Влияние нейротрансмиттера адреналина на водонагнетающую деятельность корня
На правах рукописи
ЖУКОВСКАЯ Наталья Валерьевна ВЛИЯНИЕ НЕЙРОТРАНСМИТТЕРА АДРЕНАЛИНА НА ВОДОНАГНЕТАЮЩУЮ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ КОРНЯ 03.00.12 – физиология и биохимия растений
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Москва - 2009
Работа выполнена в лаборатории регуляции водного обмена и засухоустойчивости и группе регуляции водного обмена Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва Научные руководители:
доктор биологических наук, профессор Жолкевич Владимир Николаевич кандидат биологических наук Дустмаматов Азиз Гуломович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Балнокин Юрий Владимирович доктор биологических наук Рощина Виктория Владимировна
Ведущая организация: Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А.Тимирязева (РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева)
Защита диссертации состоится 21 апреля 2009 года в 11 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Учреждении Россий ской академии наук Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адре су: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35.
Факс: (495) 977 8018, электронная почта: [email protected];
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН
Автореферат разослан « 18 » марта 2009 г.
Учёный секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций кандидат биологических наук М.И. Азаркович
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования.
У растений передвижение воды осуществляется благодаря функционирова нию верхнего (транспирация) и нижнего (корневое давление) концевых двигате лей водного тока. В отсутствие транспирации корневое давление является единст венной движущей силой, под действием которой вода перемещается из почвенно го раствора в сосуды ксилемы корня. Корневое давление имеет сложную природу и складывается из двух составляющих, условно называемых осмотической и не осмотической (гидростатической). Механизм формирования корневого давления и пути его эндогенной регуляции всё ещё не ясны. Наряду с классическими пред ставлениями о ведущей роли градиента осмотического давления, как движущей силы воды в корне (Слейчер, 1970;
Kramer, 1983;
Kramer, Boyer, 1995;
Steudle, 2002) в отношении природы корневого давления существует ряд нетрадиционных точек зрения. Среди них наиболее обоснованной является гипотеза о транспорте воды в радиальном направлении корня против градиента осмотического потен циала за счёт сокращения элементов цитоскелета в паренхимных клетках коры (Жолкевич и др., 1989;
Жолкевич, 2001). Предполагается, что в эндогенной регу ляции создаваемого таким образом корневого давления могут принимать участие фитогормоны и нейротрансмиттеры (химические передатчики (медиаторы) нерв ного возбуждения у животных) (Skoog, 1938;
Wallace, Meyer, 1941;
Tal, Imber, 1970, 1971;
Glinka, 1973;
Collins, Kerrigan, 1974;
Ionenko, Zyalalov, 1999;
Жолке вич, 2001;
Жолкевич и др., 2003). Интерес к нейротрансмиттерам возник в связи с обнаружением в растениях ацетилхолина (Emmelin, Feldberg, 1947), дофамина, норадреналина (Waakes et al., 1958), адреналина (Askar et al., 1972) и серотонина (Collier et al., 1956). Было обнаружено, что нейротрансмиттеры у растений обла дают высокой биологической активностью (Рощина, 1991;
Roshchina, 2001;
Murch, 2005;
Brenner et al. 2006). Они могут выполнять роль хемосигнализаторов, регуляторов роста и развития. На клеточном уровне они выполняют функцию ре гуляторов проницаемости мембран. В ряде работ было показано действие ней ротрансмиттеров на водонагнетающую деятельность корня (Жолкевич и др., 1995, 1997, 2001, 2003). Нейротрансмиттеры норадреналин, адреналин и серотонин стимулировали экссудацию у отделённых корней Zea mays L. Таким образом, изучение механизма регулирующего действия нейротрансмиттеров на корневое давление и на водообмен растения в целом представляет большой интерес.
Цель и задачи работы. Цель работы заключалась в исследовании влияния нейротрансмиттера адреналина на водонагнетающую деятельность корня и выяв лении возможных путей трансдукции сигнала от адреналина.
В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
1) изучить влияние адреналина на интенсивность экссудации, определить корневое давление, температурную чувствительность экссудации, осмоти ческое давление экссудата, а также рН экссудата;
2) исследовать влияние блокаторов адренорецепторов на интенсивность экссудации;
3) изучить роль G-белков в водонагнетающей деятельности корня и при пе редаче сигнала от адреналина;
4) выявить участие протеинкиназ и протеинфосфатаз в создании корневого давления и при передаче сигнала от адреналина;
5) изучить совместное действие фитогормонов (индолилуксусной или абс цизовой кислот) и адреналина на интенсивность экссудации.
Научная новизна работы.
Показан стимулирующий эффект нейротрансмиттера адреналина на экссу дацию. Определён ряд параметров экссудации на двух модельных системах – «целых» корнях и «рукавичках». Впервые показано, что в трансдукции сигнала при стимулирующем действии адреналина могут быть задействованы гетеротри мерные G-белки и кальций-зависимые серин-треониновые протеинкиназы. Впер вые испытано действие ряда блокаторов адренорецепторов на водонагнетающую деятельность корня.
Практическая значимость исследований.
Полученные данные имеют определённое значение в понимании механиз мов транспорта воды в корне, создании корневого давления, сигнальной системы регуляции деятельности корня. Вместе с тем, фундаментальные исследования ме ханизмов реакций растений с участием нейротрансмиттеров могут найти приме нение в прикладных целях. Во-первых, данные о содержании и метаболизме ней ротрансмиттеров в растениях имеют практическое значение для медицины и фар макологии как основа получения новых лекарственных препаратов растительного происхождения. Во-вторых, чувствительность растений к нейротрансмиттерам необходимо учитывать при разработке и использовании средств защиты растений.
В-третьих, накопление в растениях некоторых нейротрансмиттеров приводит к окислительно-восстановительным реакциях с образованием ядовитых продуктов.
Такие растения можно использовать как тесты на антинейромедиаторные яды.
Материалы диссертации могут быть также использованы при чтении лекций по физиологии растений для студентов биологических факультетов.
Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены на II международном симпо зиуме «Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 27-30 июня 2006 г.);
на годичном собрании общества физиологов расте ний России – конференции «Физиология растений – фундаментальная основа со временной фитобиотехнологии» (Ростов-на-Дону, 2-6 октября 2006 г.);
на годич ном собрании общества физиологов растений России – конференции «Современ ная физиология растений: от молекулы до экосистемы» (Сыктывкар,18-24 июня 2007 г.);
на годичном собрании общества физиологов растений России – конфе ренции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений» (Екатеринбург, 6-11 октября, 2008 г.).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 2 статьи в рецензируемом журнале.
Структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, включая 7 таблиц, 43 рисунка. Список литературы включает 212 источни ков, из которых 132 на иностранном языке.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект исследования. Объектом исследования были корни 5-7-дневных этиолированных проростков кукурузы (Zea mays L.) гибрида СТК-175. Семена проращивали в кювете при температуре 22±3°С. Для опыта отбирали проростки с прямым главным зародышевым корнем длиной 10 - 15 см. Лезвием бритвы в кап ле воды отсекали апикальную часть корня длиной 5 см, с которой в дальнейшем проводили эксперимент. В опытах использовали «целые» корни и полученные из них «рукавички». «Рукавички» – корни проростков, лишенные центрального ци линдра, при удалении которого разрыв происходит по клеткам эндодермы (Gins burg, Ginzburg, 1971). Для приготовления «рукавичек» корень изгибали, что при водило к разрыву коры, после этого осторожно вытягивали центральный цилиндр.
Таким образом, использовавшиеся в экспериментах «рукавички» состояли из ри зодермы, клеток коры, остатков клеток разорванной эндодермы. Внутри «рука вички» вместо удалённого центрального цилиндра находилась полость, диамет ром приблизительно 0,2 мм.
Интенсивность экссудации (Jv) «целых» корней и «рукавичек» определяли по методике Андерсена и Хауса (Anderesen, House, 1967). Установка для опытов включала в себя сосуд с испытуемым раствором и приемники для сбора экссудата – отрезки пипеток длиной 10 см, с ценой деления 1 мкл. Отделённые корни про ростков кукурузы вставляли в пипетки таким образом, чтобы корни входили в них на 2 мм. Предварительно в пипетки набирали небольшое количество воды для об легчения наблюдений за перемещением менисков. Места соединения корней с пипетками заклеивали расплавленной смесью канифоли и парафина, чтобы пре дотвратить вытекание экссудата из пипеток. Присоединённые к пипеткам корни предварительно выдерживали в течение 10 мин во влажной марле, чтобы предот вратить их высыхание и снизить раневой эффект. После этого корни с пипетками расставляли в сосуде с испытуемым раствором в вертикальном положении. Сосуд помещали в термостат U10 при температуре 30°С (при определении температур ного коэффициента также ещё и при 20°С) и определяли интенсивность экссуда ции. Интенсивность экссудации (Jv) рассчитывали как объём жидкости, проте кающей за единицу времени через единицу площади поверхности «целого» корня или «рукавички» по формуле (1):
Jv = Vэкс/(S·t), где (1) Vэкс – объём выделившегося экссудата, мкл;
S – площадь поверхности корня, см2;
t – время наблюдений, ч Площадь поверхности корня (S) рассчитывали по формуле (2):
S = 2·R·l, где (2) = 3,14;
R – радиус корня, см;
l – длина поверхности «целого» корня или «рукавички», см Температурный коэффициент (Q10, 20 – 30С) интенсивности экссудации рассчитывали как отношение Jv при 30° к Jv при 20°С.
Осмотическое давление экссудата (ОД) определяли микрокриоскопиче ским методом, используя осмометр «Osmomat 030» (фирма «Gonotec», Германия).
Экссудат для определения осмотического давления (ОД) собирали при 30С в течение 30 мин. Одновременно использовали 30 - 50 корней, экссудат которых объединяли в одну - две пробы по 50 мкл.
Корневое давление (КД) определяли компенсационным методом. Из не скольких растворов полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000), осмотическое давление кото рых было заранее измерено, выбирали такой раствор, в котором у отрезанных корней в течение пяти-десяти минут не наблюдалось экссудации. Осмотическое давление такого раствора принимали равным корневому давлению (КД).
Гидростатическую составляющую корневого давления (ГД) рассчитывали как разницу между корневым давлением и осмотическим давлением экссудата (3):
ГД = КД – ОД, где (3) ГД – гидростатическая составляющая корневого давления;
КД – корневое давление;
ОД – осмотическое давление экссудата Гидравлическую проводимость (Lp) корней определяли с помощью каме ры давления Шоландера (Scholander et al., 1964, 1965). Принцип метода заключал ся в измерении скорости экссудации при наложении внешнего давления на рас твор, в котором находились корни. Прилагаемое давление составляло 0,02 МПа.
Гидравлическую проводимость (Lp) рассчитывали по формуле (4):
Lp = Vэкс / (S·t·Р), где (4) Vэкс – объём выделившегося экссудата, мкл;
S – площадь поверхности корня, см2;
t – время наблюдений, ч;
Р – давление в камере, МПа Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета при ложений для статистической обработки данных – Microsoft Excel. На рисунках и в таблицах приведены средние арифметические и их стандартные отклонения. Раз личия между вариантами опытов оценивали по критерию Стьюдента для вероят ности 0.95. Каждый опыт проводился в 5-10 биологических повторностях, при этом в каждом варианте опыта было по 6-8 образцов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние адреналина на параметры водного обмена «целых» корней и «рукавичек» Более 20 лет назад было обнаружено стимулирующее действие ацетилхоли на и других химических передатчиков нервного возбуждения (нейротрансмитте ров адреналина, норадреналина, серотонина) на экссудацию у растений (Жолке вич, 1979;
Жолкевич и др., 1995, 1997, 1998). Мы подобрали концентрацию адре налина (10-6М), в которой он стабильно стимулировал экссудацию приблизитель но на 25 – 40 % по сравнению с контролем. Адреналин, стимулировавший экссу дацию «целых» корней (до 131% от контроля) и «рукавичек» (до 142% от контро ля), несколько увеличивал корневое давление и снижал осмотическое давление экссудата (табл. 1.). В результате этого возрастала гидростатическая составляю щая корневого давления (определяемая как разница между корневым давлением и осмотическим давлением экссудата). Объяснить усиление интенсивности экссу дации при действии адреналина можно было бы увеличением проницаемости кле ток корня для воды, однако, гидравлическая проводимость корней при действии адреналина у «целых» корней не изменялась, а у «рукавичек» даже уменьшалась (табл. 1.).
Для понимания природы происходящих явлений может помочь такой пока затель, как температурный коэффициент. У простых физических процессов Q10 бли зок к единице (например, при диффузии и осмосе), у химических реакций Q10 ра вен 2-3, у сложных процессов цепного характера превышает 3 (Zimmermann, Mil burn, 1975). Увеличение Q10 интенсивности экссудации при действии адреналина у «целых» корней (до 3,3) и «рукавичек» (до 5,0) указывает на возрастание роли сложных ферментативных процессов, вероятно, связанных с изменением движу щей силы экссудации (табл. 1.).
Таким образом, при действии адреналина происходит увеличение гидроста тической составляющей корневого давления. Ранее было сделано предположение о том, что это увеличение связано с сокращением элементов цитоскелета в парен химных клетках коры (Жолкевич, 2001).
Следует отметить, что интенсивность экссудации, как в контроле, так и при действии адреналина у «рукавичек» была существенно выше, чем у «целых» кор ней (табл. 1.). Можно видеть, что усиление интенсивности экссудации у «рукави чек» происходило как при увеличении гидравлической проводимости корней, так и возрастании корневого давления. При этом корневое давление увеличивалось в основном за счёт его гидростатической составляющей (ГД). Увеличение движу щей силы экссудации могло происходить и вследствие локального возрастания осмотического давления отдельных клеток коры, поскольку у «рукавичек» осмо тическое давление экссудата также повышалось.
Таблица 1.
Влияние адреналина на параметры водного обмена «целых» корней и «рукавичек» Jv – интенсивность экссудации;
ОД – осмотическое давление экссудата;
КД – корневое давление;
ГД – гидростатическая составляющая;
Q10 – температурный коэффициент интенсивности экссудации;
Lp – гидравлическая проводимость корня рН ГС, *Lp, мкл·см-2ч- Jv, Q Вариант ОД, кПа КД, кПа 0,02МПа экс % от мкл·см-2ч-1 су кПа - КД дата 3,9±0,3 200±20 420±20 220±20 210± Контроль, 52 3,0±0,2 5, вода 100 100 100 100 «Целые» корни 5,1±0,3 160±10 450±10 290±10 195± НСР05=0,32 НСР05=15 НСР05=15 НСР05= Адреналин, 3,3±0,2 НСР05= 64 5, НСР05=0, 10-6М 131 80 107 132 510± 9,3±0,9 250±30 700±30 450± Контроль, 65 4,0±0,2 5, вода 100 100 100 «Рукавички» 13,2±0,9 210±30 820±10 610±30 420± Адреналин, 5,0±0, НСР05=1,3 НСР05=28 НСР05=21 НСР05=28 НСР05= 74 5, НСР05=0, 10-6М 142 84 117 135 * Прим. Lp определяли в камере Шоландера при внешнем давлении 0,02 МПа Влияние блокаторов адренорецепторов на экссудацию Действие блокаторов адренорецепторов на экссудацию могло бы свидетель ствовать о вовлечении последних в регуляцию водонагнетающей деятельности корня. В связи с этим было испытано влияние различных блокаторов - и адренорецепторов животных на экссудацию «целых» корней. Известно, что адреноблокаторы у животных снижают кровяное давление, применяются в каче стве лекарственных средств при обезвоживании организма, -адреноблокаторы вызывают сужение периферических сосудов, усиливают сердечные сокращения.
Приведённые сведения указывают на то, что все адреноблокаторы прямо или кос венно воздействуют на гидростатическую составляющую и сопротивляемость тканей кровяному току у животных.
Нами были испытаны -адреноблокаторы (надолол, тимолол), селективные 1-адреноблокаторы (атенолол, ацебутолол, метапролол), -адреноблокаторы (ин дорамин, кетансерин, ницерголин, дигидроэргокристин, дигидроэрготамин), 1 адреноблокаторы (празозин), 1- и - адреноблокатор (лабеталол). Каждый препа рат применялся в диапазоне концентраций от 10-9М до 10-2М.
Большинство адреноблокаторов не оказывали существенного влияния на экссудацию (табл. 2.). Через два часа наблюдений отмечалось ингибирование экс судации под влиянием дигидроэргокристина в концентрациях 5·10-4М и 10-4М, ди гидроэрготамина в концентрациях 10-5, 10-4 и 5·10-4М, тимолола в концентрациях 10-6 и 10-5М, атенолола в концентрациях 10-3М и 10-2М, лабетолола в концентра циях 10-3М и 10-2М.
Вместе с тем обнаружено мощное стимулирующее действие на экссудацию -адреноблокатора ницерголина (табл. 2.). Ницерголин в концентрациях 5·10- (кривая 5), 10-3 (кривая 4) и 5·10-4М (кривая 3) увеличивал интенсивность экссу дации в 5 - 8 раз по сравнению с той, которая наблюдалась в контроле (рис. 1.).
При более низких концентрациях эффект ницерголина практически отсутствовал.
Следует отметить, что осмотическое давление экссудата при действии ницерго лина в момент наибольшего стимулирования экссудации не изменялось по срав нению с контролем (вода).
Таблица 2.
Влияние блокаторов адренорецепторов на экссудацию корней кукурузы Zea mays L.
Адренорецепторы Вещество Концентра- Влияние на экссудацию, экспозиция 2 ч ция, М (% от контроля) 10-4… 10- неселективные - индорамин Отсутствие статистически достоверно адренорецепторы го эффекта 5·10-4… 10- кетансерин Отсутствие статистически достоверно го эффекта 10- ницерголин 5·10-4 10-3 5·10-3 5·10- дигидроэр- 10- гокристин 10- дигидроэр- 5·10- готамин 10-4 5·10-4 10 … 10- - селективные 1- празозин Отсутствие статистически достоверно адренорецепторы го эффекта 10- неселективные - тимолол 10- адренорецепторы 10... 10- - надолол Отсутствие статистически достоверно го эффекта 10- селективные 1- атенолол 10- адренорецепторы 10 … 10- - ацебутолол Отсутствие статистически достоверно го эффекта 10-2… 10- метапролол Отсутствие статистически достоверно го эффекта 10- 1 + - лабеталол 10- адренорецепторы Ингибирование экссудации при действии некоторых адреноблокаторов (ди гидроэргокристина, дигидроэрготамина, тимолола, атенолола, лабетолола ) в не которой степени может указывать на вероятность присутствия - и -подобных адренорецепторов в клетках растений и о специфичности процесса. Мощный сти мулирующий эффект ницерголина на экссудацию, вероятно, связан с иным меха низмом действия. Скорее всего, при действии ницерголина либо сильно возраста ла гидравлическая проницаемость корней для воды, либо ницерголин оказывал разрушающее действие на мембраны, поскольку экссудация через некоторое вре мя прекращалась.
Jv, мкл/(см ч) 8, 7, 6, 5 5, 4, 3, 1 2, 1, 0, -1, 1 2 3 4 5 Время, ч Рис. 1. Влияние ницерголина в разных концентрациях на интенсивность экссудации отделённой корневой системы Zea mays L. при 30°C.
1 – контроль, вода;
Ницерголин: 2 – 10-4М;
3 – 5·10-4М;
4 – 10-3М;
5 – 5·10-3М Влияние гуанозинтиодифосфата и гуанозинтиотрифосфата на экссудацию корней по отдельности и совместно с адреналином С целью выяснения участия G-белков в регуляции транспорта воды в корне и в трансдукции сигнала при стимулирующем действии адреналина на экссуда цию были испытаны ингибитор ГТФ-связывающей активности G-белков – гуано зинтиодифосфат (ГДФ) и стимулятор этой активности гуанозинтиотрифосфат (ГТФ). G-белки рассматриваются как первое звено в сигналинге (Тарчевский, 2002). Опытным путём были подобраны концентрации, при которых экссудация подавлялась и стимулировалась этими веществами приблизительно на 30 – 50%.
Для обоих веществ она составила 2·10-5М.
Гуанозинтиодифосфат у «целых» корней ингибировал экссудацию (до 69% от контроля) (рис. 2.), а гуанозинтиотрифосфат в той же концентрации стимули ровал (до 131% от контроля) (рис. 3.). У «рукавичек» ингибирование экссудации гуанозинтиодифосфатом и стимуляция экссудации гуанозинтиотрифосфатом бы ли выражены более отчётливо, чем у «целых» корней (рис. 4, 5.). Прямо противо положный эффект при действии гуанозинтиодифосфата и гуанозинтиотрифосфата на экссудацию указывает на то, что G-белки принимают участие в регуляции транспорта воды в корне и создании корневого давления.
При совместном присутствии в инкубационной среде адреналина и гуано зинтиодифосфата происходило ингибирование экссудации, однако это ингибиро вание было выражено в меньшей степени, чем при действии одного гуанозинтио дифосфата (до 92% от контроля у «целых» корней (рис. 2.), до 86% у «рукавичек» (рис. 4.). При совместном же использовании гуанозинтиотрифосфата и адренали на наблюдалась тенденция к усилению стимуляции экссудации (до 146% у «це лых» корней (рис. 3.), до 171% у «рукавичек» (рис. 5.), т.е. была неполная ад дитивность стимулирующих эффектов. Полученные данные свидетельствуют об участии G-белков в передаче сигнала от адреналина, и в то же время, сигнал, ин дуцируемый адреналином и приводящий к стимуляции им водонагнетающей дея тельности корня, может, по-видимому, передаваться и без участия G-белков, т.е.
какими-то другими путями (иначе бы стимулирование экссудации адреналином полностью снималось при совместном использовании гуанозинтиодифосфата и адреналина).
Jv, мкл/(см 20мин) 2, Рис. 2. Влияние адреналина и гуанозинтио 131% 2, дифосфата по отдельности и совместно на 100% 92% 1,5 интенсивность экссудации «целых» корней.
69% 1 – контроль (вода);
2 – адреналин (10-6М);
1, 3 – гуанозинтиодифосфат (2·10-5М);
4 – ад 0, реналин (10-6М) + гуанозинтиодифосфат 0,0 - (2·10 М) 1 2 3 Jv, мкл/(см 20 мин) 2, 131% 131% 146% Рис. 3. Влияние адреналина и гуанозинтио 2, трифосфата по отдельности и совместно на 100% 1, интенсивность экссудации «целых» корней.
1 – контроль (вода);
2 – адреналин (10-6М);
1, 3 – гуанозинтиотрифосфат (2·10-5М);
4 – ад 0, реналин (10-6М) + гуанозинтиотрифосфат 0,0 - (2·10 М) 1 2 3 Jv, мкл/(см 20 мин) 6, 142% Рис. 4. Влияние адреналина и гуанозинтио 5, дифосфата по отдельности и совместно на 4,0 100% интенсивность экссудации «рукавичек».
86% 3,0 1 – контроль (вода);
2 – адреналин (10-6М);
45% 2,0 3 – гуанозинтиодифосфат (2·10-5М);
4 – адре налин (10-6М) + гуанозинтиодифосфат 1, (2·10-5М) 0, 1 2 3 Jv, мкл/(см 20 мин) 6,0 158% 171% 142% 5,0 Рис. 5. Влияние адреналина и гуанозинтио 4,0 100% трифосфата по отдельности и совместно на 3,0 интенсивность экссудации «рукавичек».
1 – контроль (вода);
2 – адреналин (10-6М);
2, 3 – гуанозинтиотрифосфат (2·10-5М);
4 – ад 1, реналин (10-6М) + гуанозинтиотрифосфат 0, (2·10-5М) 1 2 3 Влияние стауроспорина и окадаевой кислоты на экссудацию корней по отдельности и совместно с адреналином Протеинкиназы и протеинфосфатазы являются звеньями сигнальных сис тем. Протеинкиназы катализируют реакции фосфорилирования белков, а проте инфосфатазы – обратные им реакции дефосфорилирования, возвращающие ак тивность белков-субстратов в исходное состояние (Тарчевский, 2002;
Hunter, 1995). Для выяснения роли протеинкиназ и протеинфосфатаз в регуляции водона гнетающей деятельности корня и в трансдукции сигнала при стимулирующем действии адреналина на экссудацию были испытаны ингибитор протеинкиназ – стауроспорин (5·10-7М) и ингибитор протеинфосфатаз – окадаевая кислота (2·10-9М).
Стауроспорин подавлял экссудацию («целых» корней до 77% (рис. 6), «рукавичек» до 55% от контроля (рис. 8.), а окадаевая кислота, напротив, стиму лировала («целых» корней до 131% (рис. 7.), «рукавичек» до 145% (рис. 9.).
Это обстоятельство может свидетельствовать в пользу участия серин-треонино вых протеинкиназ и протеинфосфатаз в регуляции водонагнетающей деятельно сти корня.
При совместном присутствии в среде стауроспорина и адреналина интен сивность экссудации тормозилась, однако, в меньшей степени, чем в одном рас творе стауроспорина (до 85% у «целых» корней (рис. 6.), до 68% от контроля у «рукавичек» (рис. 8.). При совместном применении окадаевой кислоты и адрена лина происходило усиление стимуляции экссудации по сравнению с той, которая наблюдалась при действии адреналина и окадаевой кислоты по отдельности (до 146% от контроля у «целых» корней (рис. 7.), до 161% у «рукавичек» (рис. 9.). Та ким образом, полученные данные показывают, что протеинкиназы и протеинфос фатазы принимают участие в трансдукции сигнала при стимулирующем действии адреналина на экссудацию.
G-белки, протеинкиназы и протеинфосфатазы принимают участие в регуля ции водонагнетающей деятельности корня в норме. При этом сигнал, индуцируе мый адреналином и приводящий к стимуляции им водонагнетающей деятельно сти корня, вероятно, передается через G-белки и протеинкиназы, что, однако, не исключает привлечения других интермедиатов, например, вызывающих открыва ние и закрывание ионных каналов.
Jv, мкл/(см 20 мин) 2, 131% 2, Рис. 6. Влияние адреналина и стауроспорина 100% 85% 1, 77% по отдельности и совместно на интенсив ность экссудации «целых» корней.
1, 1 – контроль (вода);
2 – адреналин (10-6М);
0, 3 – стауроспорин (5·10-7М);
4 – адреналин 0,0 (10-6М) + стауроспорин (5·10-7М) 1 2 3 Jv, мкл/(см 20 мин) 2, 146% 131% 131% Рис. 7. Влияние адреналина и окадаевой ки 2, 100% слоты по отдельности и совместно на интен 1, сивность экссудации «целых» корней.
1,0 1 – контроль (вода);
2 – адреналин (10-6М);
3 – окадаевая кислота (2·10-9М);
4 – адрена 0, лин (10-6М) + окадаевая кислота (2·10-9М) 0, 1 2 3 Jv, мкл/(см 20 мин) 6, 142% 5,0 Рис. 8. Влияние адреналина и стауроспорина 100% 4,0 по отдельности и совместно на интенсив 3,0 68% ность экссудации «рукавичек».
55% 1 – контроль, (вода);
2 – адреналин (10-6М);
2, 3 – стауроспорин (5·10-7М);
4 – адреналин, 1, -6 - 0,0 (10 М) + стауроспорин (5·10 М) 1 2 3 Jv, мкл/(см 20 мин) 6,0 161% 142 % 145 % Рис. 9. Влияние адреналина и окадаевой ки 5, 100% слоты по отдельности и совместно на ин 4, тенсивность экссудации «рукавичек».
3, 1 – контроль (вода);
2 – адреналин (10-6 М);
2, 3 – окадаевая кислота (2·10-9М);
1, 4 – адреналин (10-6М) + окадаевая кислота 0,0 - (2·10 М) 1 2 3 Все испытуемые химические агенты (гуанозинтиодифосфат, гуанозинтио трифосфат, стауроспорин и окадаевая кислота) существенно меняли величину температурного коэффициента интенсивности экссудации как у «целых» корней, так и у «рукавичек» (табл. 3.). Более значительные изменения величины Q10, от меченные у «рукавичек», свидетельствуют об особенно существенной роли слож ных ферментативных процессов, вероятно, связанных с формированием движу щей силы водонагнетающей деятельности корня.
Таблица 3.
Температурный коэффициент интенсивности экссудации (Q10, (20 – 30С), экспозиция 20 мин) Вариант контроль, адреналин, ГДФ, ГТФ, стаурос- окадаевая 10-6М 2·10-5М 2·10-5М вода порин, кислота 5·10-7М 2·10-9М «целые» 3,0±0,3 3,3±0,2 1,7±0,2 3,6±0,2 2,0±0,3 3,3±0, корни «рукавич 4,0±0,3 5,0±0,3 1,3±0,2 5,8±0,3 2,1±0,3 5,5±0, ки» Совместное действие адреналина и фитогормонов (ИУК и АБК*) на экссудацию В связи с тем, что механизм регуляции водонагнетающей деятельности корня фитогормонами и нейротрансмиттерами всё ещё остаётся неизвестным, мы исследовали действие этих веществ на экссудацию. Влияние фитогормонов было изучено по отдельности и совместно с адреналином. Из рисунков 10 и 11 видно, что адреналин, ИУК и АБК стимулировали экссудацию. Вместе с тем видно, что при совместном присутствии в среде адреналина с ИУК или АБК аддитивности в действии двух веществ не было и даже происходило некоторое снижение стиму ляции экссудации, по сравнению с той, которая наблюдалась при действии этих веществ по отдельности. Стимулирование экссудации адреналином, как в присут ствии ИУК, так и в присутствии АБК составило до 118% от контроля. Получен ные результаты дают основание полагать, что действие адреналина, ИУК и АБК нацелено на одну и ту же мишень, иначе можно было бы ожидать проявления в той или иной степени аддитивности их действия. Снижение интенсивности экссу дации (хотя оно статистически недостоверно) при совместном присутствии в сре де адреналина с ИУК или адреналина с АБК может свидетельствовать о возмож ных конкурентных взаимоотношениях между адреналином и фитогормонами (Рощина, 1991;
Кулаева, 1995;
Roshchina, 2001).
* АБК – абсцизовая кислота;
ИУК – индолилуксусная кислота Jv, мкл/(см ч) 3,5 131% 125% 118% 3, 100% 2,5 Рис. 10. Влияние адреналина и ИУК по 2,0 отдельности и совместно на интенсивность 1,5 экссудации «целых» корней. 1 – контроль, 1,0 (вода);
2 – адреналин (10-6М);
3 – ИУК 0, (10-6М);
4 – адреналин (10-6М) + ИУК (10-6М) 0, 1 2 3 Jv, мкл/(см ч) 3,5 131% 131% 118% 3,0 100% Рис. 11. Влияние адреналина и АБК по от 2, 2,0 дельности и совместно на интенсивность 1,5 экссудации «целых» корней. 1 – контроль, (вода);
2 – адреналин (10-6М);
3 – АБК 1, 0,5 (4·10-7М);
4 – адреналин (10-6М) + АБК 0,0 (4·10-7М) 1 2 3 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Адреналин и другие нейротрансмиттеры (ацетилхолин, норадреналин, серо тонин), обнаруженные не только у животных, но и у растений, позволяют гово рить об их универсальности в живом мире. Учитывая то, что адреналин оказывает внесинаптическое действие на органы у животных, можно предположить, что он и в организме растения выступает как регулятор внутриклеточных процессов, в том числе водонагнетающей деятельности корня (что подтверждается достаточно низкой концентрацией, в которой действует адреналин (10-6М). Помимо сигналь ной функции накопление адреналина в высоких концентрациях (10-4М) может быть связано со стрессовой ситуацией, где адреналин выступает в роли оксиданта (Рощина, 2000;
Roshchina, 2001).
Адреналин, оказывая стимулирующие действие на экссудацию «целых» корней и «рукавичек», влияет не на гидравлическую проводимость корней, а, главным образом, на движущую силу экссудации (корневое давление). Возраста ние движущей силы при действии адреналина является результатом увеличения гидростатической составляющей корневого давления, формируемой паренхим ными клетками коры. В качестве движущей силы водонагнетающей деятельности корня при действии адреналина нельзя исключить и локальное возрастание осмо тического давления в тканях коры.
Нами исследовано возможное участие G–белков, протеинкиназ и протеин фосфатаз на передачу сигнала внутри клетки при стимулирующем действии адре налина на экссудацию. Впервые было испытано воздействие на экссудацию гуа нозинтиотрифосфата – стимулятора ГТФ-связывающей активности G-белков и гуанозинтиодифосфата – ингибитора этой активности;
окадаевой кислоты – инги битора активности серин-треониновых протеинфосфатаз и стауроспорина – инги битора серин-треониновых протеинкиназ. Действие этих веществ испытано, как на «целых» корнях так и на «рукавичках». Полученные результаты укладываются в гипотетическую схему действия адреналина у Zea mays:
адреналин рецептор G-белок протеинкиназы (протеинфосфатазы) физиологический ответ Более детально схема представлена на рисунке 12 (модифицированная схема пе редачи сигнала от адреналина у животных). В тканях коры адреналин (лиганд) может связываться с рецепторами на внешней поверхности плазматической мем браны. На возможное присутствие в клетках растений - и -подобных рецепто ров указывают данные, полученные в опытах с адреноблокаторами. Связывание гормона с рецептором может приводить к передаче сигнала на внутреннюю по верхность мембраны (G-белки) и тем самым запускать синтез вторичных мес сенджеров. К таким вторичным мессенджерам, возможно, относится цАМФ, ко торый в свою очередь активируют протеинкиназы, фосфорилирующие соответст вующие белки. Открытие в растительной клетке и её органеллах вторичных мес сенджеров (цАМФ, цГМФ, ионов Са2+), а также фермента аденилатциклазы под тверждают возможность локальной медиации адреналином. Кроме передачи сиг нала через вторичные мессенджеры, адреналин, возможно, влияет на ионные ка налы, изменяя проницаемость мембран для ионов Nа+, К+ и Са2+, что приводит к изменению мембранного потенциала и возникновению распространяющегося по тенциала действия. В итоге активация тех или иных ферментов вызывает измене ние параметров водонагнетающей деятельности корня в целом.
Рис. 12. Модифицированная схема передачи сигнала от адреналина у Zea mays В экспериментах при совместном присутствии в среде адреналина и фито гормонов (ИУК и АБК) интенсивность экссудации не усиливалась. Это позволило сделать предположение о том, что действие адреналина, ИУК и АБК нацелено на одну и ту же мишень, иначе можно было бы ожидать проявления в той или иной степени аддитивности их действия.
Таким образом, водонагнетающая деятельность корня подвергается много ступенчатой эндогенной регуляции. Все приведённые факты свидетельствуют о сложной природе движущей силы экссудации – корневого давления, создаваемого осмотическими и гидростатическими системами, вероятно, при участии сократи тельных элементов цитоскелета паренхимных клеток коры (Жолкевич, 2001).
ВЫВОДЫ 1) Адреналин, оказывая стимулирующие действие на экссудацию, влияет не на гидравлическую проводимость корней, а, главным образом, на движущую силу экссудации (корневое давление). Увеличение движущей силы экссудации «це лых» корней и «рукавичек» является результатом возрастания гидростатической составляющей корневого давления.
2) Усиление интенсивности экссудации у «рукавичек» как в контроле, так и при действии адреналина связано с увеличением гидравлической проводимости кор ней и возрастанием корневого давления (либо за счёт увеличения его гидростати ческой составляющей, формируемой паренхимными клетками коры, либо за счёт локального возрастания осмотического давления отдельных клеток коры).
3) Стимулирующий эффект адреналина на экссудацию и ингибирование экссуда ции некоторыми адреноблокаторами свидетельствует в пользу существования и -подобных адренорецепторов в растениях.
4) Результаты опытов по совместному влиянию на экссудацию адреналина с ин гибитором активности G-белков – гуанозинтиодифосфатом и стимулятором ак тивности G-белков – гуанозинтиотрифосфатом могут свидетельствовать об уча стии G-белков в регуляции транспорта воды в корне и в трансдукции сигнала при стимулирующем действии адреналина на экссудацию.
5) Данные, полученные в опытах по совместному воздействию на экссудацию ад реналина с ингибитором протеинкиназ – стауроспорином и ингибитором проте инфосфатаз – окадаевой кислотой, свидетельствуют в пользу участия протеинки наз и протеинфосфатаз в регуляции водонагнетающей деятельности корня и в трансдукции сигнала от адреналина.
6) Результаты опытов по совместному влиянию на экссудацию адреналина и фи тогормонов (ИУК или АБК) позволяют заключить о том, что действие адренали на, ИУК и АБК нацелено на одну и ту же мишень.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССРЕТАЦИИ 1. Жолкевич В.Н., Дустмаматов А.Г., Эрлих Н.Т., Жуковская Н.В., Попова М.С., Кузнецова Н.А. Сигнальные пути фитогормональной и нейромедиаторной стиму ляции нагнетающей активности корня. Тезисы докладов II международного сим позиума «Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 27-30 июня 2006 г.). Казань. 2006. С. 39.
2. Жуковская Н. В. Влияние нейротрансмиттера адреналина на водонагнетающую деятельность корня // Тезисы докладов годичного собрания общества физиологов растений России – конференции «Физиология растений – фундаментальная осно ва современной фитобиотехнологии» (Ростов-на-Дону, 2-6 октября 2006 г.). Рос тов-на-Дону. 2006. С. 89.
3. Жуковская Н.В. Участие G-белков при стимулирующем воздействии адренали на на водонагнетающую деятельность корня. Тезисы докладов годичного собра ния общества физиологов растений России – конференции «Современная физио логия растений: от молекулы до экосистемы. Часть I. (Сыктывкар, 18-24 июня 2007 г.). Сыктывкар. 2007. С. 79.
4. Жуковская Н.В. Участие протеинкиназ и протеинфосфатаз в трансдукции сиг нала, связанного с водонагнетающим действием адреналина на корни. Тезисы докладов годичного собрания общества физиологов растений России – конферен ции «Современная физиология растений: от молекулы до экосистемы. Часть I.
(Сыктывкар, 18-24 июня 2007 г.). Сыктывкар. 2007. С. 81.
5. Жолкевич В.Н., Жуковская Н.В., Попова М.С. Участие протеинкиназ и проте инфосфатаз в трансдукции сигналов при стимулирующем действии нейротранс миттеров на водонагнетающую деятельность корня. // Физиология растений. 2007.
Т. 54. № 4. С. 550 – 554.
6. Жолкевич В.Н., Жуковская Н.В., Попова М.С. Стимулирующее воздействие ад реналина и норадреналина на водонагнетающую деятельность корня и участие G белков. // Физиология растений. 2007. Т. 54. № 6. С. 885 – 892.
7. Жуковская Н.В., Попова М.С., Дустмаматов А.Г. Влияние адреноблокаторов на водонагнетающую деятельность корня. Тезисы докладов годичного собрания об щества физиологов растений России – конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений». (Екатеринбург, 6-11 октяб ря, 2008 г.). Екатеринбург. 2008. С. 175 – 176.