Разработка и стандартизация биологически активных добавок к пище, рекомендуемых для профилактики заболеваний пищеварительной системы
На правах рукописи
ПЕШКОВА ЯНА ВЛАДИМИРОВНА РАЗРАБОТКА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК К ПИЩЕ, РЕКОМЕНДУЕМЫХ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук
Улан-Удэ- 2012 Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.
М.Сеченова» Минздравсоцразвития России
Научный консультант:
доктор фармацевтических наук, профессор Маркарян Артем Александрович
Официальные оппоненты:
доктор фармацевтических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории химико-фармацевтических исследований ФГБУН «Институт общей и экспериментальной биологии» СО РАН Николаева Галина Григорьевна кандидат фармацевтических наук, зам. генерального директора Государственного предприятия «Бурятфармация» Шелухеева Марина Геннадьевна организация: Государственное научное учреждение Ведущая «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений» Российской академии сельскохозяйственных наук» (ГНУ ВИЛАР Россельхозакадемии)
Защита состоится: «23» мая 2012 г. в 16оо часов на заседании диссертационного совета ДМ 003.028.02 при Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН по адресу: 670047, г. Улан-Удэ, ул.
Сахьяновой 6.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Бурятского научного центра СО РАН Автореферат разослан «20 » апреля 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук В. Б. Хобракова ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы. Актуальность разработки и стандартизации растительных средств, предназначенных для профилактики заболеваний пищеварительной системы, обусловлена их широким распространением, приводящим к потере трудоспособности, что подчеркивает медицинскую и социально-экономическую значимость проблемы. Несмотря на значительные успехи в профилактике и лечении заболеваний указанного профиля, улучшение условий жизни и питания, еще довольно высок уровень заболеваемости населения расстройствами желудочно кишечного тракта как в России, так и странах Запада. При использовании многих синтетических лекарственных препаратов наблюдаются обострения и рецидивы в 25-80 % случаях, а у 30 % больных, в частности, существует проблема резистентности гастродуоденальных язв к базисной фармакотерапии (Григорьев П.Я. и др., 2004). Вместе с тем, для фармакотерапии и профилактики данной патологии существует группа лекарственных средств природного происхождения, обладающих широким спектром фармакологических свойств, с более физиологичным влиянием на адаптивные процессы в организме. Высокая фармакотерапевтическая эффективность фитопрепаратов, низкая токсичность или отсутствие таковой, мягкость действия определяют возможность их длительного применения без опасности возникновения побочных явлений.
Одним из факторов профилактики указанных заболеваний служит рациональное питание с использованием растений, биологически активные вещества которых, преобразуясь в процессе метаболизма в структурные и функциональные элементы клеток органов, обеспечивают физическую и умственную работоспособность, определяют здоровье и продолжительность жизни человека. Поэтому, рациональное использование растений, адекватное возрасту, профессиональной деятельности, исходному состоянию здоровья рассматривается как важнейший фактор профилактики большинства заболеваний человека, в том числе желудочно-кишечных, сердечно-сосудистых, онкологических, обмена веществ, мочевыделительной системы и т.д.
В связи с этим, разработка новых растительных лекарственных средств и биологически активных добавок (БАД) к пище является в настоящее время актуальной проблемой, направленной на профилактику и лечение распространенных заболеваний пищеварительной системы.
Известными фармакопейными растениями, широко используемыми в лечении и профилактике заболеваний пищеварительной системы являются: девясил высокий (корневище и корни), ревень тангутский (корневище и корни), имбирь лекарственный (корневище) и кровохлебка лекарственная (корневище и корни). Использование этих растений комплексно может значительно повысить эффект базисной фармакотерапии благодаря их поливалентности в действии. В экспериментальных исследованиях установлен широкий спектр фармакологической активности: антибактериальный, вяжущий, противовоспалительный и др. Кроме сборов и чаев, широко применяемых в качестве биологически активных добавок к пище при профилактике многих заболеваний, используют суммарные экстракты сухие, сохраняющие все преимущества многокомпонентных лекарственных препаратов (Николаев С.М. и др., 1986).
Таким образом, актуальным является проведение информационно - аналитических, фармакогностических, фармакологических и технологических исследований по созданию растительной композиции, повышающей функциональное состояние пищеварительной системы.
Целью исследования является обоснование, разработка способа получения и стандартизация биологически активных добавок к пище сбора и экстракта сухого из четырех видов растительного сырья, рекомендуемых для профилактики заболеваний пищеварительной системы, и установление их показателей качества.
Для достижения сформулированной цели необходимо было решить следующие основные задачи:
- обосновать и разработать исходный состав, а также соотношение ингредиентов в растительной композиции, условно названной «Гастрофит»;
- провести фармакогностическое изучение растительной композиции для идентификации компонентов и определить содержание доминирующих биологически активных веществ;
- разработать методики качественного и количественного анализа для характеристики критериев подлинности и норм содержания действующих веществ в сборе и экстракте сухом;
- разработать способ получения экстракта сухого и исследовать влияние основных факторов, влияющих на процессы экстракции биологически активных веществ из растительной композиции;
- разработать и оформить нормативные документы на рекомендуемые БАД к пище: технические условия (ТУ), технологическую инструкцию (ТИ) и рецептуру с целью внедрения их в производство.
Научная новизна Обоснован и разработан рациональный состав и соотношение ингредиентов в многокомпонентной растительной композиции «Гастрофит», рекомендованной для профилактики заболеваний пищеварительной системы. На основании макро- и микроскопического исследований установлены основные диагностические признаки исходной композиции сбора, определены числовые показатели.
Разработаны условия проведения качественного и количественного анализа, подтверждающие наличие основных групп биологически активных веществ (БАВ), характерных для каждого вида сырья. Установлено влияние условий экстракции из растительной композиции в зависимости от степени измельчения сырья, типа экстрагента, соотношения сырья и экстрагента, гидродинамических условий, позволяющие разработать рациональный способ получения экстракта сухого со стабильными показателями качества.
С учетом вклада входящих компонентов разработаны методики количественного анализа суммы фенольных соединений в пересчёте на хлорогеновую кислоту, суммы моносахаридов - в пересчёте на глюкозу, антраценпроизводных - в пересчете на реин, суммы фруктозанов и фруктозидов - в пересчете на инулин методом спектрофотометрии.
На основании полученных результатов составлены и предложены нормативные документы на БАД к пище «Гастрофит».
Практическая значимость работы На основании проведенных исследований разработаны и внедрены: Биологически активная добавка к пище «Гастрофит»:
Технические условия (ТУ 9370-016-03533369-11);
Технологическая инструкция, рецептура;
Разработан рациональный способ получения из исходной растительной композиции экстракта сухого, установлена зависимость выхода действующих веществ от режимов и условий экстракции, составлены нормативные документы (технические условия, технологическая инструкция).
Полученные результаты используются в учебном процессе на кафедре фармации Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова (Акт внедрения от 20.02.2012 г) Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки
Работа выполнена в рамках комплексной темы ГБОУ ВПО ММУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития РФ «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико биологических исследований» (рег. № 01.2.006 06 352).
Публикации По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, из них 4 - в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ.
Апробация диссертации Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2010);
II Российском фитотерапевтическом съезде и международном форуме «Интегративная медицина» (Москва, 2010);
Х1Х Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012);
ежегодных заседаниях кафедры фармации ГБОУ ВПО ММУ им.
И.М. Сеченова (2009, 2010, 2011).
Основные положения, выносимые на защиту:
данные по разработке рационального состава и соотношения ингредиентов в растительной композиции;
результаты фармакогностических исследований по установлению критериев подлинности и норм содержания биологически активных веществ в растительной композиции;
обоснование технологии получения экстракта сухого;
результаты исследований по стандартизации растительной композиции и экстракта сухого.
Объём и структура диссертации.
Диссертационная работа изложена на 180 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы и четырех глав экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 173 источника, в том числе 60 – на иностранных языках, приложений. Работа содержит 26 рисунков и 52 таблицы.
Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, представлены научная новизна и практическая значимость работы.
В 1 главе обсуждаются вопросы применения растительных композиций в лечебном питании и профилактике заболеваний пищеварительной системы. Приводится систематизация БАД к пище, рекомендуемых для профилактики заболеваний пищеварительной системы, которые представлены в Федеральном реестре, а также рассмотрены вопросы их стандартизации.
В Материалах и методах исследований приводятся сведения об объектах исследований, используемых методах и приборах, а также другие данные методического характера.
Глава 2 посвящена разработке и стандартизации растительного средства. На основании сведений литературы, с учётом опыта народной медицины, а также данных фитохимических и фармакологических исследований обоснован состав и соотношение ингредиентов сбора «Гастрофит». Микро- и макроскопическими методами исследования идентифицированы составные компоненты сбора. Качественными реакциями, а также ТСХ подтверждено наличие в сборе: дубильных веществ, сахаров, антраценпроизводных, крахмала, инулина, фенольных соединений. Методом ВЭЖХ идентифицированы: фенольные соединения, органические кислоты, сахара. Разработаны и предложены для количественной оценки БАВ методики определения суммы фенольных соединений в пересчёте на хлорогеновую кислоту, суммы моносахаридов - в пересчёте на глюкозу, антраценпроизводных - в пересчете на реин, суммы фруктозанов и фруктозидов - в пересчете на инулин методом спектрофотометрии.
В главе 3 представлены данные по разработке технологии получения экстракта сухого. Приведено влияние основных факторов на процессы одновременного экстрагирования биологически активных соединений из 4 видов лекарственного растительного сырья (из сбора «Гастрофит»). Обоснованы оптимальные условия и разработан рациональный способ получения экстракта сухого, представлена технологическая схема производства, которая апробирована в лабораторных условиях.
В главе 4 освещены вопросы подтверждения химического состава и проведена сквозная стандартизации от сырья к экстракту сухому.
Разработаны и предложены для количественной оценки БАВ методики количественного определения суммы фенольных соединений в пересчёте на хлорогеновую кислоту, суммы моносахаридов - в пересчёте на глюкозу, антраценпроизводных - в пересчете на реин, суммы фруктозанов и фруктозидов - в пересчете на инулин.
Глава 5 содержит данные по разработке показателей качества БАД к пище «Гастрофит» и экстракта сухого из него. Разработанные показатели качества включены в нормативные документы: Технические условия (ТУ) на БАД к пище «Гастрофит» и технологическая инструкция (ТИ) на производство БАД к пище в виде сбора и экстракта сухого.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты и методы исследования Объектом исследования служило лекарственное растительное сырье, отвечающее требованиям нормативной документации:
1. Девясил высокий – Inula helenium L., семейство астровых – Asteraceae.
Корневища и корни девясила - Rhizomata et radices Inula helenii – ГФ ХI изд., вып.2, ст. 73;
2. Имбирь настоящий (и. аптечный) - Zingiber officinale Roscoe, семейство имбирных – Zingiberaceae. Корневища и корни имбиря - Rhizomata Zingiberis. «Пряности. Имбирь»- ГОСТ 29046-91;
3. Кровохлёбка лекарственная - Sanquisorbia officinalis L. семейство розоцветных-Rosaceae. Корневища и корни кровохлебки - Rhizomata et radices sanguisorbae – ФС 42-1082-76;
4. Ревень тангутский - Rheum pаlmatum L.var. tanguticum Maxim. – семейство гречишных – Polygonaceae. Корни ревеня - Radices Rhei - ГФ ХI изд., вып.2, ст. 68.
На основе вышеперечисленного сырья получены различные комбинации сбора. Отбор проб проводили по методикам ГФ XI и ОФС 42-0011-03 «Правила приемки и отбора проб». Изучение внешних признаков растительной смеси проводили в соответствии с требованиями ГФ XI изд., вып.1, с. 266-267. Изучение анатомических признаков цельного и измельченного сырья проводили в соответствии с указаниями статьи «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья» (ГФ ХI, вып. 1, С. 277).
Сгущение полученных извлечений на стадии экспериментальных исследований проводили на вакуум-выпарном ротационном испарителе марки ИРМ-1. При экстракции БАВ и приготовления хроматографических систем использовали растворители марки «ч» и «хч». Приготовление реактивов, используемых в экспериментальной части работы, осуществляли согласно ГФ XII. Для хроматографии в тонком слое сорбента использовали пластинки Kieselgel 40 F254;
Е. Меrck, Darmsta, размером 1515см и Sorbfil, РФ. Для тонкослойной хроматографии использовали следующие системы растворителей: гексан – эфир (40:60);
гексан – этилацетат (85:15);
бензол – этилацетат – метиловый спирт (94:3:0,5);
этилацетат – уксусная кислота – вода (25:5:5);
пиридин – этилацетат – вода (20:40:60);
этилацетат – спирт метиловый – вода (100:17:13). Соотношение растворителей учитывали в объемных частях.
Все значения Rf обнаруженных соединений рассчитаны как средние из пяти измерений. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре «Gelios» (США) в кювете с толщиной поглощающего слоя жидкости 10 мм. ВЭЖХ-анализ БАВ проводили на хроматографе «GILSTON» (Франция) с металлической колонкой размером 4,6х250 мм Kromasil C 18, размер частиц 5 микрон, а также с металлической колонкой ALTECH OA-1000 Organic Acids размером 6.5х300 мм, с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы «Мультихром для Windows».
При разработке методик качественного и количественного определения биологически активных веществ были использованы хроматографически чистые вещества и стандарты.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Разработка способа получения и стандартизация БАД к пище «Гастрофит» и установление показателей качества Выбор отдельных видов лекарственного растительного сырья для составления растительной композиции проводили с учетом сведений народной медицины, химического состава биологически активных веществ, которые могут оказывать комплексное воздействие на состояние пищеварительной системы. При этом рассматривались только разрешенные к применению в РФ лекарственные растения и состояние их сырьевой базы. Проведена оценка исходного сырья по действующей нормативной документации. По числовым показателям образцы соответствовали требованиям НД. С целью определения оптимального соотношения входящих компонентов были изучены несколько вариантов сбора «Гастрофит», которые представлены в таблице 1.
Таблица Варианты состава сбора «Гастрофит» Варианты сбора по количеству входящих Наименование № ингредиентов (г) ингредиентов п/п сбора 1 2 3 Корневища и 1 400 300 400 корни девясила Корневища и 2 300 400 200 корни кровохлебки 3 Корневище имбиря 200 200 300 4 Корни ревеня 100 100 100 Для оценки содержания действующих веществ в исходной композиции из растительного сырья разработана методика количественного определения в сборе суммы фенольных соединений в пересчете на хлорогеновую кислоту. Количественное определение проведено методом спектрофотометрии. Содержание суммы фенольных соединений в извлечении из сбора определяли при характерном максимуме поглощения хлорогеновой кислоты при длине волны 280 нм (табл.2).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что наибольшее количество фенольных соединений содержится в сухом концентрате, полученном экстракцией 1-го варианта сбора. Фармакологические испытания показали, что сухой концентрат, полученный экстракцией 1-го варианта сбора, обладает более выраженной активностью.
Таблица Данные количественного анализа четырех вариантов сбора Содержание суммы Содержание Объект исследования, фенольных соединений в экстрактивных веществ варианты сбора. пересчёте на в 100г сырья, г хлорогеновую кислоту, % 1 вариант 12,8 4, 2 вариант 11,16 4, 3 вариант 11,52 4, 4 вариант 10,89 4, Разработана технологическая схема получения БАД к пище «Гастрофит. Для определения критериев подлинности сбора методами макро- и микроскопического анализа были определены внешние и анатомо-диагностические признаки. При визуальном осмотре c помощью лупы и стереомикроскопа установлено, что растительная композиция представляет собой смесь неоднородных по размеру и окраске частиц от желтого до бурого цвета с розовыми вкраплениями, проходящих сквозь сито d - 1мм. Запах ароматный, своеобразный. Вкус горьковатый, вяжущий. Все компоненты сбора достаточно хорошо дифференцируются по внешним признакам. Приведено детальное описание внешних характеристик каждого компонента сбора.
Исследование микроскопических признаков сырья Микроскопические исследования позволили установить диагностические признаки компонентов сбора, которые соответствовали их описанию в ГФ XI. При последовательном просмотре образцов идентифицировали основные компоненты сбора, выявлены диагностически значимые признаки, позволяющие определить подлинность сбора: на поперечном срезе корня видна многорядная серовато - бурая пробка, кора и древесина. Паренхима коры состоит из крупных клеток, содержащих инулин в виде бесформенных, бесцветных, сильно преломляющих свет "глыбок". В древесине видны крупные сосуды, особенно близ камбия, расположенные группами. В коре и древесине корня имеются крупные схизогенные вместилища со смолой и эфирным маслом. Они округлые или овальные, с хорошо заметным слоем выделительных клеток (девясил высокий). На поперечном срезе корня виден слой темно - коричневой пробки, состоящий из нескольких рядов клеток, красно - коричневый слой феллодермы, довольно узкая кора и широкая древесина. Феллодерма состоит из крупных тангентально вытянутых клеток с утолщенными стенками. Сердцевидные лучи 2 - 4 рядные, воронковидно расширяющиеся к периферии. Флоэма состоит из тонкостенных клеток, среди которых видны округлые вместилища со слизью. Древесина состоит из тонкостенных клеток паренхимы и крупных сосудов, лежащих одиночно или небольшими группами. В паренхиме коры и древесины содержатся очень крупные друзы оксалата кальция (до 100-120 мкм) и крахмальные зерна 2-40 мкм в диаметре (ревень тангутский). На поперечном срезе корня видна темно-бурая пробка, состоящая из мелких неровных клеток. Корень имеет вторичное строение.
Кора широкая. Под пробкой располагаются 2-3 слоя крупных клеток паренхимы с утолщенными оболочками. Центральная часть корневища занята сердцевиной из тонкостенных паренхимных клеток. Видны множественные крахмальные зерна. В паренхимальных клетках часто встречаются крупные друзы, призматические кристаллы (кровохлебка лекарственная). На поверхности имеется эпидермис, покрытый тонкой кутикулой. Глубже располагается коровая паренхима, состоящая из крупных неправильной формы клеток и густо заполненная зернами крахмала. В секреторных клетках паренхимы встречаются крупные капли эфирного масла ярко-желтого цвета. Во многих проводящих пучках коры и центрального цилиндра можно различить близ сосудов по 1, реже 2, клетки с рыжеватым содержимым – пигментные клетки. Присутствуют зерна крахмала (имбирь лекарственный).
Наиболее часто встречающимися видами сырья являлись:
корневища и корни девясила и кровохлебки - в 50-60 % случаях;
редко встречающиеся, около 20 % - корневище имбиря и корни ревеня. Таким образом, проведенные исследования подтвердили подлинность сбора по входящим в его состав компонентам, результаты исследования включены в соответствующие разделы нормативных документов.
Товароведческий анализ сбора позволил установить числовые показатели качества: влажность – не более 9 %;
золы общей – не более %;
золы, нерастворимой в НС1-не более 4 %;
органической примеси - не более 3 %;
минеральной примеси - не более 2 %;
Степень измельчения:
частиц, не проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 7 мм, не более 5 %;
частиц, проходящей сквозь сито с диаметром отверстий 0,25 мм - не более 3 %;
зараженность амбарными вредителями – не допускается.
Определена также микробиологическая и радиологическая чистота сбора.
2. Фитохимическое изучение сбора «Гастрофит» Установление подлинности и разработка методик количественного определения основных соединений в сырье Анализ и стандартизация растительного сырья представляет собой сложную задачу из-за многокомпонентности состава.
Биологическая активность извлечений из растений зависит от действия комплекса органических и неорганических соединений, содержащихся в них. В этом комплексе наиболее важная роль принадлежит фенольным соединениям (флавоноиды, дубильные вещества, фенолкарбоновые кислоты), органическим кислотам, полисахаридам и др.
В разделе «Качественные реакции» проекта нормативной документации (НД) предусмотрено проведение качественных реакций на наличие: танинов (черно-зелёное окрашивание при добавлении железо аммониевых квасцов), антраценпроизводных (реакция с 10 % раствором HCl, бензола и аммиака – красно-фиолетовое окрашивание аммиачного слоя), свободных сахаров - с реактивом Феллинга (должно наблюдаться появление осадка кирпично-красного цвета), крахмал (реакция с каплей йода), инулина (реакция с резорцином и HCl – красное окрашивание) и методик ТСХ.
В таблице 3 приведены данные хроматографического анализа основных групп БАВ, присутствующих в сборе.
Таблица Данные хроматографического исследования отдельных групп БАВ Группа, фракция Условия Анализ хроматограмм 1 2 Система: гексан - эфир 40:60. При просмотре в видимом свете Rf Фруктозаны и детектор: 1% раствор ванилина 0,70 (фиолетовая) цитраль, Rf 0, фруктозиды Kieselgel 40 F254;
в серной кислоте (красная) резорцин, а фиолетовая Е.Merck, зона с Rf 0,50 шогаол Система: гексан - этилацетат Rf 0,27 гераниол;
0,35 L-пинен;
Эфирные масла «Сорбфил» 85:15. 0,48 -пинен;
0,77 борнилацетат.
«Сорбфил УФ Система:бензол – этилацетат - Красная окраска в видимом свете с 254» метиловый спирт (94:3:0,5) Rf 0,4 (алантолактон) Системы: I - н-бутанол– кислота Окраска в видимом (бледно Флавоноиды Этилацетатная уксусная–вода 4:1:2;
II - 15% желтая), вУФ-свете от желтой до фракция кислота уксусная;
детекторы: коричневой;
обнаружены зоны пары NH3, 5% р-р Na2СО3, 5% сп. рутин (Rf~0,51), лютеолин БХ: «Filtrak № р-р AlCl3 (Rf~0,94), апигенин (Rf~0,90) 11» Системы: I – этилацетат-к-та Обнаружены зоны (I): рутин ТСХ: «Kiezelgel уксусная - вода 5:1:1;
II хл/ф– (Rf~0,27) апигенин (Rf~0,95) 60F254» метанол-вода 62:32: Системы: I - н-бутанол – кислота Флюоресцеция в УФ-свете ярко ФКК и уксусная – вода 4: 1:2 и II - 2% голубая, (I): галловой (Rf~0,66), оксикоричные кислота уксусная;
детекторы: хлорогеновой (Rf~0,68) и кислоты Этилацетатная пары аммиака, 3% спирт.р-р кофейной (Rf~0,80) фракция FeCl БХ: «Filtrak № Системы: I - н-бутанол- к- та Обнаружены зоны кислот (I):
11» уксусная – вода 4:1:2;
II хл/ф- хлорогеновой (Rf~0,39), галловой Этилацетатная метанол-вода 62:32:7 (Rf~ 0,80), кофейной (Rf~0,73) фракция ТСХ: Kiezelgel Согласно данным литературы и проведенному фитохимическому исследованию преобладающей группой БАВ являются фенольные соединения, что подтверждено ВЭЖХ (рис.1).
Рис 1. ВЭЖХ извлечения из сбора 70 % спиртом этиловым, при 280 нм (эллаговая кислота, галловая кислота, хлорогеновая кислота, неохлорогеновая кислота, кофейная кислота, цикориевая кислота, рутин, гингерол, лютеолин, кверцетин, апигенин) Идентифицировано 11 соединений: эллаговая кислота, галловая кислота, хлорогеновая кислота, неохлорогеновая кислота, кофейная кислота, цикориевая кислота, рутин, гингерол, лютеолин, кверцетин, апигенин.
Для идентификации органических кислот, сахаров также использован метод ВЭЖХ. Изучение проведено для органических кислот и сахаров в водном извлечении из сбора. Результаты проведенных исследований приведены на рисунках 2 и 3.
Из свободных сахаров идентифицированы: глюкоза, фруктоза, сахароза;
из органических кислот обнаружены: щавелевая, лимонная, винная, яблочная, янтарная, уксусная.
Рис. 2 ВЭЖХ органических кислот в Рис. 3 ВЭЖХ сахаров сборе «Гастрофит» 1-глюкоза, 2- фруктоза,3 1- не ид. 2-щавелевая, 3- лимонная 4- сахароза винная, 5-яблочная, 6-янтарная, 7 уксусная, 8 - не ид.
Определение эфирных масел проведено методом ГЖХ и идентифицированы: пинен, борнеол, цитраль, цинеол, гераниол.
3. Разработка методик количественного определения а) фенольных соединений Количественное определение суммы фенольных соединений основано на спектрофотометрировании водно-спиртового извлечения из сбора. Для разработки методики количественного определения суммы фенольных соединений в пересчете на хлорогеновую кислоту подобраны условия анализа (кратность экстракции, выбор экстрагента, температура, степень измельченности).
Полученные данные свидетельствуют о том, что максимальное содержание суммы фенольных соединений в извлечении наблюдается при двухкратном экстрагировании сбора, предварительно измельчённого до размера частиц, проходящих сквозь сито с размеров частиц, проходящих сквозь сито- 2 мм, экстрагентом 70 % спиртом этиловым, на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 1 ч при соотношении сырья и экстрагента 1:20. Согласно полученным данным, максимум поглощения исследуемого раствора находится в УФ-области спектра при длине волны 281±2 нм. В качестве рабочего стандартного образца предложена хлорогеновая кислота, которая совпадает с УФ-спектром спиртового извлечения из сбора (рис 4).
Рис. 4. 1 – извлечение из сбора;
2 – кислота хлорогеновая СО;
3 – плацебо Метрологические характеристики методики определения содержания суммы фенольных соединений в пересчёте на хлорогеновую кислоту приведены в таблице Таблица Метрологические характеристики методики количественного определения суммы фенольных соединений в сборе в пересчете на хлорогеновую кислоту S n f Xcр Sx P,% t (P, f) Xср ср, % 5 4 4,85 0,0016 0,018 95 2,78 0,049 ±5, Содержание суммы фенольных соединений в сборе в пересчёте на хлорогеновую кислоту должно быть не менее 4,6 %. Воспроизводимость методики количественного определения фенольных соединений была установлена на примере одного образца в 5 повторностях.
б) фруктозанов и фруктозидов Для количественного определения фруктозанов и фруктозидов в сборе «Гастрофит» был использован метод спектрофотометрии.
Для выбора длины волны предварительно был установлен спектр поглощения комплекса испытуемого раствора с раствором резорцина.
Максимум поглощения исследуемого раствора находится при длине волны 482,5±2 нм и совпадает с максимумом поглощения комплекса инулина с раствором резорцина (479,5±2 нм). В связи с этим, мы использовали длину волны 480 нм (Рис. 5).
Рис. 5. УФ-спектр извлечения из сбора с раствором резорцина (верхняя кривая), комплекс РСО инулина с раствором резорцина (нижняя кривая).
Метрологические характеристики методики определения содержания суммы фенольных соединений в пересчёте на хлорогеновую кислоту приведены в таблице Таблица Метрологические характеристики методики количественного определения суммы фруктозанов и фруктозидов в пересчёте на инулин S n f Xcр Sx P,% t (P, f) Xср ср, % 5 4 18,66 0,167 0,409 95 2,78 0,507 ±5, Содержание суммы фруктозанов и фруктозидов в пересчете на инулин в сборе должно составлять не менее 18,0 %. Относительная ошибка методики определения содержания суммы фруктозанов и фруктозидов с 95% вероятностью составляет ±5,38%.
в) антраценпроизводных Количественное определение суммы антраценпроизводных в пересчете на реин проводили методом спектрофотометрии. Для разработки методики подобраны оптимальные условия анализа (кратность экстракции, выбор экстрагента, температура, степень измельченности).
Содержание суммы антраценпроизводных рассчитывали в пересчете на реин, используя с этой целью в качестве рабочего стандартного образца раствор реина в 70 % этаноле. Согласно проведенным исследованиям содержание антраценпроизводных в сборе колеблется в пределах 0,26 %.
(табл. 6) Таблица Метрологические характеристики методики количественного определения суммы антраценпроизводных в сборе в пересчете на реин S n f Xcр Sx P,% t (P, f) Xср ср, % 5 4 0,26 0,0001 0,01 95 2,78 0,012 ±4, Относительная ошибка методики определения содержания суммы антраценпроизводных в сборе в пересчете на реин с 95 % вероятностью составляет ± 4,62 %.
г) сахаров Для количественной оценки сахаров в сборе метод спектрофотометрии предусматривает экстракцию полисахаридного комплекса из сырья водой, его осаждение спиртом этиловым, гидролиз, образование окрашенного соединения продуктов гидролиза (моносахаридов) с пикриновой кислотой в щелочной среде, последующее измерение оптической плотности. Полученный окрашенный комплекс имеет максимум поглощения при длине волны 4662 нм как и комплекс глюкозы с пикриновой кислотой (рис. 6).
Рис. 6 – УФ-спектры поглощения соединения извлечения из сбора с пикриновой кислотой (1) и продукта взаимодействия глюкозы СО с пикриновой кислотой (пикраминовая кислота) в щелочной среде(2) Согласно полученным данным продукт взаимодействия извлечения из сбора с пикриновой кислотой имеет спектральную кривую, идентичную кривой комплекса глюкозы с пикриновой кислотой.
Содержание моносахаридов в сборе должно составлять не менее 26,0 % (таблица 7) Таблица Метрологические характеристики методики количественного определения суммы моносахаридов в сборе S n f Xcр Sx P,% t (P, f) Xср ср, % 5 4 26,16 0,693 0,832 95 2,78 1,033 ±3, Относительная ошибка методики количественного определения суммы моносахаридов в пересчете на глюкозу с 95 % вероятностью составляет ±3,95 %.
Изучение стабильности сбора при хранении в рекомендуемой упаковке позволяет рекомендовать его срок годности - 2 года.
На основании приведенных данных предложен БАД к пище «Гастрофит», разработаны технические условия (ТУ), технологическая инструкция (ТИ), в которых регламентированы показатели качества, безопасности и определены сроки хранения.
4. Разработка способа получения и стандартизация экстракта сухого из сбора «Гастрофит» Дальнейшей задачей нашей работы явилась разработка экстракта сухого из сбора. Легкорастворимые чаи в виде сухих экстрактов обеспечивают максимальный выход БАВ и возможность создания стандартизованных фитопрепаратов. Для определения оптимальных условий экстракции изучены: влияние экстрагента, его соотношение с сырьем, степень измельчения сырья, продолжительность и кратность экстракций на выход БАВ, которые проводились по экстрактивным веществам, а также по разработанной ранее методике количественного определения суммы фенольных соединений в пересчете на хлорогеновую кислоту. В результате проведенных исследований предложена технологическая схема производства экстракта сухого: экстрагент – горячая вода (80-90С), соотношение его к сырью - 1:10-12 при трехкратной экстракции, причем время 1 экстракции – 1 час, 2- ой экстракции – 45 минут, 3-ей экстракции – 30 минут, которая приведена на рис. 7.
ТП 1.1 Подготовка оборудования и помещения ТП 1.2. Подготовка персонала ТП 1. Подготовительные работы ТП 1.3. Отвешивание растительного сбора ТП 1.4. Измельчение сырья ТП 1.5. Просеивание сырья, сквозь сито d= 5 мм ТП 1.6. Отмеривание воды очищенной ТП 2.1. Экстрагирование сырья при t = 80-900С Вода в отгон ТП 2.2. Фильтрование ТП 2. Получение Шрот в отход экстракта сухого ТП 2.3. Концентрирование извлечения ТП 2.4. Сепарирование Баластные вещества в отход ТП 2.5. Сушка УМО 1. Контроль качества УМО 1.1. Контроль качества экстракта готовой продукции УМО 1.2. Фасовка экстракта УМО 1.3. Упаковка и маркировка на склад УМО 1.4 Хранение Рис 7. Технологическая схема производства экстракта сухого из сбора «Гастрофит» Все подобранные оптимальные параметры процесса экстракции были положены в основу проведения серии балансовых загрузок для пяти партий экстракта сухого. Экстракт сухой представляет собой аморфный порошок от светло-коричневого до коричневого цвета со специфическим запахом, гигроскопичен, комкуется. Насыпная масса экстракта сухого при свободном падении — 0,48 г/см3, при уплотнении — 0,76 г/см3.
Сыпучесть — 1,90 г/сек, угол естественного откоса 35-37°. Потеря в массе при высушивании при 100-105°С до постоянной массы установлена в соответствии с ГФ XI изд. и не превышает 4,0 %.
5. Химическое исследование и разработка методик количественного определения основных БАВ в экстракте сухом Наличие основных групп БАВ в экстракте сухом было подтверждено качественными реакциями, методами спектрофотометрии, ТСХ и ВЭЖХ. В экстракте сухом идентифицированы: фенольные соединения, антраценпроизводные, инулин, органические кислоты, сахара. Состав экстракта сухого по результатам исследований, близок исходной композиции «Гастрофит». Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что по качественному составу происходит переход основных БАВ из сбора в экстракт сухой, что, в свою очередь подтверждает рациональность разработанной технологии его получения.
Проведена разработка методик количественного определения основных БАВ в экстракте сухом:
а) фенольных соединений Для установления подлинности экстракта сухого предусмотрено проведение качественных реакций аналогичных реакциям на БАВ в сырье, а также ТСХ - анализ со стандартными образцами. В ходе исследований подобраны условия определения фенольных соединений и разработана методика количественного определения суммы фенольных соединений в пересчёте на хлорогеновую кислоту методом спектрофотометрии. Полученные результаты приведены в таблице 8.
Таблица Метрологические характеристики методики количественного определения суммы фенольных соединений в экстракте сухом S n f Xcр Sx P,% t (P, f) Xср ср, % 5 4 8,77 0,046 0,0204 95 2,78 0,0254 ±3, Согласно проведенным исследованиям в экстракте сухом количественное содержание фенольных соединений должно быть не менее 8,5 %. Относительная ошибка методики количественного определения суммы фенольных соединений с 95 % вероятностью составляет ±4,29 %. Для проверки отсутствия систематической ошибки методики были поставлены эксперименты с добавками хлорогеновой кислоты.
б) антраценпроизводных Количественное определение антраценпроизводных в пересчете на реин, суммы моносахаридов в пересчете на глюкозу, суммы фруктозанов и фруктозидов методом спектрофотометрии проводили по методикам, аналогичным таковым на сбор «Гастрофит».
Метрологические характеристики методики представлены в таблице 9.
Таблица Метрологические характеристики методики количественного определения суммы антраценпроизводных в экстракте сухом в пересчете на реин S n f Xcр Sx P,% t (P, f) Xср ср, % 5 4 0,742 0,00052 0,228 95 2,78 0,028 ± 3, Норма содержание антраценпроизводных в экстракте сухом установлена не менее 0,7 %. Относительная ошибка методики количественного определения антраценпроизводных с 95 % вероятностью составляет ±3,77%.
в) сахаров Для количественной оценки сахаров в экстракте сухом также разработана методика с образованием окрашенного соединения продуктов гидролиза (моносахаридов) с пикриновой кислотой в щелочной среде и последующим измерением его оптической плотности. Норма содержания моносахаридов в экстракте сухом должно быть не менее 40 %.
Полученные результаты приведены в таблице 10.
Таблица Метрологические характеристики методики количественного определения суммы моносахаридов экстракте в сухом в пересчете на глюкозу S n f Xcр Sx P,% t (P, f) Xср ср, % 5 4 40,98 0,023 0,152 95 2,78 0,188 ± 3, Относительная ошибка методики количественного определения суммы моносахаридов с 95 % вероятностью составляет ±3,52%.
г) фруктозанов и фруктозидов Количественная оценка проведена по разработанной ранее методике на сбор. Норма содержания суммы фруктозанов и фруктозидов в пересчете на инулин в экстракте сухом должна быть не менее 24,0 %.
(Таблица 11) Таблица Метрологические характеристики методики количественного определения суммы суммы фруктозанов и фруктозидов в пересчёте на инулин в экстракте сухом S n f Xcр Sx P,% t (P, f) Xср ср, % 5 4 24,82 0,477 0,691 95 2,78 0,857 ± 3, Относительная ошибка методики количественного определения суммы фруктозанов и фруктозидов в пересчете на инулин с 95 % вероятностью составляет ±3,12%.
Проведены исследования по установлению сроков годности экстракта сухого. При хранении в обычных условиях показатели качества определялись через каждые 6 месяцев. На основании полученных данных установлен предварительный срок годности – 2 года, которые включены в нормативные документы.
Фармакологические исследования экстракта сухого и отвара исходного сбора показали его выраженную противовоспалительную, спазмолитическую и антибактериальную активность. По данным токсикологического исследования (острая токсичность) сбор «Гастрофит» и экстракт сухой согласно действующей классификации отнесены к практически безвредным веществам.
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ 1. На основании фармакологического скрининга и предварительного фитохимического исследования обоснован и предложен рациональный состав и соотношение компонентов сбора «Гастрофит».
2. Установлены и предложены диагностически значимые признаки и товароведческие характеристики для сбора «Гастрофит»;
качественными реакциями, методами хроматографии в тонком слое сорбента, ВЭЖХ подтверждено наличие в сборе «Гастрофит» фенольных соединений, антраценпроизводных, сахаров, фруктозанов и фруктозидов.
3. Для количественной оценки БАВ разработаны методики определения суммы фенольных соединений в пересчёте на хлорогеновую кислоту;
суммы моносахаридов - в пересчёте на глюкозу;
суммы антраценпроизводных - в пересчете на реин;
суммы фруктозанов и фруктозидов - в пересчете на инулин;
все методики количественного определения БАВ валидированы.
4. Разработан способ получения экстракта сухого;
установлено влияние основных факторов экстракции на выход биологически активных веществ: тип экстрагента - горячая вода (80-90оС);
соотношение сырья и экстрагента (1:10-12), кратность - 3;
разработаны и валидированы методики количественного определения основных биологически активных веществ, обеспечивающих сквозную стандартизацию от сырья к экстракту сухому.
5. На основании проведенных исследований предложены критерии подлинности и безопасности, сроки годности и нормы содержания биологически активных веществ, которые включены в нормативные документы на БАД к пище «Гастрофит.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Пешкова Я.В. Идентификация БАВ сбора «Гастрофит» методом ГЖХ /Я.В. Пешкова, А.А. Маркарян // Научные труды международного форума «Интегративная медицина - 2010».- М., 2010. - С.226-227.
2. Пешкова Я.В. Идентификация основных биологически активных веществ сбора «Гастрофит» /Я.В. Пешкова., А.А. Маркарян, К.А.
Потрясай //Научные труды международного форума «Интегративная медицина» - 2010.- М., 2010. - С.37.
3 Пешкова Я.В. Идентификация фенольных соединений в сборе «Гастрофит» методом ВЭЖХ /А.А. Маркарян, Я.В. Пешкова, К.А.
Красильникова //Естественные и технические науки. - 2010. – №5. – С.
221-225.
4. Пешкова Я.В. Разработка способа получения экстракта сухого из сбора «Гастрофит» /Я.В. Пешкова, А.А. Маркарян, К.А. Красильникова Т.Д.Даргаева // Естественные и технические науки. - 2010. – №5. – С. 226-229.
5. Пешкова Я.В. Идентификация фенольных соединений в сборе витаминном методом тонкослойной хроматографии /В.О. Решетова, Я.В.
Пешкова, А.А Маркарян //Естественные и технические науки. - 2012. -№1.
- С.145-148.
6. Пешкова Я.В. Пищевые растения как источник средств для снижения риска развития заболеваний желудочно-кишечного тракта /Я.В. Пешкова, О.В. Евдокимова, И. Тарраб, В.О. Решетова //Естественные и технические науки. -2012. - №1.- С.142-144.
7. Пешкова Я.В. Идентификация фенольных соединений в сборе «Гастрофит» /Я.В. Пешкова, А.А. Маркарян, К.А. Потрясай, Т.Д.
Даргаева //Матер. ХIX Росс. нац. конгресса “Человек и лекарство»- М., 2012. - С.175.