Химико – токсикологическое исследование тетраэтилтиурамдисульфида (антабуса)
На правах рукописи
ТЕРСКИХ АНАСТАСИЯ ПЕТРОВНА
ХИМИКО – ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ
ИССЛЕДОВАНИЕ
ТЕТРАЭТИЛТИУРАМДИСУЛЬФИДА (АНТАБУСА)
14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учной степени
кандидата фармацевтических наук
Курск – 2011
2
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор Шорманов Владимир Камбулатович
Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор Новиков Олег Олегович доктор фармацевтических наук, профессор Саломатин Евгений Михайлович
Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Пятигорская государственная фармацевтическая академия»
Минздравсоцразвития России
Защита состоится «_»_2012 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 208.039.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет»
Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (305041, г. Курск, ул. К.Маркса, д.3).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КГМУ Минздравсоцразвития России.
Автореферат разослан «» _ 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Пашин Е.Н.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
А к т у а л ь н о с т ь т е м ы. Тетраэтилтиурамдисульфид (антабус, тетурам) в настоящее время входит в состав многих противоалкогольных препаратов и является одним из наиболее действенных лекарственных средств для лечения хронического алкоголизма.
Есть сведения, что основной метаболит тетраэтилтиурамдисульфида – диэтилдитиокарбамат – способен стимулировать активность иммунной системы. Соли дитиокарбаминовых кислот обладают радиопротекторной активностью.
Наряду с применением в медицине тетраэтилтиурамдисульфид широко применяется в аналитической практике в качестве реагента на ионы металлов.
Рассматриваемое соединение применяют также как хелатообразователь при отравлении тетракарбонилом никеля.
Тетраэтилтиурамдисульфид и некоторые близкие к нему структуры находят широкое применение в качестве пестицидов.
Тетраэтилтиурамдисульфид токсичен для теплокровных организмов.
LD50 для крыс при пероральном введении составляет 500 мг/кг.
Описаны многочисленные случаи отравления людей данным соединением с летальным исходом. Смерть взрослого человека может наступить от 30 г тетраэтилтиурамдисульфида, а при концентрации алкоголя в крови более 0,13% – от 1 г вещества.
Широкое применение рассматриваемого вещества, его высокая токсичность, наличие случаев летального отравления, обуславливают необходимость изучения данного вещества в химико-токсикологическом отношении.
До настоящего времени остаются недостаточно разработанными вопросы изолирования тетраэтилтиурамдисульфида из объектов биологического происхождения, его обнаружения, идентификации и количественного определения. В доступной литературе отсутствуют данные по сохраняемости данного соединения в биологическом материале.
Исходя из вышеизложенного, разработка методики химико токсикологического исследования тетраэтилтиурамдисульфида является актуальной.
Ц е л ь и з а д а ч и и с с л е д о в а н и я. Целью настоящего исследования является разработка методики химико-токсикологического исследования тетраэтилтиурамдисульфида.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
1. Изучить особенности электронных и колебательных спектров тетраэтилтиурамдисульфида.
Определить характер хроматографической активности 2.
исследуемого вещества в тонких слоях и колонках сорбентов.
3. Исследовать особенности изолирования объекта исследования различными группами изолирующих агентов из биологического материала, разработать схему очистки извлечений.
4. Изучить распределение тетраэтилтиурамдисульфида в органах и биожидкостях теплокровных животных.
5. Определить сроки сохранения рассматриваемого вещества в биологическом материале.
Н а у ч н а я н о в и з н а и с с л е д о в а н и й. Изучены отдельные закономерности хроматографического поведения тетраэтилтиурам дисульфида в сорбентах с гидроксилированной и привитой поверхностями при использовании различных подвижных фаз;
определены оптимальные условия и рассчитан ряд параметров хроматографирования исследуемого вещества в тонких слоях и колонках сорбентов.
На основе проведенных исследований разработаны методики идентификации и количественного определения тетраэтилтиурам дисульфида методами ТСХ и хроматоспектрофотометрии.
Исследованы особенности поглощения веществом электромагнитного излучения в УФ-части спектра, закономерности изолирования агентами различной химической природы. Для повышения селективности качественного спектрофотометрического определения рассчитан ряд основных оптических характеристик электронных спектров.
Впервые для изолирования тетраэтилтиурамдисульфида из биологического материала обосновано использование в качестве изолирующего агента этилацетата. На основе применения в качестве изолирующего агента этилацетата и очистки в тонких слоях или колонках нормальнофазового сорбента разработаны оригинальные методики определения рассматриваемого вещества в ткани органов и биожидкостях, применимые как для исследования свежего, так и гнилостно изменнного биоматериала.
С использованием вновь разработанных методик в опытах на животных (крысы) исследованы особенности распределения тетраэтилтиурамдисульфида в организме теплокровных при его самостоятельном введении и при введении вместе с этанолом.
Определены сроки сохраняемости рассматриваемого вещества в биологическом материале (печень, кровь).
П р а к т и ч е с к а я з н а ч и м о с т ь р а б о т ы. На основании проведнных исследований разработана методика изолирования из биологического материала, очистки, идентификации и количественного определения тетраэтилтиурамдисульфида.
Внедрение результатов работы:
– методика изолирования тетраэтилтиурамдисульфида из ткани печени, одноэтапного ТСХ-разделения и количественного определения методом спектрофотометрии (внедрена в учебный и научный процесс кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 01.09.2009 г., кафедры фармацевтической химии и клинической фармации Воронежской государственной медицинской академии им. Н.Н. Бурденко с 16.02.2009 г.
и кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного национального исследовательского университета с 15.12.2010 г.);
– методика определения тетраэтилтиурамдисульфида в биологических жидкостях (кровь, моча) одноэтапного ТСХ-разделения и количественного определения методом спектрофотометрии (внедрена в учебный и научный процесс кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 01.09.2009 г. и кафедры фармацевтической химии и клинической фармации Воронежской государственной медицинской академии им. Н.Н. Бурденко с 16.02.2009 г. и кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного национального исследовательского университета с 15.12.2010 г.).
Связь исследований с проблемным планом ф а р м а ц е в т и ч е с к и х н а у к. Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета и соответствует проблеме «Фармация»
межведомственного научного совета N 36 РАМН. Номер государственной регистрации 0120.0801917.
Апробация р а б о т ы. Основные положения работы представлены и доложены на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 10-летию биотехнологического факультета Курского государственного медицинского университета (Курск, 2008), на II Международном научном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2008), на IV Международной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 2010), на IV Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2010).
Публикации. По теме диссертации опубликовано тринадцать научных работ, 4 из которых – в журналах списка ВАК, а 2 публикации являются патентами РФ.
О б ъ м и с т р у к т у р а д и с с е р т а ц и и. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (5 глав), общей схемы исследования, общих выводов, списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 168 страницах машинописного текста, содержат 10 рисунков, 27 таблиц. Список цитируемой литературы включает 169 источника, из которых 64 – на иностранных языках.
Первая глава (обзор литературы) включает в себя известные данные о тетраэтилтиурамдисульфиде как объекте химико-токсикологического исследования.
Вторая глава посвящена вопросам идентификации объекта исследования хроматографическими и спектральными методами.
В третьей главе приводятся экспериментальные данные по вопросам количественного определения анализируемого вещества.
Четвртая глава включает в себя результаты изучения особенностей выделения и очистки объекта исследования хроматографическими методами.
В пятой главе рассмотрены вопросы определения тетраэтилтиурамдисульфида после его изолирования из биологического материала оптимальным изолирующим агентом.
В шестой главе приведены данные, полученные в результате изучения особенностей распределения тетраэтилтиурамдисульфида в организме теплокровных и сохраняемости в биологическом материале (печень, кровь).
Ос новные положения, выносимые на защиту:
– результаты исследования хроматографической активности тетраэтилтиурамдисульфида в тонких слоях и колонках сорбентов;
– особенности поглощения электромагнитного излучения анализируемым веществом в УФ-области спектра;
– методики идентификации и количественного определения объекта исследования хроматографическими и фотометрическими методами;
– результаты исследования очистки тетраэтилтиурамдисульфида в тонких слоях и колонках сорбентов;
– методика изолирования объекта исследования из биологического материала (печени, крови, мочи) и очистки от соэкстрактивных веществ;
– особенности распределения тетраэтилтиурамдисульфида в организме теплокровных животных;
– сохраняемость тетраэтилтиурамдисульфида в тканях трупных органов и в биологических жидкостях.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе был использован тетраэтилтиурамдисульфид (антабус, тетурам) (в дальнейшем – ТЭТД);
стандарт ФСП – 42-0550630805;
содержание основного вещества не менее 99,9%).
Применены методы ТСХ, адсорбционной колоночной хроматографии низкого давления, ВЭЖХ, электронной и ИК- спектрофотометрии.
Методики изолирования, очистки, идентификации и количественного определения были разработаны на модельных смесях с известным содержанием определяемого вещества. Обработка результатов проводилась в соответствии с установленными требованиями с использованием пакета прикладных программ «Miсrosoft Excel».
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Исследована хроматографическая подвижность ТЭТД в тонких слоях и колонках нормальнофазовых и обращннофазовых сорбентов с использованием подвижных фаз различной полярности.
Для характеристики подвижности анализируемого соединения рассчитаны, в частности, значения абсолютной (Rf) и относительной (Rs) (по отношению к Rf тетраметилтиурамдисульфида (в дальнейшем – ТМТД)) хроматографической подвижности и условного удерживания в тонком слое сорбента (В = 1/Rf).для метода ТСХ, а также значения времени (tR) и объма удерживания (VR), относительного (по отношению к удерживанию ТМТД) удерживания, коэффициента мкости (k), числа теоретических тарелок (N) для ВЭЖХ.
Как свидетельствуют данные таблиц 1 и 2, наиболее оптимальные условия хроматографирования ТЭТД в тонких слоях гидроксилированного сорбента достигаются при использовании ряда элюентов малой и средней полярности, включающих гексан, диоксан и пропанол-2 в объмных соотношениях 8:3:0,4 и 8:3:0,8 и 15:5:1. Наиболее целесообразно применение в качестве подвижной фазы системы растворителей гексан-диоксан пропанол-2 (15:5:1). Для варианта обращннофазовой ТСХ наиболее оптимальной подвижной фазой явилась система растворителей ацетонитрил– вода (5:5).
Таблица Параметры хроматографирования ТЭТД в присутствии внутреннего стандарта (ТМТД) в тонких слоях нормальнофазового сорбента с использованием оптимальных подвижных фаз Компоненты подвижных Объмные ТЭТД ТМТД фаз соотношения компонентов В Rf Rs Rf Гексан–диоксан 6:4 0,86 1,16 1,24 0, 7:3 0,75 1,33 1,58 0, Гексан–пропанол-2 8:2 0,81 1,23 1,33 0, 2:8 0,85 1,18 1,16 0, Этилацетат–гексан 7,8:3,2 0,91 1,10 1,02 0, 6,2:5,4 0,89 1,12 1,01 0, 8,3:2,6 0,88 1,14 1,09 0, Гексан–диоксан–ацетон 7:3:0,8 0,88 1,14 1,18 0, Гексан-диоксан-пропанол-2 8:2:0,4 0,85 1,18 1,22 0, 8:2:0,6 0,86 1,16 1,22 0, 8:2:0,8 0,87 1,15 1,22 0, 8:3:0,4 0,81 1,23 1,10 0, 8:3:0,6 0,85 1,18 1,09 0, 8:3:0,8 0,91 1,10 1,09 0, 8:4:0,2 0,87 1,15 1,17 0, 8:4:0,4 0,85 1,18 1,22 0, 8:4:0,6 0,84 1,19 1,25 0, 8:4:0,8 0,81 1,23 1,30 0, 8:5:0,2 0,90 1,11 1,11 0, 15:5:1 0,87 1,15 1,39 0, Гексан-диоксан-пропанол-2- 8:2:0,4:0,4 0,84 1,19 1,29 0, ацетон 8:3:0,8:0,8 0,81 1,23 1,24 0, Таблица Параметры хроматографирования ТЭТД в присутствии внутреннего стандарта (ТМТД) в тонких слоях обращеннофазового сорбента с использованием оптимальных подвижных фаз Компоненты Объмные ТЭТД ТМТД подвижных фаз соотношения В Rf Rs Rf компонентов Диоксан–вода 6:4 0,30 3,33 0,59 0, 7:3 0,36 2,78 0,71 0, 8:2 0,53 1,89 0,78 0, Диоксан–буфер с рН 1,68 5:5 0,12 8,33 0,3 0, Ацетонитрил–вода 5:5 0,22 4,55 0,46 0, ДМФА–вода 5:5 0,13 7,69 0,26 0, Этанол–вода 5:5 0,21 4,76 0,39 0, Подвижная фаза гексан-диоксан-пропанол-2 15:5:1 (по объму), явилась такэе оптимальной для определения объекта исследования методами хроматографии низкого давления в колонках силикагеля L 40/100 и ВЭЖХ (таблица 3).
Таблица Основные параметры хроматографирования ТЭТД и ряда близких по структуре соединений методом нормальнофазовой ВЭЖХ в системе растворителей гексан–диоксан–пропанол-2 (15:5:1) Хроматографиру- tR VR Относительное k N I ВЭЖХ емые вещества удерживание (по отношению к ТМТД) Карбофуран 3,46 346 0,834 1,21 1, ТМТД 4,15 415 1 1,33 1, ТЭТД 4,42 442 1,065 1,98 3, Банкол 6,36 636 1,533 3,04 Результаты изучения особенностей хроматографической подвижности рассматриваемых соединений указывают на возможность их идентификации методами ТСХ и высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Открываемый минимум при идентификации ТЭТД методом ТСХ в сорбентах с гидроксилированной и привитой поверхностями составляет 0,1– 0,2 мкг. Открываемый минимум рассматриваемого соединения методом нормальнофазовой ВЭЖХ составляет 0,005 мкг в хроматографируемой пробе.
Изучены особенности светопоглощения рассматриваемого соединения в УФ-области спектра при использовании в качестве растворяющих сред ацетонитрила, 1,4-диоксана, хлороформа, этанола и этилацетата. Рассчитаны отдельные оптические характеристики электронных спектров ТЭТД в данных средах.
На основе изучения особенностей поглощения УФ-излучения ТЭТД в среде этилацетата, хлороформа и ацетонитрила, при длинах волн 284, 282 или 280 нм (для каждого растворителя соответственно) были построены градуировочные графики зависимости оптической плотности от концентрации определяемого вещества в дпнных растворителях для дальнейшего их использования при количественном определении ТЭТД.
При рассмотрении ИК-спектра ТЭТД отмечено присутствие в нм ряда характеристических полос, соответствующих определнным видам колебаний участков молекулы рассматриваемого вещества (таблица 4). В высокочастотной части ИК-спектра (область 2868–2972 см-1) ТЭТД присутствуют полосы, соответствующие валентным асимметрическим и симметрическим колебаниям С-Н связи в метильных и метиленовых группах. Полоса с максимумом в области 1375 см-1 предположительно может соответствовать симметричным деформационным колебаниям С–Н в метильной группе.
Асимметрическим деформационным колебаниям С–Н связей в СН3 группе соответствует полоса с максимумом при 1456 см -1.
В интервале частот 1072–1092 см-1 располагаются максимумы полос, обусловленных валентными колебаниями –С=S связи.
В ИК-спектре имеются полосы, которые могут быть отнесены к колебаниям S–S-связи, деформационным колебаниям N–C=S и колебаниям с участием связи –С=S.
Таблица Характеристика ИК-спектра ТЭТД Максимумы Отнесение Максимумы Отнесение характерис- колебаний характерис- колебаний тических тических - полос, см- полос, см Валентные асимме- Симметрические 2972 трические –СН3 деформационные –СН3 ?
Валентные асимме- Валентные –С=S 2930 трические –СН2– Валентные симме- Колебания –S–S– ?
2868 трические –СН3 Деформационные Колебания с участием 1497 связи –С=S?
N–C=S ? Асимметрические деформационные –СН Показана возможность идентификации ТЭТД по электронным (УФ-) и ИК-спектрам.
Для определения условий очистки исследуемого вещества рассмотрена возможность применения методов колоночной и тонкослойной хроматографии.
В частности, изучены особенности хроматографической активности ТЭТД в макроколонках, заполненных сорбентом с гидроксилированной поверхностью, в качестве которого рассмотрен силикагель L 40/100 µ. В качестве подвижной фазы рассмотрена система растворителей гексан– диоксан–пропанол-2 (40:5:1).
Установлено, что в стандартных условиях при использовании в качестве подвижной фазы гексан–диоксан–пропанол-2 (40:5:1) ТЭТД присутствует с девятой по шестнадцатую (18–32 мл) включительно фракциях элюата (объм каждой фракции – 2 мл).
Основываясь на полученных ранее данных, для определения условий очистки рассматриваемого вещества в тонком слое нормальнофазового сорбента была выбрана система растворителей гексан–диоксан–пропанол- (15:5:1), а в качестве элюента для извлечения вещества с пластины – ацетонитрил. Концентрация вещества при моделировании методов очистки составляла 0,001 г/мл.
Изучена зависимость степени изолирования ТЭТД из биоматериала изолирующими агентами различной природы.
В процессе исследования изучали особенности извлечения ТЭТД из биологического материала (ткани печени без признаков гнилостного изменения и соединительнотканного перерождения, взятой от трупа человека) изолирующими агентами различной химической природы:
карбоновыми кислотами (ледяная уксусная кислота), спиртами (пропанол-2), гетероциклическими кислородсодержащими соединениями (1,4-диоксан), алканами (гексан), галагеналканами (хлороформ), аренами (толуол), простыми и сложными эфирами (этилацетат, диэтиловый эфир), нитрилами (ацетонитрил).
Полученные результаты представлены в таблице 5.
Таблица Зависимость изолирования ТЭТД от природы изолирующего агента Изолирующий Степень Изолирующий Степень агент извлечения, агент извлечения, % % Этилацетат Толуол 62,64±3, 98,36±2, Хлороформ 89,26±4,25 Эфир 45,28±4, Гексан 23,13±3,16 Пропанол-2 25,69±9, Ацетонитрил 43,09±5,62 уксусная 10,28±6, Ледяная кислота 26,65±3, 1,4–Диоксан Для обнаружения и предварительной идентификации ТЭТД, выделенного из биологического материала, использована возможность применения хроматографии в тонких слоях нормальнофазового сорбента, количественное содержание ТЭТД определяли методом УФ спектрофотометрии по поглощению в ацетонитриле с использованием уравнения градуировочного графика.
Сравнение результатов изолирования ТЭТД (при содержании его в биологическом объекте 0,1%) указанными изолирующими жидкостями показывает, что максимальные значения степени извлечения достигаются при использовании в качестве изолирующего агента этилацетата.
Исследована зависимость степени извлечения рассматриваемого соединения этилацетатом от количественного соотношения изолирующего агента и биоматериала, от кратности настаивания и продолжительности каждого отдельного настаивания.
Исследования показали, что для достижения достаточно полного извлечения анализируемого вещества из биологического материала необходимо, по крайней мере, двукратное настаивание при условии, что количество изолирующей жидкости в каждом случае должно превышать количество биологического материала как минимум в два раза.
При изучении зависимости степени извлечения ТЭТД от продолжительности контакта изолирующей жидкости и биоматериала установлено, что достаточно полное извлечения анализируемого соединения из ткани печени достигаются уже при настаивании в течение 45 минут.
Установлено, что увеличение содержания ТЭТД в модельных смесях (печень) в интервале концентраций (1,0–15,0 мг) при постоянной массе биологического материала (5,0 г) сопровождалось лишь незначительным изменением среднего значения степени извлечения, не превышающим 3,0 %.
Для изолирования ТЭТД из биологической жидкости (крови) также была изучена зависимость степени извлечения данного вещества от природы изолирующих агентов.
Количественная оценка результатов определения представлена в таблице 6.
Таблица Зависимость изолирования ТЭТД из крови от природы изолирующего агента Изолирующий Внесено ТЭТД, мг в 5 г крови Найдено ТЭТД, % агент 1 2 Ацетон 0,5 2,0 17,60±3, 5, Толуол 7,85±1, 0, 64,22±2, 2, 47,65±2, 5, 1 2 Этилацетат 0,5 13,86±1, 29,86±2, 2, 30,18±1, 5, Хлороформ 21,83±2, 0, 66,79±2, 2, 53,17±1, 5, На основании проведенных исследований можно предложить использовать для крови в качестве изолирующего агента этилацетат при не менее, чем двукратном настаивании с двукратным объемом изолирующего агента.
С целью нарушения устойчивости связи ТЭТД со специфическими для крови эндогенными биологическими веществами и повышения степени извлечения ТЭТД этилацетатом из крови, рассматривали возможность введения в биологические пробы фермента пепсина, а также натрия фторида в различных количествах.
Результаты степени извлечения ТЭТД из крови при использовании пепсина представлены в таблице 7.
Таблица Зависимость степени изолирования ТЭТД из крови с гемоконсервантом «Фаглюцид» от количества добавленного пепсина Масса пепсина, мг Внесено ТЭТД, мг в 5 г Найдено ТЭТД, % крови 5 0,5 25,14±1, 26,65±1, 2, 23,63±1, 5, 10 0,5 26,42±1, 23,44±1, 2, 22,48±1, 5, 15 0,5 36,42±1, 43,35±1, 2, 44,05±1, 5, Как свидетельствуют полученные данные, внесение в искусственную смесь анализируемого вещества с кровью (5 г) навески пепсина массой 15 мг позволяет увеличить степень извлечения ТЭТД из крови до 44,05 %.
Результаты степени извлечения ТЭТД из крови при использовании натрия фторида представлены в таблице 8.
Таблица Зависимость степени изолирования ТЭТД из крови с гемоконсервантом «Фаглюцид» от количества добавленного натрия фторида Масса навески натрия Внесено ТЭТД, мг в 5 г Найдено ТЭТД, фторида, г крови % 0,5 0,5 73,85±2, 2,0 93,44±2, 5,0 95,55±2, 1,0 0,5 13,85±2, 48,16±2, 2, 44,95±1, 5, 2,0 0,5 3,85±1, 16,70±1, 2, 16,57±1, 5, Как показывают получившиеся результаты, добавление натрия фторида в количестве 0,5 г позволяет добиться высокой степени извлечения ТЭТД из крови до 95,55 % при содержании анализируемого вещества в количестве 5, мг в 5 г биожидкости.
Разработанные методики характеризуются достаточными воспроизводимостью и правильностью.
В опытах с контрольными образцами биоматериала показана достаточная эффективность очистки извлечений методами колоночной и тонкослойной хроматографии (таблица 9).
Таблица Оптическая плотность растворов остатков, полученных после очистки контрольных извлечений из ткани печени различными методами Вид очистки Элюент при Количество биоло- Длина Оптическая определении гической ткани, волны, плотность соэкстрактивные нм растворов вещества из остатков которого после очистки присутст вуют в 1 мл фотометрируемого раствора, г Колоночная гексан– 1,0 276 0, хроматография диоксан– пропанол- (15:5:1) ацетонитрил 1,0 280 0, Тонкослойная ацетонитрил 1,0 280 0, хроматография На основе предварительных исследований разработаны методики определения рассматриваемого соединения в ткани трупного органа (печени), крови и моче на основе изолирования этилацетатом и последующей очистки извлекаемого вещества в тонких слоях и колонках сорбентов.
Количественная оценка результатов определения представлена в таблице 10.
Таблица Результаты количественного определения анализируемого соединения в биологическом материале с применением очистки методами ТСХ и колоночной хроматографии Найдено ТЭТД, % Биологиче- Внесено Очистка методом колоночной Очистка методом ский ТЭТД, хроматографии ТСХ объект мг Определение Определение Определение методом методом методом спектрофото- ВЭЖХ спектрофото метрии метрии Ткань 76,64± 7,19 76,48±7,45 76,83±7, 0, печени 90,89±5,04 90,69±5,25 91,01±5, 2, 91,26±4,89 90,97±5,06 91,44±4, 5, Моча 91,26±2,41 91,03±2,67 91,96±2, 0, 93,07±2,18 92,82±2,37 93,60±2, 2, 94,30±2,06 94,12±2,35 94,44±2, 5, Кровь 75,18±2,96 74,98±3,03 76,35±2, 0, 92,98±3,83 92,89±4,11 93,42±3, 2, 95,17±3,38 94,66±2,87 95,53±2, 5, Как свидетельствуют полученные данные, при содержании ТЭТД в количестве от 0,5 до 5,0 мг в 5,0 г биоматериала разработанные методики, включающие очистку методом колоночной хроматографии, позволяют определить в ткани печени 90,97 % исследуемого вещества, в крови – 95, %, в моче – 94,12 %. Аналогичные результаты получены при использовании для очистки метода тонкослойной хроматографии.
Методики характеризуются достаточными воспроизводимостью и правильностью.
Изучены особенности распределения ТЭТД в организме теплокровных животных (крысы) при внутрижелудочном введении данного вещества самостоятельно или вместе с 40 % этанолом. В каждом случае 25 животных объединялись в 5 опытных групп по 5 особей в каждой. Самостоятельно отравляющее вещество вводили двумя способами. Согласно первому способу ТЭТД вводили 250 мг на 100 г массы животного в виде 5 мл 10% суспензии на основе 1% раствора крахмала (так как рассматриваемое соединение практически не растворимо в воде) трижды с интервалом в три часа.
Согласно второму – ТЭТД вводили в количестве 500 мг на 100 г массы животного в виде 5 мл 20 % суспензии в 1 % крахмальном растворе через каждые 12 часов в течение 3 суток.
При изучении распределения ТЭТД на фоне введения этанола исследуемое вещество вводили в количестве 500 мг на 100 г массы животного в виде 5 мл 10% суспензии на основе 1% раствора крахмала однократно. Через 1 час затравленным ТЭТД животным внутрижелудочно вводили 3 мл 40% этанола. В течение 15–20 минут животные погибали от «тетурам–этаноловой» реакции.
После гибели животных их трупы вскрывали, одинаковые органы, взятые от животных внутри каждой из групп, объединяли и исследовали на наличие в них ТЭТД. Параллельно исследовали органы животных двух контрольных групп (по 5 особей каждая), которым вводили в желудок 1 % раствор крахмала, не содержащий анализируемое вещество по схемам, соответствующим первому, второму или третьему способам введения.
Результаты изучения особенностей распределения ТЭТД в организме теплокровных животных представлены на рис. 1.
Содержание ТЭТД, % Кровь Желудок Почки Печень Мозг кишечник кишечник Моча Мышечная Селезенка Сердце Легкие Толстый Тонкий ткань Рис. 1. Распределение ТЭТД в организме теплокровных (крысы) (% к найденному в 100 г органов):
– самостоятельное введение по первому способу – самостоятельное введение по второму способу – введение третьим способом (вместе с этанолом) Определено количественное содержание ТЭТД в «органах – мишенях»
хронической алкогольной интоксикации и «органах – мишенях» основного метаболизма препарата в организме теплокровного животного (крысы). Как свидетельствуют полученные данные, при первом способе введения наибольшее количество препарата найдено в желудке, толстом кишечнике и поджелудочной железе;
наименьшее – мышечной ткани, почках и головном мозге;
при втором способе– максимальные количества найдены в тех же биологических объектах, но в немного больших количествах.
Исследованы особенности стабильности ТЭТД в биологическом материале (искусственных смесях с тканью печени или крови) при температурах от -15 до 36°С. Результаты представлены на рис. 2 и 3.
содержание, % -15 град.С 0 град. С 60 10 град. С 20 град. С 36 град. С время, сутки Рис. 2. Результаты изучения сохраняемости ТЭТД в ткани трупного органа (печени) Рис. 3. Количественное содержание ТЭТД в биологической жидкости (крови) Как свидетельствуют данные, полученные при изучении стабильности рассматриваемого вещества в биологическом материале, ТЭТД в предлагаемых температурных режимах сохранения (0 – 36 оС) определяется в биологическом материале в течение 1–3,5 месяцев в печени и в течение как минимум десяти дней в крови. При температуре ниже 0оС (-15 оС) рассматриваемое соединение определяется в ткани трупного органа и в крови соответственно в течение 7 и 1,5 месяцев.
По результатам проведенных исследований нами предложены варианта общей схемы исследования биологического материала при отравлении ТЭТД, представленные на рис. 4 и 5.
БИОЛОГИЧЕСКИЙ ОБЪЕКТ Двукратное настаивание с этилацетатом в течение 1,5 ч.
извлечение Фильтрование через безводный Na2SO4, испарение при 50-60°С остаток Растворение в системе Хроматогр. на колонке силикагеля гексан-диоксан-изопропанол L 40/100 элюент гексан-диоксан изопропанол (40:5:1) (40:5:1) элюат Отбор фракций с веществом с использованием метода ТСХ, упаривание остаток Растворение в ацетонитриле раствор ИК-СФМ ТСХ ВЭЖХ УФ-СФМ Рис. 4. Общая схема исследования биологического материала при отравлении ТЭТД на основе изолирования этилацетатом и очистки методом колоночной хроматографии БИОЛОГИЧЕСКИЙ ОБЪЕКТ Двукратное извлечение с этилацетатом в течение 1,5 ч.
извлечение Фильтрование через безводный Na2SO4, испарение при 50-60°С остаток Хроматогр. на колонке силикагеля L 40/100 элюент гексан-диоксан Растворение в хлороформе изопропанол (40:5:1) раствор ТСХ: гексан-диоксан Растворение в ацетонитриле изопропанол (15:5:1) остаток на пластине ТСХ раствор ВЭЖХ ИК-СФМ УФ-СФМ Рис. 5. Общая схема исследования биологического материала при отравлении ТЭТД на основе изолирования этилацетатом и очистки методом тонкослойной хроматографии Предлагаемые варианты схемы, представленные на рисунках 4 и 5, позволяют изолировать, очистить, идентифицировать и количественно определить исследуемое отравляющее вещество.
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ 1.Установлены особенности поглощения тетраэтилтиурамдисульфидом УФ-излучения в различных растворителях. Рассчитан ряд основных оптических характеристик электронных спектров.
Показана возможность идентификации рассматриваемого соединения методом электронной спектрофотометрии.
На основе способности к поглощению УФ-излучения тетраэтилтиурамдисульфидом в различных растворяющих средах (хлороформ, ацетонитрила и этилацетат) разработаны методики количественного определения тетраэтилтиурамдисульфида спектрофотометрическим и хроматоспектрофотометрическим методами.
Относительная ошибка среднего результата при определении данными методиками (n=5;
Р=0,95) в различных случаях не превышает ±1,5%.
Установлена целесообразность использования для идентификации рассматриваемого соединения метода колебательной спектрофотометрии в диапазоне частот 4000–400 см-1.
хроматографическое поведение 2.Исследовано тетраэтилтиурамдисульфида в присутствии ряда близких по структуре и свойствам веществ в тонких слоях и колонках неподвижных фаз с гидроксилированной и привитой поверхностями с использованием элюентов различной полярности. Рассчитаны отдельные параметры, характеризующие особенности хроматографирования анализируемых соединений.
Установлено, что универсальной подвижной фазой для определения тетраэтилтиурамдисульфида в тонких слоях широкопористого силикагеля на пластинках «Sorbfil» ПТСХ-АФ UV-254 и аналитических колонках нормальнофазного сорбента «Силасорб-600» является система растворителей средней полярности гексан–диоксан–пропанол-2 (15:5:1).
Разработана методика количественного определения рассматриваемого вещества методом нормальнофазовой ВЭЖХ.
Относительная ошибка среднего результата при определении тетраэтилтиурамдисульфида данным методом не превышает 1,6%.
3. Изучены особенности препаративного хроматографирования объекта исследования в макроколонках, заполненных силикагелем L 40/100µ.
Установлено, что при этом наиболее целесообразно использование подвижной фазы системы растворителей гексан–диоксан–пропанол- (40:5:1). Определн уровень потерь анализируемого вещества при хроматографировании в тонких слоях и колонках различных сорбентов.
Показана достаточная эффективность предлагаемых схем очистки тетраэтилтиурамдисульфида от соэкстрактивных веществ методами хроматографии.
4. Проведено сравнительное изолирование тетраэтилтиурамдисульфида из биологического материала изолирующими агентами различной химической природы.
Установлено, что извлечение рассматриваемого вещества из биологического материала наиболее целесообразно проводить этилацетатом, обеспечивающим наибольшую степень извлечения анализируемого соединения. Оптимальные условия изолирования этилацетатом можно достичь уже при двукратном настаивании в случае, когда масса изолирующего агента как минимум в два раза превышает массу биоматериала, а продолжительность отдельного настаивания составляет не менее 45 минут.
5. Разработаны методики определения тетраэтилтиурамдисульфида в тканях органов и биожидкостях на основе изолирования этилацетатом, очистки методами колоночной и тонкослойной хроматографии с последующим количественным определением методами спектрофотометрии и нормальнофазовой ВЭЖХ.
6. При внесении тетраэтилтиурамдисульфида в количестве 100 мг в г биоматериала методики, основанные на изолировании этилацетатом, позволяют определять в ткани печени 91,44%, в крови 95,53%, в моче 94,44% анализируемого соединения.
Разработанные методики характеризуются достаточными для подобного рода исследований воспроизводимостью и правильностью.
Определяемый минимум рассматриваемого вещества при использовании предлагаемых методик составляет 1,0 мг в 100 г трупного органа, 0,8 мг в 100 мл крови или 0,4 мг в 100 мл мочи.
7. Изучен характер распределения тетраэтилтиурамдисульфида в органах и биожидкостях теплокровных организмов (на примере крыс) при отравлениях, вызванных его самостоятельным введением и его введением вместе с этанолом.
Установлено, что после индивидуального введения отравляющего вещества наибольшее его количество найдено в желудке, толстом кишечнике и селезенке;
наименьшее – в мочевом пузыре с мочой, почках и головном мозге. При отравлении тетраэтилтиурамдисульфидом на фоне введения этанола отмечено значительное увеличение содержания исследуемого вещества в крови, моче и ткани почек.
8. Изучена сохраняемость тетраэтилтиурамдисульфида в гнилостно разлагающемся биологическом материале (печень, кровь) в зависимости от температурного режима сохранения. Установлено, что при температурах от до 36 °С тетраэтилтиурамдисульфид сохраняется в ткани трупного органа (печень), по крайней мере, в течение трх месяцев, в биологической жидкости (кровь) – в течение десяти дней. При температуре ниже 0оС (-15 оС) рассматриваемое соединение определяется в ткани трупного органа и в крови соответственно в течение 7 и 1,5 месяцев.
9. По результатам проведенных исследований предложена общая схема исследования биологического материала (ткань трупного органа, биожидкости) при отравлении тетраэтилтиурамдисульфидом.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Изучение условий выделения антабуса из крови человека с использованием натрия фторида / В.К. Шорманов [и др.] // Традиции и инновации фармацевтической науки и практики : мат. Всеросс. науч.-практ.
конф. с междунар. участием, посвящнный 45-летию фармацевтического факультета Курского государственного медицинского университета. – Курск:
Изд-во КГМУ, 2011. – С. 294–296.
2. Изучение условий экстракции антабуса из крови человека / А.П.
Просветова [и др.] // Каталог докладов IV Международной конференции «Экстракция органических соединений» / Воронеж. гос. технол. акад. – Воронеж: ВГТА, 2010. – С. 220.
3. Использование метода тонкослойной хроматографии при определении тетраэтилтиурамдисульфида в биологических жидкостях / А.П.
Просветова [и др.] // Сорбционные и хроматографические процессы. – 2010. – Т. 10, вып. 4. – С. 556 – 561.
4. Определение карбаматов и амидов дитиоугольной кислоты в тонком слое нормальнофазового сорбента / Е.П. Дурицын [и др.] // Биотехнология.
Биомедицинская инженерия и технология современных социальных практик : сб. трудов Всеросс. науч.-практ. конф. – Курск: Изд-во КГМУ, 2009. – С.
127 – 129.
5. Определение тетраэтилтиурамдисульфида методом УФ спектрофотометрии / Е.П. Дурицын [и др.] // Биомедицинская инженерия и биотехнология: сб. трудов Всеросс. науч.-практ. конф., посвященной 10 летию биотехнологического факультета Курского государственного медицинского университета. – Курск: Изд-во КГМУ, 2008. – С. 160 – 162.
6. Особенности извлечения тетраэтилтиурамдисульфида из биологического материала / А.П. Просветова [и др.] // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / под ред. М.В. Гаврилина. – Пятигорск: Изд-во ПГФА, 2011. – Вып. 66. – С.
446 – 448.
7. Особенности изолирования и определения тетраэтилтиурамдисульфида в биологическом материале / А.П. Просветова [и др.] // Вестник ВГУ, серия: Химия. Биология. Фармация. – 2009. – № 2. – С.
44 – 49.
8. Особенности определения и изучения сохраняемости тетраэтилтиурамдисульфида в биологическом материале / А.П. Просветова [и др.] // Судебно-медицинская экспертиза. – 2010. – № 6. – С. 31 – 34.
9. Особенности распределения антабуса в организме теплокровных животных / А.П. Просветова [и др.] // Фармация. – 2011. – № 3. – С. 42 – 45.
10.Пат. Российская Федерация № 2415425, МПК51 С 1 G01N33/48;
G01N30/02 / Способ определения тетраметилтиурамдисульфида в биологическом материале / Шорманов В.К., Королев В.А., Иванов В.П., Ким А.В., Дурицын Е.П., Просветова А.П.;
заявители и патентообладатели: В.К.
Шорманов, В.А. Королев, В.П. Иванов, А.В. Ким. – № 2009147065;
Заяв.
17.12.2009 ;
Опуб. 27.03.2011 // Изобретения (Заявки и патенты). – 2011. – № 9. – 10 с.
11.Пат. Российская Федерация № 2417372, МПК51 С 1 G01N33/48;
G01N30/02 / Способ определения тетраэтилтиурамдисульфида в крови / Шорманов В.К., Горбачева Н.А., Дурицын Е.П., Просветова А.П., Илюшина Т.Н., Королев В.А., Иванов В.П., Ким А.В.;
заявители и патентообладатели:
Шорманов В.К., Горбачева Н.А., Дурицын Е.П., Просветова А.П. – № 2010101891;
Заяв. 21.01.2010;
Опуб. 27.04.2011 // Изобретения (Заявки и патенты). – 2011. – № 12. – 6 с.
12.Просветова А.П. Изучение особенностей извлечения тетраэтилтиурамдисульфида из биологического материала (крови) / А.П.
Просветова, Т.Н. Илюшина // Материалы IV Междунар. науч. конф. молодых ученых-медиков 25-26 февраля 2010 года. – Курск: Изд-во КГМУ, 2010. – Том 3.– С. 69 – 72.
13.Химико-токсикологическая характеристика тетраэтилтиурамди сульфида / В.К. Шорманов [и др.] // Теория и практика фармации: сб. науч.
статей, посвященный 90-летию ВГМА им. Н.Н. Бурденко. – Воронеж, 2009. – С. 86 – 91.