Усиленный атерогенный эффект макрофагов из моноцитов крови больных ибс, выявленный в аэробных условиях и при аноксии in vitro.
На правах рукописи
Хильченко Алексей Валериевич УСИЛЕННЫЙ АТЕРОГЕННЫЙ ЭФФЕКТ МАКРОФАГОВ ИЗ МОНОЦИТОВ КРОВИ БОЛЬНЫХ ИБС, ВЫЯВЛЕННЫЙ В АЭРОБНЫХ УСЛОВИЯХ И ПРИ АНОКСИИ IN VITRO.
03.00.04 – биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
.
Москва – 2008
Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук
Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Биленко Марианна Владимировна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Ипатова Ольга Михайлова доктор биологических наук Дудник Людмила Борисовна
Ведущая организация: Московский государственный университет имени М.В.
Ломоносова, Факультет Фундаментальной медицины
Защита диссертации состоится 24 апреля 2008 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д. 001.010.01. при ГУ НИИ БМХ РАМН по адресу: 119121, Москва, ул.
Погодинская, д.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ БМХ РАМН по адресу:
119121, Москва, ул. Погодинская, д. Автореферат разослан “ “ марта 2008г.
Ученый секретарь Диссертационного света Кандидат химических наук Е.А. Карпова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
В настоящее время очевидно, что ключевым фактором возникновения атеросклеротических повреждений в сосудах является функциональная активность макрофагов (МФ), в частности, их способность распознавать, связывать и поглощать липопротеины низкой плотности (ЛНП), что ведет к накоплению в макрофагах липидов и холестерина, нарушению метаболизма макрофагов, превращению их в пенистые клетки, являющиеся ранней стадий проявления атеросклероза. При этом, атеросклеротические повреждения сосудов являются основной нарушений сосудистого кровообращения, причиной развития сердечно-сосудистых заболеваний, инвалидности и смерти населения крупных городов России и других развитых стран мира.
К существующим факторам «риска» развития атеросклероза, относят также гипертонию, курение, стресс, охлаждение и другие факторы [Ross R, 1986;
O'Donnell CJ, Ridker PM, Glynn RJ, et al., 1997], сопровождающиеся генерализованной гипоксией, и локальной ишемией сосудистой стенки [Crawford DW and Kramsch DM, 1988;
Seidel SL and Strong R, 1986]. Спазмы и локальная ишемия сосудов ведут к выделению эндотелиальными клетками (ЭК), МФ, клетками соединительной ткани, гладкомышечными клетками, элементами крови, в том числе циркулирующими моноцитами, активных форм кислорода (АФК), провоспалительных цитокинов (ФНО-, ИЛ-1, ИЛ-6 и др.), которые “прймируют” и “стимулируют” клетки, усиливают их способность окислять ЛНП [Клебанов ГИ, Владимеров ЮА, 1999;
Ma J, 2003].
Имеются данные, согласно которым лишь активированные моноциты/макрофаги обладают способностью осуществлять свои многоплановые функции, в том числе выделять АФК, окислять и поглощать ЛНП [Ma J, et al., 2003]. Однако, дозы цитокинов, сроки инкубации, необходимые для активации ими макрофагов in vitro, а также способность моноцит-производных макрофагов крови человека подвергаться активации in vivo, приобретая способность окислительно модифицировать ЛНП in vivo и in vitro, исследованы недостаточно.
Особенно важным является вопрос об активации моноцит-производных макрофагов крови in vivo при различных патологиях, протекающих на фоне ишемии и воспаления.
Многократно показано, что в крови больных ишемической болезнью сердца (ИБС) резко повышено содержание таких цитокинов как ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО- и др. [Holm T, et al., 2003;
Valgimigli M, et al., 2003;
Mizia-Stec K, et al., 2003;
Takahashi K, et al., 2002;
Hojo Y, et al., 2002;
Mazzone A, et al., 2001], являющихся активными стимуляторами моноцитов/макрофагов in vitro. Однако, за исключением данных об изменении генных и морфологических признаков моноцит-производных макрофагов, прямых работ, указывающих на усиление функциональной активности моноцит-производных макрофагов из крови больных ИБС (МФИБС), в литературе не выявлено, что препятствует ранней диагностике и направленному лечебному воздействию на функцию моноцитов/макрофагов у больных ИБС в целях предотвращения возникновения у них атеросклероза.
Несмотря на то, что проф. Биленко М.В. с группой сотрудников ранее отчетливо показано, что частичная и тотальная ишемия различных органов ведет к усилению продукции тканями АФК, первичных, вторичных и конечных продуктов ПОЛ, выходу этих продуктов в кровь, усилению способности ЭК сосудов окислять ЛДЛ [Биленко М.В. и др.1990;
Биленко М.В., Вахрушева Т.В.,Федосова С.В.,1998;
Биленко М.В., Ладыгина В.П., Федосова С.В.,1996 и др.], исследования по влиянию ишемии на способность моноцит производных макрофагов окислять и поглощать ЛНП практически отсутствуют.
Наряду с клеточными элементами сосудистой стенки и крови, существенная роль в атерогенезе принадлежит содержанию холестерина в крови больных и степени окисленности ЛНП. Показано, что количество окислительно модифицированных ЛНП в крови гиперхолестеринемичных людей [Cazzolato G, еt al., 1991] или животных [Hodis HN, et al., 1994;
Лопухин ЮМ, Владимиров ЮА, Молоденков МН, и др., 1983] выше, чем в крови людей и животных с нормальным содержанием холестерина.
Липопротеины низкой плотности, от людей с гиперхолестеринемией содержат также не только более высокое количество свободного холестерина и триглицеридов, но и продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), низкое содержание антиоксидантов (CoQ10, Vit E), обладают более высоким отрицательным зарядом, характеризующим модификацию апо-В белка, что обусловливает их способность быть распознанными и практически недозируемо поглощенными МФ [Steinberg D;
Lewis A, 1994;
Тертов ВВ, и др., 1989;
Sevanian A, et al., 1996].
Однако, способность ЛНП, полученных от людей с гиперхолестеринемией (ЛНПг) подвергаться дальнейшему in vivo или in vitro окислению по сравнению с ЛНП, полученными из крови здоровых доноров (ЛНПн), изучена недостаточно;
имеющиеся работы единичны, проведены, главным образом, с использование Cu2+ - опосредованного окисления и не содержат анализа показателей, характеризующих окислительную модификацию апо-В белка и тестов на сравнительную способность МФ к поглощению ЛНПн и ЛНПг.
Цель исследования:
Изучение способности макрофагов, полученных из моноцитв крови здоровых доноров и больных ИБС, окислять и поглощать липопротеины низкой плотности, полученные от здоровых доноров и людей с гиперхолестеринемией, при их инкубации в аэробных условиях и при аноксии in vitro.
В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи:
1. Изучить способность макрофагов, полученных из моноцитов крови здоровых доноров (МФН) окислять и поглощать ЛНПн и ЛНПг, в аэробных условиях и в условиях аноксии in vitro.
2. C помощью ФНО- разработать метод предстимуляции и стимуляции макрофагов, полученных из моноцитов крови здоровых доноров в условиях in vitro. Сравнить способность нестимулированных и стимулированных in vitro макрофагов, полученных из моноцитов крови здоровых доноров (МФН) окислять ЛНПн.
3. Изучить способность макрофагов, полученных из крови больных ИБС (МФИБС), окислять и поглощать ЛНПн и ЛНПг в аэробных условиях и в условиях аноксии in vitro.
4. Сравнить способность макрофагов, полученных из моноцитов крови больных ИБС и здоровых доноров окислять и поглощать ЛНПн и ЛНПг в аэробных условиях и в условиях аноксии in vitro.
Научная новизна работы.
Впервые доказано, что МФИБС обладают более выраженной способностью окислять и поглощать ЛНПн и ЛНПг по сравнению с МФН.
Впервые доказано, что способность МФИБС обладают более выраженной способностью окислять и поглощать ЛНПн и ЛНПг в условиях аноксии по сравнению с аэробными условиями.
Впервые доказано, что МФН и МФИБС более интенсивно окисляют и поглощают ЛНПг по сравнению с ЛНПн.
Разработан метод и схема активации макрофагов, полученных из крови здоровых людей малыми повторными дозами ФНО-.
Практическая значимость работы.
Полученные фундаментальные данные являются предпосылкой для, разработки экспресс–метода, основанного на оценке степени активации МФИБС и другими сердечно сосудистыми заболеваниями, и предназначенного для выявления тяжести ишемических повреждений сердца у больных ИБС, предрасположенности больных к развитию или прогрессированию атеросклероза, индивидуального подбора лекарственных препаратов противоишемического и антиатеросклеротического действия, а также контроля за эффективностью проводимой терапии.
Апробация диссертационного материала.
VI Международная конференция «Биоантиоксидант», ( Москва, Россия, 2002);
22nd European Section Meeting of the International Society for Heart Research, (Szeged, Hungary, 2002);
III Съезд биохимического общества, (Санкт - Петербург. Россия, 2002);
Europen Atherosclerosis Society 73 rd EAS congress. Supplement, (Salzdurg, Austria, 2002);
Конгресс "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии", (Москва, Россия, 2002);
Международная конференция «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека», (Смоленск, Россия, 2003);
24 Meeting ISHR, (Dresden, Germany, 2004);
XVIII World Congress of ISHR, (Brisbane, Australia, 2004);
Дизрегуляционная патология органов и систем, (Москва, Россия, 2004).
Публикации.
Материалы диссертации опубликованы в 3 статьях и 11 публикациях в сборниках докладов научных конференций.
Структура и объем работы.
Диссертация выполнена на 120 страницах, включает в себя введение, литературный обзор, материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение, выводов и списка литературы. Диссертация содержит 7 таблиц, 2 схемы и 17 рисунков. Список литературы состоит из 200 наименований.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Материалы и реактивы.
ЭДТА, натрия бикарбонат, HEPES, пируват натрия, L-глутамин, PBS, Кумасси Синий (Sigma Chemical Co., США);
среда RPMI-1640 (Flow Laboratories,США);
мембранные фильтры ( Serva, Германия);
Ficoll Pack (Amersham Biosciences, США);
культуральная посуда (Costar, Нидерланды);
гентамицин (Pharmachim, Балгария);
эмбриональная сыворотка теленка (НИИ Эпидемиологии и Микробиологии РАМН, Россия);
набор для определения холестерина (Boehringer Mannheim GmbH, Германия).
Получение культура макрофагов человека Моноциты крови человека изолировали из локтевой вены 18-ти здоровых доноров (МФН) и 25 больных с ишемической болезнью сердца (МФИБС). Кровь в количестве 10 мл брали в пробирку, содержащую 1 мл PBS и 50 ЕД гепарина;
разводили в два раза раствором PBS, на каждые 5мл наслаивали 3мл Ficoll Pack (= 1,077 г/мл) и центрифугировали при 37С в течение 20мин при 400g. Интерфазу отсасывали и центрифугировали при 37С в течение 15 мин при 400g. Затем надосадочную жидкость сливали и к осадку добавляли 10 мл PBS, вновь центрифугировали при 37С в течение 10 мин при 320g (процедуру повторяли дважды). К отмытому осадку добавляли 10 мл среды «роста», пипетировали. Для подсчета клеток к 20 мкл суспензии клеток добавляли 20 мкл трипанового синего, полученный раствор помещали в камеру Горяева и подсчитывали число неокрашенных клеток в квадратах. Суспензию клеток доводили средой роста до концентрации 106 клеток/мл. Затем 1 мл суспензии клеток (106 клеток/мл) разливали в чашки Петри (d=35 мм). Чашки Петри помещали в СО2-инкубатор (воздух 95% + СО2 5%) при 37С на 2 часа. Через два часа среду меняли на свежую и продолжали инкубировать еще в течение 18 часов, до превращения моноцитов в макрофаги.
Выделение ЛНП Липопротеины низкой плотности (ЛНП, d = 1,019 – 1,065 g/ml) выделяли из свежей плазмы крови 16-ти здоровых доноров (ЛНПн, общий холестерин плазмы 2,6–4,4 mМ, в среднем 3,6 ± 0,7 mM), или из плазмы крови людей с гиперхолестеринемией (ЛНПг, общий холестерин плазмы 7,3–13,5 mM, в среднем 9,8 ± 2,0 mМ). В последнем случае забор крови проводили до начала лечения или не ранее, чем через 4 недели после окончания, лечения и возвращения содержания холестерина в крови к уровню, наблюдавшемуся до лечения. ЛНП были выделены из плазмы крови человеком методом ультрацентрифугирования в градиенте NaBr [Lindgren F., 1975], модифицированным [Tertov VV et al., 1995] в присутствии ЭДТА, используя центрифугу L 8-55 и ротор Тi- (Beckman, США). Центрифугировали при 111 000g два раза по 2 часа. Полученные ЛНП вместе с NaBr и ЭДТА хранили при t +2 +4С, не более 7 дней. Накануне опыта диализовали в течение 18 ч при +4С против 6000 объемов PBS без добавления ЭДТА и без антиоксидантов. Для стерилизации использовали мембранные фильтры (0,45 мкм). Белок ЛНП определяли по Лоури. Содержание холестерина в плазме крови и в ЛНП определяли на автоанализаторе АА-11 (Technikon, США).
Инкубация макрофагов с ЛНП На период инкубации макрофагов с ЛНП среду «роста» в культурах заменяли безбелковой субстрат-дефицитной – «инкубационной», средой (RPMI-1640 + Na-бикарбонат+ 50 ЕД Гентамицина при отсутствии других субстратных добавок, сыворотки теленка). Аэробную инкубацию проводили в СО2 – инкубаторе (воздух 95% + СО2 5%, t = 37 С);
инкубацию в условиях аноксии – в камере, продуваемой в течение 15 мин 10 кратным объемом смеси газов: N2 95% + СО2 5% (содержание О2 0,001%), t = 37 С, что, в сочетании с субстрат дефицитной средой, близко имитировало stop-flow модель ишемии in vivo [Bilenko MV, Sevanian A, Hochstein P, 1993].
По окончании сроков инкубации среду с содержащимися в ней ЛНПн или ЛНПг отбирали и центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин, надосадочную жидкость использовали для оценки окислительной модификации ЛНП. Макрофаги, оставшиеся прикрепленными ко дну чашки, открепляли 1% трипсином + 0,2% ЭДТА.
Оценка окислительной модификации ЛНПн и ЛНПг.
Измерение продуктов реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-РП) проводили на cпектрофотометре Beckman DU-7 (532 нм.) методом [Uchiyama M, et al., 1978]. Количество TBARS выражали через эквивалентное количество малонового диальдегида (МДА), используя коэффициент мольной экстинкции, равный 156000 М-1• см-1. Результаты представлены как нмоль МДА на мг белка ЛНП.
Оценка электрофоретической подвижности ЛНПн и ЛНПг.
Электрофоретическая подвижность (ЭФП) ЛНП проводили модифицированным методом [Noble RP, 1968] c помощью горизонтального 1% агарозного гель электрофореза (барбиталовый буфере, рН 8.4). Сила тока составляла 140 мА, напряжение – 100 мV. ЛНП перед нанесением на гель смешивали с бромфеноловым синим (3:1);
электрофорез проводили при комнатной t в течение 3ч. Содержание белка ЛНП в каждой лунке составляло 3-4 мкг/лунку. Гели фиксировали 20 мин смесью 25% изопропанола и 10% уксусной кислоты, просушивали, окрашивали 8 –10 мин Кумасси синим. Отмывку геля проводили в смеси: ледяная уксусная кислота (50 мл/л), изопропанол (250 мл/л), вода (700мл). Абсолютные цифры ЭФП рассчитывали путем измерения длины пробега (Rf, см).
Динамику изменений ЭФП рассчитывали по отношению длины пробега в опытных лунках к длине пробега в контрольной лунке, принятой за 100%. Контролем служили те же концентрации исходных ЛНПн и ЛНПг без инкубации.
Оценка способности макрофагов захватывать ЛНП Захват макрофагами ЛНП оценивали по содержанию в них общего холестерина (холестерина и его эфиров) согласно методике [Chazov EI, et al., 1986]. Макрофаги, оставшиеся прикрепленными ко дну чашки Петри после их инкубации с ЛНП заливали 96% этанолом, высушивали, и замораживали при –20оС. Затем проводили экстракцию смесью гексан-изопропанола (2:3) согласно методике [Hojo Y, et al., 2002], и определяли содержания общего холестерина используя стандарнтый кит (Boehringer Mannheim, Germany) как рекомендовано в инструкции. Количество общего холестерина (ОХ) поглощенного макрофагами выражали как отношение мкг ОХ\106 клеток.
Оценка жизнеспособности макрофагов.
Жизнеспособность макрофагов определяли по количеству клеток, оставшихся прикрепленными ко дну чашек Петри по окончанию эксперимента [Morel DW, at al., 1983].
Клетки подсчитывали в камере Горяева.
Статистический анализ Статистическую обработку проводили, используя критерий Стьюдента для малых выборок на персональном компьютере в программе Microsoft Excel. Данные представляли как mean ± SEM. Достоверность различия между группами определяли по парному t-критерию Стьюдента. Для всех проведенных измерений различия считали достоверными при уровне значимости р0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Изучение способности МФН, окислять и поглощать ЛНПН, и ЛНПГ в аэробных условиях и в условиях аноксии in vitro.
В первом разделе к МФН добавляли ЛНПн или ЛНПг в количестве 200мкг белка ЛНП/мл среды, инкубировали в аэробных условиях в течение 1, 3 и 6 часов в СО2 инкубаторе (воздух 95%+СО2 5%, контроль), в опытах с аноксией- в эксикаторе, продутом и наполненном смесью газов (N2 95% + СО2 5%, содержание О2 0,0012%). Инкубацию в аэробных условиях и условиях аноксии проводили параллельно.
1.1. Оценка способности культуры макрофагов окислять ЛНПн и ЛНПг по накоплению в них ТБК-РП.
В нашем исследовании нативные (не инкубированные) ЛНПг содержали больше ТБК-РП, чем ЛНПн (0,7±0,08 vs 0,45±0,07;
## - p0,01). Присутствие ТБК-РП в ЛНПн, по видимому, обусловлено самоокислением ЛНП в процессе их диализа, который намеренно (чтобы не препятствовать дальнейшему инициированному макрофагами окислению) проводили без добавления в диализную жидкость ЭДТА и антиоксидантов (АО). Данные исследований представлены в таблице 1.1.
Таблица 1.1. Содержание ТБК-РП в ЛНПн и ЛНПг после их инкубации с МФН в аэробных условиях и условиях аноксии, нмоль МДА/мг белка ЛНП (M±m).
Аэробные условия, ч Условия аноксии, ч ЛНП Контроль 1 3 6 1 3 ЛНПн 0,45±0,07 0,39±0,13 0,40±0,20 0,36±0,18 0,48±0,15 0,43±0,19 0,53±0, 0,70±0,08## 0,73±0,16##^ 0,33±0,06*# ЛНПг 0,34±0,08* 0,34±0,19* 0,38±0,18* 0,39±0,15* Примечание:
*,** - уровень значимости различия опытов по сравнению с контролем: * - р0,05, ** р0, #,## - уровень значимости различия опытов с ЛНПг по сравнению с ЛНПн в контроле или в одинаковых условиях их инкубации: # - р0,05, ## - р0, ^,^^ - уровень значимости различия опытов в условиях аноксии по сравнению с опытами в аэробными условиями в течение одинаковых сроков инкубации: ^ - р0,05, ^^ - р0, $,$$ - уровень значимости различия опытов с МФИБС по сравнению с МФН в одинаковых условиях их инкубации: $ - р0,05, $$ - р0, Число независимых экспериментов – 6- В опытах с добавлением к культуре макрофагов ЛНПн в аэробных условиях инкубации заметных изменений в окисленности ЛНПн не наблюдалось (табл. 1.1). Эти же макрофаги, инкубированные с более окисленными ЛНПг, полученными от людей с гиперхолестеринемией, уже на ранних сроках, вызывали значительное (* - р0,05) падение окисленности ЛНПг (табл. 1.1).
Уровень ТБК-РП в ЛНПн, инкубированных с МФН в условиях аноксии, аналогично аэробным условиям, практически не менялся, а в ЛНПг значительно снижался с 3 по 6 ч инкубации.
1.2. Оценка способности МФН окислять ЛНПн и ЛНПг по изменению электрофоретической подвижности.
В нашем исследовании ЭФП нативных (не инкубированных) ЛНПг была выше ЭФП ЛНПн (137±3 vs 120±13, # - р0,05), что соответствовало литературным данным [Steinberg D and Lewis A, 1997]. Результаты ЭФП ЛНПн и ЛНПг, после их инкубации с МФН представлены в таблице 1.2.
Таблица 1.2. Электрофоретическая подвижность ЛНПн и ЛНПг после их инкубации с МФН в аэробных условиях и условиях аноксии, у.е. (M±m).
Аэробные условия, ч Условия аноксии, ч ЛНП Контроль 1 3 6 1 3 ЛНПн 120±13 157±17* 161±14** 160±12** 142±9* 165±10* 163±15** 137±3# 171±22# 181±10*# ЛНПг 180±11* 147±7 150±7** 157±5* Примечание: см. Примечание к Таблице 1. Как видно из таблицы 1.2, ЭФП ЛНПн при их инкубации с МФН в аэробных условиях значительно возрастала к первому часу и продолжала расти вплоть до 6ч инкубации (* - р0,05;
** - р0,01). Усиление степени модификации ЛНП под воздействием МФН наблюдалось и в случае с ЛНПг, однако, в отличие от ЛНПн, оно начиналось позже - с 3 часа, но носило параллельный с ЛНПн характер.
Изменение аэробных условий инкубации на условия аноксии не приводило к изменению динамики ЭФП ЛНПн, но уменьшало рост ЭФП ЛНПг. На протяжении всех сроков инкубации ЛНПг с МФН, ЭФП ЛНПг была ниже чем ЛНПн, а также ниже, чем степень модификации ЛНПн и ЛНПг в аэробных условиях.
1.3. Оценка способности МФН потреблять ЛНПн и ЛНПг по тесту аккумуляции в МФН общего холестерина.
Оценку поглощения культурой макрофагов ЛНПн и ЛНПг мы оценивали по аккумуляции общего холестерина (ОХ, холестерина и эфиров холестерина) в МФН, оставшихся прикрепленными к дну ячейки после истечения сроков совместной инкубации с ЛНП.
Таблица 1.3. Содержание общего холестерина в МФН после инкубации с ЛНПн и ЛНПг в аэробных условиях и условиях аноксии, нг/103 МФН (M±m).
Аэробные условия, ч Условия аноксии, ч ЛНП Контроль 1 3 6 1 3 ЛНПн 3,1±0,2 7,2±0,4** 10,4±0,9** 10,3±1,2** 11,7±2,9* 9,6±0,02** 10,2±1,5** ЛНПг 3,1±0,2 7,7±0,3** 14,8±0,2**## 92,6±24,9*# 17,5±3,4** ^ 27,9±9,4* 27,6±9,5*^ Примечание: см. Примечание к Таблице 1. Из табл. 1.3 видно, что аккумуляция ОХ значительно возрастала и в ЛНПн, и ЛНПг в аэробных условиях (** - р0,01). В ЛНПг аккумуляция ОХ была еще выше, чем в ЛНПн, причем, значительные различия в способности макрофагов поглощать ЛНПг по сравнению с ЛНПн наблюдались на 3-6 часах аэробной инкубации (табл. 1.3, #-р0,05;
##-р0,01).
Инкубация в условиях аноксии приводила к еще более выраженному поглощению МФН ЛНПг уже на 1 часу инкубации по сравнению с аэробными условиями (табл. 1.3, ^ р0,05). Увеличение сроков аноксии до 6 часов приводило к росту содержания холестерина ЛНПг в макрофагах по сравнению с 1-м часом инкубации. В отличие от ЛНПг инкубация МФН в условиях аноксии не вызывала значительных изменений в способности МФН аккумулировать ОХ, по сравнению с аэробными условиями.
1.4. Оценка жизнеспособности МФН в процессе их совместной инкубации с ЛНПн или ЛНПг.
В наших опытах выраженное накопление макрофагами продуктов ПОЛ и общего холестерина в процессе их совместной инкубации с ЛНПн и ЛНПг, как в аэробных условиях, так и в условиях аноксии, сопровождалось заметной гибелью макрофагов.
Таблица 1.4. Число жизнеспособных МФН в процессе их инкубации с ЛНПн и ЛНПг в аэробных условиях и условиях аноксии, 103 МФН (M±m).
Аэробные условия, ч Условия аноксии, ч ЛНП Контроль 1 3 6 1 3 ЛНПн 355±24 300±18* 252±23* 220±17** 282±26* 254±10** 242±36* 233±9**# 158±2**## 104±4**## 104±20**#^^ 80±27**##^^ 71±24**# ЛНПг 355± Примечание: см. Примечание к Таблице 1. Из табл. 1.4. видно, что в аэробных условиях инкубации культуры макрофагов с ЛНПн выявлялось заметное снижение числа жизнеспособных клеток на протяжении 1-6-го часов инкубации (*- р0,05;
** - р0,01). Использование ЛНПг приводило к значительно более резкому, по сравнению с ЛНПн, снижению числа жизнеспособых макрофагов (# р0,05;
## - р0,01.).
Инкубация в условиях аноксии, аналогично аэробной инкубации, также приводили к уменьшению числа жизнеспособных макрофагов. Однако в опытах с ЛНПн достоверно значимых различий с аэробными условиями не наблюдалось, а в опытах с ЛНПг, начиная с 1-го часа инкубации, наблюдалось как значительно более резкое снижение числа жизнеспособных макрофагов, по сравнению с ЛНПн (# - р0,05), так и с опытами в аэробных условиях (^^-р0,05;
^-р0,05).
Проведенная работа позволила установить, что МФН, способны окислять и потреблять ЛНПн и ЛНПг как в аэробных условиях, так и в условиях аноксии in vitro, что не может не проявляться у больных ИБС в условиях in vivo, способствуя началу образования атеросклеротических бляшек и, как следствие, ухудшению качества жизни, потере трудоспособности и росту смертности населения.
2. Разработка метода предстимуляции и стимуляции МФН с помощью ФНО-, и сравнение их способности окислять ЛНПн in vitro.
Для разработки метода и схемы активации макрофагов in vitro, нами был использован ФНО-. В работе использованы МФН и ЛНПн.
Проведены 2 серии исследований.
В 1-ой серии исследований к МФН добавляли ФНО- в дозе от 0,01 до 10 нг/мл среды, содержащей 106 клеток. МФН с ФНО- инкубировали в течение 10, 30, 60 мин и 3ч.
По окончании заданного срока, среду инкубации вместе с ФНО- меняли на свежую, без ФНО- и добавляли ЛНПН в дозе 150 мкг/мл и ячейки повторно инкубировали в аэробных условиях (СО2 5% + воздух 95%) в течение 3ч. После 3 часов инкубации среду совместно с ЛНПН отбирали в пробирку, центрифугировали, отделяли ЛНПН со средой от осадка на дне пробирки. Окисление ЛНПН определяли по величине ЭФП.
Полученные результаты представлены в табл. 2.1.
Таблица 2.1. Электрофоретическая подвижность ЛНПн после их 3-х часовой инкубации с МФН предварительно активированных различными концентрациями и временем инкубации с ФНО- (% к нативным ЛНП, M±m).
Время Концентрации ФНО-, нг/мл Нативные инкубации ЛНП 0, Контроль 0,5 1,0 5,0 10, МФ с ФНО 10 мин 100±3 108±3 109±6 109±7 109±4* 110±3** 30 мин 100±2 103±5 113±4* 104±2 105±7 100± 60 мин 100±5 106±8 112±5* 104±4 104±12 101± 180 мин 100±3 96±7 104±7 100±4 92±5 98± Примечание:
*,** - уровень значимости различия опытов по сравнению с нативными ЛНП: * - р0,05, ** - р0,01;
Число независимых экспериментов равно Как видно из табл. 2.1 добавление ФНО- к культуре макрофагов и их инкубация в течение 10, 30, 60 и 180 мин в большинстве использованных концентраций ФНО- вела к умеренному (а в отдельных случаях к значительному) росту ЭФП ЛНП, по сравнению с нативными ЛНП. Однако значимых различий с макрофагами, инкубированными в те же сроки без ФНО- (контроль), выявлено не было. Наиболее активной была доза 0,5 нг/мл, особенно при инкубации в течение 30 и 60 мин. Инкубация МФ с ФНО- в течение 3ч, независимо от концентрации ФНО-, не оказывала стимулирующего или оказывала слабый цитотоксический эффект.
Во 2-ой серии исследований для стимуляции макрофагов, наряду с использованием наиболее эффективной концентрации (0,5 нг/мл), применяли еще более низкую концентрацию ФНО-, а именно 0,1 нг/мл среды, а также проводили не только однократное, но и двукратное инкубирование культуры макрофагов с ФНО-, сравнивая влияние на ЛНПН однократной инкубации с двукратной, и оценивая роль возрастающих концентраций ФНО-. (0,1 и 0,5 или 0,5 и 5,0 нг/мл). Инкубацию после однократного введения ФНО- проводили в течение 10 или 30 мин, а после повторного введения - в течение 10 мин, всегда в аэробных условиях.
Критерием активации культуры макрофагов являлся рост ЭФП ЛНП и накопление в ЛНП ТБК-РП.
Из таблицы 2.2 видно, что двукратная инкубация с более высокой, чем при однократной инкубации дозой ФНО-, ведет к усилению способности макрофагов окислять ЛНПН после их последующей 3 часовой инкубации.
Таблица 2.2. Электрофоретическая подвижность ЛНП после 3ч инкубации с МФН, предварительно однократно или двукратно инкубировано, с ФНО- (% к нативным ЛНП, M±m).
Концентрации ФНО-, нг/мл Время Нативные Схема 1 Схема икубации ЛНП 0, Контроль МФ с ФНО- 0,1 0,5 0,1 + 0,5 0,5 5,0 0,5+5. 10 мин 100 116±1** 117±4** 120±2** 129±3** #^ 118±5** 116±4** 116±5* 30 мин 100 110±4* 110±1** 110±3** 108±1** 109±6 109±4 109±3* Примечание:
*,** - уровень значимости различия опытов по сравнению с нативными ЛНП: * - р0,05, ** - р0,01;
# - уровень значимости различия опытов с контролем: # - р0, ^ - уровень значимости различий между опытами с двукратной и однократной инкубацией макрофагов с ФНО- (схема 1): ^ - р0,05.
Число независимых экспериментов равно Видно, что статистически значимый активирующий эффект был получен лишь после 10 мин инкубации с применением концентраций ФНО-, равных 0,1 нг/мл – первичное введение и 0,5 нг/мл (повторное введение) (таб. 2.2, схема 1 - 0,1+0,5, # р0,05), т.е. при применении коротких сроков и более низких, как первичной, так и повторной концентраций ФНО-.
Наряду с ростом ЭФП ЛНП под воздействием дважды инкубированной с ФНО культурой макрофагов (схема 1), также наблюдался значительный рост и ТБК-РП в ЛНП.
Макрофаги, однократно инкубированные с ФНО- в концентрации 0,1 нг/мл в течение мин, заметного увеличение содержания ТБК-РП в ЛНП не вызывали.
Полученные данные, позволяют предпологать, что повторное воздействие низких доз ФНО- на макрофаги не только в условиях in vitro, но и в условиях in vivo, способно предстимулировать или стимулировать клетки, которые вследствие этого, могут более активно, чем нестимулированные макрофаги, окислять и поглощать ЛНП, способствуя началу образования атеросклеротических бляшек. Проверке данного предположения посвящен следующий раздел исследования.
3. Изучение способности МФИБС, окислять и поглощать ЛНПн и ЛНПг в аэробных условиях и в условиях аноксии in vitro.
Нами была использована культура МФИБС. МФИБС были инкубированы с ЛНПн или ЛНПг в количестве 200мкг/мл среды. По аналогии с ранее приведенными данными об инкубации МФН, инкубацию МФИБС проводили течение 1, 3 и 6 часов в аэробных условиях (воздух 95% + СО2 5%) и условиях аноксии (N2 95% + СО2 5%, содержание О2 в смеси газов 0,0012%). Исследования с (ЛНПн) и (ЛНПг) проводили параллельно.
Функциональную активность МФИБС, как и МФН, исследовали по критериям содержания ТБК-РП, ЭФП ЛНП, накоплению в МФ общего холестерина и жизнеспособности МФ.
Данные исследований представлены в таблице 3.1- 3.4.
3.1. Оценка способности МФИБС окислять ЛНПн и ЛНПг по накоплению в них ТБК-РП.
Таблица 3.1. Содержание ТБК-РП в ЛНПн и ЛНПг после их инкубации с МФИБС в аэробных условиях и условиях аноксии, нмоль МДА/мг белка ЛНП (M±m).
Аэробные условия, ч Условия аноксии, ч ЛНП Контроль 1 3 6 1 3 0,45±0,07 0,79±0,03** $ 0,44±0,08 0,34±0,1$$ 0,78±0,17* $$ 0,75±0,15*$^ 0,4±0, ЛНПн 1,18±0,05** ## 0,7±0,08## 0,48±0,12 0,35±0,14** 0,67±0,11 ^^ 0,5±0,18* # 0,69±0,23^^ ЛНПг $$ Примечание: см. Примечание к Таблице 1. Совместная инкубация МФИБС с ЛНПн или ЛНПг в аэробных условиях вызывала значительное увеличение содержания ТБК-РП как в ЛНПн, так и ЛНПг, по сравнению с контролем только на первом часе их совместной инкубации (табл. 3.1, ** - р0,01).
К третьему часу совместной инкубации уровень ТБК-РП как в ЛНПн, так и в ЛНПг значительно снижался по сравнению с первым часом;
снижение продолжалось вплоть до часа инкубации (особенно в ЛНПг, табл. 3.1, ** - р0,01).
В условиях аноксии уровень ТБК-РП в ЛНПн, инкубированных с МФИБС на 1- часах, достоверно возрастал, но снижался почти до исходного уровня к 6 часу их совместной инкубации с МФИБС.
При инкубации ЛНПг с МФИБС в условиях аноксии ТБК-РП существенно не менялись, за исключением снижения на 3 часах инкубации.
3.2. Оценка способности МФИБС окислять ЛНПн и ЛНПг по изменению электрофоретической подвижности.
Таблица 3.2. Электрофоретическая подвижность ЛНПн и ЛНПг после их инкубации с МФИБС в аэробных условиях и условиях аноксии, у.е. (M±m).
Аэробные условия, ч Условия аноксии, ч ЛНП Контроль 1 3 6 1 3 120±13 156±16** 160,5±18** 163±17** 140±13* 145±9* 146±15* ЛНПн 137±3# 170±13* 178±16* 177±16* 147±7 150±7** 157±5*$ ЛНПг Примечание: см. Примечание к Таблице 1. Как видно из табл. 3.2, величина ЭФП ЛНПн в процессе их совместной инкубации с МФИБС и в аэробных условиях, и в условиях аноксии значительно возрастала к первому часу и продолжала постепенно расти вплоть до 6 часов инкубации. Рост ЭФП в условиях аноксии, особенно в опытах с ЛНПг, был выражен слабее, чем в аэробных условиях, однако достоверных различий выявлено не было.
3.3. Оценка способности МФИБС потреблять ЛНПн и ЛНПг по тесту аккумуляции МФИБС общего холестерина.
Таблица 3.3. Содержание общего холестерина в МФИБС после инкубации с ЛНПн и ЛНПг в аэробных условиях и условиях аноксии, нг/103 МФН (M±m).
Аэробные условия, ч Условия аноксии, ч ЛНП Контроль 1 3 6 1 3 5,7±0,2** 11,1±0,9** 13,3±0,1** $ 11,8±2,9* 23,64±3,7**$$^ 23,39±2,9**$$^ ЛНПн 2,3±0, 11,6±1**##$$ 21,1±2**##$$ 14,9±2,9**##$$ 12,1±3,1* 14,5±3,5* 17,5±5,2* ЛНПг 2,3±0, Примечание: см. Примечание к Таблице 1. Из табл. 3.3. видно, что аккумуляция общего холестерина в аэробных условиях значительно возрастала и в ЛНПн, и ЛНПг (** - р0,01). В ЛНПг в первые 1-6 часов она была значимо выше, чем в ЛНПн (табл. 3.3, ## - р0,01).
Инкубация в условиях аноксии также приводила к значительному увеличению аккумуляции общего холестерина на всех сроках инкубации МФИБС, причем рост поглощения ОХ ЛНПн на 3-6 часах инкубации существенно превышал аккумуляцию ОХ в аэробных условиях (табл. 3.3, ^-р0,05). В отличие от ЛНПн, инкубация МФИБС с ЛНПг в условиях аноксии значительных различий в способности МФИБС накапливать ОХ, по сравнению с аэробными условиями, не выявила.
3.4. Оценка жизнеспособности МФИБС в процессе их совместной инкубации с ЛНПн или ЛНПг.
Таблица 3.4. Таблица 1.4. Число жизнеспособных МФИБС в процессе их инкубации с ЛНПн и ЛНПг в аэробных условиях и условиях аноксии, 103 МФН (M±m).
Аэробные условия, ч Условия аноксии, ч ЛНП Контроль 1 3 6 1 3 233±7** 192±15**$$ 179±2**$$ 186±47**^ 133±35**$^ 91±17**$$^^ ЛНПн 379± 155±5**## 115±3**#$ 113±22** 145±37** 99±23** 91±27** ЛНПг 379± Примечание: см. Примечание к Таблице 1. Из табл. 3.4 видно, что инкубация МФИБС с ЛНПн и ЛНПг приводила к значительному снижению числа оставшихся прикрепленными ко дну ячейки (т.е.
жизнеспособных) макрофагов. В аэробных условиях снижение жизнеспособных МФИБС было более выраженным при инкубации с ЛНПг, по сравнению с ЛНПн (#- р0,05, ## р0,01). В условиях аноксии снижение числа жизнеспособных МФИБС, инкубированных с ЛНПН, было выражено резче, чем в аэробных условиях;
при инкубации МФИБС с ЛНПГ различия между числом жизнеспособных клеток при аноксии и в аэробных условиях, а также различия между макрофагами, инкубированными с ЛНПГ и ЛНПН, были недостоверны.
4. Сравнение способности культуры МФИБС и МФН окислять и поглощать ЛНПн и ЛНПг в аэробных условиях и условиях аноксии in vitro.
Сравнение МФН с МФИБС в разных условиях их инкубации проводилось на основе ранее использованных критериев, а именно накопления в ЛНП ТБК-РП, аккумуляции общего холестерина в макрофагах, снижения числа жизнеспособных макрофагов.
Данные представлены в таблицах 4.1 – 4. Таблица 4.1. Сравнение ТБК-РП в ЛНПн и ЛНПг в процессе их инкубации с МФИБС и МФН в аэробных условиях и условиях аноксии, нмоль МДА/мг белка ЛНП (M±m).
Аэробные условия, ч Условия аноксии, ч ЛНП Контроль 1 3 6 1 3 ЛНПн+МФН 0,45±0,07 0,39±0,13 0,40±0,20 0,36±0,18 0,48±0,15 0,43±0,19 0,53±0, ЛНПн+МФИБС 0,45±0,07 0,79±0,03** $ 0,44±0,08 0,34±0,1$$ 0,78±0,17* $$ 0,75±0,15*$^ 0,4±0, 0,70±0,08## 0,73±0,16##^ 0,33±0,06*# ЛНПг+МФН 0,34±0,08* 0,34±0,19* 0,38±0,18* 0,39±0,15* 1,18±0,05** ## ЛНПг+МФИБС 0,7±0,08## 0,48±0,12 0,35±0,14** 0,67±0,11 ^^ 0,5±0,18* # 0,69±0,23^^ $$ Примечание: см. Примечание к Таблице 1. Из табл. 4.1 видно, что рост содержания ТБК-РП в ЛНПн и в ЛНПг как в аэробных условиях, а в опытах с ЛНПН и в условиях аноксии, в ранние сроки (1-2 часы инкубации,$p0,05;
$$ p0,01) наблюдался только в опытах инкубации ЛНП с МФИБС и отсутствовал в опытах с МФН.
Таблица 4.2. Сравнение содержания общего холестерина в МФИБС и МФН в процессе их инкубации с ЛНПн и ЛНПг в аэробных условиях и условиях аноксии, нг/103 МФ (M±m).
Аэробные условия, ч Условия аноксии, ч ЛНП Контроль 1 3 6 1 3 ЛНПн+МФН 0,45±0,07 0,39±0,13 0,40±0,20 0,36±0,18 0,48±0,15 0,43±0,19 0,53±0, ЛНПн+МФИБС 3,1±0,2 7,2±0,4** 10,4±0,9** 10,3±1,2** 11,7±2,9* 9,6±0,02** 10,2±1,5** 0,70±0,08## 0,73±0,16##^ 0,33±0,06*# ЛНПг+МФН 0,34±0,08* 0,34±0,19* 0,38±0,18* 0,39±0,15* ЛНПг+МФИБС 3,1±0,2 7,2±0,4** 10,4±0,9** 10,3±1,2** 11,7±2,9* 9,6±0,02** 10,2±1,5** Примечание: см. Примечание к Таблице 1. Из табл. 4.2 видно, что аккумуляция ОХ на 3-6 часах инкубации ЛНПН как в аэробных условиях, так и при аноксии была значительно больше, чем при инкубации ЛНПН с МФН ($Р 0,05;
$$P0,001), а также чем при инкубации МФИБС с ЛНПГ. Последнее может быть объяснено более выраженным распадом переполненных ОХ МФИБС, что и подтверждается данными, представленными в следующей таблице.
Таблица 4.3. Сравнение числа жизнеспособных МФИБС и МФН в процессе их инкубации с ЛНПн и ЛНПг в аэробных условиях и условиях аноксии, 103 МФ (M±m).
Аэробные условия, ч Условия аноксии, ч ЛНП Контроль 1 3 6 1 3 ЛНПн+МФН 355±24 300±18* 252±23* 220±17** 282±26* 254±10** 242±36* 233±7** 192±15**$$ 179±2**$$ 186±47**^ 133±35**$^ 91±17**$$^^ ЛНПн+МФИБС 379± 233±9**# 158±2**## 104±4**## 104±20**#^^ 80±27**##^^ 71±24**# ЛНПг+МФН 355± 155±5**## 115±3**#$ 113±22** 145±37** 99±23** 91±27** ЛНПг+МФИБС 379± Примечание: см. Примечание к Таблице 1. Из табл. 4.3 видно, что жизнеспособность МФИБС, инкубированных с ЛНПн и, особенно, с ЛНПг, снижалась во время первых 3 – 6 часов сильней, чем жизнеспособность МФН,($P0,05;
$$P0,01).
Приведенные данные свидетельствуют о том, что МФИБС обладают более сильным окислительным эффектом на ЛНПн и ЛНПг, более ранней и более сильной способностью аккумулировать общий холестерин, поглощая ЛНПн и ЛНПг, более ранней и более выраженной потерей жизнеспособности, по сравнению с МФН.
Из приведенных в данной работе результатов так же очевидно, что усилению функциональной активности в условиях аноксии больше подвергались МФИБС, чем МФН, последние лишь при условии их инкубации с ЛНПг.
Важно подчеркнуть, что условия аноксии, моделируемые в процессе инкубация культуры МФ+ЛНП in vitro, были близки к условиям, возникающим в сосудистой стенке в процессе сосудистого спазма, частичного тромбирования или стенозирования просвета сосуда, то есть они имитировали состояние локальной ишемии, реально возникающей в условиях ИБС и сердечной недостаточности.
Выводы 1. Показано, что МФН, способны окислять и потреблять ЛНПн и ЛНПг как в аэробных условиях, так и в условиях аноксии, причем способность к потреблению ЛНП и потеря жизнеспособности макрофагов в процессе инкубации значительно резче выражены в опытах с ЛНПг, чем с ЛНПн.
2. Разработан метод предстимуляции и стимуляции МФН, in vitro с помощью однократного (предстимуляция) и двукратного (стимуляция) введений низких доз ФНО (0,1 и 0,5 нг/мл) в среду инкубации и доказано, что стимулированные in vitro макрофаги окисляют ЛНПн значительно сильнее, чем нестимулированные.
3. Показано, что МФИБС, обладают выраженной способностью окислять и потреблять ЛНПн и, особенно, ЛНПг, как в аэробных условиях, так и при аноксии, а также подвергаться резкой и ранней гибели в процессе инкубации с ЛНПн и ЛНПГ in vitro.
4. МФН и МФИБС вызывали более сильное окисление и потребление ЛНПН и ЛНПГ, причем оба процесса, а также гибель МФИБС были резче выражены при их инкубации с ЛНПг, чем с ЛНПн и при инкубации в условиях аноксии, чем в аэробных условиях.
5. Полученные данные свидетельствуют о том, что у больных ИБС возникает предстимуляции или стимуляции моноцитов-макрофагов в условиях in vivo, что делает больных ИБС предрасположенными к раннему возникновению или прогрессированию локального или генерализованного атеросклероза.
6. На основе культуры МФИБС разработана экспресс-модель для прогнозирования тяжести ишемических повреждений, выявления предрасположенности больного к атеросклерозу, индивидуального подбора антиатеросклеротической терапии, скринингу и предклиническим испытаниям новых лекарственных средств.
Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:
1. Биленко М.В., Хильченко А.В., Павлова А.С., Анфалова И.А. Защитный эффект антиоксидантов на повреждение эндотелиальных клеток и окисление липопротеинов низкой плотности при их совместной инкубации в аэробных условиях, условиях ишемии или ишемии с добавление макрофагов в реперфузионном периоде. // Материалы VI Международная конференция «Биоантиоксидант», Москва, 16 - апреля, 2002- с. 668-669.
2. Хильченко А.В., Павлова А.С., Биленко М.В. Способность макрофагов, взятых от здоровых доноров и больных ишемической болезнью сердца, окислительно модифицировать липопротеины низкой плотности и защитный эффект антиоксидантов и антигипоксантов. // Материалы VI Международная конференция «Биоантиоксидант», Москва, 16 - 19 апреля, 2002.- с. 597-599.
3. Павлова А.С., Хильченко А.В., Биленко М.В. Устойчивость макрофагов, взятых от здоровых доноров и больных ишемической болезнью сердца, к цитотоксическому действию липопротеинов низкой плотности и защитный эффект антиоксидантов и антигипоксантов. // Материалы VI Международная конференция «Биоантиоксидант», Москва, 16 - 19 апреля, 2002. - с. 439-440.
4. Bilenko M.V., Khilchenko A.V. Free radical inhibitors (FRI) can prevent cell-mediated LDL oxidation under ischaemia and reperfusion of vascular wall in situ. // Abstract. 22nd European Section Meeting of the International Society for Heart Research,Szeged Hungary, 3 – 6 July, 2002.- J.Mol.Cell Cardiol.- 2002- V 34, 6.- P. A10.
5. Биленко М.В., Хильченко А.В. Роль эндотелиальных клеток и макрофагов в окислительной модификации липопротеидов? низкой плотности в условиях ишемии и реперфузии сосудистой стенки и защитный эффект антиоксидантов. // Материалы III го Съезда биохимического общества, Санкт – Петербург, 26 июня – 1июля, 2002.-с.
139 - 140.
6. Bilenko M.V., Khilchenko A.V. Ischemia- and TNF-–induced priming of blood macrophages increases their ability to oxidatively modify circulating LDL in aerobic and ischemic conditions // Abstract. Europen Atherosclerosis Society 73 rd EAS congress.
Supplement, Salzdurg, Austria, July 7-10, 2002. -049- P. 75.
7. Биленко М.В., Хильченко А.В., Шмитько Н.А. Свободно-радикальный механизм участия макрофагов (МФ) в окислении липопротеинов низкой плотности (ЛНП) в условиях ишемии (И) и реперфузии (Р) сосудистой стенки;
защитный эффект антиоксидантов (АО). // Материалы 5-го Конгресса "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии", Москва,12-14 ноября, 2002 Т.2.-C.21.
8. Биленко М.В., Хильченко А.В. Участие неактивированных, предактивированных и активированных макрофагов (МФ) в окислении ЛНП;
роль антиоксидантов (АО) в профилактике и лечение атеросклероза. // Материалы международной конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека».
Смоленск, 22-25 сентября, 2003.- с. 55;
9. Биленко М.В., Хильченко А.В., Шмитько Н.А. Способность низких доз ФНО предактивировать и активировать макрофаги, повышая их способность к продукции активных форм кислорода и окислению липопротеинов низкой плотности. // Бюл.Экс.Биол.Мед.-2003.- Т.135, №4. - с. 410-413.
10. Биленко М.В., Хильченко А.В., Коновалова Г.Г., Ланкин В.З. Влияние антиоксиданта пробукола на клеточно-опосредованное окисление липопротеидов низкой плотности in vitro и in vivo. // Бюл.Экс.Биол.Мед.- 2003.- Т.136, №8. - с. 142 145.
11. M. V. Bilenko, A. V. Khilchenko. The role of TNF- – and ischaemia – induced priming and activation of macrophages in their ability to oxidatively modify LDL. // Abstract. Meeting ISHR, Dresden, Germany, 2004.- J.Mol.Cell Cardiol.-2004.- 36(5). - p. 715-716.
12. Bilenko M.V., Khilchenko A.V., Nikitina N.A. The ability ofr macrophages from the blood of patients with ischemic heat diseise and healthy donors for LDL oxidation and uptake. // Abstract. XVIII World Congress of ISHR, Brisbane, Australia, 2004- J.Mol.Cell Cardiol.- 2004.- 37(1), B105. - p. 242-243.
13. Биленко М.В., Хильченко А.В., Никитина Н.А. Активация макрофагов в крови больных ишемической болезнью сердца (ИБС) и их способность более активно окислять и поглощать липопротеины низкой плотности (ЛНП), по сравнению с макрофагами из крови здоровых доноров. //Материалы конференции «Дизрегуляционная патология органов и систем, Москва, 9– 12 октября, 2004.-с.135.
14. Биленко М.В., Хильченко А.В., Павлова С.А. Применение антиоксидантов и антигипоксантов для снижения окисления ЛНП под влиянием макрофагов и эндотелиальных клеток в условиях ишемии и реперфузии сосудистой стенки. // Биомедицинская Химия.- 2004.- т.49 № 6. - с. 554-565.