del32/ССR5del32.
Таким образом, гетерозиготный генотип, хотя, и снижает вероятность инфицирования, но не обеспечивает устойчивости к инфицированию. Полную защиту от инфицирования М-тропным вариантом ВИЧ-1 может обеспечить только наличие мутации ССR5del32 в гомозиготном состоянии.
Необходимо отметить, что соотношение аллелей ССR5 дикого типа и ССR5del32 гена ССR5 находится в равновесии. Следовательно, можно предположить, что исследованная популяция находится в равновесии по данному локусу и, скорее всего, не оказывает негативного воздействия на человека, поскольку лиганды рецептора CCR5 могут использовать другие хемокиновые рецепторы. Проведенное исследование частоты мутации CCR5del32 в различных группах ВИЧ–инфицированных и неинфицированных индивидуумов является важным для понимания механизма заражения и патогенеза ВИЧ-инфекции, а также для назначения индивидуальной схемы антиретровирусной терапии для ВИЧ инфицированных с учетом особенностей их генотипа.
6.2.2. Разработка тест-системы для одновременного определения двух мутаций в гене CCR5 (CCR5del32 и CCR5m303) Нами разработан способ одновременного определения двух мутаций (CCR5del32 и CCR5m303), которые независимо друг от друга влияют на генетическую устойчивость обследуемых к инфицированию вирусом иммунодефицита человека первого типа. Достигается это тем, что используется амплификация фрагмента гена ССR5 с использованием двух праймеров, комплементарных двум участкам гена ССR5, расположенным, соответственно, с 5’ и 3’ стороны выявляемых делеционной и однонуклеотидной мутаций, с последующей рестрикцией продуктов ПЦР эндонуклеазой HincII (HindII).
Возможные результаты генотипирования с использованием разработанной нами тест-системы представлены в таблице 6.
Таблица 6. Длины фрагментов, получаемые при генотипировании аллельных вариантов CCR5del32 (32) и CCR5m303 гена CCR5 человека методом ПЦР-ПДРФ с праймерами CCR5F и CCR5R и последующей обработкой продуктов ПЦР эндонуклеазой HincII, и соответствующие им генотипы.
* wt – wild type (дикий тип, отсутствие мутации) Таким образом, нами разработана новая, более эффективная тест система, которая может найти применение в медицине при диагностике наследственной генетической устойчивости индивидуума к инфицированию вирусом иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ1) и быстрому прогрессированию к синдрому приобретенного иммунодефицита (СПИД).
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ 1. Построена интегрированная физическая NotI-карта хромосомы человека на основе данных радиационного картирования, контиг картирования области 3p21-p22 и картирования методом флуоресцентной гибридизации in situ, включающая 60 NotI-STS маркеров. NotI-STS-маркеры и построенная на их основе NotI-карта эффективны для проверки совмещения и взаимного расположения геномных контигов человека.
NotI-STS-маркеры можно рассматривать как универсальные маркеры генов.
2. Активация транскрипции онкогена RHOA в опухолях происходит как за счет умножения копий гена, так и посредством деметилирования CpG-островков промоторного района.
3. Впервые показано изменение содержания мРНК гена SEMA3B в четырех видах рака (молочной железы, толстой кишки, светлоклеточный почечноклеточный, немелкоклеточный рак легкого и эпителиальный рак яичников). Снижение уровня транскрипции этого гена характерно для светлоклеточного почечноклеточного рака, а также рака толстой кишки и эпителиального рака яичников.
4. Экспрессия генов DAG1, RARB2, GPX1 (изоформа 1) достоверно увеличивается в опухолях молочной железы.
5. Впервые показано увеличение экспрессии генов RHOA, SEMA3B и СКАР2 в крови больных различными типами лейкозов.
6. Выявлена транскрипционная активность новых некодирующих белок генов W91914 (методом количественной ПЦР в реальном времени) и H51703 (методом полуколичественной ПЦР) в опухолевых и нормальных тканях человека.
7. Описана экзон-интронная структура генов ABLIM2, СКАР2, WASF4 и NBEAL2 человека, выявлена крнсервативность генов ABLIM2 и NBEAL2 и их белковых продуктов у чаловека, мыши и крысы.
Продемонстрирована органоспецифичность экспрессии генов Ablim и Nbeal2 у крысы.
8. Места интеграции транскрибируемой в клетках плоскоклеточного рака шейки матки ДНК вируса папилломы тип 16 локализованы в активно транскрибируемых областях генома.
9. Близлежащие с 3’-конца интегрированной ДНК ВПЧ16 участки полиаденилирования генома клетки-хозяина могут быть использованы для терминации транскрипции вируса.
10. Создана тест-система для одновременного определения мутаций CCR5del32 и CCR5m303 в гене CCR5 человека, обуславливающих генетическую устойчивость обследуемых к инфицированию вирусом иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ1).
СПИСОК ОПУБЛИКОВАНЫХ РАБОТ 1. Сулимова Г.Е., Компанийцев А.А., Кунижева С.С., Климов Е.А., Рахманалиев Э.Р., Удина И.Г. Картирование в геноме человека EST- и STS-маркеров с использованием панели радиационных гибридов // Генетика. 2000. Т.36. № 7. С.900-907.
2. Сулимова Г.Е., Компанийцев А.А., Мойсяк Е.В., Рахманалиев Э.Р., Климов Е.А., Удина И.Г., Захаров И.А. Радиационное картирование как один из основных методов построения физических карт геномов человека и животных с высоким уровнем разрешения // Радиационная биология.
Радиоэкология. 2000. Т.40. №5. С.520-528.
3. Дергунова Л.В., Раевская Н.М., Владыченская И.П., Полтараус А.Б., Климов Е.А., Сулимова Г.Е., Лимборская С.А. Мозгоспецифическая последовательность Hfb1 входит в состав протяженной 3' нетранслируемой области гена комплексина 2 человека: новые данные in vitro и in silico экспериментов // Молекулярная биология. 2001. Т.35. № 5.
С.778-786.
4. Eugene Klimov, Svetlana Vinokourova, Elena Moisjak, Elian Rakhmanaliev, Vera Kobseva, Laimonis Laimins, Fjodor Kisseljov, Galina Sulimova. Human papilloma viruses and cervical tumors: mapping of integration sites and analysis of adjacent cellular sequences // BMC Cancer. 2002. 2:24.
5. Рахманалиев Э.Р., Климов Е.А., Компанийцев А.А., Сулимова Г.Е..
Структура гена CKAP2 (LB1), вовлеченного в процессы онкогенеза человека // Молекулярная биология. 2002. Т.36. №6. С.985-989.
6. Sulimova G.E., Kutsenko A.S., Rakhmanaliev E.R., Udina I.G., Kompaniytsev A.A., Protopopov A.I., Moisjak E.V., Klimov E.A., Muravenko O.V., Zelenin A.V., Braga E.A., Kashuba V.I., Zabarovsky E.R., Kisselev L.L.
Human chromosome 3: integration of 60 NotI clones into a physical and gene map // Cytogenet. Genome Res. 2002. V.98. P.177-183.
7. Рахманалиев Э.Р., Апрятин С.А., Николаева И.А., Климов Е.А., Сулимова Г.Е., Сидорович И.Г. Способ одновременного определения мутаций CCR5del32 и CCR5m303 в гене CCR5 человека, обуславливающих генетическую устойчивость обследуемых к инфицированию вирусом иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ1) // Патент RU 2249619 C2.
от 23.04.2003.
8. Рахманалиев Э.Р., Климов Е.А., Сулимова Г.Е. Методы картирования геномов млекопитающих // Успехи современной биологии. 2004. Т.124.
№3. С.286-302.
9. Сулимова Г.Е., Рахманалиев Э.Р., Климов Е.А., Компанийцев А.А., Удина И.Г., Забаровский Е.Р., Киселев Л.Л. NotI-STS как маркеры генов хромосомы 3 человека // Молекулярная биология. 2005. Т.39. №4. С.687 701.
10. Eugene Klimov, Olga Rud’ko, Elian Rakhmanaliev, Galina Sulimova.
Genomic organisation and tissue specific expression of ABLIM2 gene in human, mouse and rat // BBA - Gene Structure and Expression. 2005. V.1730/1. P.1-9.
11. Апрятин С.А., Рахманалиев Э.Р., Николаева И.А., Рубан С.В., Вазыхова Ф.Г., Климов Е.А., Сулимова Г.Е., Сидорович И.Г. Мутация CCR5del32 в гене CCR5 человека влияет на устойчивость к инфицированию М-тропным вариантом ВИЧ-1 // Генетика. 2005. Т.41. №11. С.1559-1562.
12. Debora Angeloni, Arja ter Elst, Ming Hui Wei, Anneke Y. van der Veen, Eleonora A. Braga, Eugene A. Klimov, Tineke Timmer, Luba Korobeinikova, Michael I. Lerman and Charles H.C.M. Buys. Analysis of a new homozygous deletion in the tumor suppressor region at 3p12.3 reveals two novel intronic non-coding RNA genes // Genes, Chromosomes & Cancer. 2006. V.45. №7.
P.676-691.
13. Брага Э.А., Логинов В.И., Климов Е.А., Килосанидзе Г., Ходырев Д.С., Каганова Н.Л., Казубская Т.П., Ермилова В.Д., Гарькавцева Р.Ф., Пронина И.В., Рудько О.И., Забаровский Е.Р., Сулимова Г.Е., Киселев Л.Л..
Транскрипция онкогена RHOA в эпителиальных опухолях активируется посредством умножения копий гена и/или деметилирования промоторного района // Молекулярная биология. 2006. Т.40. №5. С.865-877.
14. И.В. Пронина, В.И. Логинов, Е.А. Климов, В.С. Прасолов, Д.С.
Ходырев, Т.П. Казубская, Р.Ф. Гарькавцева, Г.Е. Сулимова, Э.А. Брага.
Профили изменения экспрессии гена SEMA3B в эпителиальных опухолях // Молекулярная биология. 2009. Т.43. №3. С.439-445.
15. Е.А. Климов. Потенциальные сигналы терминации транскрипции интегрированной ДНК вируса папилломы человека: анализ in silico // Молекулярная биология. 2008. Т.42. №1. С.178-180.
16. Е.А. Климов, Э.Р. Рахманалиев, Г.Е. Сулимова. WASF4 – новый член семейства генов WAS // Молекулярная биология. 2008. Т.42. №4. С.625 628.
17. Коробейникова Л.А., Климов Е.А. Полиморфизм генов CCK, CCK1R и CCK2R у жителей Москвы // Медицинская генетика. 2010. Т.9. №6. C.
18. Е.А. Климов. Интеграции вирусов папилломы человека в геном клетки хозяина и патогенез рака шейки матки // Успехи современной биологии.
2010. Т.130. №4. С.381-389.
Автор выражает глубокую благодарность проф. Г.Е. Сулимовой и член корр. РАН И.А. Захарову-Гезехусу за постоянный интерес к данным исследованиям, их поддержку, за обсуждение результатов представленных в диссертации работ, за полезные критические замечания, советы и помощь в подготовке диссертационной работы.
Автор выражает искреннюю благодарность всем сотрудникам, аспирантам и студентам, работавшим в лаборатории сравнительной генетики животных в период с 1998 по 2010 годы, а также всем коллегам, в сотрудничестве с которыми была выполнена данная работа: проф. Ф.Л.
Киселеву, проф. Е.Р. Забаровскому, Э.А. Брага, В.И. Логинову, О.И.
Рудько и др..