Разработка методик изолирования и определения тианептина в биоматериале для целей судебно- химического и химико-токсикологического анализа
На правах рукописи
Люст Елена Николаевна
РАЗРАБОТКА МЕТОДИК ИЗОЛИРОВАНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ТИАНЕПТИНА В БИОМАТЕРИАЛЕ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ СУДЕБНО-
ХИМИЧЕСКОГО И ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
Пермь – 2012 2
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учрежде нии высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Научный руководитель: кандидат фармацевтических наук, доцент Малкова Тамара Леонидовна
Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор Коркодинова Любовь Михайловна ГБОУ ВПО «Пермская государственная фарма цевтическая академия» Министерства здраво охранения и социального развития Российской Федерации, заведующая кафедрой доктор фармацевтических наук, профессор Куклин Владимир Николаевич ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государст венная химико-фармацевтическая академия»
Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, профессор кафедры
Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Пятигорская государственная фарма цевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального разви тия Российской Федерации
Защита состоится «27» марта 2012 г. в 1300 часов на заседании диссертацион ного совета Д 208.068.01 при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фарма цевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального разви тия Российской Федерации по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО ПГФА Мин здравсоцразвития России по адресу: г. Пермь, ул. Крупской, 46.
Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки Российской Федерации http://www.mon.gov.ru «_»
февраля 2012 г. и на сайте ПГФА http://www.pfa.ru « » февраля 2012 г.
Автореферат разослан «» февраля 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фармацевтических наук, доцент И.А. Липатникова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы Состояние тревоги и беспокойства, депрессия стали часто встречающимися нарушениями здоровья, что значительно снижает качество жизни современного человека. Особенно высока частота депрессии у людей, имеющих различные соматические болезни. Основными признаками депрессии являются подавленное настроение, утрата интереса к жизни, нарушение сна, повышение раздражительности, суицидальные мысли.
Лекарственные средства, применяющиеся для коррекции данных рас стройств, относятся к группе антидепрессантов и на текущий момент явля ются наиболее востребованными лекарственными препаратами. Наряду с этим антидепрессанты относятся к числу наиболее токсичных психотропных веществ. Необоснованное применение, как самостоятельного лекарственного средства, так и в комбинации с другими препаратами, может стать причиной острых отравлений и интоксикаций со смертельным исходом. Вследствие этого отравление антидепрессантами стало актуальной проблемой клиниче ской токсикологии.
Среди антидепрессантов важное место занимают представители три циклической структуры, к числу которых принадлежит тианептин («Коак сил®», «Stablon®»). Зарегистрированные факты немедицинского применения лекарственного средства свидетельствуют о том, что преднамеренное избы точное потребление тианептина несет в себе угрозу негативных последствий для физического и психического здоровья человека. Последствиями приме нения завышенных доз тианептина становятся различные психические рас стройства, а также соматические осложнения при инъекционном способе введения растертых и суспензированных с водой таблеток.
На основании Постановления Правительства РФ № 486 от 30.06. «О внесении изменений в некоторые акты правительства РФ, связанные с оборотом наркотических средств, психотропных веществ и их прекурсоров»
тианептин отнесен к списку психотропных веществ (список III).
В связи с этим актуальным является направление по разработке мето дик судебно-химического и химико-токсикологического анализа тианептина.
Цель и задачи исследования Цель – разработка методик изолирования, обнаружения и количествен ного определения антидепрессанта тианептина («Коаксил®») для целей су дебно-химического и химико-токсикологического анализа.
Для достижения поставленной цели предстояло решить задачи:
Разработать методики обнаружения тианептина на основе микро кристаллоскопических реакций и тонкослойной хроматографии Разработать методики определения тианептина с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии и газовой хромато графии с масс – детектированием Определить оптимальные условия изолирования тианептина из водных растворов Изучить условия экстракции тианептина на модельных смесях биологических объектов (внутренние органы, биожидкости) Апробировать результаты исследований по изучению условий экстракции и методик определения тианептина в экспериментах с ла бораторными животными Личный вклад автора Автором самостоятельно проведены исследования по выбору условий изолирования тианептина и созданию методик его анализа в биологических объектах, разработаны способы идентификации с помощью предварительных и подтверждающих методов, осуществлен анализ полученных эксперимен тальных данных. Самостоятельно проведены исследования в качестве опера тора аналитического оборудования, используемого в работе.
Научная новизна Предложен алгоритм проведения микрокристаллоскопических реакций для идентификации тианептина в ряду антидепрессантов.
Разработаны условия определения тианептина и его метаболита в био логических объектах на основе тонкослойной хроматографии (ТСХ), высоко эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), газовой хроматографии с масс – детектированием (ГХ-МС), установлены их хроматографические па раметры. Предложенные методики позволяют определить тианептин в при сутствии его метаболита и других антидепрессантов.
На основании изучения степени экстракции разработана методика изо лирования тианептина из биоматериала для целей судебно-химического и химико-токсикологического анализа.
Практическая значимость Результаты проведенных исследований позволяют сформировать алго ритм проведения этапов судебно-химического и химико-токсикологического исследования антидепрессанта тианептина в биологических объектах.
Разработанные методики определения тианептина для целей химико токсикологического анализа на основе химических и хроматографических методов внедрены в учебный процесс студентов кафедр биохимии с курсом токсикологической химии Оренбургской государственной медицинской ака демии (акт внедрения от 20 сентября 2011 г.), фармацевтической химии и слушателей центра повышения квалификации специалистов Санкт Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (акт внедрения от 20 октября 2011 г.), фармацевтической и токсикологической химии Кемеровской государственной медицинской академии (акт внедрения от 28 октября 2011 г.), в практическую работу судебно-химических отделе ний Бюро судебно-медицинской экспертизы Республики Алтай (акт внедре ния от 10 октября 2011 г.), Самарского областного бюро судебно медицинской экспертизы (акт внедрения от 03 ноября 2011 г.), Свердловско го бюро судебно-медицинской экспертизы (акт внедрения от 08 декабря года), Ульяновского областного бюро судебно-медицинской экспертизы (акт внедрения от 28 декабря 2011 года) По результатам исследований подготовлено, утверждено Ученым сове том Российского центра судебно-медицинской экспертизы и разослано в тер риториальные бюро судебно-медицинской экспертизы информационное письмо «Обнаружение и количественное определение антидепрессанта тиа нептина для целей химико-токсикологического анализа».
Апробация работы Основные материалы работы доложены на научной конференции «Раз работка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции»
(Пятигорск, 2007), международной научно-практической конференции «Здо ровье и образование» (Палермо, 2007), Всероссийской научно–практической конференции, посвященной памяти профессора Ю.М. Кубицкого «Совре менные проблемы медико-криминалистических, судебно-химических и хи мико-токсикологических экспертных исследований» (Москва, 2007), Всерос сийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических ис следований и фармацевтического анализа» (Пермь, 2009), 74-ой итоговой студенческой научно–практической конференции с международным участи ем, посвященной 100-летию со дня рождения профессора А.М. Дыхно (Крас ноярск, 2010), 85-ой Всероссийской студенческой научной конференции па мяти профессора Д.М. Зубаирова (Казань, 2011), научно–практической кон ференции с международным участием, посвященной 85-летию со дня рожде ния профессора В.И. Алисиевича «Морфология критических и терминальных состояний» (Москва, 2011), ежегодной конференции «Фармация и общест венное здоровье» (Екатеринбург, 2011), Российской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию Пермской государственной фармацевтической академии «Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских ВУЗов: от разработки до коммерциализа ции» (Пермь, 2011).
Объем и структура работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экс периментальной части (4 главы), общих выводов, списка литературы, вклю чающего 133 наименования (35 источников зарубежной литературы), прило жения. Работа изложена на 118 страницах машинописного текста, включает 21 таблицу, 32 рисунка и 35 страниц приложения, включающего акты вне дрения, Информационное письмо.
Публикации По теме диссертации опубликовано 19 работ, из них 2 – в журналах Перечня ВАК РФ.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтиче ских наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом на учных исследований Пермской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации 01.9.50 007417).
На защиту диссертации выносятся следующие положения:
Методики обнаружения тианептина на основе тонкослойной хроматографии и микрокристаллоскопических реакций Методики подтверждающего исследования тианептина методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и газовой хромато графии с масс-детектированием Результаты изучения условий изолирования тианептина из био объектов в зависимости от рН раствора и природы органического рас творителя Результаты определения тианептина и его метаболита с исполь зованием предложенных методик анализа в модельных смесях и в опы тах с биологическими объектами от лабораторных животных Схема анализа тианептина в биообъектах.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Обзор литературы Обобщены данные литературных источников о фармакологических свойствах тианептина, токсических поражениях в случаях злоупотребления препаратом. Описаны способы изолирования, химические и физико химические методы анализа, применяемые для идентификации антидепрес сантов.
2. Объекты и методы исследования В эксперименте были использованы объекты исследования:
• рабочий стандартный образец тианептина • модельные смеси биоматериала • внутренние органы и биологические жидкости от лабораторных жи вотных (суточная моча, печень, почки крыс) Оборудование и средства измерений:
Для разработки методики идентификации тианептина методом ТСХ использовали пластинки марок: «Silufol UV 254», «Sorbfil ПТСХ – АФ – В – УФ», «Merck DC – Alufolien RP – 18 F 254».
Для проведения измерений методом ВЭЖХ использовали жидкостный хроматограф А-02», детектор двухлучевой УФ «Милихром – спектрофотометр (г. Новосибирск, ЗАО Институт хроматографии «ЭКОНО ВА»), программа обработки данных «МУЛЬТИХРОМ», методика программы «База Данных-2003», аттестованная Государственным комитетом РФ по стандартизации и метрологии в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563 96 и ГОСТ Р ИСО 5725-2002.
Для проведения измерений методом ГХ-МС использовали газовый хроматограф Agilent 7890A c масс-селективным детектором Agilent 5975C (Agilent Technologies (USA)), программно-аппаратный комплекс включает в себя базу данных NIST® 2005.
3. Разработка методик обнаружения тианептина на основе метода ТСХ и МКС-реакций ТСХ. Подобраны оптимальные условия предварительного обнаруже ния тианептина: пластинки «Sorbfil ПТСХ – АФ – В – УФ»;
хроматографиче ская система – этанол 96 %: метиленхлорид: аммиака раствор концентриро ванный 25 % (57,5: 40: 2,5);
детекция – облучение УФ-светом при длине вол ны 254 (50 мкг), реактив Драгендорфа (50 мкг) (йод кристаллический, мкг);
величина Rf тианептина 0,53 ± 0,05.
Разработанная методика позволяет разделить и идентифицировать тиа нептин в ряду антидепрессантов (амитриптилин, имипрамин, тианептин, флуоксетин) (рис. 1).
Рисунок 1 – Хроматограмма в системе этанол 96 %: метиленхлорид: аммиака раствор концентрированный 25 % (57,5:
40: 2,5) на пластинке «Sorbfil ПТСХ – АФ – В – УФ» после обработки реакти вом Драгендорфа:
1 – амитриптилин Rf = 0,86, 2 – имипрамин Rf = 0,83, 3 – тианептин Rf = 0,53, 4 – флуоксетин Rf = 0,64, 5 – смесь антидепрессантов МКС. Рекомендованы для включения в схему химико токсикологического анализа тианептина МКС-реакции с реагентами – кад мия хлорида раствором 10 % (предел обнаружения 70 мкг), кобальта родани да раствором (70 мкг), хлорцинкйода раствором (10 мкг). Кристаллы, образо ванные тианептином с данными реагентами, приведены в таблице 1.
Установлено, что в ряду антидепрессантов (тианептин, амитриптилин, имипрамин, флуоксетин) кроме тианептина либо ни одно из веществ с реко мендованными реагентами кристаллы не образовало, либо форма кристаллов была отличной от формы кристаллов тианептина.
Таблица 1 – Эффекты микрокристаллоскопических реакций тианептина Реактив Эффект (предел обнаружения, мкг) Кобальта роданида голубые вытянутые тонкие прямоугольники (70 мкг) раствор Хлорцинкйода раствор мелкие темно-коричневые игольчатые (10 мкг) Кадмия хлорида тонкие игольчатые, собранные в сфероиды(70 мкг) раствор 10% 4. Выбор условий изолирования из водных растворов и определе ния тианептина методами ВЭЖХ и ГХ-МС ВЭЖХ. Исследование проводили обращенно-фазным вариантом ВЭЖХ на приборном комплексе «Милихром А-02» по унифицированной ВЭЖХ-методике анализа (База данных-2003) (табл. 2).
Таблица 2 – Данные анализа тианептина методом ВЭЖХ (n=5) Время удер- Спектральные отношения, R = S1/S210 нм Анализируемое живания, вещество мин 220 230 240 250 260 Тианептин 20,20 0,494 0,395 0,180 0,056 0,044 0, В качестве дополнительного параметра идентификации использовали УФ-спектр тианептина, полученный непосредственно в режиме хроматогра фирования (рис. 2).
Рисунок 2 – Хроматограмма элюирования тианептина методом ВЭЖХ и его УФ-спектр поглощения Для количественного определения тианептина нами предложен метод абсолютной калибровки. В качестве параметра, характеризующего содержа ние исследуемого вещества в пробе, использовали площадь хроматографиче ского пика. Линейная зависимость между концентрацией растворов и площа дью хроматографических пиков наблюдается во всем интервале выбранных концентраций (рис. 3). Предел обнаружения тианептина методом ВЭЖХ со ставил 4,5 нг. Значение градуировочного коэффициента (k) в соответствии с градуировочной характеристикой S = k * С было рассчитано методом наи меньших квадратов и составило k = 0,3477.
y = 0,3477x Площадь хроматографического пика (S), R = 0, Рисунок 3 – Калибровочный гра Au*мкл фик определения тианептина ме тодом ВЭЖХ (n = 5) Ряд Линейный (Ряд1) 0 20 40 60 80 100 Концентрация тианептина, мкг/мл В предложенных хроматографических условиях при проведении скри нинга антидепрессантов (амитриптилин, имипрамин, тианептин, флуоксетин) наблюдается эффективное разделение всех исследуемых веществ (рис. 4).
Рисунок 4 – Хроматограмма смеси антидепрессантов (ВЭЖХ):
1 – тианептин 20,080 мин, 2 – имипрамин 22,230 мин, 3 – амитриптилин 23,071 мин, 4 – флуоксетин 23,380 мин ГХ-МС. Исследование проводили на газовом хроматографе Agilent 7890A (Agilent Technologies (USA)). В ходе испытаний нами был сделан вы вод о том, что при стартовых температурах анализа методом ГХ-МС (150 оС, 200 оС) тианептин не переходит в парообразное состояние, поэтому для по лучения интенсивного ионного тока исследование проводили при повышен ных температурах. Таким образом, условиями анализа тианептина выбраны:
Температура испарителя 250 оС;
Температура хроматографической колонки: до 70 оС за 5 минут;
далее прогрев со скоростью 10 оС в минуту до 300 оС, выдержка 10 минут;
Температура интерфейса 310 оС.
В данных условиях абсолютное время удерживания для тианептина со ставило 25,12 мин (таб. 3).
Таблица 3 – Параметры идентификации тианептина в методе ГХ-МС Параметры идентификации Соединение Время удерживания, Характеристические ионы мин (в порядке уменьшения интенсивности) Тианептин 25,12 228(100), 293(56), 194(52), 214 (35), 276(28) Отсутствие молекулярного иона в спектре можно связать с разрушени ем в процессе анализа молекулы тианептина путем отщепления алифатиче ской цепочки. Ион с наибольшим m/z составляет 293. Наибольшую интен сивность пика имеет фрагментарный ион с m/z 228.
При скрининговых исследованиях группы антидепрессантов (амитрип тилин, имипрамин, тианептин, флуоксетин) в предложенных хроматографи ческих условиях ГХ-МС анализа наблюдается эффективное разделение ис следуемых веществ с возможностью получения масс-спектров для всего ряда антидепрессантов (рис. 5).
Рисунок 5 – Хроматограмма смеси антидепрессантов и масс-спектр тианептина Изолирование. Изучение условий изолирования тианептина из водных растворов проводили с использованием ряда растворителей в широком ин тервале рН от 2 до 12 (рис. 6).
Максимальное извлечение хлороформом наблюдается при рН 3 и 7 (со ответственно 75,56 и 67,40 %), эфиром диэтиловым – в интервале рН от 4 до 7 (65,84 % – 69,51 %), метиленхлоридом при значениях рН 4, 5 и 7 (65,34 %, 65,90 %, 66,10 % соответственно). Полученные данные использовали для разработки методики изолирования тианептина из биологических объектов.
Рисунок 6 – Зависимость степени экстракции тианептина из водных растворов от рН раствора и природы органического растворителя 5. Изучение условий изолирования и определения тианептина в биологических объектах В опытах с модельными смесями биожидкостей и тканей органов уста новлено, что максимальное извлечение тианептина достигается в следующих условиях:
– из мочи: с использованием хлороформа при рН 3 (52,74 %), эфира ди этилового – при рН 5 (69,87 %), метиленхлорида – при рН 7 (52,60 %);
– из плазмы: с использованием хлороформа при рН 5 и 6 (29,52 % и 31,61 % соответственно), метиленхлорида – при рН 6 (33,81 %), эфира диэти лового – при рН 7 (19,60 %);
– из биологических органов: в условиях ненаправленного (метод Ва сильевой А.А.) и направленного исследования (метод Валова П. и метод Крамаренко В.Ф.).
Таким образом, установлено, что тианептин извлекается в широком ин тервале значений рН. В условиях направленного анализа пробоподготовку целесообразнее вести из кислых растворов, в случае ненаправленного иссле дования изолирование можно проводить при рН 8-9, так как при щелочных значениях рН изолируется большинство наркотических средств и психотроп ных веществ. Пробоподготовку из биологических органов с целью иденти фикации и установления концентрации тианептина целесообразно вести по методике Васильевой А.А. с экстракцией тианептина как из кислого, так и щелочного раствора.
Балластные вещества биообъектов, извлекающиеся совместно с тиа нептином, не мешают его хроматографическому определению, так как имеют меньшие времена удерживания. Причем, при использовании хлороформа экстрагируется гораздо меньшее количество балластных веществ.
В работе с биологическими объектами от лабораторных животных ис пользовали нелинейных беспородных лабораторных животных – белых крыс массой 180,0 – 220,0 г, одно животное использовалось в качестве контроль ного (холостой опыт). Изолирование из биологических объектов вели по классическому методу Васильевой А.А. – водой, подкисленной щавелевой кислотой;
из суточной мочи тианептин последовательно извлекали прямой экстракцией при рН 3-4 и 8-9. Полученные извлечения анализировали мето дами ВЭЖХ, ГХ-МС, ТСХ, МКС-реакциями. Параллельно основному иссле дованию в тех же условиях вели изолирование из контрольных образцов.
Исследование методом ТСХ Экстракты из биологических объектов и холостых проб, рабочий стан дартный образец тианептина наносили на пластинку «Sorbfil ПТСХ – АФ – В – УФ». Хроматографирование вели в системе растворителей этанол 96 %: ме тиленхлорид: аммиака раствор концентрированный 25 % (57,5: 40: 2,5). По сле высушивания пластины просматривали в УФ свете.
При использовании данной хроматографической системы удалось от делить тианептин от метаболита. При этом значения Rf как для стандартного образца, так и тианептина в извлечениях составили 0,53 ± 0,05. Для метабо лита значение Rf составило 0,30 ± 0,05 (рис. 7).
Для детектирования тианептина и его метаболита рекомендуется облу чение пластины УФ-светом с дальнейшей обработкой реактивом Драгендор фа или парами йода. Реактивы не являются специфичными по отношению к тианептину и его метаболиту, однако, дают с ними четкий аналитический эффект. Далее из зон локализации пятен (тианептин, метаболит) вещества элюировали и исследовали методами ВЭЖХ и ГХ-МС.
Рисунок 7 – ТСХ-пластина при облучении УФ-светом:
1 – экстракт холостой пробы (почка), 2 – экстракт из почек, 3 – экстракт из мочи, 4 – экстракт холостой пробы (моча), 5 – рабочий стандартный раствор тианептина 100 мкг Проведение МКС-реакций МКС-реакции с экстрактами из биообъектов проводили с кадмия хло рида раствором 10 %, так как в экспериментах с модельными смесями после извлечения тианептин образовывал кристаллы именно с этим реагентом. Од новременно проводили реакцию с извлечениями из холостых проб и кон трольную реакцию только с реактивами. Наблюдали под микроскопом обра зование характерных кристаллов (рис. 8).
Рисунок 8 – Кристаллы тианептина с кадмия хлорида раствором 10 % после извлечения из ткани почки Исследование методом ВЭЖХ Хроматографировали экстракты из биологических объектов (мочи, пе чени, почек) по выбранным нами условиям. В качестве параметров иденти фикации использовали абсолютное время удерживания и УФ-спектр.
На рисунке 9 представлены хроматограммы извлечений из биологиче ских объектов (суточная моча, печень). Абсолютные времена удерживания для тианептина и его метаболита составили: моча – тианептин 20,03 мин, ме таболит 26,02 мин;
почка – тианептин 20,11 мин, метаболит 25,82 мин;
пе чень – тианептин 20,12 мин, метаболит 25,78 мин.
В экспериментах с холостыми пробами установлено, что балластные вещества биообъектов не мешают хроматографическому определению тиа нептина и его метаболита.
А Б Рисунок 9 – Хроматограммы определения тианептина и метаболита МС5 методом ВЭЖХ: А – в моче, Б – в печени (детекция многоволновая) Исследование методом ГХ-МС Анализировали экстракты из биологических объектов (суточной мочи, печени, почек) методом ГХ-МС по выбранным нами условиям. Идентифика цию осуществляли на определении времени удерживания и масс-спектрам.
На хроматограммах обнаруживали пик тианептина со временем удерживания 25,13 мин. Основные характеристические ионы идентичны параметрам, ус тановленным при хроматографировании рабочего стандартного раствора тианептина.
Кроме того, на хроматограммах присутствует пик соединения с време нем удерживания 30,56 мин, которое мы идентифицировали как основной метаболит тианептина – МС5. Однако, вероятно, в условиях анализа метабо лит МС5 подвергается химическому превращению – дегидратированию с циклизацией, что может объяснять отсутствие молекулярного иона в спек трах метаболита. Для метаболита ион с наибольшим m/z составляет 390.
Наибольшую интенсивность пика также имеет фрагментарный ион с m/z 228.
Хроматограмма и масс-спектры тианептина и метаболита в извлечени ях из ткани почки представлены на рисунке 10. Метаболит извлекается в тех же условиях, что и тианептин.
Абсолютные времена удерживания для тианептина и метаболита соста вили: моча – тианептин 25,13 мин, метаболит 30,56 мин;
почки – тианептин 25,14 мин, метаболит 30,52 мин;
печень – тианептин 25,12 мин, метаболит 30,53 мин.
А Б В Рисунок 10 – А – Хроматограмма экстракта из почек, Б – масс-спектр тианептина, В – масс-спектр метаболита МС Параметры идентификации (время удерживания, основные характери стические ионы и их интенсивности) тианептина и его метаболита в моче, почке, печени приведены в таблице 4.
Таблица 4 – Результаты определения параметров идентификации тиа нептина и его метаболита в биообъектах методом ГХ-МС (n=5) Характеристические ионы Время удер Соединение живания, мин (в порядке уменьшения интенсивности) Печень Тианептин 25,12 228 (100), 293 (53), 194 (46), 214 (35), 276 (23) Метаболит МС5 30,53 228 (100), 255 (48), 165 (52), 207 (61), 193 (27), 390 (16) Почки Тианептин 25,14 228 (100), 293 (47), 194 (68), 214 (34), 276 (26) Метаболит МС5 30,52 228 (100), 255 (49), 165 (37), 207 (58), 191 (23), 390 (18) Моча Тианептин 25,13 228(100), 293(55), 194(50), 214(37), 276(24) Метаболит МС5 30,56 228(100), 255(39), 165(38), 213(24), 193(22), 390(11) Таким образом, предложенные условия ГХ-МС анализа позволяют полностью разделить и идентифицировать как тианептин, так и его метабо лит МС5 в биологических объектах.
Нами проведена валидация разработанных методик определения тиа нептина в биологических объектах методами ВЭЖХ и ГХ-МС, рассчитаны метрологические характеристики определения тианептина для трех концен траций и в 3-х повторностях в различных биологических объектах (моча, пе чень). Проведенная валидационная оценка показала, что методики отличают ся специфичностью, чувствительностью, правильностью, повторяемостью, а метод ВЭЖХ линейной зависимостью, внутрилабораторной прецизионно стью полученных результатов.
Схема анализа тианептина Биологические объекты Биологическая жид Внутренние органы кость (моча) Стадия изолирования Жидкость-жидкостная Изолирование по методике экстракция Васильевой А.А.
рН 3-4, хлороформ (вода, подкисленная щавелевой кислотой раствором 10 %) рН 3-4 и 8-9, хлороформ Стадия предварительного обнаружения Тонкослойная хроматография Пластинки: «Sorbfil ПТСХ – АФ – В – УФ»
Система: этанол 96 %: метиленхлорид: аммиака раствор концен трированный 25 % (57,5: 40: 2,5) Детекция: УФ-свет, реактив Драгендорфа Стадия обнаружения Микрокристаллоскопический Хромато-масс-спектрометрия Газовый хроматограф Agilent 7890A анализ с масс-детектором Реактив: кадмия хлорида раствор 10 % Стадия количественного определения Высокоэффективная жидкостная хроматография «Милихром А-02»
База данных- ВЫВОДЫ 1. Разработаны методики обнаружения тианептина на основе ТСХ и МКС реакций. Оптимальная хроматографическая система для анализа тианептина методом ТСХ: этанол 96 %: метиленхлорид: аммиака раствор концентриро ванный 25 % (57,5: 40: 2,5). Детектор: УФ-свет, реактив Драгендорфа (предел обнаружения 50 мкг). Значение Rf тианептина составило 0,53 ± 0,05. Реко мендована для включения в схему химико-токсикологического анализа МКС реакция с кадмия хлорида раствором 10 % (предел обнаружения 70 мкг).
2. Разработаны методики исследования тианептина методами ВЭЖХ и ГХ МС. Установлены параметры идентификации тианептина методом ВЭЖХ – время удерживания 20,20 мин, спектральные соотношения, спектр поглоще ния в УФ-области (предел обнаружения – 4,5 нг). Относительная погреш ность обнаружения – 0,47 %. Установлены параметры идентификации тиа нептина при анализе методом ГХ-МС – время удерживания 25,13 мин, ос новные характеристические ионы масс-спектра 228, 293, 194, 214, 276 (пре дел обнаружения – 0,05 нг). Относительная погрешность обнаружения – 0, %.
3. Изучена степень извлечения тианептина из водных растворов в зависи мости от рН буферного раствора и природы органического растворителя. Оп тимальный экстрагент хлороформ, рН 3 (75,6 %).
4. Изучены условия изолирования тианептина из биожидкостей на примере модельных смесей, оптимальный экстрагент – хлороформ: степень извлече ния из мочи при рН 3 – 52,74 %, из плазмы крови при рН 5-6 – около 30,00 %.
Изолирование тианептина из биоорганов целесообразно вести по схеме нена правленного анализа (методика Васильевой А.А.), выход 29,34 %.
5. С положительным результатом апробированы методики изолирования тианептина и его определения с использованием методов ТСХ, МКС, ВЭЖХ, ГХ-МС в опытах с биологическими объектами от лабораторных животных, разработана схема анализа. Установлено, что в данных условиях возможно достоверное определение тианептина и его метаболита МС5. Относительная погрешность обнаружения в биообъектах методом ВЭЖХ не превышает для тианептина 0,47 %, для метаболита 0,65 %, методом ГХ-МС соответственно не превышает 0,17 % и 0,11 %.
Основные положения диссертации опубликованы в работах:
1. Люст, Е.Н. Определение тианептина в моче / Е.Н. Люст // Вестн. Рос.
ун-та дружбы народов : серия медицина. – 2009. – № 4. –– С. 137-140.
2. Люст, Е.Н. Токсикологическое значение тианептина и актуальность экспертного исследования с целью его обнаружения в биологическом материале / Е.Н. Люст, Т.Л. Малкова // Медицинская экспертиза и пра во. – 2011. – № 5. – С. 10-12.
3. Люст, Е.Н. К вопросу химико-токсикологического анализа тианептина, используемого в немедицинских целях / Е.Н. Люст, Т.Л. Малкова, Л. Фнан // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтич. продукции : сб.
науч. тр. – Пятигорск, 2007. – Вып. 62. – С. 327-328.
4. Разработка методики определения ряда антидепрессантов методом ВЭЖХ для целей химико-токсикологического анализа / Е.Н. Люст [и др]. // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. – 2007. – № 2 – С. 157-160.
5. Люст, Е.Н. Химико-токсикологическое исследование «Коаксила» / Е.Н.
Люст, Т.Л. Малкова, Ю.Н. Карпенко // Здоровье и образование : материалы междунар. науч.-практич. конф. (8 – 15 окт. 2007 г., Сицилия (Палермо)). – Пермь: ГОУ ВПО ПГМА им. акад. Е.А. Вагнера Росздрава, 2007. – С. 139 143.
6. Люст, Е.Н. Изолирование тианептина из мочи и его определение мето дом высокоэффективной жидкостной хроматографии / Е.Н. Люст, Т.Л. Мал кова, Ю.Н. Карпенко // Сб. материалов всерос. науч.-практич. конф., посвящ.
памяти проф. Ю.М. Кубицкого (31 окт. – 01 нояб. 2007 г., Москва) «Совре менные проблемы медико-криминалистических, судебно-химических и хи мико-токсикологических экспертных исследований»;
под ред. В.А. Клевно – М. : РИО ФГУ РЦСМЭ Росздрава, 2007. – С. 244-246.
7. Люст, Е.Н. Тонкослойная хроматография в анализе тианептина / Е.Н.
Люст, К.С. Кабышко // Вестник Пермской государственной фармацевтиче ской академии. – 2008. – № 4 – С. 191-193.
8. Люст, Е.Н. Разработка методик качественного химического анализа для целей химико-токсикологического исследования / Е.Н. Люст, Е.В. Беляева // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. – 2009. – № 5 – С. 132-133.
9. Люст, Е.Н. К изолированию тианептина из биологического материала / Е.Н. Люст, Е.В. Пунтус // Вестник Пермской государственной фармацевтиче ской академии. – 2009. – № 5 – С. 148-150.
10. Люст, Е.Н. Тонкослойная хроматография и качественный химический анализ в химико-токсикологическом исследовании тианептина / Е.Н. Люст, Е.В. Беляева Актуальные вопросы судебно-химических, химико // токсикологических исследований и фармацевтического анализа : материалы Рос. науч.-практич. конф. с международ. уч. (28 сент. – 3 окт. 2009). – Пермь, ГОУ ВПО ПГФА Росздрава, 2009. – С. 59 – 62.
11. Люст, Е.Н. Качественный химический анализ при идентификации тиа нептина / Е.Н. Люст // Альманах судебной медицины. – СПб. : Юридический центр Пресс, 2009. – № 5 (13). – С.48-49.
12. Люст, Е.Н. Изучение степени экстракции тианептина из плазмы / Е.Н.
Люст, О.С. Новоселова, Н.А. Урасова // Сб. материалов 74-ой итог. студен.
науч.-практич. конф. с международ. уч., посвящ. 100-летию со дня рожд.
проф. А.М. Дыхно. – Красноярск, 2010. – С. 567-569.
13. Люст, Е.Н. Анализ литературных данных по вопросу злоупотребления тианептином / Е.Н. Люст, Н.А. Урасова // Вестник Пермской государствен ной фармацевтической академии. – 2010. – № 6 – С. 350-351.
14. Люст, Е.Н. Изучение степени экстракции тианептина из биологической жидкости (плазма) / Е.Н. Люст, О.С. Новоселова // Вестник Пермской госу дарственной фармацевтической академии. – 2010. – № 6 – С. 175-177.
15. Люст, Е.Н. К вопросу экспертного анализа тианептина / Е.Н. Люст, Н.А.
Урасова // Сб. тезисов 85-ой Всерос. студен. науч. конф. памяти проф. Д.М.
Зубаирова (15 – 16 апр. 2011 г., Казань).– Казань, 2011. – С. 350.
16. Люст, Е.Н. Возможность использования метода газовой хроматографии для обнаружения тианептина в моче / Е.Н. Люст, Н.А. Урасова // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. – 2011. – № 8 – С.
119-121.
17. Люст, Е.Н. Изучение условий обнаружения тианептина в биологических органах крыс / Е.Н. Люст, Г.А. Терёхин //: Материалы науч.-практич. конф. с международ. уч., посвящ. 85-летию со дня рожд. проф. В.И. Алисевича «Морфология критических и терминальных состояний». – М. : ЮрИнфоЗд рав, 2011. – С. 120-124.
18. Люст, Е.Н. К вопросу о токсикологическом значении антидепрессанта тианептина / Е.Н. Люст // Фармация и общественное здоровье : материалы ежегод. конф. – Екатеринбург, 2011. – С.III-V.
19. Люст, Е.Н. К вопросу химико-токсикологического анализа антидепрес санта тианептина / Е.Н. Люст // Материалы науч.-практич. конф. с междуна род. уч., посвящ. 75-летию Пермской государственной фармацевтической академии «Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских вузов: от разработки до коммерциализации» (7 – 9 дек. 2011 г., Пермь). – Пермь, 2011. – С.110-112.
Люст Елена Николаевна (Россия) Разработка методик изолирования и определения тианептина в биоматериале для целей судебно-химического и химико токсикологического анализа Работа посвящена разработке методик анализа трициклического анти депрессанта тианептина («Коаксил®») для целей химико-токсикологического и судебно-химического исследования. Предложены предварительные и под тверждающие способы идентификации тианептина химическими и физико химическими методами в биологических объектах (микрокристаллоскопия, тонкослойная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматогра фия, хромато-масс-спектрометрия). Определены условия изолирования тиа нептина из биообъектов.
Lyust Elena (Russia) Development of methods of isolation and determination of tianeptine in biological material for forensic-chemical and chemical-toxicological analysis The work is devoted to developing techniques for the analysis of tricyclic antidepressant tianeptine («Coaxil®») for chemical-toxicological and forensic chemical study. Preliminary and confirmatory methods of identification of tianep tine chemical and physico-chemical methods to biological objects (mikrokristal loskopiya, thin-layer chromatography, high performance liquid chromatography, gas chromatography-mass spectrometry) were proposed. The conditions for isola tion of biological objects tianeptine were determined.
Подписано в печать «20» февраля 2012 г.
Формат 60*84/16. Набор компьютерный. Бумага ВХИ.
Тираж 100 экз. Усл. печ. л 1,5 Заказ № 27/2012.
Отпечатано на ризографе в типографии ГБОУ ВПО ПГФА 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46, тел. (342) 282-57-