Действие инфракрасного и рентгеновского излучений на мышей и их потомков
На правах рукописи
ДЮКИНА Алсу Рашидовна ДЕЙСТВИЕ ИНФРАКРАСНОГО И РЕНТГЕНОВСКОГО ИЗЛУЧЕНИЙ НА МЫШЕЙ И ИХ ПОТОМКОВ 03.01.01 – Радиобиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
МОСКВА, 2011
Работа выполнена в лаборатории клеточной инженерии Учреждения Российской академии наук Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино
Научный консультант: Кандидат биологических наук Заичкина Светлана Игоревна
Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор Засухина Галина Дмитриевна Доктор биологических наук, профессор Гераськин Станислав Алексеевич
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биофизики клетки РАН, г. Пущино
Защита диссертации состоится ноября 2011 года в ч на заседании диссертационного совета Д. 501.001.65 в Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.
Отзывы на автореферат просим присылать по адресу: 119991, г. Москва, ГСП 1, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, Т.В. Веселовой. Факс (495) 939 11-15.
Автореферат диссертации разослан « » октября 2011 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета Доктор биологических наук Т.В. Веселова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Несмотря на то, что радиационная биология в настоящий момент обладает обширными знаниями о механизмах и закономерностях действия больших доз ионизирующего излучения на живые объекты, этого оказалось недостаточно для объяснения таких специфических эффектов малых доз, как гиперчувствительность, радиационный адаптивный ответ, генетическая нестабильность в поколениях, эффект свидетеля и гормезис. Исследование этих эффектов радиации имеет не только фундаментальное значение для выяснения механизмов действия малых доз, но и практическое значение, для оценки и прогнозирования последствий облучения человека и для использования в медицине и сельском хозяйстве.
В последнее десятилетие особый интерес у исследователей вызывает феномен адаптивного ответа (АО). Этот феномен заключается в том, что предварительное облучение объекта в малых адаптирующих дозах ионизирующего излучения приводит к снижению чувствительности к последующему выявляющему воздействию больших доз радиации. Наличие радиационного адаптивного ответа (РАО) было установлено в лимфоцитах кролика (Liu et al., 1992), в растениях (Cortes et al., 1990), в клетках костного мозга мышей и крыс (Семенец и др., 1993;
Farooqi and Kesavan, 1993;
Балакин и др., 1998), сперматозоидах мышей (Сai and Liu, 1990), в фибробластах китайского хомячка (Ibuki and Goto, 1994) и других объектах in vitro (Meyers et al., 1992). Было обнаружено, что РАО проявляется в нормальных клеточных линиях и не выявляется в злокачественных клетках (Ishii and Watanable, 1996;
).
Нами впервые был обнаружен эффект длительного, сравнимого со сроком жизни животного, сохранения РАО, индуцированного дозами 0,1 и 0,2 Гр острого -облучения, в клетках костного мозга мышей по критерию хромосомных аберраций (Балакин и др., 1998;
Заичкина и др., 1999).
Многочисленные исследования РАО выявили, что этот феномен в значительной степени зависит от выбора оптимальных условий проведения эксперимента: величины и мощности адаптирующей дозы, временных параметров между адаптирующим и выявляющим воздействиями, качества излучения, объекта исследования (Заичкина и др., 2001;
Заичкина и др., 2005;
Засухина, 2008). Приведенные данные по действию малых доз -радиации свидетельствуют о том, что они переводят организм в новое адаптированное состояние, характеризующееся повышенной устойчивостью генома к повреждающим воздействиям в течение жизни животного. Явление, когда адаптирующее и выявляющее воздействия являются факторами разной природы, принято называть перекрестным АО, который рассматривается как одна из форм защиты организма от мутагенного действия, вызванного не только ионизирующей радиацией, но и химическими агентами и, вероятно, является важнейшим биологическим резервом повышения устойчивости организма к неблагоприятным воздействиям окружающей среды. Поэтому проблема поиска адаптогенов физической или химической природы, способных, как и малые дозы -излучения, переводить организм в адаптированное состояние является актуальной. В настоящее время в медицинской практике появилось много различных приборов, действие которых основано на использовании электромагнитного излучения инфракрасной части спектра, рекомендованных для лечения воспалительных процессов, что дает основание предположить о возможных адаптивных свойствах данного вида излучения.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в изучении адаптирующего действия ионизирующего (рентгеновского) и неионизирующего (инфракрасного) излучений на мышей и их потомков.
В соответствии с целью были поставлены основные задачи:
1) Выявить возможность и закономерности индукции АО в клетках костного мозга и тимуса мышей, предоблученных инфракрасным светом (ИКС) с длиной волны 850 нм, модулированной частотой 101 Гц, или рентгеновским излучением (РИ) в дозе 0.1 Гр.
2) Выявить влияние ИКС и РИ на уровень продукции активных форм кислорода (АФК) в цельной крови мышей.
3) Выявить влияние ИКС и РИ на скорость роста карциномы Эрлиха у мышей.
4) Установить возможность трансгенерационной передачи генетических повреждений трем поколениям мышей, облученных ИКС или РИ.
Научная новизна. 1) Впервые показано, что предварительное облучение мышей ИКС и малой дозой РИ уменьшает радиочувствительность клеток костного мозга и тимуса при дополнительном облучении их РИ в большой дозе, т.е. индуцирует равные по величине и временной динамике адаптивные ответы, которые сохраняются до 2-х месяцев. Предоблучение ИКС и РИ индуцирует защитный эффект по торможению скорости роста опухоли;
2) Впервые выявлена связь между уровнем продукции АФК и индукцией АО у мышей при действии ИКС и РИ;
3) Впервые с помощью теста «адаптивный ответ» в клетках костного мозга и тимуса и скорости роста опухоли обнаружена возможность трансгенерационной передачи генетических повреждений потомству самцов, облученных ИКС и РИ в трех поколениях.
Научно-практическая значимость. Обнаружено, что ИКС и РИ на ряду с такими изученными адаптогенами как алкилирующие соединения (Morse and Smith, 1987;
Дубинина, 1995), тепловой шок (Rieger et al., 1985), перекись водорода (Cortes et al., 1990), ультрафиолетовое (Жестяников и Савельева, 1994) и лазерное (Karu et al., 1994) излучения, соли тяжелых металлов (Cai and Cherian, 1996), альдегиды (Nunoshiba et al., 1991) и флавоноиды (Oliveira et al., 1997;
Oliveira et al., 2000, Кондакова, 2002) также могут индуцировать перекрестные АО, сравнимые по величине и динамике с -индуцированным АО (Wojewodzka et al., 1997). Полученные результаты позволяют рекомендовать применение ИКС в качестве адаптогена при работе в медицинской практике и лечении больных, сотрудников, занятых на производстве с повышенным радиационным фоном, а также для индукции гормезисных эффектов у сельскохозяйственных животных.
Апробация диссертации и публикации. По теме диссертации опубликовано печатных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах, 7 статей в сборниках научных конференций и 15 – в тезисах научных конференций.
Основные результаты доложены на международных и российских конференциях: III Международный симпозиум «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (24-28 января 2007 г., Москва-Дубна);
II Международная конференция «Человек и электромагнитные поля» (28 мая - июня 2007 г., Саров);
11-тая Международная Пущинская школа – конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века» (29 октября – 2 ноября 2007г, Пущино);
Российская научная конференция «Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии» (29-30 мая 2008, Санкт-Петербург, Россия);
II Санкт-Петербургский Международный Экологический Форум «Окружающая среда и здоровье человека» (1-4 июля 2008, Санкт-Петербург, Россия);
The 36th annual meeting of the European Radiation Research Society, Tours, France, 1- September, 2008;
12-тая Международная Пущинская школа – конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века» (10-14 ноября 2008г, Пущино);
7th International Meeting on the Effects of Low Doses of Radiation in Biological Systems: New Perspectives on Human Exposure (Lisbon, Portugal, 27-29 November 2008);
The 37th annual meeting of the European Radiation Research Society, Prague, Czech Republic, 26-30 August, 2009;
13-тая Международная Пущинская школа – конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века» (28 сентября- октября 2009г, Пущино);
15th International Symposium on Microdosimetry. An Interdisciplinary Meeting on Ionizing Radiation Quality, Molecular Mechanisms, Cellular Effects, and Their Consequences for Low Level Risk Assessment and Radiation Therapy (Verona, Italy, October 25-30, 2009);
The 2sd International Conference Medical Radiations: Research and Applications (7-9 April 2010, Marrakech – Morocco);
38th COSPAR Scientific Assembly, 18 - 25 July 2010, Bremen, Germany;
The 38th annual meeting of the European Radiation Research Society, Stoсkholm, Sweden, 05-09 September, 2010. 14 Congress of the European Society for Photobiology. September 1-6, 2011, Geneva, Switzerland. International Congress of radiation research. Incorporating 57 annual meeting of the Radiation Research Society. August 28 - September 1, 2011. Warsawa, Poland.
Структура и объем диссертации. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть (объекты и методы исследований, результаты и обсуждения), выводы, список цитируемой литературы.
Диссертация содержит страниц, таблиц и рисунка. Список литературы включает ссылок, из них на английском языке.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект исследования. В экспериментах использовали 2-месячных самцов белых свободно скрещиваемых мышей линии SHK. Животных содержали в стандартных условиях вивария ИТЭБ РАН в пластиковых контейнерах по штук. Эксперименты на животных проводили согласно рекомендациям Комиссии по биомедицинской этике в ИТЭБ РАН.
Условия облучения. Облучение мышей ИКС с длиной волны 850 нм, модулированной частотой 101 Гц, (22 мВт/см2), в течение 10 мин осуществляли при помощи прибора световой терапии. Облучение мышей РИ в дозе 1.5 Гр проводили на установке РУТ ИТЭБ РАН (200 кВ, 1 Гр/мин).
Схема экспериментов по исследованию адаптивного ответа. Для изучения индукции АО животных однократно в течение 10 мин облучали ИКС или РИ в дозе 0.1 Гр. Через 24 ч после адаптирующего воздействия все группы были облучены в выявляющей дозе 1.5 Гр РИ.
Приготовление цитологических препаратов костного мозга для оценки цитогенетических повреждений в полихроматофильных эритроцитах (ПХЭ) с помощью микроядерного теста осуществляли по стандартной методике (Schmid, 1975) с некоторыми собственными модификациями.
Оценку влияния облучения на тимус проводили с помощью анализа его относительной массы в зависимости от варианта воздействия.
Продукцию АФК измеряли в цельной крови методом люминол-зависимой хемилюминесценции (ХЛ) с помощью 12 канального прибора CHEMILUM-12.
Мышей декапитировали через 28 ч после воздействия в дозе 1.5 Гр. Образцы крови разводили в пропорции 1:1 (по объему) раствором Хенкса без добавления Са2+ и хранили при 4С в течение 1 ч до проведения измерения ХЛ. Сигнал ХЛ регистрировали при 37°C последовательно в 12 мини-ячейках (V=200 l) в течение 4 мин, а период обновления данных на приборе составлял 2.5 с.
Концентрация люминола была 0.35 мМ [Мальцева и др., 2006;
Servaraj et al., 1982]. Готовили 2 пробы крови от каждого животного. Измерение ХЛ в крови контрольных и облученных клеток проводили параллельно.
Получение солидной формы асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) по стандартной методике осуществляли путем внутримышечного введения в бедренную часть задней лапы 106 клеток АКЭ на мышь. Оценку скорости роста опухоли проводили путем измерения ее объема раз в неделю.
В наших экспериментах, для получения поколений самцов, облученных ИКС и в дозе 0.1 Гр РИ, через 2 недели спаривали с необлученными самками. Этот срок был выбран с учетом времени, необходимого для постмейотического созревания гамет (от стадии сперматид до сперматозоидов), которые впоследствии участвуют в оплодотворении необлученных яйцеклеток. Т.к.
клетки на постмейотической стадии сперматогенеза характеризуются низкой эффективностью функционирования систем репарации ДНК, можно полагать, что это способствует большему накоплению в созревающих сперматозоидах индуцированных радиацией нелетальных повреждений генома этих клеток (Фоменко и др., 2006).
Статистическую обработку результатов проводили с использованием встроенного пакета статистического анализа MS Excel 2003 и SigmaPlot 10. В работе производили определение средних значений (М) измеряемых величин и стандартных отклонений среднего (m). Данные в работе приведены при значениях *р0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Для исследования возможности индукции АО с помощью ИКС и РИ в дозе 0. Гр мыши были облучены по схеме радиационного АО: адаптирующим воздействием ИКС или 0.1 Гр и через 24 ч выявляющей дозой 1.5 Гр РИ. Для более плотного контакта прибора с кожей при облучении ИКС одна группа животных была обработана депилятором для удаления волосяного покрова, а другая - не подвергалась такой обработке. Обе группы были облучены с помощью ИКС по 10 мин/сут в течение 14 сут, время воздействия которого было выбрано исходя из рекомендаций по эксплуатации прибора.
Таблица 1. Количество ПХЭ с МЯ в клетках костного мозга мышей с удаленным и неудаленным волосяным покровом при сочетанном воздействии ИКС и рентгеновского излучения в дозе 1.5 Гр в условиях in vivo Воздействие Кол-во Число Число ПХЭ мышей анализи- ПХЭ с МЯ, % ных c МЯ ПХЭ мыши с удаленным волосяным покровом 0 5 7 200 20 0.31±0. 10 мин имитация ИКС (14 сут) 5 19 000 99 0.53±0. 10 мин ИКС (14 сут) 5 7 000 30 0.39±0. 10 мин ИКС (14 сут)+1.5 Гр через 1 сут 5 14 000 486 3.50±0.28* 10 мин (имитация ИКС) (14 сут) +1.5 Гр 5 20 000 1266 6.34±0. 1.5 Гр 5 14 000 978 6.98±0. мыши с волосяным покровом 0 14 18 300 85 0.46±0. 10 мин имитация ИКС (14 сут) 10 15 500 73 0.45±0. 10 мин ИКС (14 сут) 11 27 700 82 0.36±0. 10 мин ИКС(14 сут) +1.5 Гр через 1 сут 20 62 000 2782 4.42±0.31* 10 мин (имитация ИКС) (14 сут) +1.5 Гр 19 52 000 3373 6.63±0. через 1 сут 1.5 Гр 30 54 000 4299 7.81±0. 0.1 Гр+1.5 Гр 11 26 000 1401 5.25±0.34* Примечание. Здесь и далее в таблицах: *Р0.05 по сравнению с группой мышей, облученной только в дозе 1.5 Гр.
Из результатов, представленных в табл. 1, видно, что у мышей, как с удаленным, так и неудаленным волосяным покровом уровень цитогенетических повреждений при облучении их ИКС и при имитации (выключенный прибор) его действия не отличался от спонтанного уровня. В работе японских исследователей (Nagasawa et al., 2000) на мышах ICR также было показано отсутствие эффекта ИКС на спонтанные уровни репродуктивности и компонентов плазмы крови. Отсутствие цитотоксического и генотоксического эффектов облучения низкоинтенсивным красным лазером (660 нм) на эритролейкемических клетках было показано и в работе (Logan et al., 1995). В то же время длительное воздействие длинноволнового ИКС как в светлое, так и в темное время суток повышало спонтанную двигательную активность мышей, а его фракционированное воздействие увеличивало эту активность только в светлую часть суток (Nagasawa et al., 2000). В работе (Лебедева и др., 1990) на роговице мышей показано, что различные дозы УФ лазерного действия (193, 223 и 248 нм) индуцируют очевидный мутагенный эффект.
Воздействие РИ на мышей, предварительно облученных ИКС, приводило к значительному уменьшению уровня цитогенетических повреждений как у животных с волосяным покровом, так и без него, по сравнению с группой мышей, облученных только одной дозой 1.5 Гр. Это может свидетельствовать об индукции перекрестного АО, причем его величина равна величине РАО при облучении мышей РИ. Защитный эффект был также обнаружен на нормальных фибробластах человека при действии на них ИКС (700-2000 нм) и последующего ультрафиолетового излучения, токсичного для этих клеток (Menezes et al., 1998). При имитации облучения ИКС и последующем облучении в дозе 1,5 Гр как у мышей с волосяным покровом, так и без него уровень цитогенетических повреждений не отличался от уровня повреждений после облучения этих животных только в дозе 1.5 Гр. Величина АО у мышей с волосяным покровом и без него сравнима по величине с РАО, полученным при облучении мышей по стандартной схеме АО, поэтому все дальнейшие эксперименты проводили на мышах с волосяным покровом.
Для определения минимального времени действия ИКС, необходимого для индукции АО, проводили эксперименты с многократным облучением ИКС по 10 мин в течение 1, 3, 7 и 14 сут и последующим рентгеновским облучением в дозе 1.5 Гр (табл. 2). Было выявлено значительное уменьшение выхода цитогенетического повреждения во все исследуемые сроки действия ИКС, то есть наблюдался АО. Исходя из этих данных, в последующих опытах для индукции АО мышей облучали ИКС однократно в течение 10 мин.
Таблица 2. Количество ПХЭ с МЯ в клетках костного мозга мышей при сочетанном действии ИКС по 10 мин/cут в течение 1, 3, 7 и 14 сут и РИ в дозе 1.5 Гр Воздействие Кол-во Число Число ПХЭ мышей анализи- ПХЭ с МЯ, % ных c МЯ ПХЭ 0 14 18 300 85 0.46±0. 10 мин имитация ИКС 8 14 000 1027 7.05±0. (14 сут) +1.5 Гр 10 мин ИКС (14 сут) + 1.5 Гр 15 40 000 1857 4.67±0.24* 10 мин ИКС (7 сут) + 1.5 Гр 15 40 000 1780 4.40±0,62* 10 мин ИКС (3 сут) + 1.5 Гр 5 10 000 449 4,50±0,31* 10 мин ИКС (1 сут) +1.5 Гр 5 14 000 486 3.50±0.28* 1.5 Гр 15 27 000 2426 8.22±0. Для исследования динамики формирования АО нами были взяты интервалы между адаптирующими и выявляющей дозами, равные 30 мин, 1, 3, 5, 24 ч и 2 месяца. Эти сроки были определены ранее при изучении динамики РАО, индуцированного -лучами у мышей (Заичкина и др., 1998). На рис. 1.
представлены данные по изучению зависимости количества ПХЭ с МЯ в костном мозге мышей от времени между адаптирующими и выявляющим РИ в дозе 1.5 Гр воздействиями. Из рисунка видно, что уменьшение Рис. 1. Зависимость количества ПХЭ с МЯ в костном мозге мышей от времени между адаптирующими ИКС (а) и РИ в дозе 0.1 Гр (б) воздействиями и выявляющей дозой 1.5 Гр рентгеновского излучения цитогенетического повреждения как после адаптирующего воздействия ИКС, так и после адаптирующего воздействия РИ в дозе 0.1 Гр, наблюдается не ранее, чем через 5 ч и остается на этом уровне до 2-х месяцев, т.е наблюдается АО. Подобная динамика индукции АО наблюдалась на различных объектах при использовании малых доз -излучения в качестве адаптирующего воздействия (Балакин и др., 1998;
Заичкина и др., 1998, 1999, 2003). Облучение животных ИКС и рентгеновским излучением за 0.5 ч до рентгеновского облучения в дозе 1.5 Гр по схеме изучения действия радиопротекторов не выявило уменьшения количества ПХЭ с МЯ. В отличие от наших данных, в работе (Karu et al., 2005) показано, что предобработка HeNe лазером монослоя HeLa клеток увеличивает их выживаемость после гамма-излучения в дозе 5 Гр при интервале между воздействиями 60 и 180 мин, а в случае пятиминутного интервала кривые выживаемости совпадали. Авторы предполагают, что облучение HeNe лазером активизирует процессы репарации, и что этот феномен может являться АО.
Из таблицы 3 видно, что при использовании в качестве адаптирующего действия последовательного облучения ИКС и рентгеновского излучения в дозе 0.1 Гр и последующего через 24 ч дополнительного облучения выявляющей дозой 1.5 Гр не наблюдали дополнительного уменьшения повреждения, по сравнению с уровнем цитогенетического повреждения, которое наблюдается при адаптирующем действии только 0.1 Гр или только ИКС. Эти данные Таблица 3. Количество ПХЭ с МЯ в клетках костного мозга мышей при сочетанном воздействии ИКС и РИ в дозе 0.1 Гр и последующим облучении в дозе 1.5 Гр Воздействие Кол-во Число Число ПХЭ мышей анализир ПХЭ с МЯ, % ованных с МЯ ПХЭ 0 14 18 300 85 0.46±0. 10 мин воздействия ИКС 11 27 700 82 0.36±0. 10 мин (имитация ИКС) +0.1 Гр+1.5 Гр 5 18 000 810 4.47±0.67* 10 мин ИКС+0.1 Гр +1.5 Гр 15 48 200 2527 5.22±0.27* 1.5 Гр 30 54 000 4299 7.81±0. 0.1 Гр+1.5 Гр 11 26 000 1401 5.25±0.34* 0.1 Гр+0.1 Гр+1.5 Гр 5 22 000 1143 5.20±0.33* совпадают с результатами, полученными при фракционированном адаптирующем рентгеновском облучении (0.1 Гр + 0.1 Гр) и последующим выявляющем облучением в дозе 1.5 Гр. Полученные данные могут свидетельствовать о едином механизме индукции адаптивного ответа этими видами излучений у мышей in vivo.
Для обнаружения эффектов действия ИКС необходимым условием является длина волны. Так, в работе (Bradford et al., 2005) на лимфоцитах человека показано, что действие ИКС 1072 и сочетанного действия ИКС 1072 и ИКС 1268 не влияло на жизнеспособность клеток, а облучение ИКС вызывало уменьшение клеточной выживаемости, по сравнению с необлученным контролем. Таким образом, показано, что эффекты ИКС на живые организмы выявляются в очень узком диапазоне длин волн. Многие авторы соглашаются с концепцией, что только определенные длины волн имеют терапевтический эффект (Kreisler et al., 2002, 2003;
Baxter, 1994;
Castro et al., 1983).
На рис. 2 представлены данные по измерению массы тимусов после облучения мышей адаптирующими дозами ИКС и 0.1 Гр и через 24 ч выявляющей дозой 1.5 Гр РИ. Видно, что при обоих адаптирующих воздействиях на мышей масса тимуса после облучения в дозе 1.5 Гр восстанавливалась до контрольного значения (1.33 ± 0.09) по сравнению со значением массы тимуса при облучении только одной дозой 1.5 Гр (0.83 ± 0.04), *р0.05 по сравнению с группой мышей, облученной только дозой 1.5 Гр Рис. 2. Зависимость массы тимусов мышей, предоблученных ИКС и РИ в дозе 0.1 Гр по схеме адаптивного ответа которая приводила к резкому снижению массы органа. Таким образом, в тимусе, как и в клетках костного мозга, также наблюдается индукция равных по величине АО при обоих видах излучений. Масса тимуса при облучении животных только адаптирующими воздействиями практически не отличается от ее значения в контрольной группе. Таким образом, можно предположить, что ИКС, так же как и РИ в дозе 0.1 Гр, стимулирует процессы кроветворения.
Было показано, что низкие дозы радиации (0.05 – 0.1 Гр) также оказывают стимулирующий эффект на пролиферацию тимоцитов крыс (Shapochnikova et al., 1995), иммунную систему и способствуют адаптации клеток (Liu, 1995).
*р0.05 по сравнению с контрольной группой мышей Рис. 3. Динамика роста солидной формы карциномы Эрлиха у мышей после адаптирующих воздействий инфракрасным светом и рентгеновским излучением в дозе 0.1 Гр.
1 ИКС (3 дн) + опухоль;
2 0.1 Гр + опухоль;
3 опухоль + ИКС (3 дн);
опухоль.
На рис. 3 представлены результаты по динамике роста солидной формы асцитной карциномы Эрлиха у мышей, облученных ИКС и рентгеновским излучением. Видно, что объем опухоли в зависимости от времени после адаптирующих воздействий уменьшался начиная с 24 дня по сравнению с контрольной группой, т.е. наблюдалось торможение скорости роста опухоли. В работе (Hong et al., 2001) также было показано подавление пролиферации опухолевых клеток, предоблученных электромагнитными полями с разными длинами волн. Аналогичные результаты были получены другими авторами при облучении мышей ИКС (Nagasawa et al., 1999 a, b;
Toyokawa et al., 2003). Как видно из рис. 3. воздействие ИКС в течение 3 дней после перевивки опухоли не влияло на ее объем. В отличие от наших данных на мышах SHR с опухолью Эрлиха было показано, что модулированное в диапазоне 5-8 Гц резонансное акустическое воздействие (ежедневно по 10 мин в течение 20 дней) оказывает противоопухолевое действие после перевивки опухоли (Громов и др., 2006).
Аналогичное действие на уже имплантированную под кожу саркому М- оказывал лазерный аппарат (661 нм, 0.48 Вт/см2) (Романко и др., 2005).
* p0.05 по сравнению с контрольной группой (фон) Рис. 4. Зависимость уровня продукции АФК в клетках крови мышей от времени после воздействия инфракрасным (a) и рентгеновским в дозе 0.1 Гр (б) излучениями На рис. 4 представлены зависимости уровня продукции АФК в клетках крови мышей от времени после облучения ИКС и РИ в дозе 0.1 Гр. Видно, что уровень продукции АФК растет сразу после адаптирующих воздействии и достигает максимального значения через 0.5 ч, затем постепенно снижается до фонового значения к 5 ч и остается на том же уровне до 24 ч.
В работах многих авторов на различных объектах показано увеличение продукции АФК при воздействии различными повреждающими агентами. Так, на нормальных фибробластах легких человека через 30 мин после воздействия -частицами в дозах 3.6-19.0 сГр наблюдали возрастание продукции АФК и интерлейкина-8, обладающего промитогенным действием (Narayanan et al., 1999). На 2 месячных самцах мышей линии С57BL/6 с удаленным волосяным покровом при облучении в течение 30 мин УФ-лампой зоны «В» («ЛЭ-30», 5. Вт/м2) было показано, что излучение не подавляло индуцированное иммобилизованным стрессом увеличение активности супероксиддисмутазы (СОД), однако снижало уровень церулоплазмина в плазме крови и содержание кортикостероидов в надпочечниках мышей (Ахалая и др., 2006).
В опытах на клетках пяти линий карциномы установлено, что уже спустя несколько минут после воздействия -излучением в дозах 1-10 Гр продукция АФК усиливается и не зависит от дозы. Наблюдавшийся эффект активации продукции АФК авторы объясняют увеличением числа клеток, в которых оно происходило (Leach et al., 2001). При облучении крови пациентов с хронической ишемической болезнью сердца УФ-облучателем и низкоинтенсивным He-Ne лазером было показано методом индуцированной хемилюминесценции усиление продукции АФК в плазме крови (Гавришева и др., 1999). В отличие от наших данных при исследовании как фибробластов легких человека, подвергнутых воздействию -частицами в дозах 0.4-19 сГр, так и при инкубации необлученных клеток в супернатанте суспензии облученных клеток наблюдается увеличение продукции АФК в течение 24 ч (Narayanan et al., 1997). Поглощение красного и ИК излучения компонентами дыхательной цепи митохондрий способствует повышению продукции АФК, аденозинтрифосфата или циклического аденозинмонофосфата, а также инициирует работу внутриклеточных сигнальных каскадов, промотирующих клеточную пролиферацию и цитопротекцию (Grossman et al., 1998;
Karu et al., 1999;
Duan et al., 2001;
Lavi et al., 2003). Современные данные свидетельствуют о том, что низкоинтенсивное лазерное излучение в красном и ИК-диапазонах действует на клетки через фотоакцепторные молекулы цитохром С оксидазы – терминального фермента электрон-транспортной цепи митохондрий (Karu et al., 1999;
Pastore et al., 2000;
Elles et al., 2004;
Liang et al., 2006). На клетках человека и крыс показаны роль митохондрий в восстановлении внутриклеточных органоидов, их мембран, а также связь энергетических процессов с репарацией ядра. Предложена новая гипотеза единого механизма действия радиозащитных и лечебных препаратов, заключающаяся в активации окислительного фосфорилирования и биогенеза митохондрий, что обеспечивает увеличение скорости репарации клетки. Обнаружено ранее неизвестное свойство митохондрий определять гомеостаз клетки. Авторы предполагают, что активация окислительного фосфорилирования митохондрий - путь защиты клетки от экстремальных состояний, а именно, от лучевого воздействия и опухолевого перерождения (Козырев и др., 2002). В работе американских исследователей на культуре стромальных клеток костного мозга показано, что радиация вызывала дозо- (0, 1, 2, 5 Гр) и времязависимое (6, 12, 24, 48 ч) возрастание увеличения АФК (Kondo et al., 2007). Таким образом, полученные результаты указывают на то, что как ионизирующее, так и неионизирующее излучения могут усиливать продукцию АФК, которая зависит от времени после воздействия.
* p0.05 по сравнению с группой мышей, облученных в дозе 1.5 Гр Рис. 5. Зависимость уровня продукции АФК в клетках крови мышей от времени между адаптирующими дозами инфракрасного (а) и рентгеновского в дозе 0. Гр (б) излучений и выявляющей дозой 1.5 Гр При изучении индукции радиационного АО в костном мозге мышей in vivo через 0.5, 3, 5, 24 ч и 2 мес между адаптирующим в дозе 0.1 Гр и выявляющим в дозе 1.5 Гр воздействиями -лучами было показано, что АО индуцируется не ранее 5 ч [Балакин и др., 1998;
Заичкина и др., 1998], поэтому в данной работе мы определяли количество цитогенетических повреждений в костном мозге и продукцию АФК в цельной крови мышей в эти же временные интервалы. Из рис. 5 видно, что при облучении мышей обоими адаптирующими излучениями уровень продукции АФК после выявляющего воздействия снижается до контрольного значения так же к 5 ч, как и в случае облучения только адаптирующими дозами (рис. 4), и остается на этом уровне в течение 2-х месяцев, т.е., как и в случае -излучения, индуцируется АО. При облучении мышей только выявляющей дозой 1.5 Гр наблюдается максимальный уровень продукции АФК до 28 ч.
Некоторые авторы считают, что одним из возможных механизмов адаптационных процессов, индуцируемых воздействием радиации в малых дозах, является включение антиоксидантной защиты (Cramers et al., 2005). Так при сочетанном воздействии СОД и -излучения в дозе 0.1 Гр и последующим выявляющем воздействием в дозе 1.5 Гр не наблюдается уменьшение цитогенетического повреждения в клетках костного мозга мышей, т.е. АО исчезает, в отличие от животных, предоблученных только в дозе 0.1 Гр излучения (Заичкина и др., 2004). Однако, в работе Засухиной Г.Д. было показано, что выключение активности СОД не отражается на формировании АО как в здоровых, так и в репаративно-дефектных клетках человека (Засухина и др., 2004).
При исследовании хронического воздействия -излучения на мышей в течение 1 года в дозе 63.7 сГр (0.1745 сГр/сут) были показаны повышение активности репликативного и репаративного синтезов ДНК по отношению к контролю и некоторая тенденция к повышению содержания супероксидного анион-радикала. Обнаружена достоверная корреляционная связь между поврежденностью ДНК и содержанием супероксидного анион-радикала в клетках костного мозга, указывающая на большую повреждаемость ДНК оксирадикалами (Мазурик и др., 2002).
Далее нами была изучена возможность передачи генетических повреждений трем поколениям мышей, облученных ИКС или РИ в дозе 0.1 Гр.
Результаты рис. 6 демонстрируют, что у поколений мышей от адаптированных ИКС и РИ в дозе 0.1 Гр была снижена радиочувствительность и отсутствовала способность к индукции АО. При этом величина спонтанного фона была одинаковой как у потомков от облученных, так и не облученных самцов.
адаптирующая доза 0.1 Гр +1.5 Гр 1.5 Гр Число ПХЭ с МЯ, % 6 * F1 от F1 от cамцов, F1 от самцов, F2 от самцов, F3 от самцов, необлученных облученных 0.1 облученных облученных облученных самцов Гр ИКС ИКС ИКС Рис. 6. Количество ПХЭ с МЯ в клетках костного мозга у поколений от адаптированных мышей, облученных по схеме АО адаптирующая доза 0.1 Гр + 1.5 Гр 1.5 Гр 2, Индекс тимуса 1, * 0, F1 от F1 от самцов, F1 от самцов, F2 от самцов, F3 от самцов, необлученных облученных 0.1 облученных облученных облученных самцов Гр ИКС ИКС ИКС Рис.7. Масса тимусов у поколений от адаптированных мышей, облученных по схеме АО При облучении по схеме АО масса тимусов у потомков от адаптированных мышей не восстанавливалась до контрольного значения (рис.
7) и примерно была равна значению массы тимусов при облучении только одной дозой 1.5 Гр. Таким образом, и по этому критерию не наблюдается индукция АО у поколений от облученных мышей в отличие от поколения необлученных животных.
Рис. 8. Динамика роста солидной формы АКЭ у поколений самцов, облученных ИКС или РИ в дозе 0.1 Гр Результаты, представленные на рис. 8, демонстрируют, что у трех поколений мышей, от облученных ИКС или РИ в дозе 0.1 Гр, средний размер опухоли не отличается от такового у контрольных мышей.
ВЫВОДЫ 1) облучение мышей ИКС с длиной волны 850 нм, модулированной частотой 101 Гц, также, как и РИ в дозе 0.1 Гр, индуцирует равные по величине и временной динамике адаптивные ответы, которые сохраняются до 2-х месяцев;
2) облучение мышей ИКС и РИ в дозе 0.1 Гр восстанавливает массу тимусов до контрольного значения после выявляющего облучения в дозе 1. Гр;
3) впервые выявлена связь между уровнем продукции АФК и индукцией АО у мышей при действии ИКС и РИ: уровень продукции АФК достигает максимального значения через 0.5 ч и снижается до контрольного уровня к 5 ч после облучения, времени необходимого для проявления АО;
4) предоблучение мышей ИКС или РИ в дозе 0.1 Гр вызывает торможение скорости роста асцитной карциномы Эрлиха в солидной форме, воздействие ИКС после перевивки опухоли не вызывает торможения ее скорости;
5) облучение мышей ИКС или РИ в дозе 0.1 Гр индуцирует генетическую нестабильность у потомства, которая выявляется с помощью теста «адаптивный ответ» в клетках костного мозга и тимуса и скорости роста опухоли, по крайней мере, в трех поколениях.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. С.И. Заичкина, О.М. Розанова, А.Р. Дюкина, А.Х. Ахмадиева, Г.Ф.
Аптикаева, С.П. Романченко, Х. Мюллер. Инфракрасный свет, модулированный частотой 101 Гц, индуцирует цитогенетический адаптивный ответ в костном мозге мышей in vivо. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2009, Том 147, № 4, с. 407-410.
2. S.I. Zaichkina, O.M. Rozanova, G.F. Aptikaeva, A.Kh. Akhmadieva, E.N.
Smirnova, S.P. Romanchenko, O.A. Vakhrusheva, S.S. Sorokina, A.R. Dyukina.
Adaptive response and genetic instability induced by a low-dose rate radiation simulating the highaltitude flight conditions on mice in vivo. Int. J. Low Radiation, V. 6, № 1, 2009, Р. 28-36.
3. S.S. Sorokina, S.I. Zaichkina, O.M. Rozanova, G.F. Aptikaeva, A.Kh.
Akhmadieva, E.N. Smirnova, S.P. Romanchenko, O.A. Vakhrusheva, A.R.
Dyukina and V.N. Peleshko. Delayed effects of chronic low-dose high linear energy transfer (LET) radiation on mice in vivo. J. Radiation Protection Dosimetry. 2010, P. 1–6.
4. А.Р. Дюкина, С.И. Заичкина, О.М. Розанова, С.П. Романченко, В.Н.
Мальцева, Г.Ф. Аптикаева. Влияние инфракрасного и рентгеновского излучений на продукцию активных форм кислорода и индукцию цитогенетических повреждений в костном мозге мышей in vivo.
Радиационная биология. Радиоэкология. 2011, Т. 51, № 5. С. 536-541.
Список материалов в сборниках научных конференций 1. Дюкина А.Р., Заичкина С.И.,Розанова О.М., Романченко С.П., Сорокина С.С., Мюллер Х. Изучение защитных свойств инфракрасного света, модулированного частотой 101 Гц, на мышах IN VIVO //Человек и электромагнитные поля. Сборник докладов III Международной конференции 24-27 мая 2010 г. Саров. 2010.-С.271-280.
2. Заичкина С. И., Розанова О. М., Ахмадиева А. Х., Аптикаева Г. Ф., Смирнова Е.Н., Романченко С.П., Дюкина А.Р. Исследование сочетанного действия кверцетина и ионизирующей радиации на индукцию цитогенетического повреждения в клетках костного мозга мышей in vivo.
Материалы 5-й национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» Смоленск, Россия, 18-22 сентября 2007 г.
C. 429-431.
3. Sorokina S., Zaichkina S., Rozanova O., Aptikaeva G., Smirnova H., Romanchenko S., Dyukina A., Peleshko V. “Induction of adaptive response and genomic instability in mice by bendazol and chronic high-LET radiation”, P.79-82.
Proceedings of 37th Annual Meeting of the European Radiation Research Society (26-29 august, Prague, 2009).
4. Zaichkina S. I., Rozanova O. M., Dyukina A.R., Maltseva V.N., Aptikaeva G.
F., Sorokina S. S., Romanchenko S. P. and Mueller H. “Investigation of the combined action of infrared light modulated by 101 hz and X-rays on the cytogenetic damage and the production of reactive oxygen species in mice in vivo” – P. 174-176.
Proceedings of VI national scientific-practical conference with international participation "Reactive oxygen species, nitric oxide, antioxidants and human health" (Smolensk, september 14-18, 2009.) – 183 p.
5. Sorokina S. S., Zaichkina S. I., Rozanova O. M., Aptikaeva G. F., Akhmadieva A. Kh., Smirnova E. N., Romanchenko S. P., Vakhrusheva O. А., Dyukina A. R., Peleshko V. N. Low-dose-rate high-let radiation induces adaptive response and genetic instability in mice in vivo. – P.101-105. Proceedings of The International Conference «Biological effects of low dose of ionizing radiation and radioactive contamination of the environment» (September 14-17, 2009, Syktyvkar, Komi Republic, Russia).
6. С.И. Заичкина, О.М. Розанова, А.Р. Дюкина, С.П. Романченко, В.Н.
Мальцева. Инфракрасный свет (850 нм), модулированный частотой 101 Гц, индуцирует адаптивный ответ в костном мозге и крови мышей in vivo. Сборник материалов III Евразийского конгресса по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика – 2010», Москва, МГУ, 21-25 июня 2010 г. С. 7-10.
7. A.R. Dyukina. Study of the infrared light (850 nm), modulated by 101 Hz, action on the cross adaptive response induction and the reactive oxygen species production in mice in vivo. Third International Conference, Dedicated to N.W.
Timofeeff-Ressovsky "Modern problems of genetics, radiobiology, radioecology and evolution", Third readings after V.I. Korogodin and V.A. Shevchenko, NATO Advanced Research Workshop “Radiobiological issues pertaining to environmental security and ecoterrorism” “Abstracts. Papers by young scientists”, Alushta, 9- October 2010. P. 59, p. 185-187.
Список тезисов 1. Дюкина А.Р., Заичкина С.И., Розанова О.М., Ахмадиева А.Х., Аптикаева Г.Ф., Романченко С.П., Сорокина С.С., Мюллер Х. Инфракрасный свет, модулированный частотой 101 Гц, индуцирует цитогенетический адаптивный ответ в костном мозге мышей in vivo. 12-тая Международная Пущинская школа – конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века» (10-14 ноября 2008г, Пущино). – С. 127.
2. С.И. Заичкина, О.М. Розанова, А.Р. Дюкина, А.Х. Ахмадиева, Г.Ф.
Аптикаева, С.П. Романченко, С.С. Сорокина, Х. Мюллер. «Влияние предоблучения мышей инфракрасным светом, модулированным частотой Гц, на уровень цитогенетических повреждений в костном мозге, массу тимусов и скорость роста карциномы Эрлиха» (V Международный конгресс «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург, июня – 3 июля, 2009).
3. А.Р. Дюкина, С.И. Заичкина, О.М. Розанова, В.Н. Мальцева, С.С.
Сорокина, С.П. Романченко «Изучение горметического действия инфракрасного света на мышах in vivo» 13-тая Международная Пущинская школа – конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века» ( сентября-2 октября 2009г, Пущино). – С. 101-102.
4. S.I. Zaichkina, O.M. Rozanova, A.R. Dyukina, S.P. Romanchenko, S.S.
Sorokina, A. E. Shemjakov, G. F. Aptikaeva, H.N. Smirnova, V.E. Balakin, Н.
Muller. “Influence of low doses of different physical and chemical agents on the induction of cytogenetic adaptive response and the growth of solid tumor in mice in vivo”. The 2sd International Conference Medical Radiations: Research and Applications (7-9 April 2010, Marrakech – Morocco).
5. Sorokina S.S., Zaichkina S.I., Rozanova O.M., Dyukina A.R., Romanchenko S.P., Aptikaeva G.F., Smirnova H.N., O.A.Vakhrusheva. «Cross-adaptation as the way to the enhance of organism protective responses in vivo». The 38th annual meeting of the European Radiation Research Society, Stoсkholm, Sweden, 05- September, 2010.
6. S.I Zaichkina, O.M. Rozanova, A.R. Dyukina, V.N. Maltseva, G.F. Aptikaeva, S.S. Sorokina, S.P. Romanchenko, Н. Mueller. The effect of infrared light modulated by 101 Hz and X-rays pre-exposures on the cytogenetic damage and reactive oxygen species production in mice in vivo. 38th Annual Meeting of the European Radiation Research Society (ERR), Abstracts, Stockholm, 5-9 September 2010, p. 69.
7. Svetlana I Zaichkina, Olga M. Rozanova, Alsu R. Dyukina, Valentina N.
Maltseva, Gella F. Aptikaeva, Svetlana S. Sorokina, Sergei P. Romanchenko, Нartmut Mueller Investigation of the combined action of infrared light modulated by 101 Hz and X-rays on the cytogenetic damage and the production of reactive oxygen species in mice in vivo. European society for photobiology, 2010 photobiology school june 21-26, 2010, in brixen/bressanone, Italy. Programme Poster Abstracts, p.
10.
8. Дюкина А.Р. Изучение горметического действия инфракрасно света и рентгеновского излучения на мышах in vivo. Сборник работ молодых ученых ИТЭБ РАН 20-21 октября 2009 г. Пущино 2009 г. С. 25-26.
9. С.И. Заичкина, О.М. Розанова, А.Р. Дюкина, С.П. Романченко, В.Н.Мальцева,С.С. Сорокина, Х. Мюллер. Изучение горметического действия инфракрасного и рентгеновского излучений на мышах in vivo. VI Съезд по радиационным исследованиям 25-28 октября 2010 года (Москва). С. 188.
10. А.Р. Дюкина. Влияние инфракрасного света, модулированного частотой 101 Гц, и рентгеновского излучения на генетический аппарат и выживаемость f0 и f1 поколения мышей in vivo. 14-тая Международная Пущинская школа – конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века» (19 -23 апреля 2010г, Пущино). C. 127.
11. С.И. Заичкина, О.М. Розанова, А.Р. Дюкина, С.П. Романченко, С.С.
Сорокина. Изучение биологического действия инфракрасного света на мышах и их потомках. Материалы IV Международной школы молодых ученых по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки», Москва-Звенигород, ноября – 3 декабря 2010. С. 77-79.
12. А.Р. Дюкина. Исследование биологического действия инфракрасного света, модулированного частотой 101 Гц, на мышах и их потомках. 15-тая Международная Пущинская школа – конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века» (18 -22 апреля 2011 г, Пущино). C. 165-166.
13. А.Р. Дюкина, С.И. Заичкина, О.М. Розанова, С.П. Романченко, Г.Ф.
Аптикаева, С.С. Сорокина, А.Е. Шемяков. Изучение биологического действия инфракрасного света на мышах и их потомках. Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии: Тезисы докладов Российской научной конференции с международным участием, Санкт-Петербург, 19-20 мая 2011 г. – Спб: ООО «Издательство Фолиант», 2011. С. 130.
14. A.R. Dyukina, S.I Zaichkina, O.M. Rozanova, S.P. Romanchenko. Infrared light induced protective effect and transgenerational genetic instability on mice and their offspring. Programe book of abstract. 14 Congress of the European Society for Photobiology. september 1-6, 2011, Geneva, Switzerland. P. 135.
15. A.R. Dyukina, S.I Zaichkina, O.M. Rozanova, S.P. Romanchenko, G.F.
Aptikaeva, S.S. Sorokina. The study of biological action of infrared light on mice and their offspring. Programe guide and book of abstracts. 14 International Congress of radiation research. Incorporatihg 57 annual meeting of the Radiation Research Society. Agust 28 - September 1, 2011. Warsawa, Poland. P. 288.