Изучение биологической активности наночастиц меди, различающихся по дисперсности и фазовому составу
На правах рукописи
РАХМЕТОВА АЛЛА АЛЕКСАНДРОВНА ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НАНОЧАСТИЦ МЕДИ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО ДИСПЕРСНОСТИ И ФАЗОВОМУ СОСТАВУ Специальность 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Москва 2011
Работа выполнена в Институте Энергетических проблем Химической Физики РАН и на кафедре фармацевтической и токсикологической химии Медицинского факультета Российского университета дружбы народов
Научный консультант:
Богословская Ольга Александровна кандидат биологических наук, доцент
Официальные оппоненты:
Сяткин Сергей Павлович доктор биологических наук, профессор Саломатин Евгений Михайлович доктор фармацевтических наук, профессор
Ведущая организация: Московский государственный университет имени М.В.
Ломоносова факультет фундаментальной медицины
Защита диссертации состоится 21 октября 2011 года в 14:30 на заседании диссертационного совета Д 212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая д.8/2.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая д.6.
Автореферат разослан 19 сентября 2011 года
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Лукашева Е.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы:
Актуальной проблемой фармации является создание и стандартизация лекарственных средств для лечения раневых повреждений различной этиологии. Эффективность и безопасность используемых фармацевтических препаратов обеспечивает благоприятное течение раневого процесса и быстрое восстановление трудоспособности пациентов. Происходящие глобальные негативные изменения природной среды не могут не влиять на биологические свойства раневой микрофлоры и иммунную защиту человека, что оказывает воздействие на заживление ран [Абаев Ю.К., 2006].
В настоящее время продолжается поиск оптимальных методов стимуляции заживления ран, ожогов, трофических язв. Местное консервативное лечение с использованием мазей, гелей, повязок, линиментов, играет важную роль в комплексной терапии поражений кожи и сокращает сроки заживления ран [Кузин М.И., Костюченок Б. М.,1990].
Одним из перспективных направлений создания новых лекарственных средств, в том числе, и обладающих ранозаживляющим действием, является использование наноматериалов в составе лекарственных форм. Установлено, что наночастицы металлов, обладают физико-химическими свойствами, отличающимися, как от свойств массивных металлических объектов, так и от свойств отдельных атомов. При попадании в живые организмы наноразмерные частицы металлов вызывают биологический ответ, отличающийся от действия традиционной ионной формы элементов [Глущенко Н.Н., 1982-2011]. Показано, что наночастицы d-элементов при парэнтеральном введении в 7–50 раз менее токсичны, чем металлы в ионной форме. Наночастицы легко проникают во все органы и ткани и обладают пролонгированным действием. В биотических дозах они стимулируют обменные процессы и проявляют многофункциональное действие [Глущенко Н.Н., 1982-2011].
В США для лечении ран, ожогов, трофических язв, экземы, угревой сыпи широко используют повязки торговых марок Acticoat, Nucryst, в состав которых входят наночастицы серебра [Wright J.B., 2004;
Burrell R.E., 2005].
В то же время в практике лечения ран разной этиологии сохраняется высокая потребность в мягких лекарственных формах. В связи с этим наши разработки направлены на создание мягких лекарственных форм, включающих наночастицы металлов, в частности, наночастицы меди. Функция меди в организме хорошо изучена и доказана абсолютная её необходимость на всех стадиях течения раневого процесса.
Цель и задачи исследования Целью исследования является изучение биологической активности наночастиц меди, различающихся по дисперсности и фазовому составу, для создания мягкой лекарственной формы.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Установить антибактериальную активность наночастиц меди с разной дисперсностью и фазовым составом на тест-культурах клеток грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.
2. Определить показатели острой токсичности наночастиц меди, отличающихся по дисперсности и фазовому составу.
3. Разработать состав мази с наночастиц меди и лабораторно технологическую схему ее получения.
4. Оценить антибактериальную активность разработанной нами мази с наночастицами меди на тест-культурах клеток грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.
5. Изучить влияние созданной нами мази с наночастицами меди, различающимися по дисперсности и фазовому составу, на процесс ранозаживления в модельных экспериментах.
6. Разработать оптимальный метод контроля качества мазей с наночастицами меди по показателю «определение подлинности».
Положения, выносимые на защиту:
1. Способность наночастиц меди, различающихся по дисперсности и фазовому составу, оказывать антибактериальное действие в зависимости от их концентрации и вида микроорганизма.
2. Основные токсикологические характеристики наночастиц меди, отличающихся по дисперсности и фазовому составу.
3. Состав разработанной мягкой лекарственной формы и лабораторно технологическая схема ее получения.
4. Ранозаживляющие свойства мазей с наночастицами меди, различающимися по дисперсности и фазовому составу, в модельных экспериментах.
5. Антимикробная активность мази с наночастицами меди.
6. Контроль качества мазей с наночастицами меди по показателю «определение подлинности».
Научная новизна:
Впервые показано, что наночастицы меди с различной дисперсностью и фазовым составом проявляют антимикробную активность в отношении тест культур клеток грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.
Впервые показано, что наночастицы меди, обладающие различной дисперсностью и фазовым составом имеют разные токсикологические характеристики.
Впервые создана мягкая лекарственная форма – мазь с наночастицами меди, различающимися по дисперсности и фазовому составу, и разработана лабораторная технологическая схема её получения.
Впервые установлено, что наночастицы меди, отличающиеся дисперсностью и фазовым составом, оказывают разное стимулирующее действие на процесс ранозаживления.
Впервые показано, что мазь с наночастицами меди обладает антимикробными свойствами.
Впервые для контроля качества мягких лекарственных средств, содержащих наночастицы меди, предложена сканирующая электронная микроскопия образцов мази.
Практическая значимость работы:
Предложенная лабораторная схема получения мази с наночастицами меди может быть положена в основу заводской технологии приготовления мягких лекарственных форм с наночастицами меди.
Обнаруженная антимикробная активность наночастиц меди является основанием для использования их в качестве антимикробных агентов при создании антисептических медицинских и технических материалов, лаков, красок и т.д.
Полученные результаты о ранозаживляющей активности мазей, содержащих наночастицы меди различной дисперсности и фазового состава, свидетельствуют о необходимости проведения материаловедческой аттестации используемых наночастиц металлов для медицинских целей.
Метод сканирующей электронной микроскопии образцов мази может быть рекомендован для доказательства подлинности мягких лекарственных форм с наночастицами меди на фармацевтических предприятиях.
Полученные результаты расширяют теоретические представления о механизмах действия наночастиц металлов на биологические системы организма.
Результаты исследования могут быть включены в учебные программы дисциплин медицинских и ветеринарных специальностей при изучении разделов по микро- и макроэлементозам.
Приняты к утверждению два патента на изобретение: «Антимикробные агенты» рег. № 2010127540/15(039207) дата поступления 06.07.2010;
«Препарат, ускоряющий ранозаживление» рег. № 2011116961/15(025153) дата поступления 28.04.2011. Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение «Препарат, ускоряющий заживление ран» рег. № 2010126761/15(038118) 14.07. Диссертационная работа выполнена в Институте энергетических проблем химической физики РАН в Лаборатории биологического воздействия наноструктур в соответствии с планами научно-исследовательских работ – Гос. регистрация № 01120 807829 (2008-2012). Работа поддержана Грантами РФФИ № 07-08-00376, № 07-04-12200, № 09-04-13625.
Апробация работы:
Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на конференции студентов и молодых ученых "Клинические и теоретические аспекты современной медицины" (Москва, РУДН, 2008 г.), VII международной научной конференции студентов и молодых ученых "Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной физической культуры, физиотерапии и курортологии" (Москва, 2008), на Х Международном конгрессе "Здоровье и образование в XXI веке" (Москва, 2009), XIV Международном симпозиуме "Эколого-физиологические проблемы адаптации" (Москва, 2009), XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009), XXII симпозиуме «Современная химическая физика» (Туапсе, 2010).
Публикации:
По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, из них 3 в журналах списка ВАК и 1 патент.
Объем и структура диссертации:
Диссертационная работа изложена на 125 страницах, содержит таблиц, 20 рисунков. Работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследований, обсуждение результатов, заключение, выводы, список литературы, включающий 112 источников (в том числе 64 на иностранном языке) и приложения.
СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Объекты, материалы и методы исследования Объектами исследования являлись наночастицы меди, полученные методом высокотемпературной конденсации, разработанным М.Я. Геном [Ген М.Я., 1981] в ИХФ РАН им. Н.Н. Семенова, на установке Миген-3 [Жигач А.Н., 2000].
Для исследования было отобрано 5 образцов наночастиц меди, различающихся по дисперсности и фазовому составу. Основные физико химические характеристики наночастиц меди приведены в таблице 1.
Таблица Физико-химические характеристики наночастиц меди № Размер Фазовый состав Толщина образца наночастиц оксидной Содержание Другие формы меди меди, пленки, кристаллической нм нм Форма Содержание, меди, % меди % 103,0 ± 2,0 96,0 ± 4,5 4,0 ± 0, 1 CuO 47,0 ± 0,6 84,0 ± 4,2 16,0 ± 1, 2 CuO 86,8 ± 0,9 94,0 ± 4,3 6,0 ± 0, 3 CuO 4 119,0 ± 1,0 0,50 ± 0,02 CuO 90,45 ± 6,15 ** Cu2O 9,05 ± 0, 103,0 ± 2,0 71,4 ± 4,0 28,6 ± 0, 5 CuO «**» - наночастицы полностью окислены, за исключением ядра, содержащего (0,50 ± 0,02) % кристаллической меди.
Для исследования ранозаживляющих и токсических свойств наночастиц меди использовали взрослых мышей-самок линии SHK, массой 18–20 г.
Экспериментальные исследования на животных проводили в соответствии с международными требованиями [«The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals»,1996].
Для определения токсикологических характеристик наночастиц меди опытным животным внутрибрюшинно вводили 0,5 мл суспензии, содержащей наночастицы меди в различных концентрациях. Для приготовления суспензий точную навеску наночастиц меди помещали в дистиллированную воду и диспергировали на ультразвуковом диспергаторе УЗДН-2Т в режиме 0.5 А, кГц при охлаждении по следующей схеме: 20 сек. диспергирования – 1 мин.
охлаждения (3 цикла). Наблюдение за опытными животными проводили в течение 4-х недель. Критериями оценки острой токсичности служила выживаемость животных.
Антибактериальное действие наночастиц меди изучали на тест культурах грамотрицательных бактерий – Escherihia coli AB1157 (E. coli AB1157) госпитальный штамм раневых инфекций, полученный из музея НИИ микробиологии и эпидемиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН;
Escherihia coli К (E. coli К12) дикий тип из коллекции проф. Фредерика (США) и грамположительных бактерий – Staphylococcus аlbus (St. albus), полученный из музея кафедры микробиологии МГУ им М.В. Ломоносова.
Антибактериальную активность мазей, содержащих наночастицы меди, определяли на твердой питательной среде диффузионно-дисковым методом по зоне задержки роста клеток вокруг дисков с нанесенными на них наночастицами меди [Ruparelia J.P. et al., 2008;
Marius S. et al, 2011].
Фотографии чашек Петри обрабатывали на компьютере с использованием программы ImageJ для оценки диаметра зон задержки роста.
Изучение антимикробной активности наночастиц меди в жидкой питательной среде «М-9» оценивали по отношению абсорбции суспензии клеток в опытных образцах (с добавлением наночастиц меди) к абсорбции суспензии клеток в контроле (рост клеток без добавления суспензии наночастиц) [Биргер М.О., 1973]. Измерения проводили на спектрофотометре Hitachi Model 200-20 (Япония) при длине волны 630нм.
Параллельно с оценкой антимикробной активности наночастиц в жидкой питательной среде «М-9» проводили потенциометрическое измерение рН среды роста микробных клеток [ГФ ХII, 2007]. Измерение проводили на рН-метре фирмы «Metrohm» модель 692 рН/Ion Meter (Германия).
Измерение рН мазей проводили потенциометрически. Для этого готовили водную вытяжку (1:10) [ГФ ХII, 2007].
Микроскопические исследования образцов мази, содержащей наночастицы меди проводили на растровом электронном микроскопе Philips 515 (Голландия).
Для электроно-микроскопических исследований мази навеску мази растворяли в смеси толуола и этилового спирта (1:1). Отобранную пробу помещали на предметное стекло, после испарения растворителя исследуемый образец со стекла переносили на углеродный пластырь.
Оценку ранозаживляющего действия наночастиц меди в составе мази проводили на модели экспериментальных полнослойных ран. Под эфирным наркозом на спине у мышей выстригали шерсть, по трафарету наносили контуры раны (круг площадью 60 мм2), и вырезали полнослойный лоскут кожи. Все раны оставались открытыми вплоть до окончания опыта.
Мышам опытной группы сразу же после операции (а в дальнейшем ежедневно) на поверхность раны наносили 0,2 г мази с наночастицами меди.
Мышам контрольных групп наносили 0,2 г мазевой основы без наночастиц металла или 0,2 г заводской мази «Солкосерил».
Контуры раны 1 раз в сутки переносили на прозрачные плёнки и сканировали на сканере HP Scanjet 3970 (Китай). Площадь раны рассчитывали с помощью компьютерной программы ImageJ 1.30 v.
Для формализации биологического ответа были рассчитаны площади ран в % по отношению к первоначальной ране [Gul N.Y., 2008]:
S раны в день n S раны в день n в % = S раны в день операции Для оценки эффективности лечения ран рассчитывали ежесуточное уменьшение площади ран в % [Кузин М.И., Костюченок Б. М.,1990].
( S S n ) t = S t где: t – ежесуточное уменьшение площади ран, %/сутки;
S – величина площади раны при предшествующем измерении;
Sn – величина площади раны в настоящий момент;
t – число дней между первым и последующим измерением Полученные результаты обрабатывали общепринятыми статистическими методами с помощью пакета статистических программ STATISTICA 6.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Определение антибактериальной активности наночастиц меди, различающихся по дисперсности и фазовому составу Антибактериальное действие меди и её соединений известно с древних времён [Родимин Е.М., 2003]. В фармации меди сульфат используют в качестве антисептического и вяжущего средства [Машковский М.Д., 2006].
Развитие современных нанотехнологий позволяет получать наноразмерные структуры, в том числе, и наночастицы металлов. Сравнительное исследование антимикробной активности наночастиц серебра, меди, цинка и алюминия показало, что металлы тормозят рост клеток E. Coli В, и ряд токсичности элементов по мере убывания следующий: CuAgZnAl [Федоров Ю.И., Лебедев В.С., 1983]. Немногочисленные работы свидетельствуют о значении физико-химических характеристик наночастиц в проявлении антибактериальных свойств. Так, установлено, что при нагревании наночастиц серебра происходит их агрегация, уменьшение общего количества кислорода и снижение антибактериальной активности [Taylor P.L., et al, 2005]. Показано также, что наибольшее антибактериальное действие оказывают наночастицы серебра в форме усечённого треугольника в отличие от других кристаллических форм частиц [Pal S., et al, 2007].
Наши исследования были направлены на изучение антимикробных свойств наночастиц меди, различающихся по дисперсности и фазовому составу. Изучение антибактериального действия наночастиц диффузионно дисковым методом показало, что все изученные образцы обладают антибактериальной активностью в отношении клеток тест-культур как грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов (рис. 1).
Нами установлено, что существуют различия в эффективности действия наночастиц на рост микробных клеток. Показано, что наночастицы меди проявляют более выраженное антибактериальное действие в отношении грамположительных бактериальных клеток St. albus по сравнению с грамотрицательными клетками E. coli AB1157. Так, площадь зон задержки роста клеток тест-культур Г+ микроорганизмов St. albus при действии изученных образцов наночастиц меди на 11-31% больше, чем зона задержки роста клеток тест-культур Г- микроорганизмов E. coli AB1157. Видно, что наночастицы меди образцов № 1, 3, 4 (см. рис.1) практически одинаково воздействуют на клетки E. coli AB1157. В то же время ответ клеток St. albus на действие наночастиц разных образцов отличается. Так, зона задержки роста микробных клеток при действии наночастиц образца №3 на 16% больше, чем зона задержки роста при использовании наночастиц образца №1, и на 9% эффективнее, чем наночастицы меди образца №4.
1300, 1200, П лощадь зон задержки рос т а, мм 1100, 1000, 900, S t.albus E.coli 800, 700, 600, 1 3 № образца наночас т иц меди Рисунок 1. Площади зон задержки роста (мм2) клеток тест - культур St. albus и E. coli AB1157 при действии наночастиц образцов №1, №3, №4.
Нами изучено антимикробное действие наночастиц образца №1 в зависимости от их содержания в жидкой среде (М-9) на рост культуры клеток E. coli K12.
Установлено, что при добавлении к культуре клеток E. coli K наночастиц образца №1 в концентрациях от 1 до 10 мкг/мл, через 48 часов инкубации не происходит изменения биомассы бактериальных клеток по сравнению с первоначальным уровнем (рис. 2). При добавлении наночастиц образца №1 в концентрации 0,5 мкг/мл, объем биомассы микробных клеток через 48 часов инкубации увеличивается на 24% по сравнению с первоначальным уровнем, что свидетельствует о бактериостатическом действии наночастиц образца №1 в данной концентрации. Показано, что наночастицы меди образца №1, введенные в культуральную среду в концентрации 0,1 мкг/мл, не изменяют уровень биомассы в опытной группе по сравнению с контролем.
Рисунок 2. Изменение биомассы E. coli K12 (А630, О/К, %) через часов при добавлении наночастиц меди образца №1 в различных концентрациях в питательной среде (М-9).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что антимикробное действие наночастиц меди зависит от их содержания: в концентрациях от 1 до 10 мкг/мл наночастицы меди образца №1 оказывают бактерицидное действие, в концентрации 0,5 мкг/мл – бактериостатическое, а при концентрации наночастиц 0,1 мкг/мл антимикробное действие не проявляется.
Для установления различий в проявлении антимикробной активности наночастиц, различающихся по дисперсности и фазовому составу проведены сравнительные исследования наночастиц образцов №2 и №3. Показано, что в концентрации 0,2 мкг/мл через 48 часов инкубации с микробными клетками наночастицы образца №2 подавляют рост клеток E. coli K12 на 65%, а образца №3 – на 45%.
Следовательно, наночастицы меди с разной дисперсностью и фазовым составом обладают различной антимикробной активностью по отношению клеток тест-культур Г+ и Г- микроорганизмов.
2. Определение токсикологических характеристик наночастиц меди, различающихся по дисперсности и фазовому составу Исследования, проведенные в нашей лаборатории, свидетельствуют о меньшей токсичности наночастиц металлов, в том числе и меди, введенных внутрибрюшинно, по сравнению с солями (Глущенко Н.Н., 1989, Богословская О.А., 2008]. При сравнительном изучении острой токсичности меди в виде наночастиц, размером 23,5 нм, и меди хлорида, введенных перорально, также установлено, что токсичность наночастиц по показателю ЛД50 в 3,7 раза меньше, чем токсичность соли. [Сhen Z., 2006].
Изучение особенностей токсического действия наночастиц меди, различающихся по дисперсности и фазовому составу, проводили с образцами №1, №2, №3. Кроме того, параллельно исследовали токсикологические характеристики меди сульфата. Критериями оценки острой токсичности служили показатели: МПД, ЛД50 и ЛД100 (таблица 2).
Таблица Токсикологические показатели образцов наночастиц меди и меди сульфата Дозы**** МПД* ЛД50** ЛД100*** Образец меди мг/кг ммоль/кг мг/кг ммоль/кг мг/кг ммоль/кг №1 10,0±1,2 0,157±0,019 15,0±1,0 0,236±0,016 30,0±2,5 0,472±0, №2 7,5±0,2 0,118±0,003 11,0±0,8 0,173±0,013 20,0±1,0 0,315±0, №3 5,0±1,0 0,079±0,016 13,0±0,8 0,205±0,013 20,0±1,0 0,315±0, СuSO 5Н2О 1,5±0,2 0,024±0,003 3,5±0,6 0,055±0,009 7,0±0,7 0,110±0, *МПД - максимально переносимая доза, максимальная доза, которая не вызывает гибель животных **ЛД50 - доза, вызывающая 50 % гибель животных ***ЛД100 - доза, вызывающая 100 % гибель животных **** Дозы приведены в пересчете на металл.
Установлено, что изученные образцы наночастиц отличаются между собой по показателям токсичности. Например, МПД образца №3 в 2 раза ниже, чем МПД образца №1.
Установлено, что токсичность меди сульфата превосходит токсичность исследованных образцов наночастиц. Так, МПД для соли меди в 7 раз ниже, чем МПД образца №1, а ЛД50 и ЛД100 меди сульфата в 4,3 раза меньше данных показателей для образца №1, что свидетельствует о более высокой токсичности ионной формы меди.
Следует также отметить, что в рамках проведенных нами исследований наблюдается тенденция в увеличении токсичности по мере уменьшения размеров наночастиц. Так, ЛД50 образца №2 размером 47 нм на 15,4% ниже, чем ЛД50 образца №3 размером 86 нм, и на 26,7 % ниже ЛД50 образца № размером 103 нм (рис.3).
Рисунок 3. Диаграмма зависимости ЛД50 образцов наночастиц меди от их размера.
Лабораторная технологическая схема получения мази с 3.
наночастицами меди, её состав и доказательство подлинности Одной из актуальных проблем современной технологии, учитывая постоянный рост резистентности бактерий к действию сульфаниламидных препаратов, антибиотиков, антисептиков, является поиск агентов, компонентов или факторов, обеспечивающих антимикробное действие. В настоящее время в качестве антимикробных агентов могут выступать различные вещества органической и неорганической природы. Однако использование антимикробных агентов той или иной природы в медицине и фармации ограничено их безопасностью. В этом отношении более предпочтительны неорганические соединения, особенно эссенциальные металлы и их композиции, к которым относится медь. Исследования, представленные выше, показали, что наночастицы меди, с одной стороны, обладают слабой токсичностью, с другой стороны, проявляют высокий антимикробный эффект по отношению к клеткам тест-культур Г+ и Г микроорганизмов, что создает предпосылки для использования их в составе ранозаживляющих препаратов.
В связи с этим, при проведении дальнейших разработок мягких лекарственных форм с наночастицами меди нами был проведен выбор компонентов мази с учетом особенностей реакционной способности наночастиц металлов и разработана лабораторная технологическая схема получения мази.
Основная идея, положенная в основу создания мягкой лекарственной формы с наночастицами меди, является формирование двухфазной системы, состоящей из гидрофильной части (для лучшей сорбции мази на поверхности ран) и гидрофобной, в которой распределены наночастицы меди. В качестве гидрофильной основы выбран 4% гель метилцеллюлозы, который способствует полному и равномерному высвобождению лекарственных веществ, адсорбирует раневой экссудат, обладает низкой токсичностью и является гипоаллергенным [Блатун Л.А., 2002;
Панкрушева Т.А., 1995;
Тенцова А.Н., Алюшин М.Т., 1985]. В качестве гидрофобной фазы использовано вазелиновое масло, благодаря которому достигается равномерное распределение наночастиц металла, предотвращается агрегация частиц, их растворение, окисление и взаимодействие с другими компонентами мази. Это позволяет сохранить высокую реакционную способность наночастиц меди в составе мази.
Учитывая вышеописанные подходы в создании мази с наночастицами меди, была разработана лабораторная технологическая схема приготовления мази, представленная на рис. 4. Технология получения мази включает три этапа: 1-й этап - приготовление геля метилцеллюлозы;
2-й этап приготовление вазелиновой суспензии наночастиц меди и 3-й этап - введение вазелиновой суспензии наночастиц в гель метилцеллюлозы.
Рисунок 4. Лабораторная технологическая схема производства мази на метилцеллюлозе с наночастицами меди.
На основании разработанной нами лабораторной технологической схемы были получены мази, состав которых представлен в таблице 3.
Таблица Состав мазей на метилцеллюлозе с наночастицами меди Компонент Масса, г Наночастицы меди 0,02-0, Вазелиновое масло 15, МЦ-100 4, Твин-80 3, Нипагин 0, Вода 77, Конечный продукт представляет собой мазь белого цвета со слабым специфическим запахом. Для контроля качества мази определяли её однородность и рН. Установлено, что приготовленная мазь однородна по составу и не содержит механических включений. рН полученной мази находится в пределах 6,5 - 6,9, что близко к физиологическому значению рН кожи. Через год хранения органолептические показатели мази не изменились, рН мази составлял 6,8-6,9.
Для дальнейших исследований ранозаживляющих свойств разработанной нами мази, необходимо было убедиться в присутствии наночастиц меди в ее составе. Для этого мы использовали метод сканирующей электронной микроскопии. Исследования, проведенные методом сканирующей электронной микроскопии, позволили установить присутствие наночастиц меди в составе мази. На рисунке 5 представлено СЭМ-изображение наночастиц меди образца №1 до введения в состав мази (А) и наночастицы меди в составе мази (В) – видны агломераты компонентов мази с наночастицами меди на переднем плане. Проведенные исследования свидетельствуют о возможности использования метода сканирующей электронной микроскопии для доказательства подлинности мягких лекарственных форм с наночастицами металлов.
В А Рисунок 5. СЭМ-изображение наночастиц меди в образце №1 (А) и их распределение в мази (В).
Исследование антимикробной активности мази, содержащей 4.
наночастицы меди Приготовленная мазь по разработанной нами схеме, содержащая наночастицы меди, была исследована на антимикробную активность диффузионно-дисковым методом. Результаты представлены в таблице 4.
Показано, что мазь, содержащая наночастицы меди образца № обладает антимикробной активностью в отношении клеток тест-культур Г+ и Г- микроорганизмов. При этом мазь, содержащая наночастицы меди, также как и сами наночастицы меди, оказывают наиболее выраженное антибактериальное действие в отношении клеток тест-культуры St. albus.
Следует отметить, что величины зон задержки роста клеток тест культуры St. albus при действии мази с наночастицами меди меньше по сравнению с зонами задержки роста при воздействии образцов нанопорошков меди. Это связано не с потерей активности наночастиц в составе мази, а с разницей действующей концентрации наночастиц в составе образца мази и самого порошка, помещенных на чашку Петри. Сравнение антимикробной активности разработанной нами мази с наночастицами меди с антимикробным действием эталона сравнения – заводской мази «Солкосерил», показало сопоставимые результаты (табл. 4).
Таблица Площади зон задержки роста (мм ) тест-культур St. albus и E.coli AB при действии мази с наночастицами меди образца № Образцы Зона задержки роста Зона задержки роста St. albus, мм E.coli AB 1157, мм Мазь с наночастицами меди 72,8 ± 19,8 28,5 ± 0, Эталон сравнения – мазь «Солкосерил» 120,5 ± 5,2 125,7 ± 8, Следовательно, разработанная и созданная нами мазь с наночастицами меди проявляет антибактериальную активность, сопоставимую с действием заводской мази «Солкосерил».
5. Ранозаживляющее действие мазей с наночастицами меди, различающимися по дисперсности и фазовому составу Оценку ранозаживляющего действия наночастиц меди в составе мази проводили на модели экспериментальных полнослойных ран.
Для определения концентрации, оптимально влияющей на процессы ранозаживления, нами были приготовлены мази с различным содержанием наночастиц образца №5 (0,02%, 0,002%, 0,0002%). Установлено, что мазь, содержащая наночастицы меди в концентрации 0,002%, проявляет наиболее выраженную контракцию раны в первые двое суток после операции по сравнению с контролем и другими исследуемыми концентрациями. Поэтому при исследовании ранозаживляющих свойств мазей, содержащих наночастицы меди с разной дисперсностью и фазовым составом, нами была выбрана концентрация 0,002%. Контролем служили животные, леченные мазевой основой, и животные, леченные заводской мазью «Солкосерил».
Нами установлено, что мази с наночастицами меди, различающиеся по дисперсности и фазовому составу проявляют ранозаживляющие свойства, эффективность которых разная (рис. 6).
Рисунок 6. Кривые изменения площади ран животных в процессе ранозаживления при лечении мазевой основой ( ), мазью с наночастицами меди образца № 1 ( ), мазью с наночастицами меди образца № 4 ( ), заводской мазью «Солкосерил» ( ).
Видно, что наиболее эффективное действие на процесс заживление ран оказывают мази с наночастицами меди образцов №1 и №4 по сравнению с мазевой основой (без наночастиц металла) и заводской мазью «Солкосерил».
При сравнении эффективности ранозаживления исследуемых мазей с заводской мазью «Солкосерил» показано, что в группе животных, леченных мазью, содержащей наночастицы образца №1, происходит статистически достоверное уменьшение площади раневой поверхности на 1-е, 5-е, 7-е, 9-е и 11-е сутки;
а в группе животных, леченных мазью с наночастицами образца №4, на 1-е, 9-е и 11-е сутки. По сравнению с мазью «Солкосерил» мази с наночастицами образцов №1 и №4 на 1-е сутки уменьшают площадь ран в среднем на 15%. Мазь с наночастицами образца №1 сокращает площадь раневой поверхности на 5-е сутки на 17,5%, а на 7-е сутки на 14,7% по сравнению с «Солкосерилом». На 9-е сутки площади ран при лечении мазями с наночастицами образцов №1 и №4 на 15,6% и 14,5% меньше, чем в группе животных, леченных мазью «Солкосерил» соответственно. На 11-ые сутки раны животных, лечённых мазями с наночастицами образцов №1 и №4, полностью зажили в отличие от животных, леченых мазью «Солкосерил», у которых на эти сроки течения раневого процесса площадь раневой поверхности составляла 6,3%.
При сравнении площадей ран животных, леченных мазью с наночастицами образца №1 и мазевой основой (без наночастиц металла), установлено статистически достоверное уменьшение площади раневой поверхности на 1-е, 3-е, 5-е, 7-е, 9-е и 11-е сутки по сравнению с группой животных, леченных мазевой основой.
Лечение ран мазью с наночастицами меди образца №4 вызывает статистически достоверное уменьшение площади раневой поверхности на 1-е, 3-е, 5-е, 9-е и 11-е сутки - по сравнению с группой животных, леченных мазевой основой.
При лечении животных мазями с наночастицами меди образца №2 и № статистически достоверно уменьшаются площади ран на 1-е и 9-е сутки по сравнению с животными, леченными мазевой основой.
Для оценки эффективности лечения нами было рассчитано ежесуточное уменьшение площадей ран (в %) при воздействии мазей с наночастицами меди образцов №1 и №4 и заводской мази «Солкосерил» [Кузин М.И., Костюченок Б. М.,1990]. Результаты приведены на рисунке 7.
0, 0 20, 0 40, 0 60, 0 80, 0 100, 0 120, 0 140, 0 160, 1 с утки 41,9 55,7 57, Контроль - мазь "С олкос ерил" 5 с утки 7, Мазь с НЧ меди 2, 4,2 образца № 9 с утки 14,9 21,4 21,4 Мазь с НЧ меди образца № 11 с утки 35,6 50,0 50, Рисунок 7. Ежесуточное уменьшение площади ран (в %) при лечении мазями с наночастицами меди образцов №1 и №4 и заводской мазью «Солкосерил».
Видно, что для всех мазей наибольшее ежесуточное уменьшение площади ран наблюдается на 1-е сутки, меньшее на 9-е и 11-е сутки, наименьшее - на 5-е сутки.
Несмотря на общую тенденцию в ежесуточном снижении площадей ран, этот показатель при лечении мазями с наночастицами металлов выше, чем при лечении заводской мазью «Солкосерил». Проведенная нами оценка также подтверждает большую эффективность ранозаживляющего действия мазей с наночастицами меди образцов №1 и №4 по сравнению с заводской мазью «Солкосерил».
Анализ показателя полного заживления ран показал, что полное заживление ран в группах, леченных заводской мазью «Солкосерил» и мазью с наночастицами меди образца №5 происходит на 15-е сутки. В группах животных, лечённых мазями с наночастицами меди образцов №2 и № полное заживление ран происходит на 14-е сутки, также как в контрольной группе не леченых животных и в группе животных, леченных мазевой основой. В группах животных, леченых наночастицами меди образцов №1 и №4, полное заживление ран происходит на 11-е сутки (рис.8).
Рисунок 8. Время (сут.) полного заживления ран животных при лечении: (1) мазями с наночастицами меди образца №1 и №4;
(2) мазевой основой и мазями с наночастицами образца №2 и №3;
(3) мазью «Солкосерил» и мазью с наночастицами образца №5.
Следовательно, созданные нами мази, содержащие наночастицы меди, помимо антимикробных свойств, проявляют ранозаживляющую активность.
Ранозаживляющая активность мазей с наночастицами меди образцов №1 и № превосходит по эффективности мази с наночастицами меди образцов №2, № и мазь заводского изготовления «Солкосерил». Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования наночастиц меди в составе ранозаживляющих мягких лекарственных форм.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Одним из перспективных направлений создания новых лекарственных средств является использование наноматериалов в составе лекарственных форм. В настоящей работе показана возможность создания мягких лекарственных форм с наночастицами металлов на примере меди с сохранением их высокореакционной активности в составе мази. Предложен метод подтверждения подлинности мягких лекарственных средств с наночастицами металлов – метод сканирующей электронной микроскопии.
Проведенные модельные эксперименты показали, что разработанные нами мази с наночастицами меди, различающимися по дисперсности и фазовому составу, обладают ранозаживляющим и антибактериальным действием, проявляя разную эффективность. Установлено, что токсичность всех исследованных наночастиц ниже токсичности меди в ионной форме.
Изложены теоретические и практические подходы к созданию мягкой лекарственной формы наночастицами меди – мази, обладающей антимикробными и ранозаживляющими свойствами. Методом сканирующей электронной микроскопии подтверждено наличие наночастиц меди в составе созданных нами мазей.
ВЫВОДЫ Установлено, что наночастицы меди, различающиеся по дисперсности и 1.
фазовому составу, обладают антимикробной активностью в отношении клеток тест-культур грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.
Показано, что по показателям острой токсичности наночастицы меди с 2.
разной дисперсностью и фазовым составом различаются между собой и менее токсичны по сравнению с меди сульфатом.
Разработан состав мягкой лекарственной формы – мази с 3.
наночастицами меди с различной дисперсностью и фазовым составом и создана лабораторная технологическая схема её получения.
Установлено, что мазь с наночастицами меди обладает антимикробной 4.
активностью.
Показано, что образцы наночастиц меди, различающиеся по 5.
дисперсности и фазовому составу, обладают разной ранозаживляющей активностью.
Предложено для доказательства подлинности мягких лекарственных 6.
средств с наночастицами меди использовать сканирующую электронную микроскопию образцов мази.
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации Ранозаживляющие свойства наночастиц меди. Рахметова А.А., Алексеева 1.
Т.П. // Итоговая конференция студенческого научного общества медицинского факультета Российского Университета дружбы народов "Клинические и теоретические аспекты современной медицины": Материалы конференции. - Москва, 2008. - С. 100-101.
Изучение биологической активности наночастиц меди. Рахметова А.А., 2.
Алексеева Т.П., Байтукалов Т.А., Богословская О.А. // VII международная научная конференция студентов и молодых ученых "Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной физической культуры, физиотерапии и курортологии": Материалы конференции. - Москва, 2008. - С. 33.
Новый класс ранозаживляющих препаратов на основе наночастиц меди.
3.
Рахметова А.А., Алексеева Т.П., Богословская О.А., Байтукалов Т.А., Ольховская И.П., Лейпунский И.О., Глущенко Н.Н. // II Международная научная конференция "Физико-химические основы формирования и модификации микро- и наноструктур": Материалы конференции. - Харьков, 2008. - Т.2, С. 366.
Исследование ранозаживляющей активности наночастиц меди. Рахметова 4.
А.А., Алексеева Т.П., Богословская О.А., Байтукалов Т.А., Ольховская И.П., Лейпунский И.О., Глущенко Н.Н. // V Международный междисциплинарный симпозиум "ФиПС-08 Прикладная синергетика в нанотехнологиях":
Материалы симпозиума. - Москва, 2008. - С. 388.
Наночастицы меди - антимикробные агенты. Рахметова А.А., Богословская 5.
О.А., Овсянникова И.П., Лейпунский И.О., Байтукалов Т.А., Ольховская И.П., Алексеева Т.П., Глущенко Н.Н. // II Санкт-Петербургский Международный экологический форум "Окружающая среда и здоровье человека": Материалы форума. - Санкт-Петербург, - 2008 – с.24.
Ранозаживляющая активность наночастиц меди с разными физико 6.
химическими характеристиками О.А. Богословская, А.А. Рахметова, Т.П.
Алексеева, Т.А. Байтукалов, И.П. Ольховская, Н.Н. Глущенко, И.О.
Лейпунский, А.Н. Жигач, Е.С. Зотова, О.М. Жигалина, В.В.Артемов // Материалы VIII Всероссийской конференции «Физико-химия ультрадисперсных (нано-) систем. (10-14 ноября г. Белгород).
М.МИФИ.с.267-268.
Токсичность наночастиц меди с различными физико-химическими 7.
характеристиками. Богословская О.А., Алексеева Т.П., Рахметова А.А., Жигач А.Н., Лейпунский И.О., Ольховская И.П., Глущенко Н.Н. // Материалы Всероссийского совещания судебно-медицинских экспертов по применению правил и медицинских критериев определения степени тяжести вреда, причиненного здоровью человека и Итоговой научно-практической конференции Российского центра судебно-медицинской экспертизы. Москва, 2008. - С. 256.
Наночастицы меди адаптогенный фактор при заживлении 8. экспериментальных ран. Рахметова А.А., Алексеева Т.П., Богословская О.А., Жигач А.Н., Лейпунский И.О., Ольховская И.П., Глущенко Н.Н. // Материалы XIV Международного симпозиума "Эколого-физиологические проблемы адаптации". - Москва, 2009 г.
Регенерирующее действие мази с наночастицами меди. Рахметова А.А., 9.
Алексеева Т.П., Богословская О.А., Жигач А.Н., Лейпунский И.О., Ольховская И.П., Глущенко Н.Н. // Материалы XVI Российского национального конгресса "Человек и лекарство". - Москва, 2009 г. - С. 724.
Влияние модификации наночастиц меди на их антибактериальную 10.
активность и электростатические свойства внешней мембраны клеток E.coli.
Володина Л.А., Богословская О.А., Рахметова А.А., Лейпунский И.О., Жигач А.Н., Алексеева Т.П., Овсянникова М.Н., Ольховская И.П., Глущенко Н.Н. // Аннотации докладов XXI симпозиума «Cовременная химическая физика». – Туапсе, 2009 г. – С. 58.
Новые ранозаживляющие средства на основе наночастиц меди. Рахметова 11.
А.А., Богословская О.А., Ольховская И.П., Алексеева Т.П., Лейпунский И.О., Глущенко Н.Н. // Материалы международной научной конференции по вопросам состояния и перспективам развития медицины в спорте высших достижений «СпортМед – 2009». – Москва, 2009 г.С.196-197.
Ранозаживляющие свойства нового поколения на основе наночастиц меди 12.
Рахметова А.А., Богословская О.А., Ольховская И.П., Алексеева Т.П., Лейпунский И.О., Глущенко Н.Н. // Сборник трудов Х Международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке: инновационные технологии в биологии и медицине 2009». – Москва, 2009 г, С.299-300.
Влияние наночастиц меди– компонентов твердых частиц дымовых уносов 13.
тепловых электростанций на бактериальные клетки. Богословская О.А., Володина Л.А., Лейпунский И.О., Жигач А.Н., Алексеева Т.П., Рахметова А.А., Овсянникова М.Н., Ольховская И.П., Глущенко Н.Н. // Известия АН.
Энергетика. – 2010. - №2. – С.105-112.
Изучение распределения наночастиц металлов в тканях и мазях методами 14.
сканирующей электронной микроскопии. Богословская О.А., Рахметова А.А., Глущенко Н.Н., Галашина В.Н., Жигач А.Н., Березкина Н.Г., Зотова Е.С., Пшеченков П.А., Лейпунский И.О. // IX Всероссийская конференция «Физикохимия ультрадисперсных (нано-) систем»: Сборник трудов. – Ижевск. – 2010.- С.167-168.
Влияние одного из компонентов твердых частиц дымовых уносов тепловых 15.
электростанций (наночастиц меди) на рост бактериальных клеток.
Богословская О.А., Овсянникова М.Н., Рахметова А.А., Глущенко Н.Н. // Сборник материалов конференции «XXIV Любищевские чтения». – Ульяновск. - 2010. - С. 282-286.
Ранозаживляющие препараты на основе наноструктурных материалов 16.
органической и неорганической природы. Алексеева Т.П., Богословская О.А., Рахметова А.А., Левов А.Н., Ильина А.В., Варламов В.П., Глущенко Н.Н. // IV Международная научная конференция «Физико-химические основы формирования и модификации микро- и наноструктур» ФМНН2010:
Материалы конференции. – Харьков. – 2010. С.270-273.
Ранозаживляющие свойства наночастиц меди в зависимости от их физико 17.
химических характеристик. Рахметова А.А, Алексеева Т.П., Богословская О.А., Лейпунский И.О., Ольховская И.П., Жигач А.Н., Глущенко Н.Н. // Российские нанотехнологии. – 2010. – Т.5. - № 3-4. – С.102-107.
Патент «Препарат, ускоряющий заживление ран» рег. № 18.
2010126761/15(038118). - положительное решение о выдаче патента на изобретение 14.07. Рахметова Алла Александровна (Россия) Изучение биологической активности наночастиц меди, различающихся по дисперсности и фазовому составу В работе представлены результаты исследования биологической активности наночастиц меди, различающихся по дисперсности и фазовому составу. Показано, что наночастицы меди обладают антибактериальной активностью в отношении клеток тест-культур Г+ и Г- микроорганизмов, эффективность которой зависит от вида клеток, от концентрации наночастиц меди и их физико-химических характеристик. На модели острой токсичности установлено, что наночастицы меди, различающиеся по дисперсности и фазовому составу имеют различные токсикологические характеристики, токсичность всех исследованных наночастиц ниже токсичности меди в ионной форме. Изложены теоретические и практические подходы создания мягкой лекарственной формы – мази, содержащей наночастицы меди. В модельных экспериментах доказано, что созданные мази с наночастицами меди обладают антибактериальной и ранозаживляющей активностью. Метод сканирующей электронной микроскопии предложен для определения подлинности мягких лекарственных форм с наночастицами металлов.
Alla A. Rakhmetova (Russia) Studying of biological activity of copper nanoparticles of various dispersion and phase structure In the present work results of research of biological activity of copper nanoparticles of various dispersion and phase structure are presented. It was shown, that copper nanoparticles manifest antibacterial activity against gram-positive and gram-negative microorganisms, which efficiency depends on the microbial species, concentrations of copper nanoparticles and their physicochemical characteristics.
On model of acute toxicity it was demonstrated, that copper nanoparticles of various dispersion and phase structure have the various toxicological characteristics, toxicity of all examined copper nanoparticles are less then toxicity of copper ionic form (CuSO45H2O). The theoretical and practical approaches of the creation of soft medicinal form – the ointment, containing copper nanoparticles are stated. In modeling experiments it is proved, that the created ointments with copper nanoparticles manifest antibacterial and wound healing activity. The method of scanning electronic microscopy is offered for definition of authenticity of soft medicinal forms with the metal nanoparticles.