Биологические особенности и биохимический состав ксилотрофных базидиомицетов fomitopsis officinalis (vill.: fr.) bond. et sing., ganoderma applanatum (pers.) pat. и trametes versicolor (l.:fr.) pilat
На правах рукописи
КОВАЛЕВА Гульмира Кажгалиевна БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И БИОХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ FOMITOPSIS OFFICINALIS (VILL.: FR.) BOND. ET SING., GANODERMA APPLANATUM (PERS.) PAT.
И TRAMETES VERSICOLOR (L.:FR.) PILAT Специальность 03.00.24 – микология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2009
Работа выполнена в ГОУ ВПО «Сибирский государственный технологиче ский университет» на кафедре химической технологии древесины и биотехнологии
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Громовых Татьяна Ильинична
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Гарибова Лидия Васильевна кандидат биологических наук Горшина Елена Сергеевна
Ведущая организация: Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН, Красноярск
Защита состоится « 10 » апреля 2009 г. в 15 час. 30 мин. на заседании диссертаци онного совета Д 501.001.46 при Московском государственном университете им. М.В.
Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносо ва, Биологический факультет, ауд. М-1;
тел./факс (495) 939-39-70.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Мос ковского государственного университета им. М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан «_» 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук М.А. Гусаковская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Одним из приоритетных направлений развития совре менных микологии и биотехнологии является разработка технологий с использовани ем базидиальных грибов для получения биологически активных соединений. Благо даря исследованиям последних десятилетий, стало известно, что базидиальные грибы являются продуцентами целого ряда биологически активных веществ: белков, липи дов, полисахаридов, органических кислот, ферментов, витаминов и др. Многие из этих соединений являются фармакологически активными и, по сравнению с продук тами химического синтеза, менее токсичны и более эффективны при применении в медицинской практике. Большинство работ по поиску и выделению биологически ак тивных веществ базидиомицетов проведены с использованием плодовых тел (Беккер, 1988;
Белова, 2004;
Гарибова, 2003;
2005;
2008;
Феофилова, 2002;
Шиврина и др., 1969;
Reshetnicov et.al., 2001;
Sliva, 2006). Известно, что биологически активные ве щества высших грибов содержатся не только в базидиомах, но и в вегетативном ми целии гриба, получаемом путем жидкофазного и твердофазного культивирования (Автономова и др., 2006, Краснопольская и др., 2007;
Сидоренко, 2007). Важным пре имуществом получения биомассы мицелия с помощью биотехнологических методов являются экологическая чистота получаемых препаратов, возможность создания про изводства и доступность сырьевых ресурсов.
Несмотря на то, что общий объем публикаций, посвященный базидиомицетам, чрезвычайно велик, мало работ по исследованию биологической активности плодо вых тел в сравнении с биологической активностью вегетативного мицелия. Кроме то го, немногочисленны сведения о химическом составе и бактерицидных свойствах плодовых тел и мицелия многих дереворазрушающих грибов, в том числе представи телей из родов Fomitopsis, Ganoderma и Trametes.
Поиск и выделение новых штаммов, выделенных в Сибири и других восточных регионах, открывает перспективы пополнения коллекций и дает возможность их ис пользования в биотехнологии.
Цели и задачи исследования. Цель работы – изучение биологических особен ностей и биохимического состава мицелия и плодовых тел ксилотрофных базидиоми цетов Fomitopsis officinalis, Ganoderma applanatum и Trametes versicolor и разработка условий культивирования мицелия. В связи с целью были поставлены следующие за дачи:
- создание коллекции культур ксилотрофных базидиомицетов и проведение скрининга штаммов;
- определение диапазона изменчивости штаммов F. officinalis, G. applanatum и T. versicolor по морфолого-культуральным признакам и показателям роста при раз личных условиях культивирования;
- проведение сравнительной оценки биохимического состава вегетативного ми целия и плодовых тел базидиомицетов;
- изучение динамики накопления биомассы мицелия при поверхностном жид кофазном культивировании;
- изучение токсичности и зоопатогенности в отношении теплокровных живот ных;
- изучение антимикробной активности метаболитов и экстрактов из мицелия и плодовых тел в отношении условно-патогенных микроорганизмов;
- изучение противоопухолевой активности экстрактов мицелия и плодовых тел изучаемых штаммов;
- изучение возможности использования растительных отходов сельскохозяйст венного и лесоперерабатывающего производства для выращивания мицелия штам мов.
Научная новизна.
1) Впервые проведен сравнительный анализ биохимического состава мицелия штаммов, выделенных из плодовых тел базидиомицетов Средней Сибири и Респуб лика Тыва. Показано, что мицелий базидиомицетов Fomitopsis officinalis, Ganoderma applanatum и Trametes versicolor может быть использован для получения биологиче ски активных соединений. В мицелии Fomitopsis officinalis идентифицировано биоло гически активное соединение агарициновая кислота.
2) Проведена оценка продуктивности штаммов Fomitopsis officinalis, Gano derma applanatum и Trametes versicolor и показана возможность твердофазного куль тивирования изучаемых штаммов базидиомицетов на отходах лесоперерабатываю щих и гидролизных производств.
3) Изучена антимикробная и противоопухолевая активность экстрактов плодо вых тел и мицелия отобранных штаммов базидиомицетов в отношении клеток асцит ной карциномы Эрлиха.
Практическая значимость работы. Создана коллекция штаммов базидиаль ных грибов Fomitopsis officinalis, Ganoderma applanatum и Trametes versicolor, которая может быть использована в работе по скринингу продуцентов для биотехнологиче ских производств, перспективные штаммы Fomitopsis officinalis штамм Tyv-2006 и Ganoderma applanatum штамм G.a.-04 депонированы в ВКПМ. Разработаны опти мальные условия и среды для жидкофазного и твердофазного культивирования мице лия базидиомицетов. Полученные данные можно использовать для разработки лабо раторных регламентов культивирования мицелия перспективных штаммов Fomitopsis officinalis, Ganoderma applanatum и Trametes versicolor.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на Меж дународной школе-конференции «Генетика и селекция микроорганизмов (Москва Пущино, 2006);
II Международной научно-технической конференции молодых уче ных «Актуальные проблемы технологии живых систем» (Владивосток, 2007);
IV съезде биотехнологов России (Пущино, 2006);
Всероссийской конференции аспиран тов и студентов по приоритетному направлению «Рациональное природопользова ние» (Ярославль, 2006г.);
Всероссийской научно-практической конференции «Лесной и химический комплекс. Проблемы и решения» (Красноярск, 2006, 2008);
городской научно-практической конференции «Развитие инновационной деятельности в про мышленном комплексе города Красноярска», (Красноярск, 2007 г.);
семинаре кафед ры микологии и альгологии МГУ (Москва, 2008);
семинаре кафедры химия пищи и биотехнологии Московского государственного университета прикладной биотехно логии (Москва, 2008);
семинаре проблемной лаборатории Сибирского государствен ного технологического университета (Красноярск, 2008);
Всероссийской конферен ции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции», Пятигорск, 2009. Диссертация апробирована на заседании кафедры микологии и аль гологии биологического факультета МГУ 3 сентября 2008 г.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, заклю чения, выводов, списка литературы и приложения. Список литературы включает работ, в т.ч. 89 на иностранных языках. Общий объем диссертации 171 страница (ос новной текст – 160 страниц, приложение 11 страниц). Диссертация включает 28 ри сунков и 26 таблиц.
Публикации. Материалы диссертации изложены в 11 публикациях (из них статьи в журналах, рекомендованных ВАК). Экспериментальные данные, представ ленные в диссертации, получены лично соискателем и опубликованы в соавторстве с руководителями и сотрудниками, работавшими совместно с автором в процессе вы полнения исследований.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обоснована актуальность проблемы, сформулированы цели и за дачи исследований, показана научная новизна и практическая ценность результатов работы.
В первой главе представлен анализ и обобщение литературы по экологиче ским группам и географическому распространению ксилотрофных базидиомицетов Fomitopsis officinalis, Ganoderma applanatum и Trametes versicolor, а также даны со временные сведения об их систематическом положении в царстве Fungi. Проведен литературный анализ по условиям культивирования базидиомицетов, описаны пре имущества и недостатки твердофазного и жидкофазного культивирования с целью массового получения биологически активного вегетативного мицелия. Представлен обзор публикаций, посвященный мировому опыту практического использования афиллофоровых базидиомицетов, как продуцентов биологически активных веществ.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ При выполнении работы объектами исследования служили базидиомицетовые грибы: трутовик лекарственный (лиственничная губка) – Fomitopsis officinalis (Vill.:
Fr.) Bond. et Sing., плоский трутовик – Ganoderma applanatum (Pers.) Pat. и трутовик разноцветный – Trametes versicolor (L.:Fr.) Pilat. Для выделения изолятов Fomitopsis officinalis и Trametes versicolor проводили сбор плодовых тел из пораженной древеси ны в лиственничных лесах Республики Тыва. Изоляты G. applanatum выделяли из плодовых тел, собранных в различных лесорастительных зонах Красноярского края.
Выделение грибных штаммов в культуру проводили двумя методами: споровым и тканевым. Споры суспендировали в стерильной воде и высевали в чашки Петри на сусловый агар с добавлением молочной кислоты (4%), сусловый агар с добавлением и 3% лиственничных опилок и картофельно-декстрозный агар. После 1-3 суток куль тивирования наблюдали с помощью микроскопа при увеличении в 100 раз проросшие споры и формирование микроколоний. Через 5-7 суток отдельные грибные колонии образовавшиеся, как правило, из нескольких проросших спор, отсевали в пробирки со скошенным сусловым агаром.
Тканевым методом выделение культур проводили из фрагмента гименофора плодового тела или тяжа мицелия из поражённой древесины, которые помещали в центр чашки Петри на поверхность агаризованной среды – сусловый агар с добавле нием молочной кислоты (4%), сусловый агар с добавлением 1 и 3% лиственничных опилок и картофельно-декстрозный агар;
через 3-7 суток роста мицелий отсевали в пробирки.
Очистку грибных культур от сопутствующей бактериальной микрофлоры про водили путем посева мицелиальной культуры на агаризованные питательные среды с добавлением 4% молочной кислоты. После чего проводили микрокопирование для оценки возможного роста бактерий.
Культурально-морфологические признаки исследуемых штаммов изучали на различных агаризованных питательных средах (сусловый агар, сусловый агар с до бавлением 1 и 3 % лиственничных опилок, картофельно-декстрозный агар и грибной агар). Учет результатов проводили в течение всего срока наблюдения по следующим показателям: диаметр разрастания колоний, текстура и форма колоний, пигментация мицелия, плотность и высота воздушного мицелия, суточная линейная скорость рос та, ростовой коэффициент. Отбор продуктивных штаммов проводили по показателям ростового коэффициента на исследуемых питательных средах.
Изучение микроморфологических признаков штаммов проводили в камерах Ван-Тигема с использованием световой микроскопии при помощи светового микро скопа марки LW Scientific (США). Определяли наличие долипоровой септы в клеточ ной перегородке. Микроморфологию ядер изучали с использованием люминисцент ной микроскопии, для чего 7, 14 и 21-суточный мицелий фиксировали на покровном стекле в модифицированном растворе Карнуа с последующим окрашиванием реакти вом ДАПИ (4',6-диамидино-2-фенилиндол, SIGMA) в концентрации 500 нг/мл (Ota et al., 1998);
в работе использовали микроскоп Axioskop 40 FL, фильтр 02 (Zeiss).
Для изучения микроморфологии бластоконидий использовали сканирующую электронную микроскопию. Агаровые блоки с наросшим 7, 14 и 21-суточным мице лием фиксировали в парах осмия. После высушивания образцы закрепляли, напыляли смесь платины и палладия (IB-3 Ion Coater) и просматривали с помощью сканирую щего электронного микроскопа «Hitachi» S-405A лаборатории электронной микро скопии МГУ им. М.В. Ломоносова, за что автор выражает благодарность доктору биологических наук кафедры микологии и альгологии МГУ им. М.В. Ломоносова О.В. Камзолкиной.
Видовую принадлежность определяли на основании морфологических призна ков плодовых тел, описывавшихся при сборе грибов, спор и морфолого культуральных признаков (тип колоний, характер роста, цвет мицелия, запах, наличие экзопигмента). Результаты всех исследований были сопоставлены с данными опреде лителей (Stalpers, 1978;
Бондарцева, 1998).
Рост мицелия штаммов изучали при различных значениях температуры (20,0, 25.0, 30.0, 35.0 и 40 °С) и рН (от 3.5 до 7.5) и определяли оптимальные параметры для каждого штамма. Изучение динамики накопления биомассы штаммами базидиомице тов проводили путем поверхностного жидкофазного культивирования на пивном не охмеленном сусле (4°Б) при температуре 25±1 °С. Накопление биомассы оценивали весовым методом на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 и 40-е сутки культивирования. Для гриба F. оfficinalis использовали модифицированную питательную среду пивное сусло с до полнительным внесением 1% лиственничных опилок.
Изучение биохимического состава мицелия и плодовых тел базидиомицетов проводили по классическим методам. Экстрактивные вещества, получали путем хо лодной, горячей и исчерпывающей экстракции дистиллированной водой мицелия (возраста 15, 20 и 30 суток) и плодовых тел (Ушанова и др., 2004). Общее количество белка определяли по Г.А. Бузуну (Бузун и др., 1982);
качественный состав аминокис лот – с помощью автоматического аминокислотного анализатора типа ААА 339М (Microtechna, Чехия);
количество легко- и трудногидролизуемых углеводов – по ме тоду Кизеля и Семигановского (Рязанова и др., 1996;
Ушанова и др., 2004). Содержа ние липидов с их последующим разделением на нейтральные, глико - и фосфолипиды – по методу Блайя и Дайера (Кейтс, 1975). Агарициновую кислоту в мицелии опреде ляли методом УФ-спектроскопии, разработанным М.В. Гаврилиным с соавторами (2006). Экстракцию агарициновой кислоты из мицелия проводили в смеси хлоро форм-этанол 1:2. Идентификацию агарициновой кислоты проводили на хроматограм ме с использованием хроматографических пластинок "Сорбфил ПТСХ-А-УФ ". В ка честве контроля использовали стандартный образец SIGMA ALDRICH. Количество золы определяли путем сжигания пробы в муфельной печи (Плешков, 1976;
Рязанова, 1996);
состав минеральных компонентов золы исследовали спектральным методом на спектрометре рентгеновском сканирующем кристалл-дифракционном «Спектроскан» (производство Чехия). Определение массовой доли витаминов в мицелии исследуе мых базидиомицетов проводили хроматографическим методом на анализаторе жид кости «Флюорат-02» (Битуева и др., 2006).
Изучение химического состава культуральной жидкости, содержащей продук ты метаболизма гриба F. officinalis, проводили методом хромато-масс-спектрометрии на газожидкостном хроматографе «Aglent Technologies» модель 6890N фирмы «Хью летт-Паккарт» (США) с масс-селективным детектором «Aglent Technologies» модель 5973.
Твердофазное культивирование проводили на различных растительных суб стратах: коре и древесной зелени пихты, лиственничных опилках, гидролизном лиг нине и зерне пшеницы. Оценку роста изучаемых штаммов проводили по показателям среднесуточная скорость роста и характер формирования воздушного мицелия.
Изучение зоопатогенности экстрактов мицелия и плодовых тел изучаемых штаммов базидиомицетов проводили на кроликах по общепринятым методикам. Изу чение токсичности водных экстрактов и метаболитов проводили на белых нелиней ных мышах обоего пола (Краснюк, 2006;
Яковлев, 2002).
Антимикробную активность культуральных жидкостей штаммов, содержащих продукты метаболизма, и водных экстрактов из мицелия и плодовых тел базидиоми цетов изучали методом лунок (Егоров, 1994;
1995;
Бурмистрова, 2002). В качестве тест-культур использовали штаммы грамположительных и грамотрицательных ус ловно-патогенных микроорганизмов Staphylococcus aureus, S. cohnii, S. epidermidis, S. warneri, S. haemolyticus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli k 12, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes и Citrobacter freundii, а также дрожжеподобного гриба Candida albicans.
Оценку противоопухолевой активности водных экстрактов из мицелия и пло довых тел исследуемых базидиомицетов проводили in vitro и in vivo на асцитной кар циноме Эрлиха (АКЭ). Цитопатический эффект водных экстрактов in vitro оценивали через 20, 60, 120 и 180 минут инкубирования опухолевых клеток в среде 199 по их физиологическому состоянию с окрашиванием 1 % раствором метиленовой сини.
Изучение противоопухолевой активности экстрактов in vivo проводили на белых мы шах аутбредной популяции ICR одного пола в возрасте 3 месяцев. Противоопухоле вый эффект in vivo оценивали по продолжительности жизни животных, объему опу холи и количеству опухолевых клеток в организме животных.
Все результаты исследований обрабатывали статистически, используя пакет программ Statistica 6.0.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ШТАММОВ АФИЛЛОФОРОИДНЫХ ГРИБОВ FOMITOPSIS OFFICINALIS, GANODERMA APPLANATUM И TRAMETES VERSICOLOR Морфологические и культуральные характеристики штаммов В период с 2002 по 2006 гг. исследования были направлены на получение изо лятов из плодовых тел (2-х и 3-х летнего возраста) Fomitopsis officinalis, Trametes ver sicolor и Ganoderma applanatum. Общее количество выделенных и отобранных для анализа штаммов F. officinalis составило – 15 (пять из которых выделено из тяжей мицелия поврежденной древесины лиственницы), G. applanatum – 10 и Trametes versi color – 11 (в том числе использовали штамм В 18/91Trametes versicolor, выделенный из плодового тела в 1999 г. и любезно предоставленный к.б.н., доц. Н.В. Пашеновой).
Изучение культурально-морфологических признаков штаммов, получение пло довых тел в искусственных условиях, наличие долипоровой септы в клеточной пере городке, а также сопоставление результатов сканирующей электронной микроско пии выделенных мицелиальных культур с коллекционными штаммами доказывает, что выделенные из плодовых тел мицеллиальные культуры являются представите лями видов F. officinalis, Trametes versicolor и G. applanatum, соответственно (Бон дарцев, 1953;
Бондарцева, 1998;
Сафонов, 2000;
Ainsworth and Bisby’s dictionary of the fungi, 2001).
Культивирование грибов F. officinalis, Trametes versicolor и G. applanatum пока зало, что штаммы способны расти на сусло-агаре, но с разной скоростью и характе ром формирования воздушного мицелия и специализированных структур.
Анализ культурально-морфологических признаков изолятов Fomitopsis offici nalis показал наличие групп штаммов, имеющих различные показатели. Так штам мы, выделенные из тяжей мицелия, имели более низкий ростовой коэффициент (от 15,45 до 18,30) и среднесуточную скорость роста (от 0,75 до 0,85) на питательной среде сусло-агар. Способность к образованию бластоконидий была невысокой и со ставляла на 30-е сутки культивирования 6,0±0,40х107 штук на см2. Из 10 штаммов, выделенных из плодовых тел 2-х и 3-х летнего возраста, 3 имели ростовой коэффи циент от 24,45 до 25,60 (различия недостоверны), и среднесуточную скорость роста от 0,90 до 0,96;
титр бластоконидий был высоким на 30-е сутки и составлял 5,60±0,80х109 штук на см2. Семь штаммов имели ростовой коэффициент от 20,60 до 22,55 (различия недостоверны), а среднесуточная скорость роста составляла 0,65.
Титр бластоконидий на 30-е сутки культивирования составлял 7,50±0,80х108 штук на см2.
Штаммы F. officinalis формируют обильный, густой, септированный, поли морфный воздушный мицелий белого цвета с многочисленными пряжками одиноч ного, реже медальонообразного типа, размер гиф от 0.5-1.2 до3.5-5.8 мкм. Хлами доспоры и склероции не образуют. На основе показателей скорости роста, расчета ростового коэффициента и способности к образованию плодовых тел и бластокони дий отобран штамм Tyv-2006 F. officinalis (ВКПМ-968) (рисунок 1 ).
А Б Г В Рисунок 1 – Морфология мицелия штамма Tyv-2006 Fomitopsis officinalis.
Стрелками указаны: А – пряжки одиночного типа, Б и В – бластоконидии на кони диеносцах;
Г – дикариотический мицелий Изучение культуральных признаков G. applanatum показало, что изоляты, выде ленные как из плодовых тел как 2-х летнего, так и 3-х летнего возраста, делятся также на две группы: имеющие ростовой коэффициент 28,60 и среднесуточную скорость роста от 0,95 и 31,50 и среднесуточную скорость роста 1,18 (различия этих показате лей достоверны). Штаммы G. applanatum образуют разветвленный, септированный толстостенный мицелий, с многочисленными пряжками одиночного типа. Генеративные гифы бесцветные, изредка буроватые. На 20-е сутки культивирования на сусло-агаре формируют коралловидный плотный мицелий (рисунок 2). По способности к формиро ванию плодовых тел штаммы различались: штаммы, имеющие ростовой коэффициент 31,50, формировали плодовые тела на 35-е сутки культивирования, а штаммы с рос товым коэффициентом 28,60 – на 45-е сутки. Для дальнейших исследований был ото бран штамм G.a.-04 G. applanatum (ВКПМ-983).
А Б В Г Рисунок 2 – Морфология мицелия штамма G. a.-04 Ganoderma applanatum.
Стрелками указаны: А – пряжки, Б – коралловидный мицелий;
В – дикариотический мицелий;
Г – тонкий мицелий Наиболее высокими показателями ростового коэффициента отличались штаммы T. versicolor. Штаммы, выделенные из плодовых тел 2-х и 3-х летнего возраста также были выделены в две группы: имеющие ростовой коэффициент на сусло-агаре от 85,60 до 94,50 и среднесуточную скорость роста 3, 25 – 3,85, штаммы, имеющие бо лее низкие показатели ростового коэффициента (78,80-82,50) и среднесуточную ско рость роста 2,80 – 3,5). Но наибольший ростовой коэффициент (103,40) на сусло-агаре отмечен у штамма В18/91 T. versicolor, выделенного в 1999 г. Среднесуточная ско рость роста этого штамма составляла 4,93, а ростовой коэффициент 103, что, вероят но, связано с многолетним поддержанием штамма в лабораторных условиях в актив ном состоянии. Все штаммы T. versicolor хорошо культивируется на агаризованных питательных средах с образованием густого разветвленного, септированного мице лия, с многочисленными пряжками одиночного типа. Вегетативное спороношение не выявлено. Для дальнейших исследований был использован штамм В18/91 T. versicolor (рисунок 3).
А Б В Г Д Е Рисунок 3 - Морфология мицелия штамма В 18/91 Trametes versicolor. Стрел ками указаны: А – мицелий разной толщины с пряжками;
Б – пряжка и утолщение клетки мицелия;
В – вздутия в районе септ;
Г – скелетный мицелий с толстыми кле точными стенками;
Д – дикарион;
Е – дикариотический мицелий Оценка динамики роста мицелия изучаемых штаммов на агаризованных пита тельных средах показала, что максимальная колонизация субстратов достигается в различный период. Наилучшими агаризованными питательными средами, по показа телям среднесуточной скорости роста и ростовому коэффициенту для культивирова ния Fomitopsis officinalis и Ganoderma applanatum являются сусловый агар и сусловый агар с добавлением 1% лиственничных опилок (таблица 1).
Таким образом, на основании показателей ростового коэффициента и среднесу точной скорости роста на всех питательных средах к быстро растущим был отнесен В 18/91 T. versicolor, тогда как штаммы Tyv-2006 F. оfficinalis и G.a.-04 G. ap planatum – к медленно растущим. Для накопления биомассы для штаммов Tyv- F. оfficinalis и G.a.-04 G. applanatum следует использовать сусло с добавлением 1% лиственничных опилок, а для штамма 18/91 T. versicolor питательную среду, содер жащую крахмал и декстрозу.
Таблица 1 – Ростовые показатели изучаемых штаммов базидиомицетов на ага ризованных питательных средах Fomitopsis Ganoderma Trametes Питательная среда officinalis applanatum versicolor Сусловый агар (СА) 0,94 1,18 4, 25,60 31,50 103, СА+1% лиственничных 1,06 2,11 1, опилок 46,50 44,11 124, СА+3% лиственничных 0,69 1,08 1, опилок 11,50 16,41 86, Грибной агар 0,49 0,82 2, 10,30 1,31 62, Картофельно- 0,34 0,49 5, декстрозный агар 2,10 7,40 102, Примечание: в числителе – показатель среднесуточной скорости роста штамма, в знаменателе – ростовой коэффициент Исследования влияния температуры на скорость роста штаммов показали, что для штамма Tyv-2006 F. оfficinalis наиболее оптимальной является температура 25- о С, тогда как для роста мицелия штаммов G. applanatum и T. versicolor – 15-25 оС.
Гриб F. оfficinalis начал осваивать субстрат на сусловом агаре лишь при +25 оС, тогда как при росте на сусловом агаре с добавлением 1% лиственничных опилок – при о С. Незначительный рост при самой низкой исследуемой температуре (+5 оС), был зафиксирован у гриба T. versicolor.
Следует отметить, что при понижении температуры культивирования до +15 оС изменялась морфология колонии штаммов G. applanatum и T. versicolor: воздушный мицелий становился рыхлым, паутинистым. Вместе с тем, более высокий (низкий) уровень среднесуточной скорости роста и ростового коэффициента изучаемых штам мов по отношению друг другу, имеет тенденцию сохраняться при всех температурах культивирования. Наиболее четко это прослеживается для штамма В 18/91 T. versi color. Исследования показали, что по отношению к температуре роста штамм Tyv 2006 F. оfficinalis, является стенотермным, а штаммы G.a.-04 G. applanatum и В 18/ T. versicolor эвритермными.
Исследование показали, что гриб T. versicolor способен расти в широком диа пазоне значений рН питательной среды – от 3,5 до 7,5. Однако максимальные значе ния среднесуточной скорости роста 4,95, 4,80 и 4,55 мм для штамма В 18/91 отмечены на среде со значениями рН 5,5, 6,0 и 6,5. Максимальные значения скорости роста ми целия штаммов Tyv-2006 F. оfficinalis и G.a.-04 G. applanatum отмечены в диапазоне значений рН среды от 5,5 до 6,5 мм. Рост не наблюдается при значением рН 3,5 и ни же, а для штамма F. оfficinalis и при 7,5.
Динамика накопления биомассы штаммами Интенсивность развития грибов достоверно можно оценить по накоплению биомассы мицелия при выращивании на жидких питательных средах, т.к. на агаризо ванных питательных средах при равном диаметре колонии значительно отличаются по плотности и высоте. Как показали исследования, при поверхностном культивиро вании на жидкой питательной среде неохмеленное сусло, которая была использована для сравнительной характеристики штаммов, наибольшее накопление биомассы на блюдалось у штамма В 18/91 T. versicolor, что подтверждает его высокие ростовые характеристики (средний РК = 100).Так максимальное количество биомассы у штам ма В 18/91 T. versicolor на 20 и 30-е сутки культивирования составило 21,70±0,28 и 23,01±0,54 г/л, тогда как у базидиомицетов G. аpplanatum и F. оfficinalis – 15,95±0, и 4,84±0,11 г/л, соответственно (рисунок 4).
F. officinalis С у х а я б и ом а сса, г/ л (листв. опилки) F. officinalis G. applanatum T. versicolor 0 5 10 15 20 25 30 35 Продолжительность культивирования, сутки Рисунок 4 – Динамика накопления биомассы мицелия чистой культуры базидио мицетов при жидкофазном поверхностном культивировании на пивном сусле, г/л Таким образом, при поверхностном культивировании на жидкой питательной среде неохмеленное сусло наибольшее накопление биомассы наблюдалось у штамма В 18/91 T. versicolor, что подтверждает его высокие ростовые характеристики на ага ризованных питательных средах (средний РК = 100). Вторым, по интенсивности на копления биомассы мицелия, явился штамм G.a.-04 G. applanatum. Следует отметить, что извлеченная после культивирования мицелиальная пленка характеризовалась очень высокой плотностью и складчатой внутренней поверхностью. Самый низкий уровень накопления биомассы отмечен для штамма Tyv-2006 F. оfficinalis, количест венный показатель биомассы которого на 40-е сутки культивирования составил лишь 5,22 г/л, но при добавлении в питательную среду 1% лиственничных опилок количе ство биомассы увеличилось в 2 раза.
Биохимический состав мицелия и плодовых тел базидиомицетов Большое значение для получения биомассы базидиомицетов имеет количество в нем белка, углеводов, липидов, витаминов, экстрактивных и минеральных веществ.
Биомассу мицелия для биохимического исследования наращивали путем жидкофаз ного культивирования на пивном сусле (4 оБ). Cодержаниt общего количества белка, углеводов и липидов определяли в мицелии 10, 20 и 30-ти суточного возраста мед ленно растущих штаммов Tyv-2006 F. оfficinalis и G.a.-04 G. applanatum и 5, 10 и 15 ти суточного мицелия быстро растущего штамма В 18/91 T. versicolor.
Для исследования качественного и количественного состава аминокислот, экс трактивных веществ, витаминов, золы и минерального состава в мицелии изучаемых штаммов был использован 30-ти суточный мицелий медленнорастущих штаммов Tyv-2006 F. оfficinalis и G.a.-04 G. applanatum и 15-ти суточный мицелий штамма В 18/91 T. versicolor.
Одной из важных характеристик как плодовых тел, так и мицелия грибов явля ется содержание экстрактивных веществ, которое дает возможность установить каче ство экстракта получаемого растительного сырья. Известно, что процесс извлечения экстрактивных веществ зависит от ряда факторов, таких как состав сырья, продолжи тельность экстракции и температура (Государственная фармакопея, 1989;
Краснюк и др., 2006). Исследования показали, что суммарный выход экстрактивных веществ из мицелия и плодовых тел зависит от температуры и условий экстракции. Так, при тем пературе 20-22 оС количество экстрактивных веществ значительно ниже, чем при о С. Время экстракции также влияет на выход экстрактивных веществ: так в условиях исчерпывающей экстракции (при 100 оС в течение 24-72 часов) повышается выход экстрактивных веществ из мицелия и плодовых тел всех изучаемых штаммов. При чем, количество экстрактивных веществ в мицелии гриба T. versicolor увеличивается в условиях исчерпывающей экстракции, по сравнению с холодной экстракцией в раз. Тогда как для всех остальных исследуемых образцов это соотношение составило 1:2 или 1:3 (таблица 2).
Таблица 2 – Количество экстрактивных веществ в мицелии и плодовых телах высших базидиомицетов полученных путем холодной (1), горячей (2) и исчерпываю щей (3) экстракции, % В мицелии В плодовом теле Базидиомицет 1 2 3 1 2 F. officinalis 40,96±0,33 51,09±0 71,58±1,12 3,59±0,07 8,36±0,20 8,48±0, G. applanatum 10,81±0,06 20,03±0,21 34,31±0,08 5,94±0,24 10,96±0,41 20,03±0, T. versicolor 3,39±0,16 15,30±0,04 23,33±0,35 3,56±0,13 8,92±0,27 18,45±0, Из представленной таблицы видно, что количество экстрактивных веществ в мицелии максимально у штамма F. officinalis, тогда как в плодовом теле – у гриба G.
applanatum.
Исследования по определению общего содержания белка показали, что наи большее количество общего белка содержится в биомассе мицелия штамма Tyv- F. officinalis и с возрастом оно увеличивается и на 10, 20 и 30-е сутки культивирова ния и составляет 12,05, 14,34 и 15,68 %, соответственно. Содержание общего белка в мицелии этого гриба в 10 раз больше, чем в плодовых телах, количество которого со ставляет только 1,53 %. Полученные результаты по содержанию белковых веществ в плодовых телах F. officinalis согласуются с литературными сведениями (Ооржак и др., 2004;
2006), согласно которых количество белковых веществ зависит от возраста плодовых тел, и составляет от 4,84 до 1,39 %.
Доля общего белка в мицелии гриба G. applanatum на 10, 20 и 30-е сутки куль тивирования составляет 8,28, 10,03 и 10,74 %, соответственно, тогда как доля общего белка в плодовых телах составляет 9,95 %, т.е. количественные показатели доли об щего белка в мицелии и плодовых телах гриба мало различаются. Незначительно с возрастом изменяется доля общего белка в мицелии гриба T. versicolor. Так после 5, 10 и 15-ти суток культивирования на пивном сусле количество общего белка в мице лии составило 13,04, 13,86 и 14,63 % соответственно, а в плодовых телах гриба T. ver sicolor доля белка составляет 7,25 %, что почти в два раза ниже, чем в мицелии.
Сравнительная оценка аминокислотного состава мицелия и плодовых тел всех изучаемых базидиомицетов показала, что в исследуемых образцах содержание ами нокислот в мицелии превышает таковое в плодовых телах. Причем среди незамени мых аминокислот в мицелии исследуемых базидиомицетов преобладают такие как изолейцин, лейцин и тирозин, тогда как в плодовых телах базидиомицетов G. ap planatum и T. versicolor – лейцин и тирозин, а в плодовых телах F. officinalis изолей цин, лейцин, тирозин, треонин и валин. Общее количество незаменимых аминокислот от общей суммы аминокислот в чистой культуре мицелия грибов G. applanatum, F.
officinalis и T. versicolor составляет 25,4, 34,8 и 23,9%, тогда как в плодовых телах – 20,2, 37,0 и 34,6%, соответственно. Полученные данные свидетельствуют о том, что только в плодовых телах гриба T. versicolor содержание незаменимых аминокислот от общего количества аминокислот превосходит почти на 30% этот показатель в мице лии. Среди заменимых аминокислот, как в мицелии, так и в плодовых телах большое количество гистидина, аспарагиновой и глютаминовой кислот.
Биологическую активность многих грибов связывают с наличием в них углево дов, в том числе гликанов, гетерогликанов, гликозаминогликанов. По современным представлениям углеводы цитозоля клеток грибов, выполняют множество функций (Феофилова, 1997;
Щерба, 2004).
Изучение биохимического состава штаммов базидиомицетов показало, что наибольшее количество общего количества полисахаридов в мицелии изучаемых штаммов выявлено у гриба T. versicolor, причем количество легкогидролизуемых уг леводов в мицелии значительно отличается от количества трудногидролизуемых уг леводов. Количество легко- и трудногидролизуемых углеводов в мицелии различного возраста штаммов G. applanatum и T. versicolor различается недостоверно. У гриба F.
officinalis, напротив, количество как легкогидролизуемых, так и трудногидролизуе мых полисахаридов возрастает при культивировании штамма (таблица 3).
Таблица 3 – Доля углеводов в мицелии изучаемых базидиомицетов различного возраста, % Продолжительность Легкогидролизуемые Трудногидролизуемые культивирования полисахариды полисахариды штамма, сут Fomitopsis officinalis 10 13,09±0,85 4,87±0, 20 17,85±1,01 6,53±0, 30 18,83±0,66 6,11±0, Ganoderma applanatum 5 21,43±0,97 8,10±0, 10 23,04±1,13 8,25±0, 15 22,14±0,78 9,64±0, Trametes versicolor 5 38,36±1,64 7,30±0, 10 42,10±2,05 9,13±0, 15 41,55±1,21 12,85±0, Сравнительный анализ доли углеводов в плодовых телах изучаемых базидио мицетов показал, что плодовые тела гриба T. versicolor содержат наибольшее количе ство легко- и трудногидролизуемых углеводов, тогда как плодовые тела базидиоми цетов G. applanatum и F. officinalis характеризуются более низким содержанием об щего количества углеводов, суммарный выход составил соответственно – 50,7, 23,2 и 12,63 % (таблица 4).
Таблица 4 – Содержание углеводов в плодовых телах базидиомицетов, % Легкогидролизуемые поли- Трудногидролизуемые по Базидиомицет сахариды лисахариды 7,95±0,13 4,68±0, Fomitopsis officinalis 16,81±0,49 6,41±0, Ganoderma applanatum 37,63±0,98 13,14±0, Trametes versicolor Таким образом, наиболее перспективным источником, не менее ценных по сравнению с белками, веществ углеводной природы является мицелий всех изучае мых штаммов, которые могут представлять интерес для создания биологически ак тивных добавок, а также с целью обогащения кормов для сельскохозяйственных жи вотных. Кроме того, олигосахариды могут являться биологически активными соеди нениями, обладающими противоопухолевой и антимикробной активностью (Чхенке ли, 1998;
2005).
Важное место среди биологически активных веществ занимают липиды, при чем их ценность тем выше, чем больше в их составе важных в биологическом отно шении фосфолипидов. Проведенные исследования по определению количества общих липидов в мицелии изучаемых штаммов показали довольно широкий диапазон дан ных (от 1,02 до 7,47 % от а.с.с.). Содержание общего количества липидов в мицелии гриба F. officinalis значительно различается от возраста культуры. Так 10-суточный мицелий содержит общую долю липидов в 2,5 раза меньше, чем 30-ти суточная куль тура штамма. Содержание липидов в мицелии базидиомицетов G. applanatum и T. ver sicolor в зависимости от возраста различается незначительно (таблица 5).
Таблица 5 – Содержание липидов в мицелии базидиомицетов, % Продолжительность Всего Нейтраль- Глико- Фосфо культивирования липидов ные липиды липиды штамма, сутки Fomitopsis officinalis 10 3,25±0,10 77,10±2,25 20,35±0,66 1,03±0, 20 6,18±0,25 70,85±1,56 24,44±1,10 1,76±0, 30 7,47±0,14 60,29±1,17 33,88±0,33 3,89±0, Ganoderma applanatum 5 3,14±0,06 68,9±1,25 21,2±1,00 7,73±0, 10 3,26±0,05 67,5±2,13 19,1±1,18 10,15±0, 15 3,88±0,01 60,98±1,7 24,35±0,43 11,51±0, Trametes versicolor 5 1,02±0,04 68,15±2,05 17,26±1,13 10,89±0, 10 1,37±0,01 70,40±2,64 15,15±0,805 14,00±1, 15 1,49±0,06 66,64±1,20 16,92±1,25 13,82±0, Из представленной таблицы видно, что общей закономерностью является пре обладающее количество нейтральных липидов в составе общей фракции мицелия всех изучаемых штаммов различного возраста. Причем четкой тенденции к увеличе нию или уменьшению их количественного показателя с возрастом не прослеживается.
Количество гликолипидов значительно изменяется в зависимости от возраста культу ры у гриба F. officinalis. Так, 10-ти суточный мицелий содержит на 40 % гликолипи дов меньше, чем 30-ти суточный мицелий. Содержание гликолипидов у базидиомице тов G. applanatum и T. versicolor в зависимости от возраста различается недостоверно.
На долю фосфолипидной фракции 30-ти суточного мицелия гриба F. officinalis приходится лишь 3,9 %, что в 3 раза больше, чем его доля в 10-ти суточном мицелии гриба. Наиболее высоким синтезом фосфолипидов характеризовались культуры ми целия грибов T. versicolor и G. applanatum. Причем, содержание фосфолипидов в ми целии гриба G. applanatum и T. versicolor изменяется с возрастом примерно на 30%.
Сравнительный анализ количественного определения доли общих липидов в плодовых телах изучаемых базидиомицетов показал, что отличительной чертой гриба F. officinalis является высокое содержание в его плодовых телах – 29,3 %, тогда как плодовые тела базидиомицетов G. applanatum и T. versicolor содержат лишь 4,14 и 1,90 %, соответственно (таблица 6).
Таблица 6 – Содержание липидов в плодовых телах базидиомицетов, % Всего Нейтраль- Глико- Фосфо Базидиомицет липидов ные липиды липиды 29,29±0,12 54,36±0,01 38,96±0,01 1,72±0, Fomitopsis officinalis 4,14±0,07 84,14±0,93 5,89±0,29 7,87±0, Ganoderma applanatum 1,90±0,03 43,10±1,17 36,85±0,22 19,23±0, Trametes versicolor Из представленной таблицы видно, что наибольшее количество фосфолипидов содержат плодовые тела гриба T. versicolor. Количественный показатель в 10 и 2, раза выше, чем содержание таковых у базидиомицетов F. officinalis и G. applanatum, соответственно. Таким образом, по количеству общих липидов и фосфолипидов, для практического использования в различных отраслях народного хозяйства (пищевой, фармацевтической промышленности, медицине, косметологии и др.), мицелий бази диомицетов F. officinalis, G. applanatum и T. versicolor может представлять большую значимость.
Одним из наиболее важных компонентов плодовых тел F. officinalis является агарициновая кислота. Последние исследования зарубежных авторов доказывают, что агарициновая кислота является соединением, которое индуцирует проницаемость ми тохондрий путем связывания с аденин-нуклеотидтранслоказой, т.е. может использо ваться при раковых новообразованиях (Гаврилин и др., 2006). Проведенный сравни тельный анализ УФ-спектроскопии образца мицелия F. officinalis 30-ти суточного возраста и стандартного образца агарициновой кислоты (Sigma OLDRICH, Германия) показал идентичность спектров опытного и стандартного образцов (рисунок 5).
Полученные нами результаты не согласуются с данными О.М. Ефименко (1965), которая отмечала, что 30-40-суточный мицелий Fomitopsis officinalis не со держит агарициновой кислоты. Следовательно, мицелий Fomitopsis officinalis может быть использован для получения биологически активного соединения агарициновой кислоты.
Рисунок 5 – Уф-спектры раствора порошка, полученного из мицелия гриба Fomitopsis officinalis и стандартного образца, и стандартного образца агарициновой кислоты Твердофазное культивирование штаммов Перспективным биотехнологическим способом получения мицелия грибов – про дуцентов биологически активных веществ может быть твердофазная ферментация растительных материалов. Для массовой наработки биомассы грибов необходимым этапом исследований является подбор дешевых и экологически безопасных расти тельных субстратов. В этой связи перспективным источником сырья для фермента ции могут служить отходы деревообрабатывающей промышленности и сельского хо зяйства. Как показали результаты исследования, для всех изучаемых штаммов луч шим субстратом для культивирования явилось измельченное зерно пшеницы, тогда как на гидролизном лигнине рост не был отмечен. Штамм гриба F. officinalis утили зировал лиственничные опилки и кору пихты, а штамм гриба T. versicolor утилизиро вал кору, древесную зелень пихты и лиственничные опилки. Скорость роста штаммов и характер формирования воздушного мицелия на различных субстратах были не одинаковы. Изучаемый штамм гриба G. applanatum не утилизировал отходы дерево обрабатывающей и гидролизной промышленности.
Проведенный факторный эксперимент с использованием различных компози ций из субстратов показал, что для наращивания мицелия пштамма-продуцента F. of ficinalis необходимо использовать композицию растительного субстрата, где доля лигнина 60%, древесной зелени пихты и коры пихты по 20%;
для штамма гриба T.
versicolor субстраты, где доля лигнина 20%, древесной зелени пихты и коры пихты по 40%.
Токсичность и зоопатогенность штаммов Изучение токсичности и зоопатогенности штаммов-продуцентов биологически активных веществ, является обязательным условием для возможности их рекоменда ции в массовое производство. Водные экстракты из мицелия и плодовых тел F. offici nalis, G. applanatum и T. versicolor отнесены к классу нетоксичных. Культуральные жидкости, содержащие продукты метаболизма, штаммов G.a.-04 G. applanatum и В 18/91 T. versicolor являются нетоксичными, тогда как метаболиты штамма Tyv- F. officinalis – высокотоксичные.
Исследование химического состава метаболитов штамма Tyv-2006 F. officinalis методом хромато-масс-спектрометрии показало высокое содержание нервного яда – гидроксиметилфурфурола, количество которого в образцах составляет 60,04 % что, возможно, и определяет их токсичность.
Антимикробная активность водных экстрактов из мицелия и плодовых тел базидиомицетов Многие макромицеты являются продуцентами широкого спектра антибиотиков и препаратов противоопухолевого и иммуномодулирующего действия. Повышенному интересу к грибам этой группы способствовали многочисленные исследования, пока завшие, что они могут стать незаменимыми источниками для получения лекарствен ных препаратов, имеющих антимикробную активность (Низковская, 1983;
Бухало и др., 1996;
Даниляк, 1996;
Чхенкели, 1998;
2006;
Sliva, 2006;
Ziegenbein et.al., 2006;
Gao et.al., 2002;
Ikewawa, 2003;
Jeong et.al., 2008 и другие).
В настоящее время часто при инфекционных заболеваниях различной этиоло гии используются лекарственные средства, обладающие либо крайне низкой активно стью, либо имеющие высокий процент резистентности в отношении основных возбу дителей гнойно-воспалительных заболеваний. В связи с этим весьма актуальна задача поиска новых продуцентов антибиотических веществ и препаратов, активных в от ношении микроорганизмов, имеющих множественную лекарственную устойчивость (Сидоренко, 2002;
Яковлев, 2002). Изучение антимикробной активности водных экс трактов из мицелия показало, что все тест-культуры оказались чувствительными к биологически активным соединениям, экстрагируемым водой из мицелия гриба T.
versicolor. Водный экстракт из мицелия G. applanatum обладает антимикробной ак тивностью в отношении всех взятых для эксперимента тест-культур, кроме микроор ганизмов рода Staphylococcus, из мицелия лиственничной губки обладает антимик робной активностью в отношении S. aureus, B. subtilis, P. aeruginosa 114, E. coli k-12, S. typhimurium, L. monocytogenes и C. freundii (таблица 7).
Водный экстракт из мицелия штамма Tyv-2006 F. officinalis проявлял среднюю степень антимикробной активности к микроорганизмам S. aureus, S. typhimurium и C.
freundii. Тогда как, среди тест-культур обладающих средней чувствительностью к биологически активным соединениям, экстрагируемым водой из мицелия штамма G.a.-04 G. applanatum оказались лишь C. albicans и B. subtilis. Остальные тест культуры показали слабую чувствительность к исследуемым экстрактам. Следует от метить, что степень активности водных экстрактов из мицелия штамма В 18/91 T. ver sicolor, оценивается как средняя ко всем тест-культурам, за исключением микроорга низмов E. coli k-12, L. monocytogenes и Citrobacter freundii, где зоны вокруг лунок бы ли менее 12 мм в диаметре, что свидетельствует о слабой чувствительности штаммов к биологически активным соединениям, экстрагируемым водой из мицелия гриба T.
versicolor.
Исследование культуральных жидкостей изученных грибов F. officinalis, G.
аpplanatum и T. versicolor, покзали, что антимикробную активность в отношении всех используемых в эксперименте тест-культур проявляют только метаболиты F.
оfficinalis. Следует отметить, что метаболиты гриба F. officinalis обладающие анти микробной и фунгицидной активностью, являются высокотоксичными.
Таблица 7 – Антимикробная активность водных экстрактов из мицелия изучае мых базидиомицетов Зона подавления роста тест-культур, мм Тест-культура Кон Fomitopsis Ganoderma Trametes троль officinalis applanatum versicolor 12,05±0,41 – 11,67±0,41 – Staphylococcus aureus - – 16,83±0,20 – Staphylococcus cohnii - – 17,17±0,54 – Staphylococcus epidermidis - – 16,83±0,20 – Staphylococcus warneri - – 17,00±0,35 – Staphylococcus haemolyticus - 13,83±0,20 16,17±0,20 – Candida albicans 9,03±0,25 13,20±0,42 14,40±0,05 – Bacillus subtilis 10,14±0,30 10,45±0,45 19,00±0,89 – Pseudomonas aeruginosa 9,25±0,08 11,00±0,50 11,25±0,15 – Escerichia coli k- 12,10±0,10 10,05±0,20 14,30±0,45 – Salmonella typhimurium 11,41±0,10 8,73±0,01 8,25±0,05 – Listeria monocytogenes 15,35±0,29 9,17±0,36 10,55±0,28 – Citrobacter freundii Примечание: « – » - активность не выявлена Водные экстракты из плодовых тел гриба T. versicolor оказывают антимикроб ную активность в отношении грамположительных стафилококков, в частности коагу лазоположительного S. aureus и коагулазоотрицательного S. haemolyticus, тогда как действия экстрактов из плодовых тел базидиомицетов F. officinalis и G. applanatum в их отношении не выявлено.
Полученные данные свидетельствуют о том, что культуры исследуемых бази диомицетов F. officinalis, G. applanatum и T. versicolor могут быть использованы как продуценты биологически активных веществ, обладающих антимикробной активно стью.
Противоопухолевые свойства водных экстрактов из мицелия и плодовых тел базидиомицетов Повышенному интересу к дереворазрушающим базидиомицетам способствова ли многочисленные исследования, показавшие, что эти организмы могут стать неза менимыми источниками для получения лекарственных препаратов, имеющих имму номодулирующую и противоопухолевую активность. Наиболее активными считаются полисахариды, стероидные соединения и каротиноидные пигменты, проявляющие модифицирующее действие на активность клеток врожденного иммунитета (Красно польская, 2007;
Феофилова, 1996;
2006;
Щерба и др., 2007;
Cui et.al, 2003;
Cao et.al., 2004;
Jiang te.al., 2007;
Muller et.al., 2006;
Sliva, 2006;
Moradali et.al., 2006). Исследо вание показало, что водные экстракты мицелия и плодовых тел всех изучаемых штаммов базидиомицетов, в той или иной степени оказывают цитопатическое дейст вие на опухолевые клетки АКЭ. Результаты исследования in vivo, проведенные на мышах линии ICR, показали, что водные экстракты мицелия F. officinalis и плодового тела G. аpplanatum обладали выраженной противоопухолевой активностью. Объем и концентрация живых клеток опухоли достоверно снижался по сравнению с группой мышей, получавших противоопухолевый препарат циклофосфан, и с контрольной группой мышей, не получавших препараты.
Наиболее выраженное достоверное торможение роста опухоли (ТРО) регистри руется при введении экстракта из мицелия F. officinalis и составляет 77 %. Получен ные данные о противоопухолевом действии сибирских штаммов базидиомицетовых грибов открывают новые возможности и перспективы использования в комплексной терапии рака биологически активных веществ, получаемых из биомассы мицелия продуцентов.
ВЫВОДЫ 1. В результате лабораторных исследований in vitro установлены культурально морфологические признаки и особенности роста Fomitopsis officinalis, Ganoderma ap planatum и Trametes versicolor. К быстро растущим отнесены штаммы T. versicolor, медленно растущим – F. officinalis и G. applanatum. По особенностям роста в различ ном интервале температур F. оfficinalis относится к стенотермным видам (25-30 оС), а G. applanatum и T. versicolor (15-25 оС) к эвритермным. Оптимальным рН для роста всех изучаемых штаммов является 5,5-6,5. По показателям ростового коэффициента и скорости роста проведен отбор продуктивных штаммов Fomitopsis officinalis Tyv- (ВКПМ F-968) и Ganoderma applanatum G.a.-04 (ВКПМ F-983).
2. Относительное содержание белка в мицелии грибов F. officinalis и T. versicolor увеличивается в процессе культивирования;
доля общего белка в биомассе мицелия штамма Tyv-2006 F. officinalis в 10 раз превосходит его содержание в плодовых телах.
Содержание белка в мицелии грибов G. applanatum и T. versicolor при культивирова нии изменяется незначительно;
доля общего белка в мицелии штамма T. versicolor почти в два раза выше, чем в плодовых телах. В мицелии штамма G.a.-04 G. ap planatum содержание белка на 10 % выше, чем в плодовых телах.
Качественный состав аминокислот белка мицелия базидиомицетов характеризуется преобладанием незаменимых аминокислот изолейцина, лейцина и тирозина. В плодо вых телах базидиомицетов G. applanatum и T. versicolor – обнаружены - лейцин и ти розин, а в плодовых телах F. officinalis - изолейцин, лейцин, тирозин, треонин и ва лин.
3. При культивировании изученных грибов возрастает количество трудногид ролизуемых (37,63±0,98) и легкогидролизуемых (13,14±0,19) полисахаридов у штам ма F. officinalis, у штаммов G. applanatum и T. versicolor эти различия не обнаружены.
Наибольшее количество легко- и трудногидролизуемых углеводов содержат плодо вые тела гриба T. versicolor, плодовые тела базидиомицетов G. applanatum и F. offici nalis характеризуются более низким содержанием общего количества углеводов, со ставляющее соответственно – 50,7, 23,2 и 12,63 %.
4. В процессе культивирования всех изученных штаммов изменяется общее со держание липидов в мицелии, причем в составе общей фракции мицелия различного возраста преобладали нейтральные липиды. Содержание липидов, как в мицелии, так и в плодовых телах базидиомицетов G. applanatum и T. versicolor различалось незна чительно, их соотношение составило 1:1. Доля общих липидов в плодовых телах гри ба F. officinalis в 4 раза выше, чем в биомассе мицелия. В липидной фракции мицелия и плодовых тел F. оfficinalis идентифицирована агарициновая кислота.
5. Штаммы грибов различаются характером и скоростью роста на различных пи тательных субстратах. Увеличение выхода биомассы медленно растущего штамма Tyv-2006 F. оfficinalis достигалось после обогащения питательной среды лиственнич ными опилками.
6. Штаммы базидиомицетов F. officinalis, G. applanatum и T. versicolor могут быть использованы в качестве продуцентов биологически активных веществ, обла дающих антимикробной активностью в отношении грамотрицательных и грамполо жительных бактерий. Антимикробной активностью в отношении грамположительных стафилококков отличались водные экстракты из биомассы мицелия и плодовых тел гриба T. versicolor и культуральная жидкость штамма Tyv-2006 F. оfficinalis. Проти вокандидозной активностью обладали водные экстракты мицелия T. versicolor и G.
applanatum. Водный экстракт из мицелия штамма Tyv-2006 F. officinalis проявлял из бирательное действие в отношении к микроорганизмов.
7. Водные экстракты мицелия всех изученных штаммов и культуральные жид кости, содержащие продукты метаболизма штаммов G. applanatum и T. versicolor, не являются токсичным для теплокровных животных, тогда как метаболиты культураль ной жидкости штамма F. оfficinalis высокотоксичны.
8. В опытах in vitro установлено, что водные экстракты из мицелия и плодовых тел гриба T. versicolor оказывают прямое цитопатическое воздействие на опухолевые клетки асцитной карциномы Эрлиха, тогда как экстракты из мицелия штаммов G. ap planatum и F. оfficinalis – длительное цитопатическое действие. В опытах in vivo наи более выраженное достоверное торможение роста опухоли оказывает водный экс тракт из мицелия лиственничной губки (F. officinalis).
Для культивирования мицелия штаммов F. оfficinalis и T.
9.
versicolor.разработаны оптимальные композиции растительных субстратов с исполь зованием отходов промышленности лесоперерабатывающего комплекса. Лучшим субстратом для твердофазного культивирования мицелия исследованных штаммов базидиомицетов G. applanatum, F. оfficinalis и T. versicolor является измельченное зерно пшеницы. Полученная биомасса базидиомицетов может быть использована для получения биологически активных веществ.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Садыкова В.С., Ковалева Г.К., Чижмотря Н.М., Гаврилова А.Г., Громовых Т.И., Новицкий И.А. Антимикробная активность грибов рода Trichoderma и Trametes в отношении патогенных микроорганизмов рода Staphylococcus // Сибирский меди цинский журнал. – Иркутск, 2006. – Т. 66, №8. – С. 18-20.
2. Ковалева Г.К., Громовых Т.И. Биологические свойства и продуктивность но вого штамма базидиомицета G.a.-04 Ganoderma applanatum (Pers. ex Wallr.) Pat // Вестник КрасГАУ. – Красноярск, 2008. - №1. – С. 70-73.
3. Ковалева Г.К., Громовых Т.И. Биологические свойства и продуктивность но вого штамма базидиомицета Tyv-2006 Fomitopsis officinalis (Will.) Bond. et Singer // Вестник КрасГАУ. – Красноярск, 2009. - №1. – С. – 68-75.
4. Ковалева Г.К., Громовых Т.И. Изучение биологической активности и продук тивности на растительных субстратах сибирского штамма базидиомицета Trametes versicolor (L. Ex Fr.) Lloyd // Материалы Всероссийской конференции студентов и ас пирантов по приоритетному направлению «Рациональное природопользование». – Ярославль, 2006. – С. 260-262.
5. Ковалева Г.К., Громовых Т.И. Перспективы создания новых биотехнологий на основе сибирских штаммов базидиомицетов // Материалы Международной школы конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» – Москва-Пущино, 2006.
– С.130-131.
6. Ковалева Г.К., Громовых Т.И. Новые альтернативные пути получения биоло гически активных веществ // Материалы городской научно-практической конферен ции «Развитие инновационной деятельности в промышленном комплексе города Красноярска». – Красноярск, 2007. – С. 74-76.
7. Ковалева Г.К., Громовых Т.И. Перспективы создания новых биотехнологий на основе сибирского штамма B 18/91 базидиомицета Trametes versicolor // Материа лы II Международной научно-технической конференции молодых ученых «Актуаль ные проблемы технологии живых систем». – Владивосток, 2007. – С.55-57.
8. Громовых Т.И., Ковалева Г.К., Садыкова В.С., Гаврилова А.Г. Противоопу холевые свойства макро- и микромицетов Средней Сибири // Современная микология в России. Тезисы докладов второго съезда микологов России. М: Национальная ака демия микологии. – 2008. – С. 517.
9. Громовых Т.И., Садыкова В.С., Ковалева Г.К., Кутафьева Н.П., Гайдашева И.И., Миронов А.Г., Пашенова Н.В. Коллекция чистых культур макро- и микромицетов средней Сибири – база для создания новых биотехнологий и образовательного процесса // Современная микология в России. Тезисы докладов второго съезда микологов России. М:
Национальная академия микологии. – 2008. – С. 109-110.
Ковалева Г.К., Садыкова В.С., Громовых Т.И., Инжеваткин Е.В. Биоло 10.
гия, культивирование и лекарственные свойства Trametes versicolor // Высшие бази диальные грибы: индивидуумы, популяции, сообщества. Материалы юбилейной кон ференции, посвященной 100-летию со дня рождения М.В. Горленко. М.: Восток Запад, 2008. – С. 190-191.
Патент 2007147074/13 (051610) RU МПК7 C12N 1/14 Штамм базидиоми 11.
цета Fomitopsis officinalis ВКПМ F - 961, используемый для получения противоопухо левых препаратов / Т.И. Громовых, В.С. Садыкова, Е.В. Инжеваткин, Г.К. Ковалева, Л.И. Черепанова;
заявл. 17.12.07 г.