Кардиотропные эффекты адф-рибозы у зимоспящих и незимоспящих животных

на правах рукописи

КУЗЬМИН Владислав Стефанович КАРДИОТРОПНЫЕ ЭФФЕКТЫ АДФ-РИБОЗЫ У ЗИМОСПЯЩИХ И НЕЗИМОСПЯЩИХ ЖИВОТНЫХ 03.00.13 – физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2006

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова (Зав. кафедрой – профессор А.А.

Каменский), в лаборатории электрофизиологии сердца ИЭК РК НПК РФ (заведующий – академик РАН Л. В. Розенштраух).

Научный консультант:

кандидат биологических наук, доцент Г. С. Сухова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В. Б. Кошелев доктор биологических наук Т. Г. Емельянова

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Российский Государственный Медицинский Университет Росздрава.

Защита состоится 25 декабря 2006 года в 15 час. 30 мин. на заседании Диссертационного Ученого Совета Д. 501.001. биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова по адресу:

119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет, дом 1, стр.12., ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан ноября 2006 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор биологических наук Б. А. Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Зимоспящие животные обладают способностью при наступлении неблагоприятных климатических условий значительно снижать метаболизм и длительное время поддерживать его на низком уровне.

Уникальными особенностями обладает сердечно-сосудистая система зимоспящих животных. Сердце зимоспящего способно выполнять свою функцию при температуре тела 1-5°С (Lyman, 1955;

Ануфриев, 2005). При этом в сердце зимоспящего никогда не наблюдается аритмий или фибрилляции (Burligton et al., 1989). Механизм вхождения животного в спячку и поддержания в течение продолжительного времени функционирования организма в экстремальных условиях не выяснен.

Многолетние исследования показали, что в регуляции естественного гипобиоза принимают участие нейропептиды, гормоны, медиаторы ЦНС, жирные кислоты (Корякина, 1976;

Margules, 1979;

Swan, 1981;

Oeltjen, 1988;

Milsom, 1993;

Jansky, 1990). Однако, в регуляции естественного гипобиоза принимает участие ряд малоизученных веществ, которые могут содержаться во фракциях экстрактов, выделенных из ряда тканей зимоспящих животных (Игнатьев и др., 1998). Такие фракции обладали гипометаболическим эффектом при введении незиомспящим животным, провоцировали спячку у зимоспящих (Иваницкий и др., 1982;

Пастухов и др, 1983;

Игнатьев и др., 1987). При исследовании фракций в их составе был обнаружен ряд пептидов и нуклеотидов пуринового ряда (Зиганшин, 1994). Для некоторых фракций было показано, что их гипометаболический эффект практически полностью обусловлен нуклеотидами (Сухова и др., 1998).

В составе фракций был обнаружен такой нуклеотид, как АДФ-рибоза. АДФ рибоза широко распространена в организме: присутствует практически во всех тканях (Franco et al., 2001). Существует ряд ферментов, ответственных за синтез и метаболизм АДФ-рибозы как внутри, так и снаружи клетки (Kim et al., 1993;

Zolkievska, 2005). Этот нуклеотид участвует в регуляции ряда внутриклеточных функций. АДФ-рибоза является разобщителем дыхательной цепи митохондрий, внутриклеточным агонистом катионных неселективных каналов (Perraud et al., 2001), участвует в регуляции уровня цитоплазматического кальция, через модуляцию рианодиновых рецепторов (Jayaraman et al., 1992) и кальциевых АТФ аз (Berridge et al., 2003), модулирует активность КСа– и КАТФ—каналов (Li, Zou et al., 1998;

Kim et al., 1993). Активирует некоторые пуриновые рецепторы (Hoyle et al., 1992).

АДФ-рибоза обнаружена в составе низкомолекулярных фракций экстрактов ряда тканей зимоспящих животных во время гибернации, в то же время у летнеактивных зимоспящих она не определена. Представляется логичным, что во время гибернации нуклеотид может опосредовать ряд эффектов, характерных для зимней спячки. Роль АДФ-рибозы в регуляции сердечно-сосудистой системы зимоспящего и незимоспящего животного не изучена. До настоящего времени не было известно, обладает ли АДФ-рибоза кардиотропным действием на сердце млекопитающего.

Цель настоящей работы состояла в исследовании действия АДФ-рибозы и её метаболитов на сердце зимоспящего и незимоспящего животного.

В работе были поставлены следующие задачи 1.Выявить возможные кардиотропные эффекты АДФ-рибозы в сердце суслика и крысы.

2.Выявить мишени действия АДФ-рибозы в сердце суслика и крысы.

Изучить эффекты АДФ-рибозы на электрическую активность различных отделов сердца.

3.Сравнить действие АДФ-рибозы на сердце зимоспящего и незимоспящего животного.

4.Определить, являются ли эффекты АДФ-рибозы самостоятельными или связаны с действием её метаболитов.

5.Выявить возможные рецепторные механизмы действия АДФ-рибозы в сердце.

6.Изучить влияние АДФ-рибозы на работу изолированного сердца крысы при гипоксии и реоксигенации.

Научная новизна. В работе было впервые рассмотрены кардиотропные эффекты АДФ-рибозы у незимоспящих и зимоспящих млекопитающих. Показано, что АДФ-рибоза оказывает действие на сердечно-сосудистую систему крысы in vivo. Впервые показано, что АДФ-рибоза обладает выраженным самостоятельным кардиотропным действием. При перфузии изолированного сердца АДФ-рибоза оказывает ингибиторное действие – снижает частоту сокращения, различные параметры механической активности сердца.

В работе впервые продемонстрировано, что АДФ-рибоза изменяет биоэлектрическую активность рабочего миокарда и предсердия, уменьшая длительность ПД. АДФ-рибоза усиливает ингибиторные эффекты гипоксии.

Впервые установлено, что механизмы ингибиторного действия АДФ рибозы в сердце млекопитающего связаны с активацией аденозиновых А1 рецепторов.

Теоретическая и практическая значимость работы. В теоретическом аспекте работа представляет интерес в плане понимания механизмов естественного гипобиоза, расшифровки роли нуклеотидов в регуляции работы сердца зимоспящего животного. Несомненный научный интерес представляет выявленные в работе кардиотропные эффекты и механизмы действия рибозилированного пуринового нуклеотида – АДФ-рибозы. Результаты работы могут быть применены в будущем для моделирования состояний искусственного гипобиоза, использованы при разработке кардиоактивных препаратов.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на III Всероссийской конференции, посвященной 175-летию со дня рождения Ф.В.Овсянникова (Санкт-Петербург, 2003), VI симпозиуме по сравнительной электрокардиологии (Сыктывкар, 2004), XIX съезде физиологического общества им. Павлова (Екатеринбург, 2004). Диссертационная работа апробирована на заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ (2006), на семинаре в лаборатории электрофизиологии сердца института экспериментальной кардиологии РК НПК (2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе статьи.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, изложение результатов и их обсуждение, выводов, заключения и списка цитируемой литературы. Список литературы включает 306 работ, их них 50 работ отечественных авторов, 256 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 47 рисунками, содержит 5 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Поскольку количество якутских сусликов было ограничено, предварительные исследования проводились на лабораторных крысах, в то время как основные задачи решались в опытах с использованием животных обоих видов. Изучение кардиотропной активности АДФ-рибозы проводили на целом животном (крысе) in vivo, изолированном сердце крысы, препаратах папиллярной мышцы правого желудочка, стенки предсердия крысы и якутского суслика, находящегося в состоянии зимней спячки, а также на препаратах синусного узла кролика. Работа выполнена на более чем на 150 самцах крыс Wistar, 8 кроликах, 12 якутских сусликах (Citellus undulatus). Возможность провести эксперименты с препаратами сердца гибернирующего суслика была любезно предоставлена руководителем лаборатории электрофизиологии сердца ИЭК РКНПК РФ («кардиологического центра») Л. В. Розенштраухом. Работа осуществлялась на базе лаборатории электрофизиологии сердца. Суслики содержались в специально оборудованном помещении с постоянной температурой воздуха +2С в темноте.

Гибернирующих сусликов забивали в течении баута, только если в течении 4 дней перед забоем животное не проявляло двигательной активности.

Поскольку АМФ и аденозин являются метаболитами АДФ-рибозы и обладают кардиотропным действием, эффекты АДФ-рибозы сравнивались с эффектами АМФ и аденозина.

1. Исследование кардиотропных эффектов АДФ-рибозы на целом животном Регистрацию параметров системной гемодинамики при введении АДФ рибозы проводили на хронически-оперированных крысах. С помощью вживленных катетеров у животных регистрировали ЧСС и артериальное давление в брюшной аорте. Операцию по вживлению катетеров проводили по стандартной методике за сутки до опыта под нембуталовым наркозом (40 мг/кг, внутрибрюшинно). Введение АДФ-рибозы, АМФ или физиологического раствора осуществляли в течении 30 секунд, через катетер введенный в левую бедренную вену. Объем введённого раствора составлял 0,4 мл (0,2 мл раствора вещества + 0, мл физиологического раствора для промывки катетера). АДФ-рибозу и АМФ растворяли в физиологическом растворе.

Для регистрации давления, катетер, вживленный в левую бедренную артерию крысы, присоединяли к датчику давления («mpx5050dpt», Motorola Ltd., США). Сигнал от датчика давления, через усилитель, поступал на аналого цифровой преобразователь (La2a, «Руднев-Шиляев», Россия) и на компьютер, где с помощью программы «ПУЛЬСАР» (Закарян А. А.) данные регистрировались и обрабатывались.

2. Ретроградная перфузия изолированного сердца крысы Для приготовления препарата изолированного сердца использовали самцов крыс массой 200-250 г. Перфузию изолированного сердца крысы производили по стандартной методике Лангендорфа (Langendorff, 1903;

Лопухин Ю.М., 1971).

Для изучения эффектов регистрировались частота сокращений препарата изолированного сердца, давление, развиваемое в полости левого желудочка, максимальная скорость нарастания и спада пульсовой волны в левом желудочке.

Для того, чтобы охарактеризовать работу сердца, рассчитывали сократительную активность как произведение амплитуды и частоты сокращения препарата (амплитуда х ЧС) для каждого цикла.

Для определения параметров механической активности левого желудочка при помощи катетера, проведенного через аортальную канюлю и аортальный клапан в полость левого желудочка, регистрировали давление, развиваемое в полости желудочка. Через катетер сигнал передавался на датчик давления, затем через усилитель и аналого-цифровой преобразователь на компьютер, где с помощью программы «ПУЛЬСАР» данные регистрировались и обрабатывались.

Нормоксическая перфузия осуществлялась раствором Кребса-Хензеляйта (NaCl 118,0 мМ, KCl 4,7 мМ, NaHCO3 25,0 мМ, MgSO4 1,2 мМ, CaCl2 2,5 мМ, KH2PO4 1,2 мМ, глюкоза 5,5 мМ, pH 7,3-7,4) при температуре 370С и постоянной оксигенации карбогеном. При подготовке гипоксической перфузии готовился безглюкозный раствор Кребса-Хензеляйта. Непосредственно перед экспериментом раствор деоксигенировался. Деоксигенация осуществлялась откачкой газов из раствора вакуумным насосом. В процессе эксперимента для предотвращения насыщения раствора кислородом воздуха, осуществлялась непрерывная поддувка сосуда с раствором аргоном.

В условиях нормоксической перфузии после присоединения препарата изолированного сердца крысы к перфузионной установке, периода адаптации ( мин.) и контрольной записи (10 мин.) инфузировали растворы АДФ-рибозы, АМФ, аденозина в течении 3-х минут со скоростью 0,1 мл/мин. В течение инфузии производили регистрацию параметров работы препарата. В течение минут после окончания инфузии веществ, происходило восстановление работы препарата («отмывка»), после чего инфузия экспериментальных веществ повторялась в более высокой концентрации. Кардиотропные эффекты АДФ рибозы исследовали в диапазоне концентраций 1*10-6 — 5*10-5М.

Для изучения эффектов АДФ-рибозы в условиях гипоксической перфузии изолированного сердца крысы выполняли эксперименты согласно следующему протоколу. В условиях нормоксической перфузии в течении 10 минут происходила стабилизация параметров работы препарата, еще в течении 10 минут осуществляли контрольную запись параметров работы сердца. Затем в течении 370С минут при осуществляли перфузию изолированного сердца деоксигенированным перфузионным раствором (контроль), или деоксигенированным перфузионным раствором, который содержал АДФ-рибозу, АМФ, аденозин в концентрации 1*10-5М. После окончания 20-ти минутного периода гипоксической перфузии осуществляли реоксигенауцию препарата изолированного сердца, которая продолжалась 45 минут. При обработке и анализе экспериментальных данных сравнивали скорость и величину снижения параметров работы изолированного сердца при гипоксической перфузии в контрольной группе и экспериментальных группах. Также сравнивали степень и скорость восстановления параметров в разных группах при реоксигенации.

3. Регистрация потенциалов действия (ПД) изолированной папиллярной мышцы, предсердия и синусного узла различных млекопитающих В отдельной серии экспериментов проводили регистрацию потенциалов действия различных отделов сердца незимоспящих животных (крысы, кролика) и зимоспящего животного (суслика).

Для экспериментов с миокардом желудочка выделяли папиллярную мышцу из правого желудочка сердца. Для получения препарата правого предсердия отделяли часть предсердия, включая правое ушко, при этом старались не захватывать межвенную область, чтобы препарат не обладал собственной спонтанной активностью.

Отведение ПД от синусного узла крысы затруднено, так как он имеет малый размер и располагается внутри стенки предсердия. Из литературы известно, что пуриновый нуклеозид аденозин вызывает однонаправленные изменения ритма в синусном узле кролика и крысы (Belardinelli et al., 1983, 1988, 1995). АДФ-рибоза является производным ряда пуриновых нуклеотидов. Вследствие этого, эффекты АДФ-рибозы на пейсмекер изучали на препарате синусного узла кролика. При выделении препарата синусного узла кролика препаровку участка правого предсердия производили так, чтобы препарат включал синусный узел, основания верхних и нижних полых вен, межвенную область, пограничный гребешок, часть ушка правого предсердия. Отведение ПД предсердия и синусного узла осуществляли от эндокардиальной стороны препарата.

Препараты сердца крысы и суслика суперфузировали раствором Кребса следующего состава (ммоль/литр): NaCl – 133.47, KCl – 4.69, NaH2PO4·2H2O – 1.35, NaHCO3 – 16.31, MgSO4·7H2O – 1.18, CaCl2·2H2O – 2.5, глюкоза – 7.77. pH – 7,2-7,4. Препарат синусного узла кролика суперфузировали раствором Тироде следующего состава (ммоль/литр): NaCl – 130, KCl – 4, NaH2PO4·2H2O – 1,2, NaHCO3 – 24, Mg Cl2 – 1, CaCl2 – 1,8, глюкоза – 5,6. pH – 7,2-7,4. Растворы оксигенировались карбогеном (95% O2 и 5% CO2). Суперфузию проводили при температуре 37С в камере объемом 5 мл (для папиллярной мышцы) или 11 мл (для препарата синусного узла и предсердия) со скоростью протока 15 мл/мин. Во всех экспериментах суперфузию раствором, содержащим АДФ-рибозу (1·10-5М), АМФ (1·10-5М) или аденозин (1·10-5М), осуществляли в течении 3-х минут.

Поскольку препараты папиллярной мышцы и предсердия не обладали спонтанной активностью, их постоянно стимулировали при помощи серебряных электродов (диаметр 1 мм, межэлектродное расстояние 2-3 мм). Длительность стимула составляла 1 мс, частота стимуляции для папиллярной мышцы суслика – 2 Гц, для крысы – 3,5 Гц, амплитуда устанавливалась в 1,5 раза больше пороговой. Перед началом эксперимента препараты адаптировались в перфузионной камере в течении 90-120 мин. (папиллярная мышца крысы – мин). Потенциалы действия (ПД) отводили при помощи стандартной микроэлектродной методики.

Потенциалы усиливали с помощью усилителя (WPInstruments, модель 701, США). Для обеспечения визуального контроля сигнал с усилителя подавался на осциллограф (Techtronix, модель 5113, США). Для записи и обработки сигнал передавался на АЦП (WPInstruments, США) и стационарный компьютер.

Для обработки данных использовали программу LabPCD, с помощью которой измеряли длительность ПД на уровне 50% и 90% реполяризации. В экспериментах с регистрацией ПД синусного узла рассчитывали длительность цикла активности синусного узла, максимальную производную фронта потенциала действия (dV/dt).

4. Изучение рецепторных механизмов кардиотропных эффектов АДФ рибозы Для выяснения механизмов кардиотропных эффектов АДФ-рибозы регистрировали параметры работы изолированного сердца и параметры электрической активности предсердий крысы на фоне блокаторов пуриновых рецепторов: теофиллина (неселективного блокатора пуриновых рецепторов), DPCPX – селективного блоктора А1-аденозиновых рецепторов.

Теофиллин и DPCPX растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО), затем в перфузионном растворе. Конечная концентрация блокаторов в перфузате составляла 1·10-5-1·10-4М для теофиллина и 1·10-7М для DPCPX. Конечная концентрация ДМСО в перфузате составляла 0,1% об. или менее. Такая концентрация не вызывала каких-либо изменений работы препарата изолированного сердца, электрической активности препарата предсердия.

При регистрации механической активности изолированного сердца и потенциалов действия препарата предсердия крысы в течении 3-х минут осуществляли суперфузию раствором, содержащим блокатор (теофиллин 1·10-4М или DPCPX 1·10-7М), затем, еще в течении 3-х минут, раствором, одновременно содержащим блокатор и АДФ-рибозу, АМФ или аденозин (теофиллин 1·10-4М, DPCPX 1·10-7М, АДФ-рибоза, АМФ, аденозин - 1·10-5М).Эффекты на фоне блокаторов, сравнивались с самостоятельными эффектами АДФ-рибозы, АМФ, аденозина.

В работе были использованы следующие соединения: аденозин (Sigma, США);

АДФ-рибаза – аденозин-5’-дифосфат-рибоза (Sigma, США);

АМФ – аденозин-5’монофосфат (Sigma, США);

ДМСО – диметилсульфоксид (Вектон, Россия);

нембутал (Биохеми ГмбХ, Австрия);

теофиллин (Sigma, США);

DPCPX – 8-циклопентил-1,3-дипропилксантин (Sigma, США).

Статистическая обработка результатов Статистическая значимость изменений оценивалась с помощью непараметрических критериев Вилкоксона (Т-критерий) и Мана-Уитни (U критерий). Расчет производился при помощи программы Statistica 7. Различия считались значимыми при p0.05. Все данные в работе представлены как среднее±стандартная ошибка среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изучение кардиотропных эффектов АДФ-рибозы на животном in vivo При введении в бедренную вену крысы АДФ-рибоза вызывала дозозависимое снижение ЧСС, систолического и диастолического давления. В дозах 0.055-0.55 мг/кг АДФ-рибоза вызывает снижение только систолическго давления, в дозах 5,5-55 мг/кг снижение ЧСС, диастолического и систолического давления (Рис. 1 и 2). В дозе 5,5 мг/кг АДФ-рибоза вызывает снижение ЧСС на 25%, диастолического давления на 23%. Диастолическое давление изменялось в большей степени, чем систолическое (Рис. 2).

Таким образом, in vivo АДФ-рибоза оказывала влияние на сердечно сосудистую систему у крысы. Тот факт, что при инфузии АДФ-рибозы происходит снижение диастолического давления, говорит о наличии в сосудах рецепторов, опосредующих её эффекты. Низкая чувствительность к АДФ-рибозе в сосудах может объяснятся низкой плотностью или низкой чувствительностью рецепторов. Известно, что в сосудах присутствуют пуриновые А2-рецепторы (Hourani et al., 1993;

Shin et al., 2000), которые опосредуют вазодилятаторное действие аденозина и его производных. Возможно, что эти рецепторы служат мишенью АДФ-рибозы.

Однако, ингибиторные эффекты АДФ-рибозы у крысы in vivo могут быть опосредованы ее метаболитом – АМФ. Исходя из того, что эффекты при введении АДФ-рибозы развивались довольно быстро, можно предположить, что они не связаны с гидролизом нуклеотида, и отражают самостоятельное действие АДФ рибозы.

Эффекты АДФ-рибозы in vivo могут быть результатом как прямого действия нуклеотида на сердце, так и опосредованного реакцией сосудов. Для того, чтобы выявить прямые эффекты АДФ-рибозы проводились эксперименты на изолированном сердце крысы.

Эффекты АДФ-рибозы в условиях нормоксической перфузии изолированного сердца крысы В наших экспериментах при регистрации механической активности изолированного сердца крысы АДФ-рибоза в концентрации 1·10-5 - 5·10-5М вызывала отрицательные хронотропный и хроноинотропный эффекты. Инфузия АДФ-рибозы (n=20), в концентрации 1·10-5 М приводила к снижению ЧС на 9%, в концентрации 5·10-5М на 67% (ЧС снижалась в среднем с 300 уд/мин до уд/мин, в нескольких случаях наблюдалась остановка сокращений препарата).

АДФ-рибоза вызывала снижение скорости нарастания и спада пульсовой волны в левом желудочке сердца крысы. В концентрации 5·10-5М отрицательный хронотропный эффект АДФ-рибозы статистически значимо превышал эффекты её метаболитов АМФ и аденозина (Рис. 3).

АДФ-рибоза в большей степени, чем её метаболиты снижала и другие параметры механической активности сердца (скорость нарастания и спада давления в левом желудочке). При перфузии изолированного сердца крысы АМФ (прямой метаболит АДФ-рибозы) практически не изменял скорости нарастания пульсовой волны и незначительно изменял скорость спада давления в левом желудочке, вызывал только слабые отрицательные хронотропный и хроноинотропный эффекты. Можно предположить, что эффекты АДФ-рибозы, как и аденозина, связаны с влиянием на ритмогенную область (отрицательный хронотропный эффект) и рабочий миокард (снижение скорости нарастания давления в левом желудочке), в то время как эффекты АМФ в большей степени, связаны с влиянием на ритмогенную область. Исходя из того, что эффекты АДФ рибозы были значительно больше АМФ, можно сказать, что эффекты АДФ рибозы в сердце не связаны с гидролизом этого вещества, а являются прямыми.

Различия в действии АДФ-рибозы и АМФ, аденозина не ограничивались амплитудой ингибиторных эффектов. При инфузии АДФ-рибозы ЧС препарата падает с гораздо большей скоростью, чем при инфузии АМФ и аденозина, что говорит о более сильном влиянии АДФ-рибозы на ритмогенную область, чем АМФ и аденозина (Рис. 4).

Таким образом, АДФ-рибоза обладает самостоятельным ингибиторным действием на изолированное сердце крысы, которое отличается от АМФ и аденозина по амплитуде, динамике, но сходно по направленности действия.

Изучение влияния АДФ-рибозы на электрическую активность различных отделов сердца зимоспящего и незимоспящего животного На следующем этапе работы, мы попытались выяснить, в какой степени АДФ-рибоза действует на рабочий миокард, миокард предсердий и пейсмекер.

Для этого регистрировали потенциалы действия кардиоцитов папиллярной мышцы, стенки предсердия крысы и суслика, синусного узла кролика.

Влияние АДФ-рибозы на ПД папиллярной мышцы и предсердия крысы 5·10-5М (n=6) вызывала снижение АДФ-рибоза в концентрации длительности ПД кардиоцитов папиллярной мышцы крысы: на уровне 50% реполяризации (что соответствует фазе плато) на 26%, на уровне 90% реполяризации на 37% (Рис. 6). АДФ-рибоза вызывает несколько большее снижение длительности, чем её метаболит – АМФ. Примеры экспериментальных записей ПД приведены на Рис.5.а.

В кардиоцитах предсердия крысы АДФ-рибоза вызывала снижение длительности ПД на уровне 50% и 90% реполяризации на 25% и 26% соответственно. Наибольшее снижение длительности ПД вызывал аденозин, наименьшее - АМФ. В предсердии эффекты АДФ-рибозы статистически * 160% АДФ-р., n= -p(M-U) 0, АМФ, n= * # - p(T)0, физ.раствор, n= 140% 116% 120% 115% 111% 111% ЧСС, % от нормы 98% 100% # 91% # 80% # 72% 60% 38% 40% # 30% # 20% 0% АДФ-р. - 0,055 0,55 5,5 55 мг/кг физ.

АМФ - 0,034 0,34 3,4 34 мг/кг раствор доза, мг/кг Рис. 1. Влияние АДФ-рибозы и АМФ на ЧСС крысы при введении нуклеотидов в бедренную вену животного в разных дозах. АДФ-рибоза и АМФ вводились в эквимолярных соотношениях. Данные представлены как среднее±ст. ош. ср.

доза, мг/кг АДФ-рибоза АДФ-рибоза АМФ (3,4 АМФ ( % (5,5 мг/кг) (55 мг/кг) мг/кг) мг/кг) 0% -6% -8% -25% -28% -23% -20% -34% -40% -40% -65% -60% -80% -100% Рис. 2. Влияние АДФ-рибозы (n=5) и АМФ (n=6) на систолическое и диастолическое давление при введении нуклеотидов в бедренную вену крысы в разных дозах. АДФ-рибоза и АМФ вводились в эквимолярных соотношениях. По оси абсцисс отложена доза АДФ-рибозы и АМФ, по оси ординат – относительная величина эффекта (%). (ср.±ст. ош. ср.) РИС. 1: Изменение ЧС препарата изолированного сердца крысы при перфузии АДФ-рибозы, АМФ и Аденозина в различных концентрациях * * 106% 102% * *# 99% 92% 91% # ЧС,% от нормы 80 # # 77% 76% Аденозин, n= АМФ, n= АДФ-Р, n= 40% # 33% # *- p(M-U)0, # -p(T)0, 1*10(-6) М 1*10(-5) М 5*10(-5) М концентрация, М Рис. 3. Влияние АДФ-рибозы, АМФ и аденозина на ЧС препарата изолированного сердца крысы (ср.±ст. ош. ср.).

Аденозин, n= АМФ, n= АДФ-рибоза, n= * Скорость снижения ЧС, уд / мин * сек 41, 20 18, 17, 6, 4, 4, АДФ-Р АМФ аденозин - 1*10-5M, - 5*10-5M Рис. 4. Скорость развития эффекта (падения ЧС) при действии АДФ-рибозы на изолированное сердце крысы (в сравнении с АМФ и аденозином) (ср.±ст. ош. ср.).

значимо превосходят эффекты АМФ, но сопоставимы с эффектами аденозина.

Примеры экспериментальных записей ПД приведены на Рис.5.б.

Таким образом, АДФ-рибоза оказывает действие и на миокард желудочка и на миокард предсердия крысы, вызывая снижение длительности ПД на уровне 50% реполяризации (фазы плато), на уровне 90% реполяризации (последней фазы реполяризации). Тот факт, что эффекты АДФ-рибозы превосходили эффекты её прямого метаболита АМФ подтверждает самостоятельность эффектов АДФ рибозы.

Снижая длительность ПД на уровне плато, АДФ-рибоза вызывает отрицательный инотропный эффект в миокарде желудочка и предсердиях крысы.

Отрицательный хроноинотропный эффект наблюдали при перфузии изолированного сердца.

Снижение длительности ПД может быть связано с активацией калиевых и/или подавлением кальциевых токов. Известно, что снижение длительности ПД в желудочке и предсердии крысы, вызванное аденозином, обусловлено активацией IKAch/Ado и подавлением базального ICa,L тока (Belardinelli et al., 1995).

АДФ-рибоза, АМФ и аденозин в меньшей степени изменяли длительность ПД кардиоцитов предсердия, чем кардиоцитов папиллярной мышцы. ПД кардиоцитов папиллярной мышцы и предсердия имеют различную длительность.

Отчасти это обусловлено различной выраженностью кальциевого тока и величиной фазы плато ПД. Можно предположить, что большее снижение длительности ПД, вызванное АДФ-рибозой в папиллярной мышце, связано с большим подавлением базального ICa,L в этом отделе сердца крысы.

На этом этапе работы было сделано предположение, что АДФ-рибоза, являясь производным ряда пуриновых нуклеотидов, может активировать в сердце те же рецепторы, что и аденозин.

Влияние АДФ-рибозы на ПД папиллярной мышцы и предсердия гибернирующего суслика АДФ-рибоза (n=6) вызывала снижение длительности ПД папиллярной мышцы суслика на уровне 50% и 90% реполяризации. Примеры экспериментальных записей ПД приведены на Рис.7.а.

На уровне 50% реполяризации ПД папиллярной мышцы суслика АДФ рибоза в концентрации 1*10-5 М снижала длительность ПД на 26%. Практически такие же изменения вызывал АМФ и аденозин. Снижение длительности, вызываемые АДФ-рибозой на уровне 50% реполяризации ПД, статистически значимо отличались от контроля (p(T)0,05), однако не отличались от эффекта, вызываемого ею в сердце крысы.

На уровне 90% реполяризации ПД АДФ-рибоза снижала длительность ПД на 12%. Практически такие же изменения вызывал АМФ и аденозин (Рис. 8).

Изменения, вызываемые всеми нуклеотидами, статистически значимо отличались от контроля (p(T)0,05). Укорочение ПД на уровне 90% реполяризации, вызываемое АДФ-рибозой и другими пуриновыми нуклеотидами в кардиоцитах папиллярной мышцы суслика было в 2,5-3 раза меньше такового в кардиоцитах папиллярной мышцы крысы (Рис. 8).

Таким образом, характер изменения длительности ПД, вызываемый АДФ рибозой и другими пуриновыми нуклеотидами в кардиоцитах папиллярной мышцы суслика, отличается от такового в сердце крысы. Снижение длительности ПД в папиллярной мышце крысы, вызванное АДФ-рибозой обусловлено изменением длительности преимущественно на последней фазе реполяризации. В папиллярной мышце суслика снижение длительности происходит на уровне 50% реполяризации, в то время как на уровне последней фазы реполяризации дополнительного изменения практически не происходит.

Во время последней фазы реполяризации выражены, в основном, К+-токи, в то время, как Са2+-ток невелик. Можно предположить, что различия в характере действия нуклеотидов на папиллярную мышцу крысы и суслика заключаются в разной степени активации К+-токов. Можно также предположить, что снижение длительности ПД в папиллярной мышце суслика на уровне 50% реполяризаци обусловлено в основном подавлением Са2+-тока, а в сердце крысы и Са2+-тока и К+-токов. В результате такого действия, нуклеотиды не вызывают сильного укорочения ПД папиллярной мышцы суслика, хотя выраженность фазы плато снижается (развивается отрицательный инотропный эффект). Интересно, что такие же изменения формы и длительности ПД папиллярной мышцы суслика вызывал ацетилхолин, однако, чувствительность к ацетилхолину была на порядок выше (Абрамочкин и др., 2006).

Отсутствие активации калиевых токов, в сочетании с подавленным кальциевым током может лежать в основе устойчивости середа зимоспящих животных к аритмиям в условиях гипоксии и гипотермии, которые сопровождают зимнюю спячку. Такой характер изменения ПД в сердце суслика вызывали все протестированные нами нуклеотиды.

В кардиоцитах предсердия суслика АДФ-рибоза (n=6) в концентрации 1*10 М не вызывала изменений длительности ПД (в отличие от предсердия крысы).

Интересно, что АМФ и аденозин в концентрации 1·10-5М снижали длительность ПД в предсердии суслика на уровне 50% и 90% реполяризации.

Характер изменения формы ПД при действии АМФ и аденозина был такой же, как и в предсердии крысы с той разницей, что величина снижения длительности в предсердии суслика была меньше. АМФ (n=5) и аденозин (n=5) снижали длительность на уровне 50% и реполяризации на 10% и 18% соответственно. На уровне 90% реполяризации АМФ снижал длительность ПД на 9%, аденозин на 11%. Эти изменения статистически значимы (p(T)0,05). Примеры экспериментальных записей ПД приведены на Рис.7.б.

Таким образом, АДФ-рибоза снижала длительность ПД папиллярной мышцы гибернирующего суслика, но не изменяла длительность ПД в предсердии. АМФ и аденозин снижали длительность ПД и в папиллярной мышце и в предсердии.

Характер изменения формы ПД, вызываемый протестированными нуклеотидами, был различен только в папиллярной мышце крысы и суслика, но не в предсердиях.

Отсутствие ингибиторного эффекта АДФ-рибозы, меньшую величину эффектов АМФ и аденозина в предсердии зимнего спящего суслика по сравнению с предсердием крысы можно связать с низкой плотностью или чувствительностью пуриновых рецепторов.

I II III Время, мсек Время, мсек Время, мсек Мв Мв Мв 0 50 0 50 100 0 50 контроль контроль контроль АМФ АДФ-рибоза аденозин 50 мВ 50 мВ 50 мВ Рис. 5.а. Примеры ПД кардиоцитов папиллярной мышцы крысы в контроле и при действии: I. АДФ-рибозы (1·10-5М), II. АМФ (1·10-5М), III. аденозина (1·10-5М).

II III I Время, мсек Время, мсек Время, мсек Мв Мв 0 Мв 0 20 40 60 20 40 0 20 40 контроль Контроль контроль АМФ АДФ-рибоза аденозин 50 мВ 50 мВ 50 мВ Рис. 5.б. Примеры ПД кардиоцитов предсердия крысы в контроле и при действии: I. АДФ-рибозы (1·10-5М), II. АМФ (1·10-5М), III. аденозина (1·10-5М).

* Длительность ПД на уровне 90% реполяризации, % * # p(T)0, * * p(M-U)0, 90% # от нормы 74% # 71% # 66% # 63% # 59% 60 # АДФ-Р АМФ Аденозин Концентрация веществ 1*10-5 М, - правое предсердие крысы - папиллярная мышца правого желудочка крысы Рис. 6. Длительность ПД на уровне 90% реполяризации кардиоцитов папиллярной мышцы правого желудочка и предсердия сердца крысы при инфузии АДФ-Рибозы (АДФ-Р), АМФ и аденозина (ср.±ст.ош.ср.).

Рис.7.а. папиллярная мышца суслика Рис.7.б. предсердие суслика I I Время, мсек Время, мсек 0 Мв 50 0Мв 50 100 контроль контроль 50 мВ 50 мВ АДФ-рибоза АДФ-рибоза II II Время, мсек Время, мсек Мв 0Мв 50 0 50 100 контроль контроль 50 мВ 50 мВ АМФ АМФ III III Время, мсек Время, мсек 0 Мв Мв 50 0 50 100 контроль контроль 50 мВ 50 мВ аденозин аденозин Рис. 7. Примеры ПД кардиоцитов папиллярной мышцы (а) и предсердия (б) суслика в контроле и при действии: I - АДФ-рибозы (1·10-5М), II - АМФ (1·10-5М), III - аденозина (1·10-5М).

* -p(M-U)0,05, # - p(Т)0, * * * 90% # # Длительность ПД, % от нормы # 90 88% 87% 71% 63% 59% АДФ-Р АМФ Аденозин папиллярная мышца: - крыса, - суслик Рис. 8. Длительность ПД на уровне 90% реполяризации кардиоцитов папиллярной мышцы правого желудочка крысы и суслика при инфузии АДФ-Рибозы (АДФ-Р), АМФ и аденозина (ср.±ст.ош.ср.).

Влияние АДФ-рибозы на электрофизиологическую активность синусного узла кролика Как указывалось выше, отведение ПД от синусного узла крысы затруднено, так как он имеет малый размер и располагается внутри стенки предсердия. Из литературы известно, что пуриновый нуклеозид аденозин вызывает однонаправленные изменения ритма в синусном узле кролика и крысы (Belardinelli et al., 1983, 1988, 1995). АДФ-рибоза является производным ряда пуриновых нуклеотидов. Вследствие этого, эффекты АДФ-рибозы на пейсмекер изучали на препарате синусного узла кролика.

АДФ-рибоза оказывает влияние на синусный узел кролика, снижая в концентрации 1·10-5М (n=6) частоту сокращений изолированного синусного узла кролика на 16,5%.

АМФ и аденозин в данной концентрации вызывали меньшее снижение частоты сокращений (на 6%). Примеры экспериментальных записей приведены на Рис. 9.

Основной вклад в снижение частоты сокращений синусного узла кролика вносит снижение скорости медленной диастолической деполяризации и фронта ПД, в то время как снижения длительности ПД при действии АДФ-рибозы не происходит.

Можно предположить, что в синусном узле кролика базальный ICa,L не подавляется АДФ-рибозой. Снижение скорости МДД может быть обусловлено увеличением времени инактивации калиевых токов.

I II Мв Время, мсек 0 200 400 600 Время, мсек Мв контроль 0 200 400 600 АМФ АДФ-рибоза контроль 50 Мв 50 Мв III IV Время, мсек 0 200 400 600 800 Длительность цикла, % от контроль аденозин 1 16, нормы 106, 106, 50 Мв АДФ-рибоза АМФ аденозин Рис. 9. Примеры записи ПД синусного узла кардиоцитов кролика в контроле и при инфузии: I - АДФ-рибозы (1·10-5М), II – АМФ (1·10-5М), III - аденозина (1·10 М). IV – изменение длительности цикла сокращения в синусном узде кролика (ср.±ст.ош.ср.).

Изучение рецепторных механизмов действия АДФ-рибозы в сердце На этом этапе работы мы попытались выяснить, какие механизмы опосредуют эффекты АДФ-рибозы в сердце. Так как АДФ-рибоза является производным ряда пуриновых нуклеотидов, в некоторых тканях может активировать пуриновые рецепторы, казалось логичным, что и в сердце ее эффекты обусловлены этими рецепторами.

В первую очередь было изучено влияние теофиллина на эффекты АДФ рибозы. Теофиллин – это слабый, неселективный блокатор пуринорецепторов.

Выяснилось, что при перфузии изолированного сердца крысы на фоне теофиллина, ингибиторные эффекты АДФ-рибозы не снимаются (Рис.10.а).

Однако, теофилиин снимает снижение длительности ПД, вызванное АДФ рибозой, в предсердии крысы (Рис. 10.б.). Эти результаты подтвердили предположение, что АДФ-рибоза является агонистом пуриновых рецепторов.

Однако, пуриновые рецепторы представляют собой довольно большую группу и могут опосредовать разнонаправленные реакции. Из литертуры известно, что ингибиторные эффекты аденозина в сердце опосредуют А1-пуринорецепторы.

При перфузии изолированного сердца на фоне DPCPX-селективного блокаотра А1-аденозиновых рецепторов, ингибиторные эффекты АДФ-рибозы полностью снимались. Более того, инфузия АДФ-рибозы на фоне DPCPX приводила к развитию положительного хронотропного эффекта.

В экспериментах на изолированном сердце крысы DPCPX (n=13) при инфузии в концентрации 1·10-7 М приводил к увеличению ЧС препарата сердца в среднем на 4%. При инфузии АДФ-рибозы (n=6) в концентрации 1·10-5М на фоне DPCPX отрицательные хронотропные эффекты АДФ-рибозы полностью снимались (Рис. 10). На фоне этого блокатора эффект АДФ-рибозы инвертировался – развивался положительный хронотропный эффект. ЧСС увеличивалась на 8%. ЧС при действии АДФ-рибозы на фоне DPCPX статистически значимо отличается от ЧС в контроле и на фоне DPCPX (p(T)0,05). При отмывке от блокатора отрицательная направленность и средняя величина эффектов нуклеотидов полностью восстанавливалась (Рис. 11).

а б 110 - самостоятельное действие # # - на фоне теофиллина # # # Длительность ПД на уровне 90% 109% реполяризации, % от нормы ЧС препарата, % от нормы 107% 100% 92% 91% АМ АД Ф АДФ АМ Фн -р. н -р.

Ф аф те о АДФ-Р аф те о АМФ аденозин тео оне фил оне лин филл фил лин ина а Рис. 10. (а) Частота сокращения изолированного сердца крысы при перфузии на фоне теофиллина, теофиллина и АДФ-рибозы, теофиллина и АМФ, АМФ, АДФ рибозы. (б) Длительность ПД предсердия крысы на уровне 90% реполяризации при перфузии АДФ-рибозы, АМФ и аденозина на фоне теофиллина.

Концентрация в-в: теофиллин 1·10-4М, АМФ 1·10-5М, АДФ-рибоза 1·10-5М, (ср.±ст.ош.ср.).

На основании полученных данных был сделан вывод, что отрицательный хронотропный эффект АДФ-рибозы в изолированном сердце крысы обусловлен активацией А1-аденозиновых рецепторов. Ингибиторные эффекты АМФ и аденозина (по данным литературы) так же связаны с активацией этих рецепторов.

Из литературы известно, что аденозин и селективные агонисты А2А-рецепторов могут увеличивать амплитуду сокращения, скорость сокращения, скорость расслабления, коронарный проток изолированного сердца крысы. В присутствии DPCPX активаторные эффекты потенцирируются, а в присутствии специфических антагонистов А2А-рецепторов - снимаются (Monahan, 2000). Агонисты А2А рецепторов увеличивали сократительную активность изолированной папиллярной мышцы крысы(Legssyer, 1988), морской свинки (Bruckner, 1985) и собаки (Chiba, 1975).

Исходя из того, что в сердце представлены А2-рецепторы, агонистами которых является аденозин и его производные, и активация которых вызывает положительные хронотропные и инотропные можно предположить, что положительные эффекты АДФ-рибозы на фоне DPCPX опосредуются этими рецепторами.

В экспериментах с регистрацией ПД предсердия крысы DPCPX практически полностью блокировал снижение длительности ПД на уровне 50% и 90% реполяризации, вызываемое АДФ-рибозой (Рис. 12).

Таким образом, в предсердии крысы снижение длительности ПД, вызываемое АДФ-рибозой, а следовательно – отрицательный инотропный эффект в основном опосредуется аденозиновыми А1-рецепторами.

Эти результаты хорошо согласуются с данными литературы. Аденозиновые А1-рецепторы связаны с ингибиторным Gi/0-белком. Активация А1-рецепторов приводит к снижению уровня цАМФ через ингибирование аденилатциклазы, снижению уровня цитоплазматического кальция, инактивации кальциевых каналов L-типа, активации фосфолипазы С. -субъединица этого белка активирует калиевые каналы, что приводит к усилению IKAch/Ado (Rockman, 2002:

Николлс, 2003). Эти изменения будут приводить к снижению длительности ПД, развитию отрицательного инотропного и хронотропного эффекта.

Изучение эффектов АДФ-рибозы при гипоксии и реоксигенации АДФ-рибоза обнаружена в составе фракций экстрактов ряда тканей зимоспящих животных, находившихся в состоянии гибернации. Поскольку гибернация как правило развивается на фоне гипоксии (Игнатьев, 1998) представлялось интересным изучить влияние АДФ-рибозы на сердце во время гипоксии и, при восстановлении от гипоксии.

Оказалось, что АДФ-рибоза изменяет параметры работы изолированного сердца крысы при гипоксии и реоксигенации. В условиях гипоксической перфузии АДФ-рибоза (n=5) в концентрации 1·10-5М приводила к более быстрому снижению ЧС препарата изолированного сердца крысы, чем в контрольных экспериментах (n=12). Эти изменения статистически значимы. В контроле к минуте гипоксической перфузии ЧС препарата снижалась в среднем до 25% от нормы. При инфузии АДФ-рибозы, к 20 минуте гипоксической перфузии, в среднем, ЧС снижалась до 5% от нормы, часто происходила остановка препарата.

АМФ (n=7, 1·10-5М) и аденозин (n=6, 1·10-5М) вызывали точно такое же изменение ЧС изолированного сердца при гипоксии (Рис.13.а).

В контрольной группе сократительная активность к 20-ой минуте гипоксической перфузии снижалась до 5% от исходных значений. В экспериментах с АДФ-рибозой, АМФ и аденозином сократительная активность уже на 10-ой минуте снижалась до 1-2% от исходных значений (Рис. 13.б).

# * * -p(T) p0, # -p(T) p0, 112% 110% ЧС препарата, % от нормы 105 104% 100% 92% 91% АДФ-Р контроль DPCPX+ADP-R АМФ DPCPX DPCPX+AMP АДФ-Р Рис. 11. ЧС препарата изолированного сердца крысы при инфузии АДФ-рибозы или АМФ на фоне селективного блокатора А1-аденозиновых рецепторов (DPCPX) (ср.±ст.ош.ср.).

110 - АДФ-рибоза, АМФ или аденозин, - АДФ-рибоза, АМФ или аденозин на фоне DPCPX Изменение длительности ПД на уровне 90% # # # 100 99,0% реполяризации, % от контроля 95,9% 95,8% 82,9% 80 78,9% 73,0% АДФ-Р АМФ аденозин Рис. 12. Длительность ПД (в % от контроля) на уровне 90% реполяризации.

Эффекты АДФ-рибозы, АМФ, аденозина на фоне DPCPX. # - p(Т)0.05 – статистически значимые различия в величине эффектов, вызываемых нуклеотидами самостоятельно и на фоне DPCPX. Концентрация АДФ-рибозы (АДФ-Р), АМФ и аденозина – 1·10-5 М, DPCPX – 1·10-7 M, (ср.±ст.ош.ср.).

При реоксигенацации параметры работы изолированного сердца крысы после инфузии АДФ-рибозы восстанавливались в меньшей степени и с меньшей скоростью, чем в контрольных экспериментах или после инфузии АМФ и аденозина.

В экспериментах с АДФ-рибозой сократительная активность восстанавливалась слабо – к 45-ой минуте реоксигенации до 4% от нормы (Рис.

12.б). В контрольной группе, сократительная активность на 10-ой минуте реоксигенации в среднем восстанавливалась до 12% от исходного значения.

Однако, вскоре начинала снижаться и к 30-ой минуте реоксигенации достигала 7 8% от исходного значения. В группах АМФ и аденозина сократительная активность восстанавливалась к 30-ой минуте реоксигенации до 19% и 17% от исходного уровня.

Таким образом, АДФ-рибоза усиливала эффекты гипоксии на изолированное сердце крысы. АДФ-рибоза подавляла работу сердца не только во время гипоксии, но и при реоксигенации. В качестве кардиопротекторных эффектов АДФ-рибозы можно рассматривать только снижение реперфузионного скачка параметров сокращения сердца. Возможно, АДФ-рибоза способствует отставленному восстановлению параметров работы сердца.

Возможно, замедленное восстановление активности изолированного сердца после гипокстической перфузии связано именно с тем, что АДФ-рибоза активирует преимущественно А1-аденозиновые рецепторы. В некоторых работах показано, что в изолированном сердце крысы активация А1-рецепторов не оказывает кардиопротекторых эффектов (Yao, 2001).

гипоксическая перфузия реоксигенация ЧС, % от нормы аденозин АМФ контроль АДФ-рибоза 0 10 20 30 40 50 60 70 АДФ-рибоза, АМФ или аденозин время, мин Рис. 13.а. ЧС препарата изолированного сердца крысы при гипоксической перфузии и при реоксигенации. АДФ-рибоза (n=5), аденозин (n=6), АМФ (n=7) в концентрации - 1·10-5М.

АДФ-рибоза Сократительная активность, % от нормы аденозин АМФ гипоксическая контроль реоксигенация 70 перфузия 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 АДФ-рибоза, АМФ или аденозин Время, мин Рис. 13.б. Сократительная активность (амплитуда Х ЧС) препарата изолированного сердца крысы при гипоксической перфузии и при реоксигенации.

АДФ-рибоза (n=5), аденозин (n=6), АМФ (n=7) в концентрации - 1·10-5М.

Предполагается, что кардиопротекторное действие пуриновых нуклеотидов обусловлено кооперативным действием всех подтипов аденозиновых (Р1) и других пуриновых (P2) рецепторов в миокарде, стенке сосудов, тканевых тучных клетках, терминалях нервных окончаний (Headrick, 2003).

В процессе развития баута гибернации АДФ-рибоза может способствовать снижению ритма сердца, его насосной функции. Метаболиты (АМФ, аденозин), накапливающиеся при гидролизе АДФ-рибозы во время спячки, могут опосредовать кардиопротекторные эффекты, так как гибернация развивается на фоне гипоксии. АДФ-рибоза, АМФ, аденозин вызывают расслабление сосудов.

Известно, что во время спячки артериальное давление сильно снижено. К моменту пробуждения уровень нуклеотидов, их соотношение может меняться.

Уровень АДФ-рибозы к концу баута спячки может снижаться, в огранизме животного может повышаться уровень нуклеотидов, вызывающих положительный инотропный эффект в сердце, вазоконстрикцию, – например, АТФ. Во внеклеточном пространстве существуют ферменты, которые катализируют образование АТФ из АДФ и других пуриновых нуклеотидов (Yegutkin,2002). Можно предположить, что в крови или других тканях зимоспящих животных существует система, в которой изменение уровня и соотношения различных кардиотропных нуклеотидов синхронизировано с циклом спячка-бодрствование. Можно также предположить, что эта система обеспечивает заблаговременную адаптацию сердца гибернанта к определенному этапу спячки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Подводя итог проведенным исследованиям можно заключить, что АДФ рибоза обладает кардиотропным действием – оказывает влияние и на сердечно сосудистую систему in vivo, и на изолированное сердце млекопитающего, где действует на рабочий миокард и миокард предсердий. Кардиотропные эффекты АДФ-рибозы являются самостоятельными и не связаны с гидролизом до АМФ или аденозина. Ингибиторные эффекты АДФ-рибозы опосредуются А1 аденозиновыми рецепторами. Однако, АДФ-рибоза способна активировать и другие рецепторы в сердце. Вероятно, положительный хронотропный эффект, вызываемый АДФ-рибозой на фоне блокады А1-рецептров, обусловлен активацией А2-аденозиновых рецепторов. Однако, при самостоятельном действии наблюдаются только ингибиторные эффекты АДФ-рибозы.

АДФ-рибоза оказывала действие на сердце зимоспящего животного – снижала длительность ПД папиллярной мышцы суслика. Однако действие АДФ рибозы на сердце зимоспящего животного более специфично, чем на сердце крысы: АДФ-рибоза не вызывает изменения длительности ПД предсердций суслика, в то время как АМФ и аденозин снижают длительность ПД. Таким образом, нуклеотиды могут принимать участие в регуляции работы сердца зимоспящего животного во время спячки. Специфичность регуляции сердца нуклеотидами может определятся уровнем экспрессии пуриновых рецепторов, изменением их чувствительности к агонистам в различных отделах сердца.

Возможно, в регуляции сердечно-сосудистой системы во время гипобиоза имеет значение секреция специфических агонистов в определенные этапы спячки.

Таким агонистом может быть АДФ-рибоза.

В заключение следует отметить, что гибернация - это сложный многофазный процесс, регуляция которого опосредована целым рядом регуляторных веществ, принадлежащих различным классам, и нуклеотиды играют определенную роль в этом процессе. АДФ-рибоза может ускорять вхождение в гипобиоз, в то время как её метаболиты могут оказывать протекторные эффекты во время гипобиоза.

ВЫВОДЫ 1. АДФ-рибоза обладает кардиотропной активностью в сердце гибернирующего суслика и крысы. АДФ-рибоза вызывает снижение частоты сокращения, механической активности изолированного сердца, вызывает снижение ЧСС, диастолического и систолического давления у крысы in vivo.

2. АДФ-рибоза изменяет электрическую активность всех отделов сердца:

уменьшает длительность ПД в предсердии и папиллярной мышце крысы, снижает длительность ПД в папиллярной мышце гибернирующего суслика, снижает скорость нарастания медленной диастолической деполяризации в синусном узле.

3. Характер изменения ПД при действии АДФ-рибозы в папиллярной мышце крысы и гибернирующего суслика различен. На уровне 90% реполяризации ПД папиллярной мышцы суслика АДФ-рибоза вызывает значительно меньшее снижение длительности, чем в кардиоцитах крысы.

4. АДФ-рибоза обладает самостоятельным действием, отличным от действия ее метаболитов. В условиях перфузии изолированного сердца АДФ-рибоза вызывает большие по величине эффекты, чем её метаболиты. АДФ-рибоза быстрее снижает ЧС препарата, чем АМФ или аденозин. В кардиоцитах папиллярной мышцы и предсердия АДФ рибоза вызывает большее снижение длительности ПД, чем АМФ, и равное аденозину.

5. Ингибиторные эффекты АДФ-рибозы преимущественно обусловлены активацией А1 аденозиновых рецепторов. Отрицательный хронотропный эффект АДФ рибозы в изолированном сердце крысы обусловлен активацией А1 аденозиновых рецепторов.

Снижение длительности ПД и отрицательный инотропный эффект АДФ-рибозы в кардиоцитах предсердия крысы преимущественно обусловлен активацией А1 аденозиновых рецепторов.

6. АДФ-рибоза изменяет работу сердца во время гипоксической перфузии и реоксигенации: усиливает снижение работы изолированного сердца крысы при гипоксической перфузии. Во время реоксигенации АДФ-рибоза вызывает замедленное восстановление параметров работы изолированного сердца.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ Статьи:

1) Погорелов А.Г., Кокоз Ю.М., Дубровская М.И., Погорелова В.И., Корыстова А.Ф., Кузьмин В.С. Сравнительный анализ внутриклеточного содержания калия для кардиомиоцита в ткани папиллярной мышцы и в первичной культуре сердца // Цитология, Т.39, №4, С. 829-834, 1997.

2) Гольдштейн Д.В., Закарян А.А., Кузьмин В.С., Погорелов А.Г., Сухова Г.С.

Доклиническое изучение активности кардиотропных препаратов на модели изолированного сердца //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, Т. 137, № 6, С. 644-645, 2004.

3) Кузьмин В.С., Сосулина Л.Ю., Сухова Г.С., Ашмарин И.П. АДФ-рибоза и цАДФ-рибоза – эндогенные регуляторы клеточного ионного баланса.

Кардиотропное действие АДФ-рибозы // Успехи физиологических наук, Т.

37, №1, С. 3-17, 2006.

4) Кузьмин В.С., Сухова Г.С., Ашмарин И.П. Обратимое ингибиторное действие аденозиндифосфатрибозы на изолированное сердце крысы и на сердце крысы in vivo // Кардиология, Т. 46, №4, С. 39-45, 2006.

Тезисы:

5) Кузьмин В.С., Сухова Г.С. Обратимое ингибиторное действие аденозиндифосфатрибозы на изолированное сердце крысы в сравнении с действием её метаболита – АМФ. // III Всероссийская конференция с международным участием, посвященная 175-летию со дня рождения Ф.В.Овсянникова, 29 сентября - 1 октября 2003 г., Санкт-Петербург, С. 167 168, 2003.

6) В.Н.Погорелова, Г.С.Сухова, В.С.Кузьмин, А.А.Закарян, А.Г.Погорелов Доклиническое изучение "специфической" токсичности стимулирующего препарата на модели изолированного сердца // 2-ой съезд токсикологов России, 10-13 ноября 2003 г., Москва, С.477-479, 2003.

7) Алексеенко А.А., Закарян А.А., Зиганшин Р.Х., Кузьмин В.С., Ляшков А.Е., Сухова Г.С. Действие неокиоторфина (НКТ) на миокард теплокровных животных при гипоксии и гипотермии // Российский симпозиум по химии и биологии пептидов, 17-19 ноября 2003 г., Москва, Тезисы докладов, С. 56, 2003.

8) Кузьмин В.С., Погороелов А.Г., Сухова Г.С. Изменение общей внутриклеточной концентрации ионов Nа+ и К+ в кардиомиоцитах изолированного сердца крысы под действием аденозина и АМФ в условиях нормоксической и гипоксической ретроградной перфузии // VI симпозиум по сравнительной электрокардиологии, 21-23 июня 2004 г., Сыктывкар, Тезисы – С. 31, 2004.

9) Алексеенко А.А., Закарян А.А., Зиганшин Р.Х., Кузьмин В.С., Сухова Г.С.

Поиск регуляторов гибернации: кардиотропные эффекты некоторых сигнальных молекул // XIX съезд физиологического общества им. Павлова, 20-24 сентября, 2004 г., Екатеринбург, Тезисы в Рос. Физиол. Журнал им.

И. М. Сеченова, Т. 90, № 8, С. 203, 2004.