Влияние флавоноидов на каналообразующую активность токсинов и антимикробных агентов в липидных бислоях
На правах рукописи
ЕФИМОВА Светлана Сергеевна ВЛИЯНИЕ ФЛАВОНОИДОВ НА КАНАЛООБРАЗУЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ ТОКСИНОВ И АНТИМИКРОБНЫХ АГЕНТОВ В ЛИПИДНЫХ БИСЛОЯХ 03.01.03 – молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Санкт-Петербург 2013 2
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук, Санкт-Петербург
Научный консультант: кандидат биологических наук, доцент Ольга Сергеевна Остроумова Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии Российской академии наук
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Ирина Ильинична Марахова Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии Российской академии наук, ведущий научный сотрудник доктор биологических наук, профессор Зоя Иринарховна Крутецкая Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт Петербургский государственный университет», зав. кафедрой
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук, Санкт-Петербург
Защита состоится «18» октября 2013 года в 12.00 ч на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 на базе Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. Сайт института: www.cytspb.rssi.ru Адрес электронной почты института: [email protected] Факс института (812) 297-35-
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН
Автореферат разослан «_» сентября 2013 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.В. Каминская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования Плазматическая мембрана является первичной мишенью взаимодействия токсинов и лекарственных веществ с клеткой. Во многих случаях взаимодействие экзогенных соединений с мембраной приводит к нарушению ее барьерных функций за счет образования ион-проницаемых трансмембранных пор, последующему разрушению мембраны и гибели клетки. Когда токсичность экзогенных соединений в отношении клеток млекопитающих связана с образованием трансмембранных ионных каналов, актуальной фармакохимической задачей является поиск веществ, способных уменьшать их каналообразующую активность. Но если мишенями являются грибковые или бактериальные клетки, интерес представляют соединения, увеличивающие мембранную активность антибиотиков.
В качестве потенциальных регуляторов каналообразующей активности токсинов и антимикробных агентов можно рассматривать флавоноиды. Флавоноидами называется группа фенольных соединений преимущественно растительного происхождения.
Амфифильность молекул флавоноидов позволяет им легко встраиваться в биологические мембраны и изменять их физико-химические свойства, в том числе, дипольный потенциал. Этот скачок потенциала на границе раздела мембрана-раствор возникает в результате определенной взаимной ориентации диполей молекул липидов и воды. В результате углеводородная область бислоя оказывается заряженной положительно относительно окружающей мембрану водной фазы [1-3]. Известно, что уменьшение дипольного потенциала мембраны при адсорбции флавоноида флоретина вызывает изменение каналообразующей активности некоторых антимикробных пептидов и липопептидов, в частности, грамицидина А, аламетицина, сирингомицина Е и сурфактина [4-7]. Интерес к флавоноидам обусловлен также широким спектром их биологической активности;
они обладают Р-витаминной активностью, гипотензивным, седативным, кардиопротекторным, противовоспалительным и противомикробным действием [8-11].
При этом многие флавоноиды малотоксичны для клеток млекопитающих, что указывает на перспективы создания новых фармакологических препаратов на их основе.
Для получения надежных результатов, позволяющих выявить механизмы влияния флавоноидов на процессы формирования и функционирования ион-проницаемых пор, образуемых в мембранах токсинами и антимикробными соединениями, необходимо широкое варьирование липидного состава мембран и их ионного окружения, что в случае клеточных мембран практически невозможно. Поэтому использование модельных липидных бислоев по-прежнему является актуальным методическим подходом.
Поскольку составной частью каждой клеточной мембраны является липидный бислой, взаимодействие токсинов и антимикробных соединений с бислойными липидными мембранами в значительной мере отражает характер их биологической активности.
Цели и задачи исследования. Цель работы – установить молекулярные механизмы влияния флавоноидов на каналообразующую активность токсинов и антимикробных агентов в модельных липидных мембранах. Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:
1. поиск адекватных экспериментальных моделей: выбор каналообразующих агентов, мембранных систем и флавоноидов;
2. определение изменения дипольного потенциала липидных бислоев при адсорбции тестируемых флавоноидов;
3. измерение характеристик одиночных ион-проводящих пор и кинетики трансмембранного тока, протекающего через модифицированные токсинами и антимикробными соединениями липидные бислои, в отсутствие и в присутствии флавоноидов;
4. выявление закономерностей влияния флавоноидов на формирование и функционирование ион-проводящих пор, образованных токсинами и потенциальными фармакологическими агентами в липидных бислоях.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Флавонолы (кверцетин и мирицетин) и изофлавоны (генистеин и биоханин А) уменьшают дипольный потенциал мембран.
2. Дипольный потенциал мембраны влияет на каналообразующую активность антимикробного пептида цекропина А.
3. 5- (7-) и 4’-гидроксилированные флавоноиды увеличивают потенциал чувствительность закрывания одиночной -гемолизиновой поры.
4. Каналообразующая активность макролидных полиеновых антимикотиков в стерин содержащих бислоях при введении флавоноидов определяется двумя факторами:
величиной дипольного потенциала мембран и стабильностью полиен-стериновых комплексов.
Научная новизна. Среди флавоноидов обнаружены новые, ранее не известные, дипольные модификаторы мембран: кверцетин, мирицетин, биоханин А и генистеин.
Впервые показано, что распределение электронной плотности вблизи карбонильной группы и общая гидрофобность молекулы определяют величину индуцированного флавоноидом уменьшения дипольного потенциала мембраны. Впервые установлено, что частично закрытые состояния -гемолизиного канала обладают катионной селективностью. Обнаружены флавоноиды, способные увеличивать потенциал чувствительность одиночного -гемолизинового канала при взаимодействии с его сенсором напряжения. Исследование влияния флавоноидов на каналообразующую активность полиеновых макролидных антибиотиков позволило установить определяющую роль стабильности полиен-стериновых комплексов при формировании и функционировании каналов.
Теоретическое и практическое значение. Представленные результаты позволяют расширить представления о мембранной активности флавоноидов. Впервые получены данные о том, что влияние флавоноидов на каналообразующую активность токсинов и антимикробных агентов может быть результатом не только индуцированного ими изменения дипольного потенциала мембраны, но и непосредственного взаимодействия флавоноидов с каналообразующими молекулами. Результаты работы способствуют пониманию важности участия диполь-дипольных и заряд-дипольных взаимодействий в процессах формирования и функционирования ионных каналов. Полученные в работе данные существенны также для понимания механизмов перехода -гемолизинового канала между подсостояниями проводимости. Флавоноиды, увеличивающие активность полиеновых макролидных антибиотиков в эргостерин-содержащих бислоях, могут рассматриваться как потенциальные синергисты противогрибкового действия полиенов и использоваться при создании более эффективных фармакологических препаратов.
Результаты работы могут быть использованы в курсах лекций по молекулярной и клеточной биологии, фармакологии и биофизике.
Апробация работы. Основные положения работы были представлены на конференции Европейского биофизического общества (Будапешт, 2011), 54 конференции Американского биофизического общества (Сан-Франциско, 2010), II и III конференциях молодых ученых ИНЦ РАН (Санкт-Петербург, 2010, 2012), Политехническом симпозиуме «Молодые учёные – промышленности Северо-Западного региона» (Санкт-Петербург, 2010), III Международной конференции «Современные проблемы молекулярной биофизики» (Санкт-Петербург, 2011), 17 Международном биофизическом конгрессе (Пекин, 2011), Международной научно-практической конференции «МЕТРОМЕД» (Санкт-Петербург, 2011), 4 Международной конференции молодых ученых «Биология: от молекулы до биосферы» (Харьков, 2011), IV Съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012), Ежегодной конференции немецкого биофизического общества (Гёттинген, 2012), 37 и 38 конгрессах Европейского биохимического общества (Севилья, 2012;
Санкт-Петербург, 2013). Материалы докладывались на научных семинарах Лаборатории ионных каналов клеточных мембран ИНЦ РАН.
По результатам диссертации опубликовано 20 печатных работ, в том числе 7 статей в рецензируемых научных журналах из перечня изданий, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, содержащего 165 наименований, и приложения. Работа изложена на 107 страницах и иллюстрирована 54 рисунками и таблицами.
Личный вклад автора. Все экспериментальные процедуры и обработка результатов выполнены автором лично. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем.
Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке программы президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», Министерства образования и науки (Соглашение № 8119), Российского фонда фундаментальных исследований (гранты 06-04-48860, 09-04-00883, 12-04-00948, 12-04-31332, 12-04-33121), Президента РФ (грант № MK-1813.2012.4) и Правительства Санкт-Петербурга (гранты ПСП № 10286 и ПСП № 12109).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы. В работе использовали следующие реактивы: аспартат натрия (NaAsp) и глюконат натрия (NaGlc) (“Fluka”, США);
NaCl, KCl, MOPS, Hepes, пентан, этанол, хлороформ, гексадекан, сквален, флоретин, флоридзин, генистин, генистеин, кверцетин, мирицетин, биоханин А, (±) гидрат катехина, (±) гидрат таксифолина, даидзеин, 2’,4’,6’- моногидрат тригидроксиацетофенона (ТГАФ), диметилсульфоксид (ДМСО), нонактин, -гемолизин из Staphylococcus aureus (АГЛ), амфотерицин В (АМВ), филипин и цекропин А (“Sigma”, США). Сирингомицин Е (СМЕ) был выделен и очищен, как описано в литературе [12], и любезно предоставлен д-ром Д. Такемото (Utah State University, США). Фосфолипиды и стерины: 1,2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфохолин (ДФФХ), 1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфосерин (ДОФС), 1,2-диолеил-sn-глицеро-3 фосфоэтаноламин (ДОФЭ), 7-дегидрохолестерин (ДХол), холестерин (Хол), эргостерин (Эрг) и стигмастерин (Стигм) (“Avanti Polar Lipids”, США).
Формирование и измерение электрических параметров липидных бислойных мембран. Бислойные липидные мембраны создавали из фосфолипидов и стеринов по методу Монтала и Мюллера [13] путем сведения конденсированных липидных монослоев на отверстии в тефлоновой пленке, разделяющей экспериментальную камеру на два (цис и транс-) отделения. Каналообразующие агенты, СМЕ, цекропин А и АГЛ, добавляли к водной фазе цис-отделения камеры до конечной концентрации в пределах 15, 24 мкМ и 1040 нМ соответственно. АМВ и филипин добавляли к водной фазе обоих отделений камеры до конечной концентрации в пределах 10-8–10-6 М.
Для подачи трансмембранного потенциала (V) и отведения сигнала от мембраны использовали хлор-серебряные электроды (Ag/AgCl), соединенные с растворами камеры через мостики с 1.5 %-ной агарозой в растворе 2 М KCl. Положительным считали потенциал, вызывающий поток катионов из цис- в транс-отделение камеры.
Электрофизиологические измерения проводили при комнатной температуре. Измерения и оцифровку трансмембранных токов проводили в режиме фиксации потенциала с помощью Axopatch 200B и Digidata 1440A (Axon Instruments). При обработке данных использовали 8-полярный фильтр Бесселя и частоту фильтрации 1 кГц. Обработку записей трансмембранных токов осуществляли с использованием программного пакета Clampfit 9.0 (Axon Instruments, США). Статистический анализ полученных данных проводили с помощью программы Origin 8.0 (OriginLab, США).
Построение гистограмм флуктуаций трансмембранного тока, протекающего через одиночные каналы, и времени жизни каналов. При построении гистограмм флуктуаций трансмембранного тока по оси ординат откладывали приведенные к ширине столбца гистограммы частоты (общее число событий превышало 100). Все пики аппроксимировали плотностью нормального распределения. Для построения гистограмм времени пребывания каналов в открытом состоянии по оси ординат откладывали относительные частоты (общее число событий более 100), а распределение аппроксимировали плотностью показательного распределения с параметром, равным среднему времени жизни канала (on). Для проверки гипотезы о законе распределения использовали критерий 2 (P 0.05). Проводимость каналов (g) определяли как отношение протекающего через одиночный канал тока (i) к трансмембранной разности потенциалов (V). Средненормированный ток, протекающий через одиночные каналы (isc), считали как сумму произведений средних токов, характеризующих разные подуровни проводимости, и вероятностей их появления.
Определение изменения дипольного потенциала мембран после введения флавоноидов. Изменение дипольного потенциала мембраны (d) определяли по изменению равновесной нонактин-индуцированной проводимости бислоя до и после введения в мембраноомывающие растворы (0.1 M KCl, 5 мМ Hepes, рН 7.4) флавоноида (до конечной концентрации в диапазоне от 2.5 до 150 мкМ) при фиксированном трансмембранном потенциале: Gm / Gm exp( F d / RT ) [1], где G0m и Gm – значения равновесной К+-проводимости бислоя, обусловленной нонактином, до и после введения флавоноида;
F – число Фарадея (F = 96485 Кл/М);
R – универсальная газовая постоянная (R = 8.31 Дж/(МК));
T – термодинамическая температура (Т = 294 К). Средние величины изменения дипольного потенциала мембран определяли как средние арифметические значения и их стандартные отклонения при измерении d 35 бислоев. Для описания адсорбции флавоноидов на поверхности липидных бислоев использовали изотерму Ленгмюра: d (C ) d ()С /(С K ), где d (C ) – изменение дипольного потенциала мембран при фиксированной концентрации (С) флавоноида в мембраноомывающем растворе, d () – максимально достижимое изменение дипольного потенциала мембран при введении флавоноидов, К – константа десорбции флавоноида [3].
Для определения катион-анионной Измерение селективности каналов.
селективности каналов на мембране создавали 10-кратный градиент концентрации электролита. Число переноса для анионов (t–) рассчитывали согласно уравнению Гендерсона [14]: V * RT / F 1 2t ln C цис / C транс, где V* – потенциал реверсии, соответствующий нулевому трансмембранному току, при отношении концентраций проникающих ионов с цис- и транс-стороны мембраны (Сцис/Странс).
Определение отношения равновесного интегрального трансмембранного тока, индуцированного каналообразующими молекулами, до и после введения флавоноидов. Среднее отношение (I/I0) равновесного интегрального трансмембранного тока, индуцированного каналообразующим агентом в присутствии (I) и в отсутствие флавоноида (I0), определяли как среднее арифметическое значение и его стандартное отклонение при измерении I/I0 39 бислоев. Равновесное число функционирующих в мембране каналов (Nop) определяли как отношение равновесного интегрального трансмембранного тока (I0) к току, протекающему через одиночный канал (i).
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Выбор объектов исследования. Для выявления общности механизмов действия флавоноидов на мембранную активность порообразующих токсинов и антимикробных агентов потребовался широкий круг изучаемых объектов – как мембранных систем, так и используемых для тестирования биологически активных соединений, флавоноидов и каналообразующих соединений. Основными критериями отбора каналообразующих соединений служили следующие: наличие антимикробной или токсической активности, химическая структура и способ порообразования. В результате были выбраны антигрибковый липопептид из Pseudomonas syringae сирингомицин Е, антимикробный пептид из Hyalophora cecropia цекропин А, основной белковый токсин из Staphylococcus aureus -гемолизин и полиеновые макролидные антибиотики из Streptomyces амфотерицин В и филипин. Составы мембранообразующего и мембраноомывающего растворов были подобраны для каждого порообразующего соединения на основании данных, имеющихся в литературе, с учетом поставленных задач. Основными критериями выбора флавоноидов были их структурные особенности, в частности, принадлежность к определенной группе в зависимости от степени окисления и гидроксилирования пропанового фрагмента, положения фенильного радикала, размер молекул флавоноидов, общая гидрофобность молекулы и расположение гидроксильных групп. В результате были выбраны следующие классы флавоноидов: халконы, изофлавоны, флавонолы, флаваноны, флаванонолы и флорглюцинолы.
Влияние флавоноидов на дипольный потенциал липидных бислоев Измерены величины изменения дипольного потенциала различного состава.
фосфолипидных и стерин-содержащих бислоев при адсорбции флавоноидов. На рис. показаны зависимости уменьшения величины дипольного потенциала липидных бислоев от концентрации различных флавоноидов в околомембранных растворах. Видно, что добавка в мембраноомывающие растворы флоретина, флоридзина, генистеина, кверцетина, биоханина А и мирицетина вызывает уменьшение дипольного потенциала ДФФХ-бислоев, а введение ТГАФ, катехина, генистина и таксифолина практически не изменяет d.
Рис. 1. Зависимость уменьшения d, мВ дипольного потенциала мембраны от концентрации флоретина (), флоридзина (), генистеина (), кверцетина (), биоханина А (), мирицетина (), ТГАФ (), катехина (), генистина () и таксифолина ( ) в мембраноомывающем растворе.
Мембраны сформированы из ДФФХ в растворах 0.1 М КCl (рН 7.4).
0 C, мкМ 25 50 75 Трансмембранный потенциал V = 50 мВ.
Полученные результаты указывают на то, что халконы (флоретин и флоридзин), флавонолы (кверцетин и мирицетин), а также некоторые изофлавоны (генистеин и биоханин А) значительно уменьшают дипольный потенциал фосфолипидных и стерин содержащих мембран. При этом влияние флаванолов (катехина) и флаванонолов (таксифолина) на дипольный потенциал липидных бислоев пренебрежимо мало.
Сопоставление химических структур молекул флавоноидов и соответствующих величин d дает основание считать, что уменьшение дипольного потенциала мембраны при адсорбции флавоноидов обусловлено гидрофобностью молекул (более гидрофобный халкон или изофлавон вызывает большее изменение d) и распределением электронной плотности в С-кольце (насыщенные аналоги практически не влияют на d).
Влияние флавоноидов на каналообразующую активность сирингомицина Е в Введение противогрибкового циклического присутствии больших анионов.
липодепсипептида сирингомицина Е (СМЕ) в растворы цис-отделения экспериментальной камеры и последующее приложение разности потенциалов (V) приводит к формированию ионных каналов. На рис. 2 видно, что проводимость СМЕ-каналов (g) зависит от вида проникающего аниона (хлора, аспартата или глюконата) и падает в ряду Cl–, Asp– и Glc– в результате различной подвижности этих анионов. Добавка 20 мкМ флоретина в мембраноомывающие растворы уменьшает проводимость СМЕ каналов в системе, содержащей анионы хлора, и не влияет на величину g в присутствии анионов аспартата и глюконата.
Рис. 2. Проводимость СМЕ-каналов до и контроль флоретин после введения флоретина в 0.4 М растворы NaAsp, NaGlc или NaCl (pH NaAsp 1 пСм 6.0), омывающие ДФФХ-мембраны.
0.05 мин Левая панель – контроль;
правая панель – в присутствии 20 мкМ флоретина.
NaGlc 0.5 пСм Трансмембранный потенциал V = – 0.05 мин мВ. Штриховые линии соответствуют 0 пСм.
NaCl 5 пСм 0.05 мин Исследование катион-анионной селективности СМЕ-каналов показало, что замена в омывающих мембраны растворах Cl– на Asp– или Glc– сопровождается потерей преимущественно анионной селективности СМЕ-каналов. Числа переноса t– = 0.9 ± 0.02 и t– = 0.41 ± 0.08 для систем, содержащих NaCl и NaAsp (или NaGlc) соответственно.
Введение флоретина, вызывающего уменьшение дипольного потенциала, приводит к увеличению энергетического барьера для проникающих анионов, в результате чего наблюдается уменьшение величины g анион-селективных СМЕ-каналов в мембранах, омываемых растворами NaCl. Малая селективность СМЕ-каналов в присутствии анионов Asp– или Glc– в мембраноомывающих растворах объясняет отсутствие влияния дипольного потенциала ДФФХ-мембран на величину g [15].
Добавка флоретина в мембраноомывающие растворы NaGlc вызывает увеличение равновесного числа функционирующих СМЕ-каналов (Nop) приблизительно в 3 раза (рис. 3, А). Аналогичными изменениями Nop сопровождается введение 20 мкМ флоретина в омывающие мембраны растворы NaAsp. Введение 20 мкМ флоретина в 0.4 М растворы NaCl, омывающие ДФФХ мембрану, сопровождается более существенным увеличением Nop – в 110 ± 60 раз (рис. 3, Б).
Анализ механизмов увеличения равновесного числа функционирующих СМЕ каналов показал, что в присутствии больших анионов (Asp– и Glc–) увеличение Nop определяется, главным образом, коэффициентом распределения липопептида между липидной и водной фазами, в то время как в системах, содержащих анионы Cl–, рост Nop определяется еще и увеличением потенциал-чувствительности каналов.
Рис. 3. Влияние флоретина на равновесное число открытых Б А Nop Nop элементарных СМЕ-каналов (Nop).
Бислои сформированы из ДФФХ в 1000 1 пА растворах 0.4 М растворами NaGlc 0.5 мин 0 пА (А) или NaCl (Б) (pH 6.0).
Трансмембранный потенциал V = 0 t, мин t, мин 35 60 мВ. Стрелками указаны моменты 10 20 введения 20 мкМ флоретина.
Влияние флавоноидов на каналообразующую активность антимикробного пептида цекропина А. Введение цекропина А в цис-отделение экспериментальной камеры и последующее приложение трансмембранного потенциала вызывает образование в мембране ионных каналов многоуровневой проводимости. Например, на рис. 4 видно подуровней проводимости.
уровень уровень Записи флуктуаций Рис. 4.
5 пА трансмембранного тока, 0.1 сек индуцированного цекропином А.
Мембрана сформирована из эквимолярной смеси ДОФС и ДОФЭ в растворах 0.1 М KCl (pH 7.4). Цифрами (1–5) обозначены подуровни проводимости цекропиновых каналов.
Трансмембранный потенциал V = 1 0 пА мВ.
Для того чтобы охарактеризовать все подуровни проводимости цекропиновых каналов использовали средненормированный ток (isc) (см. раздел «Материалы и методы»). На рис.
5 представлена зависимость средненормированной проводимости цекропиновых каналов ( g SC iSC / V ) от V в ДОФС:ДОФЭ-мембранах в отсутствие и в присутствии флавоноидов (флоретина и мирицетина). На рис. 5 видно, что средненормированная проводимость цекропиновых каналов уменьшается при введении флоретина и практически не зависит от добавки мирицетина.
Сходным образом ведет себя и равновесный цекропин-индуцированный трансмембранный ток: добавление в мембраноомывающие растворы 20 мкМ флоретина приводит к уменьшению I в 7 ± 4 раз (рис. 6). Введение 20 мкМ мирицетина практически не влияет на I (I/I0 = 1.4 ± 0.5). Изучение влияния флавоноидов на дипольный потенциал бислоев показало, что флоретин в этой же концентрации уменьшает дипольный потенциал ДОФС:ДОФЭ-мембран на 90 ± 10 мВ, а мирицетин – на 20 ± 5 мВ.
gSC, пСм Рис. 5. Зависимость средненормированной проводимости цекропиновых каналов (gsc) от трансмембранной разности потенциалов (V) до и после введения флоретина. Бислои сформированы из эквимолярной смеси ДОФС и ДОФЭ в растворах 0.1 М раствора KCl (рН 7.4). – контроль;
– 20 мкМ флоретина;
– мкМ мирицетина.
-100 0 V, мВ I, пА Влияние флоретина на Рис. 6.
равновесный трансмембранный ток, индуцированный цекропином А.
0 pA Мембрана сформирована из эквимолярной 5 pA 1 sec смеси ДОФС и ДОФЭ в растворах 0.1 М KCl (pH 7.4). Момент добавления 20 мкМ флоретина в мембраноомывающие растворы указан стрелкой.
Трансмембранный потенциал V = 50 мВ.
t, мин 10 20 Сопоставление полученных величин d, g SC и I в присутствии флоретина и мирицетина позволяет полагать, что наблюдаемые изменения являются результатом обусловленного этими флавоноидами изменения дипольного потенциала мембран, модифицированных цекропином А.
Влияние флавоноидов на потенциал-зависимость -гемолизинового канала.
Одиночный -гемолизиновый канал при трансмембранной разности потенциалов V |100| мВ закрывается, т.е. переходит из основного (открытого) состояния в частично закрытые состояния с близкой малой проводимостью (рис. 9, А). Оказалось, что введение 20 мкМ флоретина способствует закрыванию АГЛ-канала при V |5| мВ (рис. 9, Б), но не влияет на проводимость различных подсостояний (g0 = 900 ± 90 и 100 ± 50 пСм для открытого и частично закрытых состояний АГЛ-канала соответственно) (рис. 10). Отсутствие влияния на свойства АГЛ-канала двух других флавоноидов (флоридзина и биоханина А), уменьшающих d на 75 ± 10 и 80 ± 15 мВ соответственно, показывает, что увеличение потенциал-чувствительности закрывания АГЛ-канала в присутствии флоретина не является результатом изменения дипольного потенциала мембраны при добавке флоретина (d = –130 ± 10 мВ).
А Б ± 150 мВ ± 150 мВ ± ± 125 ± ± ± ± 75 5 pA ± ± 50 1 m in 0 pA ± 25 ± 0 пА 0 пА 20 pA 6 sec 25 пА 0 pA 25 пА 5 мин 5 мин Рис. 9. Запись флуктуаций трансмембранного тока, протекающего через одиночный канал, образованный -гемолизином в ДФФХ-мембранах, омываемых раствором 1 М KCl (pH 7.5) в отсутствие (А) и в присутствии 20 мкМ флоретина (Б). Стрелками указаны моменты изменения трансмембранного потенциала. Значения трансмембранного потенциала указаны над стрелками.
Рис. 10. Зависимость проводимостей Б A g, пСм g, пСм одиночного -гемолизинового канала (g) от трансмембранного потенциала (V) для открытого () и частично закрытых () состояний в ДФФХ мембранах, омываемых раствором M KCl (pH 7.5) в отсутствие (А) и в -100 0 -100 0 V, мВ присутствии 20 мкМ флоретина (Б).
V, мВ Результаты измерения катион-анионной селективности АГЛ-канала при 10-кратном градиенте концентрации электролита на мембране позволили установить, что открытое состояние канала характеризуется анионной селективностью (t– = 0.70 ± 0.05), в то время как частично закрытые состояния – катионной (t+ варьирует от 0.69 до 0.83). Добавка флоретина не изменяет селективности подсостояний проводимости. Это обстоятельство с учетом неизменности проводимости подсостояний АГЛ-канала в присутствии флоретина свидетельствует о том, что флоретин не является блокатором канала. Можно предположить, что эффект флоретина обусловлен его непосредственным взаимодействием с сенсором напряжения -гемолизиновго канала. Для установления стехиометрии взаимодействия было измерено время жизни канала в открытом состоянии при различных концентрациях флоретина. Наклон участка линейного роста зависимости обратного времени жизни канала в открытом состоянии от концентрации флоретина, представленной в двулогарифмическом масштабе, характеризует число молекул флоретина, связывающихся с одиночной порой: как минимум 3 молекулы флоретина приходится на 7 протомеров, формирующих АГЛ-канал (рис. 11). Для проверки того, какие гидроксильные группы флавоноида участвуют в образовании водородных связей с аминокислотными остатками в составе сенсора напряжения АГЛ-канала, были проведены измерения потенциал-зависимости закрывания канала в присутствии аналогов флоретина, гидроксилированных в различных положениях циклов А и В, даидзеина, генистеина, кверцетина, мирицетина, таксифолина и катехина. Подобный подход позволил определить ОН-группы, участвующие в образовании водородных связей с сенсором напряжения канала. Это ОН-группы в 5-м положении А-цикла и в 4’-положении B-цикла. Учитывая, что растительные флавоноиды гидроксилированы в 7-м положении А-цикла, нельзя исключить возможности участия этой ОН-группы во взаимодействии с АГЛ-каналом.
Анализ литературных данных позволил оценить среднее расстояние между 5-ОН и 4'-OH группами флавоноидов, комплексированных с различными белками, как 0.83 ± 0.05 нм [16-27]. Суммируя это значение с длиной двух водородных связей, можно оценить расстояние между двумя аминокислотными остатками, с которыми связывается одна молекула флавоноида: оно составляет 1.1 нм.
Зависимость величины, Рис. 11.
обратной среднему времени пребывания -гемолизинового канала в открытом -1, мин-1 состоянии (on-1), от концентрации on флоретина (C) в омывающих ДФФХ 100 n/N мембрану растворах 1 M KCl (pH 7.5), 0, представленная в двулогарифмическом on = 0.51 ± 0.02 s масштабе. Наклон участка линейной 10 0, зависимости характеризует количество time, s молекул флоретина, взаимодействующих m=3± 0 1 2 3 4 с -гемолизиновым каналом (m).
Трансмембранный потенциал C, мкМ V = – 100 мВ.
Вставка: пример гистограммы 0,1 1 10 распределения времени жизни основного состояния одиночного -гемолизинового канала в ДФФХ-мембранах при концентрации флоретина 60 мкМ в мембраноомывающих растворах.
Анализ структуры АГЛ-канала [28] позволил найти подходящего «кандидата» для взаимодействия с 5- (7-) и 4’-гидроксилированными флавоноидами. Им оказался треонин в 129-м положении глицин-обогащенного участка в области транс-устья поры (расстояние между треонинами соседних протомеров составляет около 1.1-1.2 нм).
Сделано предположение, что эти аминокислотные остатки входят в состав сенсора напряжения АГЛ-поры и одна молекула флавоноида взаимодействует с двумя треонинами соседних протомеров.
Влияние флавоноидов на каналообразующую активность макролидных полиеновых антибиотиков. Проводимость одиночных амфотерициновых каналов в ДФФХ:Хол (67:33 М %)-мембранах, омываемых 2 М раствором KCl, составляет около пСм. Введение в околомембранные растворы 20 мкМ флоретина или кверцетина вызывает уменьшение величины g при V 0 (g0) приблизительно в 3 и 2 раза соответственно (рис.
12). Добавка 20 мкМ флоридзина, биоханина А, ТГАФ, генистина или генистеина практически не влияет на проводимость АМВ-каналов (рис. 12).
Запись флуктуаций Рис. 12.
трансмембранного тока, протекающего через одиночные АМВ A Б В каналы в ДФФХ:Хол (67:33 М%) мембранах, омываемых раствором 0 пА 2 M KCl (pH 7.0).
Г Д Е Мембраноомывающий раствор: А – в отсутствие флавоноидов (контроль), Б – 20 мкM флоретина, В – 20 мкM флоридзина, Г – 20 мкМ кверцетина, Д 0 пА Ж З – 20 мкM генистеина, Е – 20 мкM 1пА биоханина А, Ж – 20 мкM ТГАФ и З – 0.5 сек 20 мкM генистина. Штриховые линии 0 пА соответствуют 0 пА.
Трансмембранный потенциал V = мВ.
Результаты определения изменения дипольного потенциала ДФФХ:Хол-мембран показали, что добавка 20 мкМ флоретина или кверцетина в мембраноомывающие растворы уменьшает d на 100 ± 9 и 120 ± 12 мВ соответственно, а введение 20 мкМ флоридзина, биоханина А, генистеина, генистина и ТГАФ уменьшает d в среднем на 40 ± 10 мВ. Сопоставление результатов измерения величины g0 и d позволяет предположить, что уменьшение проводимости одиночных АМВ-каналов после введения в мембраноомывающие растворы флоретина или кверцетина связано с уменьшением дипольного потенциала мембраны при их адсорбции. В отсутствие флавоноидов проводимость одиночных АМВ-каналов в Эрг- и Хол-содержащих мембранах совпадает.
Добавка 20 мкМ флоретина, уменьшающая d Эрг-содержащих мембран на 150 ± 5 мВ, приводит к падению величины g0 в 2.3 раза (рис. 13). Введение в околомембранные растворы 20 мкМ кверцетина, уменьшающее d на 110 ± 15 мВ, практически не влияет на проводимость АМВ-каналов в Эрг-содержащих мембранах в отличие от мембран, включающих Хол. Эти данные указывают на то, что изменение величины g0 может быть обусловлено не только изменением дипольного потенциала бислоя, но и непосредственным взаимодействием флавоноидов со стериновыми молекулами.
Исследование влияния флавоноидов на равновесный интегральный трансмембранный ток, индуцированный АМВ (I), показало, что добавка флоретина вызывает существенное увеличение I в ДФФХ:Хол-бислоях (I/I0 = 11.0 ± 2.9), при этом флоретин не влияет на ДФФХ:Эрг-мембраны (I/I0 = 0.8 ± 0.1) (рис. 14, А, Б). Введение кверцетина не изменяет I в ДФФХ:Хол-мембранах (I/I0 = 1.1 ± 0.2) и приводит к уменьшению I в ДФФХ:Эрг-бислоях (I/I0 = 0.5 ± 0.1) (рис. 14, В, Г). Другие флавоноиды (флоридзин, генистеин, генистин, биоханин, мирицетин и ТГАФ) не влияют на I как в Хол-, так и в Эрг-содержащих мембранах. Очевидно, что величина I не зависит от d, а определяется стериновым составом бислоя.
g, пСм Рис. 13. Зависимость проводимости одиночных АМВ-каналов от трансмембранного потенциала.
Мембраны сформированы из смеси ДФФХ:Эрг (67:33 М%) в растворах 2.0 M KCl 5 мM Hepes pH 7.0.
Мембраноомывающий раствор: – в отсутствие флавоноидов (контроль), – 20 мкM флоретина, – 20 мкМ кверцетина, – 20 мкM флоридзина;
.
-200 -100 0 100 V, мВ Влияние флоретина и Рис. 14.
Б А I, пА I, пА кверцетина на равновесный трансмембранный ток, индуцированный 0 pA 0.5 pA АМВ.
2 sec Мембраны сформированы из ДФФХ:Хол t, мин 0 t, мин 100 50 250 300 (67:33 М%) (левая панель) и ДФФХ:Эрг (67:33 М%) (правая панель) и омываются В Г I, пА I, пА 2.0 M KCl (pH 7.0). Моменты введения в мембраноомывающие растворы 20 мкМ 2000 флоретина (А, Б) или 20 мкМ кверцетина (В, Г) указаны стрелками.
0 t, мин 0 t, мин Трансмембранный потенциал V = 50 мВ.
100 200 50 100 150 Для проверки предположения о возможности взаимодействия флавоноидов не только со стериновыми, но и с полиеновыми молекулами были проведены измерения равновесного трансмембранного тока, индуцированного другим полиеновым макролидным антибиотиком филипином. Молекула филипина отличается от АМВ отсутствием аминосахарного остатка. Независимо от вида мембранообразующего стерина добавка флоретина и кверцетина увеличивает трансмембранный ток, индуцированный филипином, в 2.5 и 11.0 раз соответственно.
Известно, что каналообразующие комплексы образованы за счет Ван-дер Ваальсовых взаимодействий [29]. Присутствие дополнительных двойных связей в стероидном ядре и боковой цепи Эрг по сравнению с Хол приводит к образованию более стабильного АМВ-Эрг комплекса за счет дополнительных точек --электронного взаимодействия [30]. Можно думать, что отсутствие аминосахара в молекуле филипина может приводить к изменению сети водородных связей в филипин-стериновых комплексах и сказываться на их стабильности. Наличие двойных связей и гидроксильных групп в молекулах флоретина и кверцетина позволяет им принимать участие, как в - электронных взаимодействиях, так и в сети водородных связей, что приводит к изменению силы Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий в полиен-стериновых комплексах.
Полученные в работе результаты и проведенный анализ литературных данных позволили предложить следующую общую схему, иллюстрирующую возможные механизмы влияния флавоноидов на каналообразующую активность токсинов и антимикробных агентов.
ВЫВОДЫ 1. Молекулярные механизмы влияния флавоноидов на каналообразующую активность токсинов и антимикробных агентов включают изменение дипольного потенциала мембран и взаимодействие флавоноидов с каналообразующими молекулами.
2. Дипольный потенциал мембран влияет на каналообразующую активность сирингомицина Е и цекропина А.
3. Обнаруженное увеличение потенциал-чувствительности закрывания гемолизинового канала в присутствии 5- (7-) и 4’-гидроксилированных флавоноидов является результатом их взаимодействия с сенсором напряжения канала.
4. Каналообразующая активность макролидных полиеновых антимикотиков в стерин содержащих бислоях при введении флавоноидов определяется суперпозицией двух факторов: величины дипольного потенциала мембран и стабильности полиен стериновых комплексов, формирующих ион-проводящие поры.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:
1. Остроумова О.С., Ефимова С.С., Щагина Л.В. 2009. Проводимость фитотоксиновых каналов в присутствии больших органических ионов. Цитология. 51 (8): 670-675.
2. Ефимова С.С., Остроумова О.С., Малев В.В., Щагина Л.В. 2011. Транспорт больших органических анионов через сирингомициновые каналы в мембранах, содержащих дипольные модификаторы. Цитология. 53 (5): 450-456.
3. Ostroumova O.S., Efimova S.S., Schagina L.V. 2011. 5- and 4’-hydroxylated flavonoids affect voltage gating of single alpha-hemolysin pore. Biochim. Biophys. Acta. 1808 (8): 2051-2058.
4. Ostroumova O.S., Efimova S.S., Schagina L.V. 2012. Probing amphotericin B single channel activity by membrane dipole modifiers. PLoS One. 7 (1): e30261.
5. Efimova S.S., Ostroumova O.S. 2012. Effect of dipole modifiers on the magnitude of the dipole potential of sterol-containing bilayers. Langmuir. 28: 9908-9914.
6. Ostroumova O.S., Efimova S.S., Chulkov E.G., Schagina L.V. 2012. The interaction of dipole modifiers with polyene-sterol complexes. PLoS One. 7 (9): e45135.
7. Остроумова О.С., Ефимова С.С., Щагина Л.В. 2013. Изменения дипольного потенциала фосфолипидных мембран при адсорбции флавоноидов. Биофизика. 58 (3): 474-480.
Тезисы:
8. Efimova S.S., Ostroumova O.S., Schagina L.V. 2010. Phloretin affects the voltage gating of alpha-hemolysin channel. 54th Annual Meeting of the Biophysical Society. February 20-24, San Francisco, California, USA. Biophys. J. 98 (Issue 3, Suppl. 1), 108а.
9. Ефимова С.С., Остроумова О.С. 2010. Природа низкопроводящих состояний альфа гемолизинового канала. II Конференция молодых ученых Института цитологии РАН.
15-16 февраля, Цитология. 52 (6): 495-496.
10. Ефимова С.С., Остроумова О.С., Щагина Л.В. 2010. Влияние флавоноидов на воротный механизм альфа-гемолизинового канала. Молодые ученые – промышленности северо западного региона: материалы конференций политехнического симпозиума. – 20 мая, СПб.: Изд-во Политехн. ун-та. С. 226-229.
11. Ефимова С.С., Остроумова О.С., Щагина Л.В. 2011. Активность сирингомициновых каналов в присутствии органических анионов и дипольных модификаторов в мембраноомывающих растворах. III Международная конференция «Современные проблемы молекулярной биофизики». 14-15 июня, Петродворец, С. 43.
12. Efimova S.S., Ostroumova O.S., Malev V.V., Schagina L.V. 2011. Dipole modifiers affect properties of syringomycin channels in the presence of large organic anions. 8th European biophysics congress. Budapest, Hungary, Aug. 23-27. Eur. Biophys. J. 40 (Suppl. 1), 167.
13. Efimova S.S., Schagina L.V., Ostroumova O.S. 2011. Role of sterols in the channel-forming activity of amphotericin B in planar lipid bilayers. 17th International Biophysics Congress. Oct.
30 - Nov. 3, 2011, Beijing, China. P. 353.
14. Ефимова С.С., Остроумова О.С. 2011. Дипольный потенциал стерин-содержащих модельных мембран в присутствии флавоноидов. Измерительные и информационные технологии в охране здоровья. Метромед-2011: сборник научных трудов международной научной конференции. 8-10 ноября, Санкт-Петербург. С. 136-137.
15. Ефимова С.С., Остроумова О.С. 2011. Роль органических анионов в регуляции активности сирингомициновых каналов в присутствии дипольных модификаторов.
«Биология: от молекулы до биосферы». Материалы VI Международной конференции молодых ученых. 22-25 ноября 2011г., Харьков, Украина. С. 14-15.
16. Ефимова С.С., Остроумова О.С. 2012. Активность антимикотика амфотерицина В в липидных бислоях, содержащих дипольные модификаторы. III Конференция молодых ученых Института цитологии РАН. 15-16 мая, Санкт-Петербург, Цитология. 54(4):340.
17. Ефимова С.С., Остроумова О.С., Щагина Л.В. 2012. Роль дипольных модификаторов в регуляции каналообразующей активности полиенового антибиотика филипина в липидных бислоях. IV Съезд биофизиков России. Симпозиум I «Физико-химические основы функционирования биополимеров и клеток». Материалы докладов. 20-26 августа 2012 г., Нижний Новгород. С. 101.
18. Efimova S.S., Schagina L.V., Ostroumova O.S. 2012. Channel-forming activity of cecropin A depends from membrane dipole modifiers in planar lipid bilayers. 37th FEBS Congress.
September 4-9, Seville, Spain. FEBS J. 279 (Suppl. 1), 253.
19. Ostroumova O.S., Efimova S.S., Malev V.V., Schagina L.V. 2013. Plant flavonoids affect membrane activity of antimicrobial agents. 38th FEBS Congress. July 6-11, Saint-Petersburg, Russia. FEBS J. 280 (Suppl. 1), 191-192.
20. Efimova S.S., Schagina L.V., Ostroumova O.S. 2013. Role of dipole potential in the channel forming activity of cecropin A in planar lipid bilayers. 38th FEBS Congress. July 6-11, Saint Petersburg, Russia. FEBS J. 280 (Suppl. 1), 188.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Andersen et al., 1976, J. Gen. Physiol. 67:749-771;
2. Franklin and Cafiso, 1993, Biophys. J.
65:289-299;
3. Cseh et al., 2000, Eur. Biophys. J. 29:172-183;
4. Rokitskaya et al., 1997, Biophys. J.
73:850-854;
5. Luchian and Mereuta, 2006, Langmuir 22:8452-8457;
6. Ostroumova et al., 2008, Langmuir 24:2987-2991;
7. Ostroumova et al., 2010, Langmuir 26:15092-15097;
8. Cowan et al., 1999, Clin. Microbiol. Rev. 12:564-582;
9. Middleton et al., 2000, Pharmacol. Rev. 52:673-751;
10.
Soobrattee et al., 2005, Mutat. Res. 579:200-213;
11. Singh et al., 2008, J. Agric. Food Chem.
56:4855-4873;
12. Bidwai et al., 1987, PNAS USA 84:6755-6759;
13. Montall and Mueller, 1972, PNAS USA 65:3561-3566;
14. Morf, 1977, Analyt. Chem. 49:810-813;
15. Jordan, 1983, Biophys. J.
41:189-195;
16. Alguel et al., 2007, J. Mol. Biol. 369:829-840, (PDB ID: 2UXI, PDB ID: 2UXH);
17. Trivella et al., 2010, J. Struct. Biol. 170:522-531, (PDB ID: 3KGU, PDB ID: 3KGT);
18. Manas et al., 2004, Structure 12:2197-2207, (PDB ID: 1X7R, 1X7J);
19. Nettles et al., 2008, Nat. Chem.
Biol. 4:241-247, (PDB ID: 2QA8);
20. Pike et al., 1999, EMBO J. 18:4608-4618, (PDB ID: 1QKM);
21. Wiseman et al., 2010, Mol. Cell. 38:291-304, (PDB ID: 3LJO);
22. Gledhill et al., 2007, PNAS USA 104:13632-13637, (PDB ID: 2JJ2);
23. Wilmouth et al., 2002, Structure 10:93-103, (PDB ID:
1GP5, PDB ID: 3LM5, PDB ID: 3BPT);
24. Sicheri et al., 1997, Nature 385:602-609, (PDB ID:
2HCK);
25. Modolo et al., 2009, J. Mol. Biol. 392:1292-1302, (PDB ID: 3HBF);
26. Walker et al., 2000, Mol. Cell. 6:909-919, (PDB ID: 1E90);
27. Holder et al., 2007, Mol. Cancer Ther. 6:163-172, (PDB ID: 2O63);
28. Song et al., 1996, Science 274:1859-1866;
29. Neumann et al., 2010, J. Phys.
Chem. B. 113:15875-15885;
30. Baran et al., 2009, Biophys. Chem. 141:162-168.