Разработка технологии твердых лекарственных форм на основе изомальта
На правах рукописи
Саблина Ольга Сергеевна РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ТВЕРДЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ НА ОСНОВЕ ИЗОМАЛЬТА 14.04.01 – технология получения лекарств
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук
Пермь - 2013 2 Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Уральская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Научный консультант: доктор фармацевтических наук Гаврилов Андрей Станиславович
Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор Молохова Елена Игоревна ГБОУ ВПО государственная «Пермская фармацевтическая академия» Минздрава России, профессор кафедры промышленной технологии лекарств с курсом биотехнологии доктор фармацевтических наук, профессор Бекетов Борис Никандрович ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Минздрава России, профессор кафедры фармацевтической технологии и фармакогнозии с курсом ботаники
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт им. В.В. Закусова» Российской академии медицинских наук.
Защита состоится «19» марта 2013 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01 при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России по адресу:
614990, г. Пермь, ул. Полевая, 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России по адресу:
614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46.
Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки Российской Федерации http://www.mon.gov.ru «» февраля 2013 г. и на сайте ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России http://www.pfa.ru «» февраля 2013 г.
Автореферат разослан «» февраля 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фармацевтических наук, доцент И.А. Липатникова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы Ключевыми проблемами российского рынка лекарственных средств являются высокая степень импорта и низкий уровень научно-исследовательских работ. Принятая Правительством РФ программа развития фармацевтической отрасли предусматривает к 2020 году увеличение доли отечественной продукции на рынке до 50%, а инновационных препаратов – до 60%. Реализация программы - это, прежде всего, лекарственная безопасность России, улучшение экономического климата, снижение цен, повышение доступности инновационных лекарственных средств и, как следствие, продолжительности и качества жизни людей.
Одним из видов деятельности фармацевтических производителей является совершенствование состава и технологии производства уже известных лекарственных средств с целью оптимизации их биофармацевтических свойств.
Решение данной задачи предполагает, в частности, внедрение новых вспомогательных веществ. Перспективным вспомогательным веществом в технологии производства твердых лекарственных форм является изомальт, т.к.
он обладает рядом уникальных технологических свойств, приятным сладким вкусом и таким преимуществом, как возможность его применения больными сахарным диабетом.
Цель и задачи исследования Целью настоящей работы является разработка технологии твердых лекарственных форм на основе изомальта для совершенствования состава и оптимизации их биофармацевтических свойств.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
1. Провести анализ и обобщение данных литературы о существующих видах вспомогательных веществ, выделить аспекты, определяющие возможность применения изомальта в составе твердых лекарственных форм.
2. На основе модельных исследований технологических свойств изомальта выявить закономерности, определяющие эффективность его применения в качестве наполнителя таблетированных лекарственных форм, получаемых методом прямого прессования, и разработать технологию таблеток валидола 0, г, аскорбиновой кислоты 0,05 г, калия йодида 131 мкг без сахара.
3. Разработать технологию производства твердых форм для рассасывания на основе изомальта по результатам конструирования состава и внедрения карамели калия йодида 33 мкг.
4. Разработать технологию инкапсулирования термостабильных лекарственных субстанций в расплав изомальта и на ее основе состав таблеток калия йодида 262 мкг.
Разработать технологию производства драже с использованием 5.
изомальта в качестве крупки, наполнителя и компонента сиропа на примере драже аскорбиновой кислоты 0,05 г без сахара.
6. Разработать технологию влажного прессования брикетов со стевиозидом 20 мг, содержащих изомальт в качестве наполнителя.
Личный вклад автора Автором самостоятельно проведены исследования свойств изомальта и полученных на его основе лекарственных форм (таблеток, драже) и биологически активных добавок к пище (карамель, брикеты). Автором разработаны составы и технологии производства таблеток калия йодида, аскорбиновой кислоты, валидола, драже аскорбиновой кислоты, карамели с калия йодидом, брикетов со стевиозидом.
Научная новизна работы 1. На основании комплексного изучения физико-химических свойств по показателям: фазово-дисперсный состав, сыпучесть, упруго-пластические характеристики частиц, гигроскопичность, стабильность цветовых характеристик при хранении установлено, что порошок изомальта DC обладает оптимальными технологическими характеристиками в сравнении с изученными наполнителями для прямого прессования, разработаны составы таблеток калия йодида 131 и 262 мкг (в пересчете на йод 100 и 200 мкг), аскорбиновой кислоты 0,05 г, валидола 0,06 г без сахара, получаемых методом прямого прессования, отличающихся стабильностью качественных и количественных характеристик в течение срока годности.
2. При разработке технологии инкапсулирования термостабильных лекарственных средств показано, что введение раствора калия йодида в расплав изомальта с последующим измельчением карамельной массы и прямым прессованием таблеточной смеси позволяет обеспечить однородность дозирования, увеличить стабильность действующего вещества при хранении.
3. На основании исследований свойств смеси расплава изомальта с вспомогательными веществами выявлена комплексная зависимость влияния редуцирующих веществ, влажности, присутствия в составе кислот и эфирных масел на стабильность основы при хранении;
разработан состав и технология лечебно-профилактической карамели с калия йодидом 33 мкг (25±11 мкг в пересчете на йод) без сахара. Показано, что сочетание в одной лекарственной форме источника йода и изомальта приводит к увеличению биодоступности действующего вещества в сравнении с контролем (Патент РФ № 2448724), позволяет получать лекарственную форму для рассасывания, отличающуюся стабильностью действующего вещества при хранении, однородностью дозирования и отличными органолептическими свойствами 4. При разработке технологии производства драже с использованием изомальта в качестве крупки, наполнителя и в составе сиропа, было установлено, что при неизменных параметрах технологического процесса изомальт является полноценным заменителем сахарозы в составе драже аскорбиновой кислоты 0, г, отличающегося улучшенными органолептическими свойствами, стабильностью при хранении и возможностью применения больными сахарным диабетом.
5. Изучены свойства смеси изомальта с полисахаридами при увлажнении и влажном прессовании. Установлено, что оптимальными параметрами, определяющими устойчивость влажного прессования, являются соотношение мальтодекстрин - изомальт ST-M - стевиозид (1:8,9:0,1) и увлажнение до 2%.
Разработана технология получения брикетов стевиозида 20 мг при условии устойчивого прессования и соответствия качества продукции требованиям НД.
Практическая значимость работы и внедрение результатов исследования На основании проведенных исследований разработаны:
- состав и технология прямого прессования таблеток калия йодида мкг (проект фармакопейной статьи предприятия и пояснительная записка, акт апробации технологии на ОАО «Уралбиофарм» от 12.12.2012 г.);
- состав и технология прямого прессования биологически активной добавки таблеток калия йодида 131 мкг «Йоданорм» (ТУ 9197-007-69055552-12, ТИ 9197-007-69055552-12, акт апробации ОАО «Уралбиофарм» от 12.12.2012 г.);
- состав и технология получения драже аскорбиновой кислоты 0,05 г без сахара (проект фармакопейной статьи и пояснительная записка, акт апробации технологии на ОАО «Уралбиофарм» от 12.12.2012 г.).
На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:
- состав и технология производства лечебно-профилактической карамели с калия йодидом 33 мкг (технологическая инструкция на промышленное производство ТИ 9121-003-61464073-2010, технические условия ТУ 9121-003 61464073-2010 биологически активная добавка к пище «Йодинка» карамель с йодом 25 мкг без сахара, свидетельство о государственной регистрации RU.77.99.11.003.Е.001623.02.11 от 03.02.2011, акт апробации технологии на ООО «Слада» от 22.02.2012 г.);
- состав и технология получения брикетированного заменителя сахара на основе изомальта и стевиозида (технологическая инструкция на промышленное производство ТИ 9197-003-69055552-11, технические условия ТУ 9197-003 69055552-11 «Заменитель сахара «Сладис-БИО со стевиозидом», свидетельство о государственной регистрации № RU.77.99.88.009.Е.041238.10.11 от 03.10.2011, акт апробации технологии на ООО «Арком» от 20.12.2011 г.).
Апробация работы Основные результаты диссертационной работы были доложены на:
конференции с международным участием «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2009, 2010, 2011, 2012), 64 всероссийской научно-практической конференции молодых учёных и студентов «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения» (Екатеринбург, 2009), II международной студенческой научной конференции «Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (Москва, 2010), научно практической конференции с международным участием «Научно-технический прогресс и оптимизация технологических процессов разработки лекарственных препаратов» (Тернополь, Украина, 2011) и XVIII российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2011).
Связь задач исследования с проблемным планом научных работ Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ГБОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия» (протокол № 2 от 18.09. 2009 г.), НИР ОАО «Уралбиофарм», поддержана грантами правительства Свердловской области в рамках молодежного инновационного форума МИФ 2010, грантами программ УМНИК-2009 и СТАРТ-2009.
Публикации По материалам диссертации получен 1 патент, опубликовано печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы исследования, 2 главы исследований), выводов, списка литературы, включающего 111 наименований (из них 83 источника зарубежной литературы), приложений.
Работа изложена на 148 страницах, включает 35 таблиц, 16 рисунков и 13 приложений.
Основные положения, выносимые на защиту:
Результаты оптимизации технологий прямого прессования, дражирования, брикетирования, инкапсулирования с использованием изомальта в качестве вспомогательного вещества (наполнителя) и разработки составов таблеток калия йодида, валидола, аскорбиновой кислоты, йодсодержащей лечебно профилактической карамели, драже аскорбиновой кислоты и брикетированного подслащивающего средства.
Материалы и методы исследований Настоящая работа проводилась с 2009 по 2012 гг. на кафедре фармации Уральской государственной медицинской академии. Опытно-промышленные и промышленные эксперименты проводились на базе ОАО «Уралбиофарм» (г.
Екатеринбург), ЗАО «Берёзовский фармацевтический завод» (г. Березовский), ООО «Арком» (г. Екатеринбург), ООО «Слада» (г. Ишим).
В экспериментальных исследованиях использовали субстанции, сырье и реактивы, получаемые с химических и химико-фармацевтических заводов. Все сырье отвечает требованиям НД (ФС, ФСП, ГОСТ, ТУ или иным нормативным документам).
При выполнении работы использовали оборудование: лабораторный гидравлический пресс с усилием прессования до 250 кгс/см2, стрелочный микрометр «МКИ» с точностью измерения 0,01 мм, прочность таблеток на истирание определяли на приборе 545Р-АК-8, сыпучесть таблеточных масс – ВП-12А, распадаемость таблеток – 545-АК-1, растворение – 545-АК-7, прочность на излом – ТВН-200/ТD, таблеточные прессы (РТМ-12, РТМ-41, Pressima-19), лабораторный дражировочный котел, линия пo прoизвoдствy сaхaрa прессoвaннoгo в кyбикaх «TYO40сp».
Структурно-механические и технологические характеристики таблеточной массы и таблеток определяли с помощью общепринятых в фармацевтической практике методик, установленных ГФ ХI. При разработке методов количественного определения, однородности дозирования и теста «растворение» использовали метод ВЭЖХ.
Для анализа изменения цветовых характеристик таблеток использовали сканер НPscanjet 4470c. Цвет таблеток определяли путем анализа полученного графического файла в координатах RGB с помощью процедуры “пипетка” в программе “Photo-paint 7».
Доклинические исследования проводили на трех группах по 20 крыс обоего пола массой 300-350 г. Лабораторные животные содержались в стандартных условиях вивария и получали одинаковый рацион. Эффективность поступления йода у крыс контролировали по показателю йодурии и уровню тиреоидных гормонов в крови (трийодтиронина и тироксина). Токсическое действие на организм лабораторных животных отмечали по изменению уровня ферментов печени (аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза), амилазы и щелочной фосфатазы.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Изучение технологических свойств изомальта и разработка 1.
технологии получения таблеток на его основе Методом Хеккеля изучали упруго-пластические свойства изомальта DС в сравнении с известными наполнителями (лактоза DC, смесь лактозы DC с МКЦ (70:30), сорбит). Значение коэффициента Хеккеля вычисляли по формуле:
Ln(1/(1-D))=m*P+b (1), где: m – коэффициент угла наклона кривой Хеккеля, характеризующий способность к прессованию;
b – отрезок на оси Y пересечения с кривой, характеризующий свойства порошков;
Р – давление прессования;
D – отношение плотности таблетки к истинной плотности порошка. Результаты математической обработки уравнений кривых Хеккеля использовали для расчета давления начала пластической деформации частиц, которое служило критерием оптимальности при выборе наполнителя.
Кривые Хеккеля (рисунок 1) для перечисленных наполнителей, имеют линейный характер зависимости (коэффициент апроксимации R2 = 0,98 – 0,99).
4, Лактоза DC 3, Сорбит ln(1/(1-D/Dист)) 3, Изомальт DC 2, МКЦ 2, Лактоза DC:МКЦ 1, (70:30) 1, 30 50 70 Давление прессования, кгс/см Рис. 1 – Кривые Хеккеля таблеточных масс Данные математического анализа кривых (таблица 1) свидетельствуют о том, что по возрастанию пластических и убыванию упругих свойств частиц исследованные наполнители можно расположить в ряд: лактоза DC – лактоза DC:МКЦ (70:30) – сорбит – изомальт DC – МКЦ. При этом частицы изомальта DC склонны к пластической деформации в два раза больше, чем лактозы DC – расчетное давление начала пластической деформации 48,5±5,2 и 95,2±10, кгс/см2 соответственно (таблица 1).
Таблица 1 – Константы уравнения Хеккеля таблеточных масс m, см2/кгс R2, кгс/см Состав смеси, % b 100 лактоза DC 0,0105±0,0011 1,49±0,04 0,9914 95,2±10, 70 лактоза DC:30 МКЦ 0,0148±0,0011 1,36±0,06 0,9908 67,6±5, 100 изомальт DC 0,0206±0,0022 1,19±0,04 0,9976 48,5±5, 100 сорбит 0,0149±0,0020 1,43±0,08 0,9816 67,1±9, 100 мкц 0,0404±0,0015 0,15±0,03 0,9983 24,8±1, m- коэффициент угла наклона кривой Хеккеля, характеризующий способность к прессованию b - отрезок на оси Y пересечение с кривой, характеризующий свойства порошков R2-коэффициент корреляции – расчетное давление начала пластической деформации Таблетки, полученные на основе изомальта DC, обладают прекрасным внешним видом, ярким белым цветом и приятным сладким вкусом, в отличие от МКЦ (цвет - белый с оттенком, не глянцевые, привкус целлюлозы). Поэтому применение изомальта DC является весьма перспективным в составе таблетированных лекарственных форм, получаемых методом прямого прессования.
В таблице 2 представлены результаты изучения сыпучести и насыпной плотности изомальта DC в сравнении с лактозой DC, сорбитом и МКЦ.
Таблица 2 – Технологические характеристики изучаемых наполнителей Наименование образца Насыпная плотность, г/см3 Сыпучесть, г/сек № Изомальт DC 1 0,95±0,08 9,1±0, Сорбит 2 0,90±0,08 10,0±1, Лактоза DC 3 0,89±0,07 10,0±1, МКЦ 4 0,52±0,05 4,3±1, Из таблицы 2 видно, что порошок изомальта DC имеет самую большую насыпную плотность в сравнении с другими известными наполнителями, сыпучесть, статистически равную лактозе DC, и в два раза выше МКЦ. Это подтверждается практически равным гранулометрическим составом и сходной формой частиц (рисунки 2 и 3). Однако свойства частиц существенно отличаются от лактозы DC. Это показано в экспериментах по изучению влияния скользящих веществ и дезинтегрантов на свойства получаемых таблеток.
Установлено, что введение 0,5 – 0,7 % аэросила практически не изменяет сыпучесть изомальта DC в отличие от лактозы DC, где сыпучесть увеличивается на 30-40%. По нашему мнению, это связано с отсутствием электростатического заряда на поверхности и сходной формой частиц (рисунки 2 и 3).
Рис. 2 – Изомальт DC Рис. 3 – Лактоза DC Так же установлены существенные различия между изомальтом DC и лактозой DC в опытах по изучению влияния давления прессования и введения дезинтегрантов на распадаемость. Выявлено, что увеличение давления прессования от 50 до 125 кгс/см2 не приводит к статистически достоверному изменению распадаемости. По нашему мнению, это объясняется высокими пластическими свойствами частиц изомальта DC. В результате таблетка приобретает свойства монолита, пористость практически не изменяется, следовательно, вода не проникает внутрь массива и растворение происходит только с поверхности.
Введение супердезинтегрантов (полипласдон XL, кроскармеллоза натрия, натрия гликолят крахмала) в области изученных концентраций (от 1 до 5 %) не оказывает существенного влияния на распадаемость таблеток изомальта, в отличие от таблеток лактозы DC, где зарегистрировано многократное ускорение процесса. По нашему мнению, это так же объясняется различием упруго пластических свойств изомальта DC и лактозы DC. Упругие свойства кристаллов лактозы DC способствуют пористости массива таблетки, в результате вода легче проникает внутрь, поступает к частицам супердезинтегранта, которые разбухают и разрывают массив таблетки изнутри.
Пластические свойства изомальта DC способствуют образованию монолитной (малопористой) структуры таблетки, что затрудняет проникновение среды растворения внутрь и действие супердезинтегранта. Это обстоятельство является существенным ограничением применения изомальта DC в качестве наполнителя быстрорастворимых таблеток, хотя в экспериментах зарегистрирована скорость распадаемости до 15 минут плацебо изомальта DC массой до 1,0 г.
Изучено влияние скорости прессования на прочность таблеток изомальта DC в сравнении с известными наполнителями. Результаты представлены на рисунке 4.
Изомальт Прочность на раздавливание, Н DC Сорбит Лактоза 60 DC Лактоза DC:МКЦ (70:30) 0 20 40 60 Скорость прессования, количество оборотов ротора в мин Рис. 4 – Влияние скорости прессования на прочность таблеток Из рисунка 4 видно, что для всех наполнителей имеется одинаковая зависимость снижения прочности при увеличении скорости прессования. Это объясняется сокращением экспозиции порошков под давлением. Однако все изученные порошки по-разному реагируют на увеличение скорости прессования.
Таблетки изомальта DC обладают максимальной прочностью в сравнении с сорбитом, лактозой DC и смесью лактозы DC с МКЦ (70:30). При увеличении скорости вращения ротора таблеточного пресса с 10 до 25 оборотов в минуту прочность таблеток на основе лактозы снижается в два раза. Снижение прочности таблеток изомальта DC при тех же условиях составляет всего 10 %.
Следует подчеркнуть высокую прочность и отличные органолептические свойства таблеток изомальта DC, полученных при недостижимых для других наполнителей скоростях вращения ротора 50 и даже 70 оборотов в минуту. По нашему мнению, это объясняется отличными пластическими свойствами, высокой насыпной плотностью и сыпучестью частиц изомальта DC.
Определение динамики изменения цветовых характеристик таблеток, полученных на основе изомальта DC, при хранении в условиях термостатирования при 60 С в сравнении с другими наполнителями показало, что таблетки изомальта DC отличаются большей стабильностью при хранении (рисунок 5), в отличие от лактозы DC и сорбита.
Лактоза-DC Изомальт-DC Сорбит 0 50 Ухудшения цвета, % 90 дней 30 дней 15 дней Исходный уровень Рис. 5 – Динамика «В» координаты цвета таблеток при хранении Таким образом, комплексными исследованиями доказано, что изомальт DC может использоваться в качестве наполнителя для таблеток, получаемых прямым прессованием, т. к. обладает требуемыми для вспомогательных веществ данного класса высокой сыпучестью, насыпной плотностью, пластическими свойствами частиц и кроме того стабильностью при хранении, приятным сладким вкусом. Нами был предложен состав комплексного наполнителя:
изомальт DC – 99 %, магния стеарат – 1 %. На основе предложенного наполнителя был разработан состав таблеток калия йодида 131 мкг: изомальт DC – 0,21633, калия йодид – 0,00013, магния карбоната основной – 0,01124, магния стеарат – 0,00230. Масса таблетки 0,23 г, диаметр 9 мм. Таблетки соответствуют показателям качества проекта ТУ 9197-007-69055552-12 «Йоданорм».
Разработка технологии таблеток аскорбиновой кислоты 0,05 г с глюкозой В ходе оптимизации технологии прямого прессования таблеток глюкозы 0,05 г. было предложено изучить влияние соотношения изомальт DC - глюкоза на упруго-пластические свойства смесей, гигроскопичность таблеток, провести опытно-промышленные испытания.
Было выявлено, что увеличение глюкозы в смеси приводит к увеличению гигроскопичности таблеток. Данный факт объясняется ее более высокой гигроскопичностью по сравнению с изомальтом DC.
Исследовали упруго-пластические свойства смесей с соотношением глюкоза - изомальт DC – 100:0, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50 при давлении от 30 до 120 кгс/см2. Установлено, что коэффициент Хеккеля в опытах составил, 0,0110±0,0021, 0,0140±0,0021, 0,0156±0,00220, 0,169±0,0022 0,0186±0,0012, 0,0206±0,0022 см2/кгс соответственно. Показано, что упруго-пластические свойства смеси пропорциональны соотношению ингредиентов. Увеличение глюкозы приводит к росту упругих свойств частиц, изомальта DC пластических. Таким образом, с целью повышения эффективности прямого прессования таблеток аскорбиновой кислоты 0,05 г с глюкозой было предложено введение в состав изомальта DC для улучшения прессуемости и снижения расчетного давления начала пластической деформации таблетки с 91±17 до 71±11 кгс/см2 при увеличении прочности таблетки с 75 до 90 Н.
Опытно промышленными испытаниями состава таблеток аскорбиновой кислоты 0,05 г. (масса таблетки 2,0 г): аскорбиновая кислота – 0,05 г, изомальт DC – 1,544 г, глюкоза – 0,386 г, магния стеарат – 0,02 г показано устойчивое таблетирование при скорости вращения ротора таблеточного пресса РТМ 41-М 14 об/мин. Анализ качества подтвердил соответствие полученных таблеток требованиям фармакопеи (масса таблеток 2,0 г, высота 5,4 мм, распадаемость 9±1 мин, прочность на истираемость 98,9 %, отклонение в массе отдельных таблеток 2,3 %, внешний вид – таблетки однородного белого цвета с ровными кромками).
Разработка технологии таблеток валидола 0,06 г Изучали сыпучесть смеси изомальта DC с валидолом в сравнении с контролем (гранулят смеси глюкоза – сахароза – валидол), а также влияние количества валидола, добавляемого к таблетмассе и давления прессования на показатели распадаемости и прочности получаемых таблеток массой 0,8 г, диаметром 13 мм.
В ступку загружали навеску изомальта DC 2,0 г, магния стеарата 0,2 г и 1,0;
1,28;
1,50;
1,74;
2,0 г валидола, доводили добавлением изомальта DC до массы 20,0 г, перемешивали встряхиванием, измеряли сыпучесть в десяти повторениях. В качестве контроля использовали таблеточную массу валидола, полученную в полном соответствии с ФСП ЛСР-010613/09-25109, где 116,0 г сахарной пудры смешивали с 47,0 г глюкозы, 2,0 измельченной стеариновой кислоты, 15,0 г валидола и гранулировали 30,0 г сахарного сиропа (18,0 г сахарозы и 12,0 г воды), сушили при температуре 45 °С, гранулировали через сито с отверстиями 2,0 мм, опудривали 2,0 г аэросила.
Результаты исследования сыпучести опытной и контрольной смесей представлены в таблице 3.
Таблица 3 – Сыпучесть опытных и контрольных вариантов № Содержание валидола, % Сыпучесть таблетмассы, г/сек 1 5,0 13,8±0, 2 6,4 12,0±0, 3 7,5 11,1±0, 4 8,7 10,8±1, 5 10 8,5±1, Контроль 6 11,3±0, Из таблицы 3 видно, что варианты №№ 2 – 4 имеют сыпучесть статистически равную контролю. Варианты опытов №№ 1 – 5 и контроль прессовали пуансонами диаметром 13 мм при давлении 70 кгс/см2. Масса таблетки 0,8 г. Исследовали внешний вид полученных таблеток, прочность на истирание и раздавливание. Результаты представлены в таблице 4.
Таблица 4 – Качество опытных и контрольных образцов таблеток № Средняя Прочность на Прочность Распадаемость, Описание Вкус масса, г раздавливание, на мин Н истирание, % 1 0,801 * ** 150±15 99,9±0,2 7,2±0, 2 0,805 * ** 150±15 99,9±0,2 8,2±0, 3 0,804 * ** 140±15 99,9±0,2 9,2±0, 4 0,809 * ** 150±15 99,4±0,2 9,2±0, 5 0,801 * ** 140±10 99,7±0,2 10,2±0, 6к 0,795 * ** 75±11 97,9±0,2 4,6±0, Примечание: * - таблетки плоскоцилиндрической формы, белого или белого с сероватыми вкраплениями цвета, с риской и фаской, с характерным запахом ментола;
** - сладковатый, с привкусом валидола.
Из таблицы 4 видно, что замена сахарозы и глюкозы на изомальт DC в составе таблеток, изменение технологии влажной грануляции на прямое прессование не оказывает существенного влияния на качество таблеток.
Производственными испытаниями показано, что состав: валидола 0,06 г, магния стеарата 0,008 г, изомальта DC до массы 0,8 г устойчиво прессуется таблеточным прессом РТМ-12 при скорости вращения ротора 33 об/мин.
2. Разработка технологии твердых лекарственных форм для рассасывания на основе изомальта Исследовали влияние соотношения патока-изомальт на гигроскопичность карамельной основы. Было установлено, что увеличение количества патоки приводит к росту гигроскопичности (рисунок 6).
20 Влажность, % 0 1 2 3 4 Время экспозиции, сут Рис. 6 – Влияние соотношения патока - изомальт на гигроскопичность карамели (1 – 24:42;
2 – 16:42;
3 – 12:42;
4 – 8:42;
5 – контроль) На рисунке 6 кривая 4 статистически равна контрольной (патока сахароза (8:42)) (5), поэтому было выявлено, что соотношение патока - изомальт (8:42) является оптимальным. Изучение влияния остаточной влажности карамельной массы на ее гигроскопичность показало, что карамель влажностью 2% идентична по гигроскопичности сахарной. Однако достижение данного значения требует длительного времени уваривания карамельной массы и, как следствие, изменению цвета и качества получаемой продукции. Поэтому было предложено для изомальтсодержащей карамельной основы установить предел влагосодержания не более 4,0 %.
В ходе экспериментов выявлена комплексная зависимость влияния редуцирующих веществ, влажности, присутствия в составе кислот и эфирных масел на стабильность карамельной основы. В результате был разработан оптимальный состав карамельной массы лекарственных форм для рассасывания без сахара, %: стевиозид 0,05 – 0,09, лимонная кислота 0,3 – 0,8, ароматизатор (эфирные масла) 0,15 – 0,2, рибофлавин 0,0025 – 0,0050, основа патока изомальт (8:42) до 100 %.
По наличию плато в области 143 – 150 С установлена оптимальная температура плавления смеси патока-изомальт (8:42) (рисунок 7).
Разработана технология производства лекарственных форм для рассасывания не содержащих сахарозы: упаривание смеси воды, изомальта и патоки при температуре 143 – 150 С до влажности менее 4 %, охлаждение до – 100 С, введение при перемешивании субстанций лекарственных средств, ароматизаторов, подсластителей, подкислителей, раствора красителя, формование стержня, прессование, упаковка и фасовка.
Рис. 7 – Динамика плавления смесей (1 – патока - изомальт (8:42), 2 – патока - сахароза (8:42)) В работе исследовали преимущества включения калия йодида в состав карамельной массы в сравнении с введением его в таблеточную массу из раствора на стадии грануляции. Установлено, что потери йода при изготовлении карамели составляют 4,0±0,4 %, а при влажной грануляции 5,8±0,4 %.
Исследование стабильности в течение 90 сут при 45 С качественных и количественных показателей йодсодержащей карамели без сахара в сравнении с таблетками известного йодсодержащего лекарственного средства показало, что инактивация йода при хранении в условиях эксперимента составила 11,3 % и 24,0 % соответственно.
В ходе доклинических испытаний показано, что сочетания калия йодида с изомальтом эффективнее контроля. Установлено, что уровень йодурии лабораторных животных после 45 суток приёма раствора комбинации калия йодида и изомальта (в пересчете на йод — 10 мкг/кг массы тела, изомальт — 0, г/кг массы тела в день) составил 153,3±3,5 мкг/л, а после приема раствора калия йодида (в пересчете на йод — 10 мкг/кг массы тела в день) - 148,2±2,0 мкг/л.
Исходный уровень медианы йодурии - 144,2±2,2 мкг/л.
3. Разработка технологии инкапсулирования калия йодида с применением изомальта в качестве вспомогательного вещества Была разработана технология инкапсулирования лекарственных средств на примере калия йодида: к навеске изомальта добавляли расчетное количество раствор калия йодида, нагревали до температуры 143 – 150 С. Уваривали массу до влажности не более 4 %. Полученный расплав охлаждали, измельчали и просеивали через сито с ячейками размером 1мм.
Показано, что порошок инкапсулированного в расплав изомальта калия йодида обладает склонностью к агломерации. Поэтому было предложено ввести в состав вспомогательное вещество – аэросил. Установлено, что аэросил в концентрации до 1 % увеличивает сыпучесть порошка инкапсулированного калия йодида с 7,0±0,2 до 9,5±0,4 г/сек и препятствует агломерации частиц при хранении.
Исследовали влияние количества инкапсулированного порошка на технологические свойства в смеси с разработанным нами наполнителем.
Установлено, что введение 1 – 10 % порошка инкапсулированного калия йодида не приводит к существенному изменению сыпучести таблеточных масс.
Увеличение количества порошка инкапсулированного калия йодида более 10 % повышает гигроскопичность таблеток и ухудшает внешний вид (мраморность поверхности), а снижение его количества менее 5 % приводит к неоднородности дозирования лекарственного средства выше требований фармакопеи и замедляет распадаемость таблеток массой 0,23 г на 2 – 3 минуты в сравнении с контролем.
Однако все варианты соответствуют требованиям фармакопеи по показателю распадаемость. Таким образом, оптимальным количеством порошка инкапсулированного калия йодида было выбрано 5 % от общей массы таблеточной смеси. Данное количество обеспечивает получение таблеток, отвечающих всем требованиям ГФ XI, в том числе «однородность дозирования».
Введение лубрикантов приводит к незначительному увеличению прочности и продолжительности распадаемости таблеток. В опытах отмечено увеличение устойчивости прессования при содержании 0,7 – 1,0 % лубрикантов в составе таблеточной массы. Разработан состав таблеток калия йодида 262 мкг: порошка инкапсулированного калия йодида 0,012 г (0,00026 калия йодида и изомальта до массы 0,012), магния стеарат 0,0023 г, аэросил 0,0001 г, изомальт DC до массы таблетки 0,23 г. Таблетки, полученные на основе инкапсулированного калия йодида, более стабильны в условиях ускоренного старения при 60 С, чем контрольные образцы йодсодержащего таблетированного лекарственного средства (НД 42-8682-02) (90,0 и 71,4% соответственно). По нашему мнению, частицы калия йодида, окруженные карамельным стеклом, покрываются инертной газонепроницаемой оболочкой и практически не поддаются химическим изменениям. Таким образом, применение технологии инкапсулирования калия йодида в состав карамельной массы и последующее использование порошка измельченной карамели в качестве тритурации в составе таблеточной массы на основе изомальта благоприятно сказывается на стабильности лекарственного средства при хранении.
Данное заключение служило основой для разработки проекта фармакопейной статьи предприятия «Йод-200» ОАО «Уралбиофарм». Опытно промышленные испытания проведены на ОАО «Уралбиофарм».
4. Разработка технологии применения изомальта в составе драже Было предложено использовать изомальт ST-PF (фракция 1,0 мм) в смеси с мальтодекстрином (3:7) в составе сиропа, изомальт ST-M (фракция 3 – 3,5 мм) в качестве крупки и изомальт ST-PF (фракция 1,0 мм), как порошок для посыпки. Драже получали по принятой ОАО «Уралбиофарм» технологии за исключением того, что вместо сахарозы использовали изомальт перечисленных классификаций. Установлено, что полученное в ходе промышленных испытаний драже аскорбиновой кислоты соответствует всем показателям качества проекта ФСП на «Драже аскорбиновой кислоты 0,05 г без сахара» и стабильно при хранении в течение 18 месяцев. Выход готовой продукции практически не отличается от контроля. Замена сахарозы на изомальт в составе драже позволяет сохранить все положительные свойства данной лекарственной формы. Если учесть, что драже витаминных препаратов особенно актуально для больных сахарным диабетом, пациентов с аллергией на сахарозу и детей, то перспектива использования изомальта в качестве наполнителя лекарственных форм без сахара становится очевидной.
5. Применение изомальта в технологии влажного прессования Процессы брикетирования и влажного прессования являются перспективными направлениями фармацевтической технологии, т.к. позволяют получать быстрорастворимые таблетки, не содержащие лубрикантов. Кроме того, брикеты широко выпускаются пищевой промышленностью, т.к., в отличие от порошков, обладают простотой применения и точностью дозирования.
Нами был разработан брикетированный подсластитель в виде кубиков без сахара массой 2,0 г на основе изомальта ST-M (объемный наполнитель) и стевиозида (интенсивный подсластитель).
Для определения соотношения компонентов использовали данные математической обработки результатов дегустации репрезентативной группы экспертов. Выявлено, что при уровне корреляции более 0,95 уравнение сладости стевиозида имеет вид:
Х = 204,9*Устев (2);
где Устев. – масса стевиозида, Х – масса сахарозы.
Таким образом, коэффициент сладости стевиозида составляет 204,9.
Представленное выше уравнение сладости позволило рассчитать количество интенсивного подсластителя, эквивалентного 5 г сахарозы для брикетов массой 2,0 г по формуле: Устев.= (5-2*0,5)/204,9 = 0,02 (3).
Таким образом, расчетная концентрация стевиозида в массе для брикетирования должна составлять 0,02/2,0*100 %= 1,0 % Исследование влияния влажности на сыпучесть смеси изомальта фракции ST-M с 1 % стевиозида в сравнении с сахарозой показало, что данный показатель незначительно ухудшается при увлажнении до 2 % по сравнению с сахарозой (таблица 5).
Таблица 5 – Сыпучесть увлажненных порошков, г/сек Влажность, % Изомальт ST-M + стевиозид Сахароза 0 8,7±0,8 9,0±1, 1 8,0±0,9 4,4±0, 2 3,2±0,6 1,4±0, 3 1,1±0,4 0,5±0, Однако перемешивание смеси с изомальтом в течение 2 – 3 минут сопровождалось образованием трудно измельчаемого агломерата. Это свойство негативно влияет на работу смесителя и формующего пресса. Для решения данной проблемы нами было предложено введение дополнительных вспомогательных веществ, которые бы препятствовали агломерации.
Исследовали влияние введения в дополнение к гранулированной фракции изомальта ST-M мелкой фракции ST-PF, лактозы и мальтодекстрина. Из представленных смесей хорошие результаты показало только введение в состав мальтодекстрина в количестве более 10% - смесь оставалась пластичной и рыхлой более 5 минут. Агломерация смеси с мелкой фракцией ST-PF 10 и 20 % происходила при перемешивании в течение 2,5 и 1,5 минуты соответственно.
Введение 10 % лактозы сопровождается утратой качества смеси в течение минут перемешивания. Таким образом, было рекомендовано ввести в смесь 10 % мальтодекстрина для сохранения оптимальных технологических свойств.
Результат исследования давления прессования на прочность брикетов показал, что необходимое значение данного показателя достигается при кгс/см2 (таблица 6). Дальнейшие увеличение не целесообразно, т.к. приводит к затруднению в работе прессующего механизма и ухудшает распадаемость.
Таблица 6 – Влияние давления прессования на свойства брикетов Давление, кгс/см2 Распадаемость, сек Прочность на истирание, % 20 23,1±0,5 82,2±0, 30 43,6±0,7 97,0±1, 40 62,5±0,8 98,1±1, В условиях производства исследовали влияние увлажнения на устойчивость прессования смеси: изомальта ST-M 89 %, мальтодекстрина 10 %, стевиозида 1%. Результаты экспериментов представлены в таблице 7.
Установлена оптимальная влажность смеси составляет 1 – 2 % при устойчивой работе пресса и качества прессованного сахарозаменителя, соответствующего требованиям разработанного нами НД.
Таблица 7 – Влияние влажности на свойства брикетов Внешний вид* Влажность, Адгезивные Стабильность Прочность на свойства** при сушке истирание, % % Не соответствует Стабильны 0 - 78,8±1, Соответствует Стабильны 1 - 98,1±1, Соответствует Стабильны 2 - 98,9±1, Соответствует Расплываются Отсутствует 3 ++ Соответствует Расплываются Отсутствует 5 +++ Примечание: * – кубики белого цвета прочные, с гладкой поверхностью, с ровными краями – налипание на пуансоны (-) – отсутствует, (+) – присутствует.
, ** Репрезентативной группой дегустаторов показано, что брикеты быстро растворяются в кипящей воде, а вкус раствора брикета практически не отличается от вкуса раствора 5,0 г сахарозы в воде.
Таким образом, разработан состав и технология производства послащивающего средства в виде брикетов со стевиозидом, отличающегося улучшенными потребительскими свойствами, стабильностью при хранении в течение двух лет.
ВЫВОДЫ 1. На основании комплексного изучения физико-химических свойств установлено, что порошок изомальта DC обладает оптимальными технологическими характеристиками в сравнении с известными наполнителями для прямого прессования. Разработаны составы таблеток калия йодида 131 и 262 мкг (в пересчете на йод 100 и 200 мкг), аскорбиновой кислоты 0,05 г, валидола 0,06 г без сахара, получаемых методом прямого прессования, отличающихся стабильностью качественных и количественных характеристик в течение срока годности, соответствующих требованиям ГФ и проектам НД.
2. В результате исследований свойств смеси расплава изомальта с вспомогательными веществами выявлена комплексная зависимость влияния редуцирующих веществ, влажности, присутствия в составе кислот и эфирных масел на стабильность основы при хранении. Разработаны состав и технология лечебно-профилактической карамели с калия йодидом 33 мкг (25±5 мкг в пересчете на йод) без сахара.
3. Биофармацевтическими исследованиями показано, что сочетание в одной лекарственной форме источника йода и изомальта приводит к увеличению биодоступности действующего вещества в сравнении с контролем, позволяет получать лекарственную форму для рассасывания, отличающуюся эффективностью и безопасностью для детей и людей, больных сахарным диабетом.
4. На примере калия йодида разработана технология инкапсулирования лабильных субстанций в расплав изомальта с последующим измельчением массы и прямым прессованием таблеточной смеси, что позволяет увеличить стабильность действующего вещества при хранении.
5. При разработке технологии драже аскорбиновой кислоты 0,05 г без сахара установлено, что при неизменных параметрах технологического процесса дражирования изомальт является полноценным заменителем сахарозы в качестве крупки, наполнителя и компонента сиропа, а получаемое драже отличается улучшенными органолептическими свойствами, стабильностью при хранении.
6. Изучены свойства смеси изомальта ST-M с полисахаридами при увлажнении и влажном прессовании. Установлено, что оптимальными параметрами, определяющими устойчивость влажного прессования, являются соотношение мальтодекстрин - изомальт ST-M - стевиозид (1:8,9:0,1) и увлажнение до 2 %. Разработана технология получения брикетов стевиозида при условии устойчивого прессования и соответствия качества продукции требованиям НД.
Основные положения диссертации опубликованы в работах:
1. Оценка обеспеченности йодом и новый способ профилактики йододефицита у детей / О.С. Саблина, Г.М. Филатова, Л.В. Левчук, Н.Е.
Санникова, А.С. Гаврилов // Научные ведомости Белгородского государственного университета. – 2011. – №16 (111). - С. 159 – 164.
2. Анализ йодной обеспеченности детей г. Екатеринбурга и варианты профилактики йододефицитных состояний / О.С. Саблина, Г.М.Филатова, Л.В.Левчук, Н.Е.Санникова, А.С.Гаврилов // Вестник уральской медицинской и академической науки. – 2012. – №1. - С. 26 – 28.
3. Изучение стабильности и эффективности применения йодсодержащих твердых лекарственных форм / О.С. Саблина, Л.В. Левчук, А.А. Тумашов, А.С.
Гаврилов // Химико-фармацевтический журнал. – 2012. – №5. - С. 59 – 61.
4. Пат. № 2448724 Российской Федерации МПК A61K36/61 Лечебно профилактическая карамель / О.С. Саблина [и др.] (РФ) – заявл. 11.04.2011;
опубл. 27.04.2012, Бюл. №12.
5. Сладкий сахар / О.С. Саблина, А.С. Гаврилов, А.А.Тумашов, Г.А.
Тренихин // «Фармация и общественное здоровье» : материалы конф. с междунар. участием. – Екатеринбург, 2009. – С. 155-157.
6. Швецова, А.В. Лечебно-профилактические леденцы. [Текст]/ А.В.
Швецова, О.С. Саблина, А.С. Гаврилов // «Фармация и общественное здоровье» : материалы конф. с междунар. участием. – Екатеринбург, 2009. – С. 170-171.
7. Швецова, А.В. Разработка лечебно-профилактических леденцов на основе растительных экстрактов / А.В. Швецова, О.С. Саблина // «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения» : материалы межвуз. науч.-практ. конф. молодых учёных и студентов с междунар. участием.
– Екатеринбург, 2009. – С. 480-481.
8. Саблина, О.С. Сладкий сахар / О.С. Саблина // «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения» : материалы 64 межвуз.
науч.-практ. конф. молодых учёных и студентов с междунар. участием. – Екатеринбург, 2009. – С. 465-467.
9. Саблина, О.С. Определение массовой доли йода в лечебно профилактических леденцах титриметрическими методами / О.С.Саблина, Е.Г.Суханова, А.С. Гаврилов // «Фармация и общественное здоровье» :
материалы конф. с междунар. участием. – Екатеринбург, 2010. - С. 273 – 276.
10. Саблина, О.С. Брикетированные подслащивающие средства / О.С.Саблина, А.Б.Ершов, А.С. Гаврилов // «Фармация и общественное здоровье» : материалы конф. с междунар. участием. - Екатеринбург, 2010. – С.
202-204.
11. Саблина, О.С. Определение массовой доли йода в кондитерских лекарственных формах с помощью масс-спектрометрии /О.С.Саблина, Е.Г.Суханова, А.С. Гаврилов // «Фармация и общественное здоровье» :
материалы конф. с междунар. участием. – Екатеринбург, 2010. - С. 270 – 273.
12. Саблина, О.С. Изучение гигроскопичности карамельных лекарственных форм. [Текст] / О.С.Саблина, А.В.Филимонова, А.В.Швецова, А.С. Гаврилов // «Фармация и общественное здоровье» : материалы конф. с междунар. участием.
– Екатеринбург, 2010. - С. 257 – 261.
13. Саблина, О.С. Сравнительное определение массовой доли йода в карамельных лекарственных формах с помощью масс-спектрометрии и титриметрического методов анализа / О.С. Саблина // «Клинические и теоретические аспекты современной медицины» : материалы II международной студ. науч. конф. – Москва, 2010. – С. 245-246.
14. Саблина, О.С. Изучение эффективности применения карамели с йодом для профилактики йододефицита у детей / О.С. Саблина, Г.М. Филатова, Л.В.
Левчук, Н.Е. Санникова // «Человек и лекарство» : материалы XVIII Росс. нац.
конгресса. – Москва, 2011. - С. 399.
15. Саблина, О.С. Технологии изготовления твердых лекарственных форм с йодом [Текст] / О.С. Саблина, А.С. Гаврилов // «Актуальные вопросы повышения качества последипломной подготовки фармацевтических кадров» :
материалы росс. науч.-практ. конференции. – Казань, 2011. – С. 115 – 118.
16. Саблина, О.С. Изучение безопасности и эффективности применения карамели с йодом в эксперименте на лабораторных животных [Текст] / О.С.
Саблина, А.Б. Ершов, К.В. Подгорбунская // «Фармация и общественное здоровье» : материалы конф. с междунар. участием. - Екатеринбург, 2011. - С.
96 – 98.
17. Кох, Е.С. Карамельные лекарственные формы для больных сахарным диабетом [Текст] / Е.С. Кох, О.С. Саблина, А.С. Гаврилов // Научно технический прогресс и оптимизация технологических процессов разработки лекарственных препаратов» : материалы науч. – практ. конф. С междунар.
участием. – Украина, Тернополь, 2011. – С. 81 – 83.
18. Саблина, О.С. Изучение цветовых характеристик таблеток, полученных на основе изомальта [Текст] / О.С. Саблина, А.С. Гаврилов // «Фармация и общественное здоровье» : материалы конф. с междунар. участием. Екатеринбург, 2012. - С. 132 – 134.
19. Саблина, О.С. Стабильность калия йодида в таблетках / О.С. Саблина, Е.Ю. Ермишина, А.С. Гаврилов // «Фармация и общественное здоровье» :
материалы конф. с междунар. участием. - Екатеринбург, 2012. - С. 134 – 135.
20. Саблина, О.С. Разработка состава таблеток с применением технологии инкапсулирования калия йодида в расплав изомальта / О.С. Саблина, А.С.
Гаврилов // «Фармация и общественное здоровье» : материалы конф. с междунар. участием. - Екатеринбург, 2012. - С. 135 – 137.
Саблина Ольга Сергеевна (Россия) Разработка технологии твердых лекарственных форм на основе изомальта Изучены физико-химические и технологические характеристики порошка изомальта DC и показана возможность его применения в качестве наполнителя для таблеток, получаемых методом прямого прессования. На основе обобщения полученных данных, разработан состав таблеток валидола 0,06 г, кислоты аскорбиновой 0,05 г, калия йодида 131 и 262 мкг. Изучены технологические характеристики карамельной массы. Разработан состав лечебно профилактической карамели с калия йодидом (25 мкг йода) без сахара.
Проведены доклинические испытания комбинации изомальта с калия йодидом.
Установлено, что данная комбинация является более эффективной. Показана возможность применения изомальта в качестве вспомогательного вещества для инкапсулирования лабильных субстанций (калия йодида). Исследована возможность применения изомальта в качестве крупки, а так же в составе порошка для обсыпки и сиропа для наслаивания и наращивания оболочки в процессе получения драже без сахара. Разработаны состав и технология производства драже аскорбиновой кислоты 0,05 г без сахара на основе изомальта. Доказана возможность применения изомальта в качестве наполнителя брикетов, получаемых влажным прессованием.
Sablina Olga (Russia) The development of technology for solid dosage forms based on isomalt Physico-chemical and technological characteristics of isomalt DC and the possibility of its use as a filler for the tablets obtained by direct compression have been studied.
Based on the data obtained tablets of potassium iodide 262 mcg have been designed.
Isomalt has been shown to be a useful basis for dosage forms for resolution..
Technological characteristics of caramel mass and effect of the introduction of various excipients have also been studied. The composition of therapeutic and preventive lozenges with potassium iodide (25 mg iodine) without sugar has been developed. Pre clinical and clinical trials of isomalt and potassium iodide combination have been performed. This combination has been established to be more effective. The possibility of the use of isomalt as a supporting material for encapsulation of labile substances (potassium iodide) has been studied. The scope of the use of isomalt as grits as well as in the powder sprinkled and syrup for layering and building cover during the process of sugar-coated dragee has been studied. The composition and technology of ascorbic acid 0.05 g sugar free isomalt based dragee have been proposed. The possibility of the use of isomalt as sticks filler, got by wet pressing has been proved.