Фармакогностическое исследование некоторых культивируемых растений с цель ю расширения их использования в фармации

На правах рукописи

ОРЛОВСКАЯ ТАТЬЯНА ВЛАДИСЛАВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ

КУЛЬТИВИРУЕМЫХ РАСТЕНИЙ С ЦЕЛЬЮ РАСШИРЕНИЯ

ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ФАРМАЦИИ

14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора фармацевтических наук

Пятигорск – 2011

2 Диссертационная работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

доктор фармацевтических наук, профессор

Научный консультант:

Гаврилин Михаил Витальевич

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор Оганесян Эдуард Тоникович доктор фармацевтических наук, профессор Куркин Владимир Александрович доктор биологических наук, профессор Яковлев Геннадий Павлович ГОУ ВПО «Пермская государственная

Ведущая организация:

фармацевтическая академия Росздрава»

» _ 2011 г. в 900 часов на заседании дис

Защита состоится « сертационного совета Д 208.069.01 при ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росзд рава» (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Пятигор ская ГФА Росздрава».

Автореферат разослан « » _ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Е.В. Компанцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из важных направлений медицинской и фармацевтической науки является поиск новых источников биологически ак тивных соединений (БАС) с целью дальнейшего расширения производства фи топрепаратов различного спектра действия, которые характеризуются эффек тивностью и малой токсичностью, что позволяет использовать их длительное время для профилактики и лечения многих заболеваний без риска возникнове ния побочных явлений. Не менее важно и то, что некоторые природные БАС пока не могут найти синтетических аналогов. Однако потребность населения в препаратах природного происхождения удовлетворяется не полностью, в част ности, это происходит из-за дефицита лекарственного растительного сырья (ЛРС) [Каухова И.Е., 2006].

Многие лекарственные растения, применяемые отечественной традици онной медициной, уже давно не образуют промышленных зарослей, а некото рые являются редкими или исчезающими. Динамика ухудшения экологической обстановки, антропогенное воздействие на природные фитоценозы дикорасту щих лекарственных видов также катастрофически сокращают их природные за пасы. Рассматриваемая проблема актуальна и с позиций фармакоэкономики, т.к. для современного производства фитопрепаратов необходима гарантирован ная сырьевая база, которую в настоящее время, могут обеспечить растения, культура выращивания которых, хорошо развита, так как они имеют опреде ленное значение в качестве сырья для пищевой промышленности.

Новый подход к использованию в фармации некоторых культивируемых пищевых растений имеет ряд неоспоримых преимуществ: во-первых, это доста точная сырьевая база (опыт культуры выращивания, селекция, сортовой отбор с повышенным содержанием действующих веществ, высокий уровень агротехни ки, возможность размещения посадочных площадей в наиболее благоприятных почвенно-климатических и экологических зонах и т.д.). Во-вторых – исследуе мые растения являются пищевыми, а, следовательно, безвредными для орга низма человека.

Анализ литературных данных показал, что многие пряно-ароматические растения содержат ряд ценнейших веществ и обладают различной фармаколо гической активностью. Следует отметить, что многие из них такие, как курку ма, имбирь, артишок, кунжут, момордика, пажитник и др., уже давно применя ются в научной медицине многих стран и входят в их Фармакопеи (Европей ская, США, Британская Травяная, Китайская и др.), что делает их приоритет ными для включения в отечественную фармакопею [Смирнова Ю.А., Киселева Т.Л., 2009]. На основе их сырья создан целый ряд эффективных препаратов, од нако в нашей стране из-за отсутствия соответствующих нормативных докумен тов многие из них не используются в достаточной мере.

Литературные сведения о химическом составе изучаемого сырья нельзя считать полными, т.к. исследователей, как правило, интересовала та или иная группа химических соединений, имеющих пищевое значение, а не весь ком плекс БАС, для некоторых видов сырья информация отсутствует, не указаны соединения, по которым следует проводить химическую стандартизацию сы рья. За счет выявления новых групп БАС, более полной утилизации комплекса веществ из растительного сырья, можно расширить рамки использования не только новых видов сырья, но и уже официнального (плоды моркови дикой, семена кунжута восточного и пажитника сенного).

Актуальным является и совершенствование норм и контроля качества как исходного ЛРС, так и препаратов из него по основным группам БАС [Маркарян А.А., 2004] с привлечением наиболее современных и перспективных физико химических методов. Проблема морфолого-анатомической диагностики расти тельного сырья для объективной оценки его подлинности, отличия от примесей и фальсификации также актуальна.

Фармакологические исследования по рассматриваемым видам сырья но сят фрагментарный характер, так как проводились в отношении только некото рых групп БАС, большая часть данных имеет предварительное значение.

В настоящее время, в современной фармацевтической науке создалась противоречивая ситуация между необходимостью поиска новых источников природных БАС, существующими возможностями культивирования растений и отсутствием исследований, позволяющих внедрить в медицинскую практику новые растительные источники сырья. Все это приводит к выводу об актуаль ности полного фармакогностического изучения исследуемых видов раститель ного сырья как новых источников природных БАС.

Таким образом, изучение, освоение и использование культивируемых пищевых лекарственных растений открывает отчетливые перспективы для соз дания экономически выгодных, доступных, безопасных и терапевтически эф фективных отечественных лекарственных препаратов, что, несомненно, совпа дает с задачами, поставленными Российским правительством по развитию оте чественной фармацевтической промышленности.

Цель работы. По итогам комплексного фитохимического изучения сырья культивируемых пищевых растений разработать научно-методическое обосно вание их использования в качестве лекарственного растительного сырья и соз дания фитопрепаратов на их основе.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Проанализировать современное состояние исследований по биологическим, химическим и фармакологическим свойствам культивируемых ЛР, выде лить и дать теоретическое обоснование необходимости и возможности их применения в медицинской практике.

2. Провести фитохимические исследования по группам биологически актив ных соединений: липиды, эфирные масла, углеводы, пептиды, полифенолы, а также макро- и микроэлементы.

3. Установить диагностические признаки ЛРС, разработать методики качест венного и количественного определения БАС.

4. Обосновать показатели норм качества ЛРС и разработать нормативную до кументацию на лекарственное сырье наиболее перспективных растений и фитосубстанций на их основе.

5. Провести фармакологический скрининг наиболее перспективных фракций из растительного сырья.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. В результате проведенных исследований теоретически обоснована и экспериментально под тверждена целесообразность использования сырья культивируемых растений, имеющих пищевое значение: куркумы длинной, имбиря аптечного, моркови дикой, клоповника посевного, артишока колючего, пажитника сенного, момор дики харантия, чернушки посевной, кунжута восточного, кмина тминового, перца однолетнего, полыни эстрагон в качестве источников ценных БАС, что доказывает перспективу расширения их использования в медицинской практи ке.

Впервые с помощью современных физико-химических методов (ВЭЖХ, ГЖХ, ГХ-МС, электрофореза и др.) проведено систематическое фитохимиче ское изучение основных групп биологически активных веществ (углеводов, ли пидов, пептидов, эфирных масел, фенольных соединений, сапонинов и др.).

Данные исследования показали значение различных классов соединений, что определяет развитие новых ресурсосберегающих технологий комплексного ис пользования сырья при его промышленной переработке.

Среди углеводов исследуемых растительных объектов выделены и изуче ны: спирторастворимые углеводы, водорастворимые, кислые углеводы и геми целлюлозы. Определен их качественный и количественный состав. Проведен анализ структурных особенностей пектинов. В результате проведенных иссле дований, впервые в качестве источников полисахаридов предложены новые ви ды сырья: околоплодник момордики харантия, корневища имбиря аптечного, корневища куркумы длинной, семена клоповника посевного, семена пажитника сенного, листья артишока колючего (технологический выход в пересчете на аб солютно сухое сырье данных видов составлял от 20 до 30 %).

Впервые изучен липидный комплекс семян пажитника сенного, моморди ки харантия, чернушки посевной, клоповника посевного, плодов моркови ди кой, кмина тминового, корневищ имбиря аптечного и куркумы длинной с опре делением физико-химических показателей жирного масла, определением ком понентного состава методом ГЖХ, ТСХ и ГХ-МС. В качестве промышленных источников жирного масла можно отнести семена чернушки посевной (содер жание липидного комплекса составляет до 35 %), семена клоповника посевного (до 20 %) и плоды артишока колючего (до 20 %). Наиболее ценными по составу можно считать жирные масла семян пажитника сенного и момордики харантия, что предопределяет перспективу изучения их фармакологических свойств, как ранозаживляющих, гепатопротекторных и гиполипидемических средств.

Разработана методика экстракции пептидов из семян кунжута восточного, момордики харантия, клоповника посевного, чернушки посевной, пажитника сенного, полыни эстрагон, перца однолетнего, плодов кмина тминового, морко ви дикой и артишока колючего, на основе которой получены пептидные экс тракты и установлен их аминокислотный состав. В результате анализа пептид ных фракций методом ВЭЖХ было определено количественное содержание каждого пептида и его молекулярная масса, что позволяет решать вопросы, свя занные с идентификацией, контролем чистоты и количественным определени ем. Впервые из плодов кмина тминового, семян перца однолетнего, кунжута восточного получены биоактивные пептиды, установлена их фунгицидная и цитотоксическая активность.

Впервые проведено изучение с использованием метода ВЭЖХ фенольных соединений в образцах сырья: плоды моркови дикой, листья и плоды артишока колючего, семена пажитника сенного, корневища куркумы длинной и имбиря аптечного, семена и околоплодник момордики харантия, семена клоповника посевного. Всего в исследуемых объектах идентифицировали 30 соединений фенольной природы, относящихся к коричным кислотам, флавоноидам, фено логликозидам, фенолокислотам, кумаринам и дубильным веществам.

Установлено что, такие растительные объекты как: листья и плоды ар тишока колючего, семена пажитника сенного, корневища куркумы длинной, околоплодник момордики харантия и семена клоповника посевного нужно рас сматривать как лекарственное растительное сырье, в котором гидроксикорич ные кислоты могут выступать в роли индикаторных компонентов, что предо пределяет перспективу их медицинского использования и вопросы стандарти зации сырья. В свою очередь, как источник флавоноидов можно рассматривать такие растительные объекты как: семена клоповника посевного, пажитника сенного, плоды моркови дикой и листья артишока колючего, как источники ку маринов – плоды моркови дикой, семена пажитника сенного, околоплодник момордики харантия, фенолокислот – плоды моркови дикой и артишока колю чего, семена клоповника посевного и пажитника сенного, корневища куркумы длинной и имбиря аптечного.

Определен химический состав изучаемых образцов эфирного масса мето дом ГХ-МС: в эфирном масле корневищ имбиря аптечного идентифицированы 29 веществ;

корневищ куркумы длинной идентифицированы 25 веществ;

пло дов моркови дикой – 18;

семян чернушки посевной – 7;

плодов кмина тминово го из Узбекистана – 15, а из Марокко – 16 компонентов. Общее количество идентифицированных веществ составляло от 93 до 100 %. Изученные образцы эфирного масла отличались от литературных данных, как по составу, так и по количеству идентифицированных компонентов, в связи, с чем доказано, что проводить стандартизацию сырья, особенно имбиря аптечного, куркумы длин ной и моркови дикой только по показателю «Эфирное масло» недостаточно.

Впервые проведены систематические исследования накопления куркуми ноидов в корневищах куркумы длинной и кумаринов в плодах моркови дикой, выделенных из различных образцов сырья, которые послужили основой для разработки единых подходов к обнаружению данных соединений в ЛРС и ре шению проблемы стандартизации по группам БАС, наиболее стабильных в хи мическом отношении и привносящих наибольший вклад в биологическую ак тивность суммарных препаратов.

В результате впервые предложены новые методики оценки качества кор невищ куркумы длинной, позволяющая достоверно устанавливать содержание куркуминоидов при помощи объективного метода ВЭЖХ и новая методика оценки качества плодов моркови дикой по содержанию кумаринов спектрофо тометрическим методом.

На основании морфолого-анатомического исследования уточнены мор фологические и выявлены диагностически значимые анатомические признаки, позволяющие проводить диагностику ЛРС: корневищ куркумы длинной (цель ное сырье, измельченное, порошок), корневищ имбиря аптечного (цельное сы рье, измельченное, порошок), плодов моркови дикой (цельное сырье и поро шок), плодов кмина тминового (цельное сырье), семян пажитника сенного (цельное сырье), семян клоповника посевного (цельное сырье), плодов момор дики харантия (цельное сырье), плодов артишока колючего (цельное сырье).

Микродиагностические признаки плодов кмина тминового, момордики харан тия, артишока колючего и семян клоповника посевного описаны впервые.

Впервые проведены фармакологические скрининговые исследования стандартизированных фитосубстанций на основе исследуемых видов сырья, по зволяющие их рекомендовать для получения новых фитопрепаратов, обладаю щих отхаркивающим, гепатопротекторным, гипохолестеринемическим, антиок сидантным, антибактериальным и гипогликемическим действием.

На основании изучения данных литературы, химического состава и фар макологической активности исследуемых видов растительного сырья предло жены научно-методические подходы к обоснованию использования сырья пи щевых растений как источников новых лекарственных средств.

Практическая значимость работы. В результате фитохимического и фармакологического исследования доказана возможность и перспективность использования ряда пищевых растений в качестве новых источников биологи чески активных соединений, создания фитопрепаратов на основе различных групп БАС изученных растений.

Предложены новые виды ЛРС для включения в Государственную фарма копею России XII издания: корневища куркумы длинной, корневища имбиря аптечного, семена пажитника сенного, плоды моркови дикой, листья артишока колючего.

Впервые установлены нормы качества сырья: корневищ куркумы длин ной, корневищ имбиря аптечного, плодов моркови дикой, листьев артишока ко лючего, семян пажитника сенного, которые легли в основу нормативной доку ментации (ФС и ФСП).

Разработан унифицированный подход к стандартизации: корневищ кур кумы длинной, корневищ имбиря аптечного, плодов моркови дикой, листьев артишока колючего свежих, семян пажитника сенного в соответствии с совре менными требованиями и группой действующих БАС, которые включены в со временную нормативную документацию (НД).

Для НД и оценки качества сырья, на основании проведенных фитохими ческих исследований разработаны и предложены методики ТСХ-анализа для корневищ куркумы длинной (куркуминоиды);

семян клоповника посевного (кумарины);

семян пажитника сенного (диосцин, диосгенин).

Разработаны методики количественного определения: куркуминоидов в корневищах куркумы длинной (спектрофотометрия и ВЭЖХ);

кумаринов в плодах моркови дикой (спектрофотометрия);

суммы гидроксикоричных кислот (в пересчете на кофейную кислоту) в листьях артишока колючего (спектрофо тометрия);

суммы фенольных соединений (в пересчете на хлорогеновую кисло ту) в семенах клоповника посевного (спектрофотометрия);

суммы фенольных соединений (в пересчете на 6-гингерол) в корневищах имбиря аптечного (спек трофотометрия);

определения диосгенина и суммы фурастаноловых гликозидов в семенах пажитника сенного (спектрофотометрия).

Для определения куркуминоидов в корневищах куркумы длинной и ку маринов в плодах моркови дикой установлены валидационные характеристики (по параметрам специфичность, линейность, предел количественного опреде ления, точность, прецизионность, уровень систематической погрешности).

Теоретически и экспериментально доказана целесообразность использо вания новых видов ЛРС: плоды момордики харантия, семена клоповника по севного, семена полыни эстрагон, семена перца однолетнего, семена чернушки посевной, плоды артишока колючего, плоды кмина тминового и семена перца однолетнего для применения в медицинской практике.

Показана возможность использования исследуемых видов растительного сырья в комплексных малоотходных технологиях получения современных ле карственных фитопрепаратов.

Материалы внедрения. На основании проведенных исследований разра ботаны НД для включения в Государственную фармакопею России XII изда ния:

1. Фармакопейные статьи (ФС) «Куркумы длинной корневища» и «Моркови дикой плоды» (находятся на экспертизе в ФГУ «НЦ ЭСМП»);

2. Фармакопейная статья предприятия (ФСП) «Моркови дикой плодов экстракт жидкий» (Регистрационное удостоверение ЛРС – 005939/09-210709);

3. Фармакопейная статья (ФС) «Имбиря аптечного корневища» (подготовлена к рассмотрению);

4. Проекты ФСП «Артишока колючего листья» и «Пажитника сенного семена».

Результаты диссертационной работы включены в монографию Т.В. Ор ловской, М.В. Гаврилина, В.А. Челомбитько «Новый взгляд на пищевые расте ния, как перспективные источники лекарственных средств».

Разработан «Способ количественного определения восстанавливающих сахаров» (патент № 2403566).

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Теоретическое обоснование необходимости и возможности использования новых сырьевых источников на основании изучения химического состава и фармакологической активности в научной медицине.

2. Результаты изучения химического состава исследуемых объектов.

3. Обоснование норм качества некоторых видов ЛРС.

4. Результаты скрининговых фармакологических исследований.

5. Научно-методическое обоснование использования сырья пищевых расте ний, как источников новых лекарственных средств.

Апробация работы. Материалы исследования доложены и обсуждены на различных региональных, Всероссийских и международных конференциях, в том числе на Международной научно-практической конференции «Потреби тельский рынок: качество и безопасность товаров и услуг» (Орел, 2001 г.), на XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, г.), на VII Интернациональном симпозиуме по химии природных соединений (Республика Узбекистан, г. Ташкент, 2007 г.) на I Международной научно практической конференции «Инновационные технологии в пищевой промыш ленности» (Пятигорск, 2008 г.), на региональных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г. Пятигорск, 2010, 2011 гг.).

Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно исследовательских работ ГОУ ВПО «Пятигорская государственная фармацев тическая академия Росздрава» по комплексной теме: «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (№ Гос. регистрации 01200906461).

Публикации. Основные положения отражены в 40 научных работах, в том числе 1 патента РФ на изобретение, 18 статей в журналах, рекомендован ных ВАК РФ для публикации результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора наук.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 358 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), главы «Объекты и методы исследования» (2 глава), эксперименталь ной части (3, 4, 5 главы), общих выводов, списка литературы и приложения. В тексте содержится 80 таблиц, 122 рисунка. Список цитируемой литературы, включает 580 источников, из них – 253 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований. В основу скринингового отбора объектов исследования положен принцип современных информационных ре сурсосберегающих технологий [Смирнова Ю.А., 2009]: анализ данных литера туры о применении растений в научной и народной медицине, рынка пищевого сырья в РФ, сведений о химическом составе, сырьевой базы и биологической активности (рис. 1). На первом этапе изучили номенклатуру ЛРС, применявше гося ранее в России и включенного в настоящее время в зарубежные фармако пеи. Факт включения объекта в нормативный документ такого уровня предпо лагает наличие достоверных сведений об эффективности его применения в ме дицине. Затем провели оценку сырьевой базы, учитывая несколько позиций:

доступность на российском рынке в качестве пищевого сырья, возможной ин тродукции растений в условиях России и развитие промышленной культуры, как в России, так и за рубежом. Анализ степени изученности химического со става и проблем стандартизации позволил сформулировать необходимость комплексного подхода к фитохимическому изучению растительного сырья, что определяет экономический фактор целесообразности его использования и уста новления достоверных показателей качества. Расширение номенклатуры ЛРС возможно также за счет видов длительно применявшихся в народной медицине и имеющих пищевую ценность наряду с лекарственной, либо широко исполь зуемых в качестве БАД. Актуальным является и изучение растительных объек тов с доказанной экспериментально и клинически фармакологической актив ность особенно в отношении лечения социально значимых заболеваний (сахар ный диабет, злокачественные новообразования и др.).

В результате научно-методического подхода к выбору растений, как воз можных источников лекарственных средств, выделили наиболее перспектив ные для дальнейшего исследования.

Объектами изучения служили промышленные образцы растительного сырья, полученные от фирм-изготовителей, которые имели соответствующие сертификаты качества и безопасности на выпускаемую продукцию, документы о регистрации растительного сырья на территории РФ, что гарантирует стан дартную процедуру получения сырья. Качество и безопасность растительного сырья соответствовали гигиеническим нормативам, установленным СанПиН 2.3.2.560-96 «Гигиенические требования к качеству и безопасности продоволь ственного сырья и пищевых продуктов».

Фитохимические исследования проводились с использованием современ ных физико-химических методов: хроматография колоночная (КХ), тонкослой ная (ТСХ), бумажная (БХ), газожидкостная (ГЖХ), газожидкостная хромато масс-спектрометрия (ГХ-МС), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), электрофорез, спектрофотометрия в УФ, видимой и ИК- областях, атомно-абсорбционная спектроскопия (ААС) и др.

Скриниговые микробиологические и фармакологические исследования включали изучение антибактериальной, фунгицидной, цитотоксической, отхар кивающей, гепатопротекторной, гипогликемической, гипохолестеринемиче ской, антиоксидантной, ферментной, ранозаживляющей активностей.

Анализ нормативных документов момордика куркума длинная артишок колючий кунжут восточный пажитник сенной имбирь аптечный перец однолетний харантия Ph. Fr, ГФ КНР, JP, Ph. Eur, DAB, BР, Ph. Eur, DAB, BР, JP, Ph. Eur, DAB, BР, BHP, Ph. Eur, DAB, BР, Ph. Eur, DAB, BР, BHP, USP ОГФ I-VIII Ph. Fr, ГФ КНР, ОГФ I-II NF, Ph. Fr, JP, ОГФ I-IV ОГФ I-III Ph. Fr, BHP USP-NF, ОГФ IV-VIII ГФ КНР Виды растений с доказанной возможностью интродукции в условиях РФ артишок момордика пажитник клоповник чернушка кунжут клоповник перец полынь морковь колючий харантия сенной посевной посевная восточный посевной однолетний эстрагон дикая Виды растений широко культивируемых в мировой практике, имеющих коммерческую значимость артишок куркума имбирь чернушка морковь кунжут пажитник кмин клоповник колючий длинная аптечный посевная дикая восточный сенной тминовый посевной Растения, имеющие актуальное фармакотерапевтическое действие артишок имбирь кунжут куркума пажитник морковь чернушка клоповник кмин момордика харантия колючий аптечный восточный длинная сенной дикая посевная посевной тминовый Перспективные объекты для исследования Curcuma Trigonella Lepidium Nigella Momordica Cynara Zingiber Daucus Cuminum Sesamum Artemisia Capsicum longa foenum- sativum sativa charantia scolymus officinale carota cyminum orientale dracunculus annuum сем.

сем. graecum сем. сем. сем.

сем.

сем. сем. сем. сем. сем.

Astera Zingibe Zingibe- сем. Brassica- Ranuncu- Cucurbita Apiaceae Apiaceae Pedaliaceae Asteraceae Solanaceae raceae ceae raceae Fabaceae ceae laceae ceae Рисунок 1 – Схема информационного поиска перспективных объектов исследования (BHP – Британская Травяная Фарма копея 1996 г.;

ВР – Британская Фармакопея 2009 г.;

DAB – Немецкая фармакопея 2008 г.;

JP – Фармакопея Японии XV изд.;

Ph. Eur. – Евро пейская фармакопея 2009 г.;

ГФ КНР – Государственная фармакопея Китайской народной республики VII изд.;

USP-NF – Фармакопея США;

Ph. Fr. – Французская фармакопея X изд.;

ОГФ – отечественная государственная фармакопея) ИССЛЕДОВАНИЕ ОСНОВНЫХ ГРУПП БАС Исследование углеводов Используя различную растворимость углеводов в полярных и неполяр ных растворителях в зависимости от природы, степени полимеризации и физи ко-химических свойств, выделены углеводные фракции: спирторастворимые углеводные фракции;

растворимые в холодной воде углеводы;

растворимые в горячей воде углеводы;

кислые углеводы;

гемицеллюлозы А и Б (щелочные уг леводы). Представленные данные позволяют считать наиболее богатыми угле водами (более 20 %) следующие растительные источники: момордика харантия (околоплодник), имбирь аптечный (корневища), пажитник сенной (семена), клоповник посевной (семена), артишок колючий (листья), куркума длинная (корневища) (табл.1).

Методом ГЖХ изучен качественный и количественный состав полисаха ридных комплексов исследуемых видов сырья. Установлено, что в составе раз личных углеводных фракций преимущественно содержатся глюкоза, галактоза, арабиноза;

в качестве минорных моносахаридов присутствуют рамноза, ксило за, манноза. С учетом количественного соотношения моносахаридов содержа щиеся остатки чаще всего представляют собой глюкогалактаны, глюкоарабаны, арабиногалактаны. Накопление указанных компонентов, особенно глюкозы, га лактозы, арабинозы, предопределяет перспективность фармацевтического ис пользования соответствующих фракций углеводов.

Учитывая перспективность фармацевтического использования пектинов, была поставлена задача – исследовать наиболее важные характеристики пекти нов (рН 1 % водных растворов, содержание свободных и этерифицированных карбоксильных групп, полигалактуроновой кислоты) для оценки функциональ ных свойств (табл. 2).

Высокое содержание свободных карбоксильных групп пектинов до 47 % (исчисление от молярной массы полимера), выделенных из корневищ имбиря аптечного, околоплодника момордики харантия, а также из семян кунжута вос точного, чернушки посевной, момордики харантия и листьев артишока колюче го, делает перспективными данные растительные объекты для выделения пек тинов с выраженными сорбционными свойствами, особенно в отношении ио нов токсичных и тяжелых металлов.

Таблица 1 – Результаты определения суммы углеводных фракций, % к сырью, n= Спирторас- Растворимые в Растворимые в Растительные Кислые Гемицел творимые холодной воде горячей воде Итого объекты углеводы люлозы углеводы углеводы углеводы Морковь дикая — 1,61±0,21 0,25±0,15 1,19±0,16 0,54±0,15 3,59±0, (плоды) Момордика харантия: 6,02±1,25 0,54±0,15 1,26±0,28 1,24±0,31 4,06±1,56 13,12±0, семена околоплодник 9,31±2,32 12,72±2,46 2,13±0,75 2,73±0,54 2,68±0,52 29,57±1, Имбирь аптечный 3,34±1,05 5,33±1,15 9,62±2,42 5,66±1,23 5,41±1,65 29,36±1, (корневища) Куркума длинная — — 2,72±0,45 1,43±0,16 17,41±3,56 21,56±1, (корневища) Клоповник посевной 8,78±2,31 5,44±1,42 1,78±0,34 2,74±0,12 4,58±1,08 23,32±1, (семена) Чернушка посевная 2,31±0,58 1,07±0,15 1,34±0,15 3,18±0,12 3,24±0,15 11,14±0, (семена) Кунжут восточный 1,42±0,51 1,05±0,45 0,29±0,09 3,62±0,75 6,15±1,75 12,53±0, (семена) Пажитник сенной — — 7,82±2,34 8,41±2,85 11,93±3,57 28,16±2, (семена) Артишок колючий: 11,34±2,34 5,11±1,12 0,78±0,15 2,41±0,57 2,63±0,43 22,27±0, листья — плоды 0,12±0,05 0,36±0,05 0,56±0,05 7,73±1,10 8,77±0, Кмин тминовый плоды — 0,44±0,01 1,16±0,17 0,48±0,01 2,06±0,12 4,14±0, образцы: Узбекистан — Марокко 0,25±0,05 0,25±0,05 0,42±0,15 0,89±0,18 1,81±0, Высокая степень этерификации карбоксильных групп пектинов, получен ных из плодов моркови дикой и кмина тминового, корневищ куркумы длин ной, семян момордики харантия, листьев и плодов артишока колючего (40 88 %), является основанием для рекомендации данных пектинов к использова нию в качестве вспомогательных веществ при приготовлении лекарственных форм: гелеобразователей, загустителей, стабилизаторов и др.

Таблица 2 – Физико-химические характеристики пектинов содержащихся в углеводных фракциях исследуемых растений, n= Содержание Расти- Содержание Степень рН 1 % этерифициро тельный свободных этерифи Сырье водных ванных источник карбоксильных кации, растворов карбоксильных пектинов групп, % % групп, % Морковь плоды 3,61±0,18 2,7±0,2 19,8±1,0 88,0±4, дикая семена 3,42±0,17 12,2±0,5 9,7±0,5 44,3±2, Момордика около харантия 3,28±0,16 27,1±1,3 9,4±0,5 25,8±1, плодник Имбирь корне 3,12±0,14 46,8±2,2 1,1±0,1 2,3±0, аптечный вища Куркума корне 3,61±0,17 2,3±0,2 3,2±0,2 58,2±2, длинная вища Клоповник семена 3,21±0,15 10,1±0,4 2,8±0,3 21,7±1, посевной Чернушка семена 3,39±0,17 14,4±0,7 4,5±0,2 23,8±1, посевная Кунжут семена 3,35±0,17 16,2±0,8 9,9±0,5 37,9±1, восточный Пажитник семена 3,52±0,16 6,4±0,9 2,9±0,6 31,18±2, сенной листья Артишок 3,50±0,16 5,0±0,3 4,5±0,2 47,4±2, колючий: плоды 3,42±0,17 12,2±0,6 8,3±0,4 40,5±2, Кмин тминовый 3,57±0,16 4,1±0,2 3,2±0,2 43,8±2, плоды Узбекистан 3,58±0,15 3,2±0,2 2,2±0,2 40,7±2, Марокко Для анализа пектинов использован метод спектрофотометрии по реакции взаимодействия с карбазолом (табл. 3). Как видно из представленных данных, выраженным накоплением галактуроновой кислоты характеризуются углевод ные фракции, полученные из семян пажитника сенного, плодов кмина тминово го, плодов артишока колючего, корневищ куркумы длинной, семян кунжута восточного. Причем, первые четыре из перечисленных пектинов сопоставимы по анализируемому показателю с известными промышленными пектинами – цитрусовым и яблочным.

Таблица 3 – Результаты количественного определения полигалактуроновой кислоты в углеводных фракциях по реакции взаимодействия с карбазолом, n= Растительный Содержание источник Сырье полигалактуроновой кислоты, пектина % к фракции углеводов Пажитник сенной семена 65,4±3, Кмин тминовый плоды 60,1±3, Артишок колючий плоды 53,2±2, Куркума длинная корневища 52,2±2, Кунжут восточный семена 40,9±2, Клоповник посевной семена 30,2±1, Чернушка посевная семена 29,3±1, Морковь дикая плоды 21,6±1, Момордика харантия семена 20,1±1, Имбирь аптечный корневища 19,7±0, Момордика харантия околоплодник 18,4±0, Артишок колючий листья 18,2±1, Исследование липидов Жирное масло получали классическими методами Сокслета и Фолча (табл. 4). Такие объекты как семена чернушки посевной, семена клоповника по севного и плоды артишока колючего могут быть отнесены к «масличному» сы рью (содержание жирного масла более 18 %), что в свою очередь, позволит для данных объектов использовать не только экстракционные методы выделения, но и метод прессования.

Для идентификации масла и контроля отсутствия в нем посторонних примесей использовали метод ГЖХ. По набору и количеству эссенциальных жирных кислот отличаются масла, полученные из семян чернушки посевной (55,2 %), клоповника посевного (41,5 %), плодов артишока колючего (37,8 %) и корневищ имбиря аптечного (39,9 %). Во всех исследованных образцах масел преобладали ненасыщенные жирные кислоты от 58,1- 95,0 %. Значительным количеством насыщенных жирных кислот отличались масла семян момордики харантия 36,0 % и корневищ имбиря аптечного 41,9 %. Доминирующее количе ство олеиновой кислоты обнаружено в масле плодов кмина тминового 61,2-70, % и плодов моркови дикой – 61,3 %.

Установленные методом ГЖХ параметры исследованных жирных масел позволяют проводить их идентификацию и предлагать ГЖХ анализ в качестве унифицированного метода стандартизации данных растительных объектов.

Хлороформно-метанольный экстракт колоночной хроматографией разде ляли на нейтральные (НЛ), гликолипиды (ГЛ) и фосфолипиды (ФЛ). Содержа ние каждой группы устанавливали гравиметрически после удаления раствори теля. Содержанием ФЛ отличались плоды моркови дикой и плоды артишока колючего, а ГЛ – семена чернушки посевной и плоды артишока колючего, а особенно семена момордики харантия (табл. 4).

Таблица 4 – Фракционный состав липидного комплекса изучаемых объектов Содержание, Выход, % к сырью Наименование % от общей массы сырья Б Х/М НЛ ГЛ ФЛ Семена пажитника сенного 7,67±1,13 8,05±2,09 64,5±3,6 28,2±2,3 7,3±1, Семена момордики харантия 10,04±2,51 12,68±2,85 35,4±2,2 57,4±3,1 7,2±1, Плоды артишока колючего 16,34±3,05 24,09±3,85 44,2±2,0 30,9±2,3 24,9±2, Семена чернушки посевной 36,01±4,58 37,01±3,95 53,0±2,3 37,2±2,3 9,8±1, Семена клоповника посевного 17,95±3,15 21,56±3,05 62,6±3,0 20,8±2,0 16,6±1, Плоды моркови дикой 12,24±2,38 15,64±3,54 58,5±3,1 17,8±1,2 23,7±2, Корневища имбиря аптечного 7,93±2,31 10,29±2,85 75,0±3,5 17,9±1,6 10,1±1, Плоды кмина тминового 9,52±2,35 14,23±2,12 66,4±3,8 20,5±2,0 13,1±1, Примечание: экстрагент Б – бензин «Нефракс», Х/М – хлороформ - метанол (2:1) В результате изучения хлороформно-метанольной фракции методами га зожидкостной хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) установлено, что наибо лее многообразными по количеству идентифицированных компонентов явля ются масла:

корневищ имбиря аптечного (идентифицировано 19 компонентов, среди ко торых специфические для данного растения вещества: куркумен – 6,08 % и зингиболен – 6,55 % и остатки фосфолипидов);

семян чернушки посевной (идентифицировано 36 компонентов, помимо жирных кислот, присутствуют ретинолы, токоферолы, ситостерины);

семян клоповника посевного (триглицериды состоят из кислот: олеиновой – 25,55 % и линолевой – 20,63 %, из 24 идентифицированных соединений, интерес в плане фармакологического действия масла представляют фосфо липиды и гликолипиды);

плодов кмина тминового (компонентный состав жирного масла представ лен 24 соединениями, из жирных кислот доминирует линолевая – 24,56 %, заслуживают внимания, содержащиеся в нем фосфолипиды, стерины и их производные, токоферол и ретинол).

В масле плодов артишока колючего идентифицирована редкая вакценовая кислота (3,3 %), которая для данного вида сырья может являться маркерной.

Наиболее ценными по составу можно считать жирные масла семян па житника сенного (в жирном масле присутствуют составляющие фосфо- и гли колипидов, ксантины, а из жирных кислот превалирует олеиновая кислота – 17,17 %) и момордики харантия (компонентный состав липидов доказывает вы сокое содержание в них фракции гликолипидов от 54 до 60 %), что предопреде ляет перспективу изучения их фармакологических свойств, как ранозаживляю щих средств.

Таким образом, изучен компонентный состав 8 образов жирного масла исследуемых растительных объектов методам ГХ-МС, который позволил иден тифицировать не только жирнокислотный состав, но и сопутствующие фосфо-, гликолипиды, стерины, ретинолы, токоферолы и др. БАС.

Исследование пептидов Количественное содержание суммарного белка в исследуемых образцах, определяли методом Кьельдаля (табл. 5). Полученные данные свидетельствуют о высоком содержании белков во всех исследованных образцах (8,12-25,93 %), однако околоплодник момордики харантия, корневища куркумы длинной и им биря аптечного, листья артишока колючего не перспективны в плане изучения пептидной фракции, ввиду низкого содержания общего белка (менее 15 %).

На первоначальном этапе исследовалась эффективность экстракции ка тионных пептидов из семян различными минеральными и органическими ки слотами, 60 % водным ацетоном, буферами с различной ионной силой. Уста новлено, что наибольшая полнота извлечения пептидов из измельченных и обезжиренных семян достигалась 0,05 М раствором уксусной кислоты.

Все пептидные экстракты, полученные по разработанной методике, оха рактеризованы методом аминокислотного анализа. Данная методика позволяет получать пептидные экстракты с воспроизводимым компонентным составом.

Как следует из результатов исследования, аминокислотный состав пеп тидных экстрактов представлен всеми незаменимыми аминокислотами, в раз личном количественном соотношении и отличается сбалансированностью по заменимым аминокислотам. В обогащенной пептидами фракции наибольшее содержание азотсодержащих веществ находится в экстрактах семян полыни эстрагон, чернушки посевной, моркови дикой, перца однолетнего (более 40 %).

Количественное определение пептидов в анализируемых образцах сырья проводили спектрофотометрическим методом (метод Каар-Каля, табл. 5).

Таблица 5 – Содержание белка и пептидов в исследуемых образцах, n= Наименование растения: сырье Выход белка, % Выход пептидов, % Кунжут восточный: семена 22,68±2,21 1,02±0, Кмин тминовый: плоды 15,73±1,31 1,44±0, Момордика харантия: семена 22,85±3,13 2,20±0, Момордика харантия: околоплодник 12,32±1,24 — Клоповник посевной: семена 23,02±2,71 1,68±0, Чернушка посевная: семена 19,43±1,02 0,86±0, Пажитник сенной: семена 25,76±2,75 3,60±0, Артишок колючий: плоды 1,22±0, 19,95±1, Артишок колючий: листья 11,63±2,05 — Морковь дикая: плоды 25,93±2,01 1,88±0, Полынь эстрагон: семена 24,78±2,01 1,34±0, Имбирь аптечный: корневища 10,24±1,06 — Куркума длинная: корневища 8,12±1,07 — Перец однолетний: семена 5,68±0, 28,65±3, Из данных таблицы следует, что содержание пептидного комплекса в анализируемых образцах сырья составляет в среднем от 0,86 до 5,68 %, что в свою очередь позволяет предположить перспективность их дальнейшего изуче ния.

Диализованные экстракты пептидных комплексов исследовали методом гель-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) для определения гомо генности и молекулярных масс пептидов которые варьировали в каждом об разце от 67 000 Да до 36-35 Да. Низкомолекулярные пептиды от 250 кДа до 11 кДа зафиксированы в образцах, полученных из семян кунжута восточного, клоповника посевного, пажитника сенного, чернушки посевной, перца одно летнего и плодах артишока колючего (рис. 2).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Рисунок 2 – Электрофореграмма пептидов:

мар – белки-маркеры, 1 – кунжута восточного, 2 – кмина тминового, 3 – момордики харантия, 4 – клоповника посевного, 5 – перца однолетнего, 6 – чернушки посевной, 7 – пажитника сенного, 8 – артишока колючего, 9 – моркови дикой, 10 – полыни эстрагон В последние годы для разделения смесей пептидов очень широко приме няется метод ОФ-ВЭЖХ, который предполагает предварительную обработку пептидов ферментами для их энзиматического распада, но процесс данной ста дии зависит от многих условий (температура проведения реакции, качество ферментов, индивидуальные свойства пептидов, время реакции), что весьма трудно воспроизвести с точностью при нескольких повторных опытах. Мы в своих исследованиях использовали более современный, воспроизводимый и точный метод эксклюзионной ВЭЖХ. Данный метод является разработкой со трудников лаборатории пептидов Института химии природных соединений.

На примере изучения пептидов плодов артишока колючего методами электрофореза (рис. 2) и ВЭЖХ (рис. 3) видно, что разделение пептидного экс тракта проходит идентично, но в результате анализа пептидных фракций мето дом ВЭЖХ не только уточнена молекулярная масса каждого пептида, но и оп ределено их количественное содержание, что позволяет решать вопросы, свя занные с идентификацией, контролем чистоты и количественным определени ем.

Norm.

min 5 10 15 20 Рисунок 3 – Хроматограмма ВЭЖХ пептидов плодов артишока колючего По литературным данным известно, что пептиды, содержащиеся в семе нах, имеют катионную природу и проявляют выраженную антимикробную и фунгицидную активности. Такие пептиды могут послужить альтернативой ан тибиотикам, к которым у ряда патогенов выработалась резистентность.

Поэтому для получения катионных пептидов полученные экстракты из семян перца однолетнего, кунжута восточного и чернушки посевной, плодов кмина тминового и моркови дикой разделяли с помощь ионообменной хрома тографии, полученные активные пептидные фракции после диализа лиофильно высушивали и использовали для дальнейшего анализа методом гель электрофореза в ПААГ и ВЭЖХ.

В результате их экстракта семян перца однолетнего выделили 2 фракции (рис. 4).

Полученные фракции были исследованы методами гель-электрофореза (рис. 5) и ВЭЖХ (рис. 6). Анализ фракций показал, что экстракт и выделенные фракции содержат в своем составе низкомолекулярные белки порядка 6-10 кДа.

0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 10 20 30 40 50 60 70 № пробирки Рисунок 4 – Результаты изучения пептидного экстракта семян перца однолетнего методом ионнообменной хроматографии кДа 12. 3 4 5 1 Рисунок 5 – Электрофореграмма пептидов семян перца однолетнего:

1 – цитохром – 12,4 кДa;

2 – смесь маркеров (фосфорилаза В – 97 кДa, альбумин – 68 кДa, карбонангидраза – 29 кДa), 3 – пептидный экстракт, 4 – I фракция;

5 – II фракция;

6 – III фракция Рисунок 6 – ВЭЖХ анализ фракции II пептидного экстракта семян перца однолетнего Пептидный экстракт плодов кмина тминового состоял из одной фракции, содержащий белок с молекулярной массой порядка 10 кДа.

Из экстракта семян кунжута восточного получено 4 фракции, которые проанализированы методом электрофореза в градиенте 10-15 % ПААГ (рис. 7).

кДа 1 2 3 Рисунок 7 – Электрофореграмма пептидных фракций семян кунжута восточного:

1 – смесь белков-маркеров (карбонангидраза – 29 кДа;

цитохром С – 12,4 кДа), 2 – пептидный экстракт, 3 – фракция I, 4 – фракция II, 5 – фракция III, 6 – фракция IV Все фракции пептидов семян кунжута восточного содержат низкомолеку лярные пептиды с относительной молекулярной массой 5-10 кДа.

Анализ суммарного белкового экстракта плодов моркови дикой показал, что он содержит большое количество низкомолекулярных пептидов с молеку лярным весом в пределах 2,5-8 кДа. После его разделения на колонке с Сефа дексом G-15 получили три фракции. Далее фракция 1 была разделена ионооб менной хроматографией на колонке с КМ-TSK-650 M. В результате получены две пептидные фракции с молекулярной массой в пределах 9-10 кДа.

После разделения ионообменной хроматографией пептидного экстракта из семян чернушки посевной получено 3 фракции. Содержание пептидов в по лученных фракциях анализировали электрофоретическим методом, который показал наличие пептидов с молекулярной массой порядка 5-10 кДа во второй и третьей фракции.

Исходя из литературных данных, можно предположить, что пептиды с молекулярной массой 2-5 кДа относятся к классу дефензинов, а с М.м. около кДа – к так называемым липидпереносящим белкам и соответствует данным для известных антимикробных пепетидов. Следует отметить, что результаты изучения пептидов из плодов моркови дикой и семян чернушки посевной, заго товленных от растений, выращенных в России сопоставимы с ранее получен ными данными из образцов сырья, выращенных в Узбекистане, что косвенно доказывает устойчивость пептидного состава [Ю.И. Ощепкова, 2009, A.Yili, 2007].

Таким образом, из пептидных экстрактов, полученных из семян перца од нолетнего, кунжута восточного, чернушки посевной, плодов кмина тминового и моркови дикой с помощь ионообменной хроматографии и гель-электрофореза выделили и охарактеризовали биоактивные пептиды.

Все пептидные фракции были протестированы на фунгицидную и проти воопухолевую активность, в аккредитованной лаборатории Института биоорга нической химии им. А.С. Садыкова АН РУз (Республика Узбекистан, г. Таш кент).

Биологическую активность пептидных экстрактов и фракций, получен ных после разделения на СМ-TSK геле, проверяли на фунгитоксичность на культуре патогенных штаммов № 108 гриба Verticillium dahlia турбидиметриче ским микропланшетным методом.

Таблица 6 – Фунгицидная и цитотоксическая активность пептидных фракций Цитотоксичность, % Фунгитоксичность Фракции подавления включения IC50 мкг/мл Н3-тимидина Экстракт перца овощного 79 33, Фракция П-1 70 10, Экстракт кунжута восточного 60 2, Фракция К-2 37 1, Фракция К-3 30 2, Фракция К-4 39 Экстракт кмина тминового 64 1, Экстракт чернушки посевной 65 95, Фракция Ч-1 41 39, Фракция Ч-2 58 96, Фракция Ч-3 18 42, Экстракт моркови дикой 60 21, Фракция М-1 16 10, Фракция М-2 25 5, Примечание: IC50 – концентрация пептидов, вызывающих 50 % подавление роста гриба Как следует из полученных данных, наибольшей фунгицидной активно стью обладают пептидные экстракты кунжута восточного и моркови дикой и их отдельные компоненты их фунгицидная активность возрастает в 2-3 раза. Не которая разница в активности различных фракций, по-видимому, связана с за грязнениями или возможной другой природой пептидов, что приводит к отно сительно более низкой величине фунгицидной активности между фракциями (табл. 6).

Действие полученных фракций и индивидуальных пептидов на пролифе ративную активность клеток меланомы мышей КМЛ в культуре тканей оцени валось в цитотоксическом тесте по включению Н3-тимидина в ДНК опухоле вых клеток. Рост меланомы мышей под действием исследуемых белков в кон центрации 100 мкг/мл in vitro подавляется (табл. 6).

Выраженная цитотоксическая активность пептидов чернушки посевной делает их перспективными для дальнейшего углубленного изучения противо опухолевой активности на различных видах опухолей в тестах, как in vitro, так и in vivo.

Исследование эфирных масел Несмотря на то, что в химическом отношении наиболее изученной груп пой БАС (по данным литературы) являются эфирные масла (особенно имбиря аптечного, куркумы длинной и моркови дикой) в теоретическом плане всегда представляет интерес их исследование и сравнение с данными литературы, так как эта группа БАС является одной из самых лабильных по составу в зависимо сти от многих факторов. Это необходимо учитывать, также и потому, что фар макологическая активность может изменяться в зависимости от компонентного состава. Поэтому определен химический состав изучаемых образцов эфирного масса методом ГХ-МС: в эфирном масле корневищ имбиря аптечного иденти фицированы 29 веществ;

в эфирном масле корневищ куркумы длинной иденти фицированы 25 веществ;

в эфирном масле плодов моркови дикой идентифици ровали 18 химических компонентов;

в эфирном масле семян чернушки посев ной идентифицировано 7 компонентов;

в эфирном масле плодов кмина тмино вого из Узбекистана – 15, а из Марокко – 16 компонентов. Общее количество идентифицированных компонентов составляло от 93 до 100 %.

Данный фрагмент работы, показал, что изученные нами образцы эфирно го масла отличались от описанных в литературе образцов, как по составу, так и по количеству идентифицированных компонентов. В связи, с этим можно ска зать, что проводить стандартизацию сырья, особенно имбиря аптечного, курку мы длинной и моркови дикой только по показателю «Эфирное масло» нецеле сообразно.

Исследование фенольных соединений С использованием метода ВЭЖХ определено относительное содержание отдельных идентифицированных фенольных веществ (табл. 7).

В результате проведенных исследований можно констатировать тот факт, что, такие растительные объекты как: листья и плоды артишока колючего, се мена пажитника сенного, корневища куркумы длинной, околоплодник момор дики харантия и семена клоповника посевного нужно рассматривать как лекар ственное растительное сырье, в котором гидроксикоричные кислоты могут вы ступать в роли индикаторных компонентов и являться их источниками, что в свою очередь предопределяет перспективу их медицинского использования и вопросы стандартизации сырья. В свою очередь, как источник флавоноидов Таблица 7 – Компонентный состав фенольных соединений исследуемых видов растительного сырья Наименование сырья околоплод- семена плоды листья плоды семена корневища корневища семена Группа Наименование ник моморди моркови артишока артишока пажитника куркумы имбиря клоповника БАС вещества момордики ки дикой колючего колючего сенного длинной аптечного посевного харантия харантия содержание в смеси, % (метод внутренней нормализации) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Корич- Кофейная кислота 2,10 38,55 3,63 24,70 17,86 2,72 17,28 1, ные Хлорогеновая 0,88 1,00 8,98 3,54 14, кисло- кислота ты Неохлорогеновая 6,88 1,46 8,17 2, кислота Цикориевая 2,70 2,88 7,45 0, кислота Феруловая кислота 1,19 12,12 3,28 0,65 6,86 2,45 5, Коричная кислота 2, Флаво- Лютеолин-7 2,20 35,19 1,34 1,58 14, ноиды гликозид Лютеолин 0, Дигидрокверцетин 4,99 4,99 10,81 0,00* 4, Ориентин 0,46 7, Рутин 7,37 0,08 6,54 2,34 5,46 1, Кверцетин 2,43 3,70 2,33 3, Гесперидин 2,33 0, Витексин 5,31 9,22 6, Гиперозид 0,01 1,35 3, продолжение таблицы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Гесперидин 1,05 2, Виценин 0, Апигенин 0,02 0, Кемпферол 0,00* 0,08 2, Феноло- Арбутин гликози- 9, ды Феноло- Салициловая 6,06 2, кислоты кислота Галловая кислота 13,51 21,05 11,73 11,49 24,12 5,15 9, Кумари- 4-Оксикумарин 0, ны Кумарин 3,04 1,73 0,97 2, Метоксикумарин 5, Скополетин 18, Умбеллиферон 7,66 2,35 2, Эскулетин 1,57 10,76 0, Дубиль- Пирагаллол 5,61 0, ные Эпикатехин 1, вещества Неидентифицированые 13 2 12 11 8 4 8 13 пики Примечание: «*» значение 0,00 вещества, не означает, что их нет, в сумме веществ они являются самыми минорными можно рассматривать такие растительные объекты как: семена клоповника по севного и листья артишока колючего, как источники кумаринов – плоды мор кови дикой, семена пажитника сенного, околоплодник момордики харантия, фенолокислот – плоды моркови дикой и артишока колючего, семена клоповни ка посевного и пажитника сенного, корневища куркумы длинной и имбиря ап течного.

Артишок колючий по системе магнолиофитов Тахтаджяна относится к трибе Carduinae. К близким родам этой трибы относятся расторопша (Silybum).

В связи с этим, в плодах артишока колючего проводили целенаправленный по иск флаволигнанов – фармакологически активной группы соединений расто ропши пятнистой.

Для исследования плодов артишока колючего на присутствие флаволиг нанов в качестве СО был использован силимарин, содержащий сумму флаво лигнанов расторопши пятнистой. Согласно полученным данным, в СО силима рина зафиксировано 8 пиков. На хроматограмме спиртового извлечения плодов артишока колючего идентифицировано 3 пика, соответствующих по времени удерживания компонентам силимарина.

Для количественной оценки использовали сумму площадей идентифици рованных веществ. Согласно полученным данным в плодах артишока колючего методом ВЭЖХ найдено суммы флаволигнанов, в пересчте на силимарин 0,28±0,02 %.

Учитывая, что флаволигнаны расторопши пятнистой представляют собой группу соединений доминирующими компонентами, которой являются сили бин, силидианин и силикристин, продолжили исследование плодов артишока колючего с целью выяснения содержания в них силибина. При добавлении к изучаемому спиртовому извлечению раствора ГСО силибина была получена хроматограмма представленная на рисунке 8. Метод добавок отрицает наличие силибина в плодах артишока колючего.

Несмотря на отсутствие силибина проведенные исследования доказывают наличие других составляющих флаволигнанов растропши пятнистой, что не за крывает возможности дальнейших исследований плодов артишока колючего в отношении изучения гепатопротекторного и антиоксидантного действия.

1 Рисунок 8 – Хроматограмма спиртового извлечения из плодов артишока колючего(1) и спиртового извлечения с добавлением ГСО силибина (2) *** Результаты показали значительное количество органических кислот в ис следуемых видах сырья только в околоплоднике момордики харантия (0,41 %±0,02), поэтому продолжили изучение данной группы БАС методом ВЭЖХ. В результате исследования идентифицированы и количественно опре делены кислоты (%, метод внутренней нормализации): щавелевая (64,84), ли монная (2,87), винная (3,85), аскорбиновая (27,02), янтарная (1,43).

*** Для определения подлинности и показателей норм качества растительно го сырья проводили морфолого-анатомическое изучение, определение число вых показателей и разработку методов количественного определения БАС в не которых видах сырья.

Установление морфолого-анатомического строения изучаемых образцов растительного сырья проводили по следующей схеме:

описание внешних признаков цельного, измельченного и в виде порошка сырья;

общая схема и фрагмент поперечного среза;

микрофотографии и схемы анатомо-диагностических признаков на соот ветствующих срезах цельного сырья;

микрофотографии и схемы анатомо-диагностических признаков порошка.

В результате проведенных исследований уточнены морфологические и выявлены диагностически значимые анатомические признаки, позволяющие определять подлинность лекарственного растительного сырья для 8 образцов сырья. Микродиагностические признаки плодов кмина тминового, момордики харантия, артишока колючего и семян клоповника посевного описаны впервые.

Определены числовые показатели качества сырья: влажность, зола общая, зола, нерастворимая в 10 % кислоте хлористоводородной, содержание суммы экстрактивных веществ, извлекаемых водой очищенной, спиртом этиловым 40 %, 70 % и 96 %.

Совершенствование методов оценки качества ЛРС Для раздела НД «Подлинность» были разработаны методики ТСХ анали за для некоторых видов сырья. Для этого подбирали оптимальную систему ТСХ, избирательный экстрагент, условия очистки извлечения и детектирования хроматограмм. В результате предложены следующие методики:

идентификации куркуминоидов в корневищах куркумы на пластинках «Си луфол УФ-254» в системе растворителей хлороформ – спирт этиловый (19:1) с детекцией в УФ свете с длиной волны 254 и 366 нм;

идентификации кумаринов в семенах клоповника посевного в системе хло роформ – метанол – вода (26:16:4) и детектировании в УФ свете при длине волны 366 нм;

идентификации диосгенина в семенах пажитника сенного на пластинках «Силуфол» в системе растворителей хлороформ – петролейный эфир – аце тон (6:2:1) и детектировании путем опрыскивания хроматограммы реакти вом Санье и нагревании при 90-1000 С в течение 2 минут.

*** Исходя из первичного аналитического скрининга фенольных соединений, проведенного методом ВЭЖХ, мы выделили для каждого объекта ведущую группу биологически активных соединений, для которой разрабатывали методы количественного определения.

Количественное определение куркуминоидов в корневищах куркумы длинной В фармакологическом отношении наиболее важной группой соединений в корневищах куркумы длинной являются куркуминоиды, которые представле ны тремя соединениями куркумином, деметоксикуркумином и бис деметоксикуркумином. Их соотношение может изменяться в зависимости от фазы вегетации или места сбора. Все куркуминоиды обладают одинаковым фармакологическим действием, которое определяется наличием гептадиено нового фрагмента. Именно поэтому вся процедура идентификации должна быть направлена на выявление этой группы соединений.

Чаще всего, для идентификации куркуминоидов в сырье используется ме тод спектрофотометрии. Использование данных методик обусловлено наличи ем максимума поглощения при 425±3 нм. Однако такой же характер спектра будет присущ извлечениям из сырья любого вида куркумы. В этой связи иден тификация сырья по УФ спектру будет недостаточно объективной. Поэтому для идентификации и количественного определения целесообразнее использовать метод ВЭЖХ. В качестве элюента использовали водно-ацетонитрильные смеси различной концентрации, а в качестве модификатора – кислоту муравьиную. В наших условиях был получен ряд хроматограмм, из которых следовало, что только при элюировании 37-35 % ацетонитрилом с 1-2 % кислоты муравьиной удается достичь удовлетворительного разделения (рис. 9).

mV К у р 3 1 9 8.6 9 40 К у р 1 2.7 20 10 9 67 1415 1718 16 19 22 24 ch мин 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Рисунок 9 – Хроматограмма извлечения из сырья – экстрагент:

ацетонитрил 35 % По результатам валидации установлено, что приведенная методика явля ется специфичной для определения содержания куркуминоидов в сырье, харак теризуется корректной точностью и воспроизводимостью при величине относи тельного стандартного отклонения (3,48 %), что позволяет использовать ее для достоверной оценки качества сырья.

Содержание суммы куркуминоидов колебалось от 1,21 до 2,77 %. На осно вании полученных данных установили нижний предел содержания куркуми ноидов в сырье не менее 1,0 %. Разработанная методика нашла отражение в ФС «Куркумы длинной корневища».

Количественное определение кумаринов в плодах моркови дикой Ввиду того, что количество и качество эфирного масла плодов моркови дикой меняется в зависимости от места произрастания растения, условий хра нения сырья, климатических условий и других факторов разработать современ ную методику стандартизации сырья моркови по показателю «Эфирное масло»

с установлением четкого содержания компонентного состава не представляется возможным. Поэтому разработана методика количественного содержания ку маринов в сырье моркови дикой, как наиболее стабильной группы БАС и обес печивающей фармакологический эффект. Для количественного определения кумаринов использовали градиентный режим элюирования. В качестве опти мальных условий были признаны следующие: 15 минут элюирования смесью ацетонитрил : раствор кислоты муравьиной 20 г/л 10:90, затем за 35 минут со отношение ацетонитрила и раствора кислоты муравьиной изменялось до 60: при расходе подвижной фазы 1 мл/мин. В этих условиях были проанализирова ны извлечения из различных образцов сырья плодов моркови дикой. Содержа ние каждого из компонентов (кумарина, умбеллиферона, эскулетина, скополе тина) определялось с использованием соответствующих стандартных образцов, а содержание неидентифицированного компонента в пересчете на кумарин. По лученные данные представлены в таблице 8.

Таблица 8 – Результаты количественного определения отдельных кумаринов в различных образцах сырья, % Название вещества № Неидентиф.

об разца Кумарин Умбеллиферон Скополетин Эскулетин пик в пересчете на кумарин 1 0,0112 0,0447 0,0268 0,0060 0,1181 0, 2 0,0011 0,0137 0,0876 0,0106 0,2149 0, 3 0,0196 0,0016 0,0024 0,0063 0,1798 0, 4 0,0151 0,0013 0,0013 0,0023 0,2700 0, 5 0,0120 0,0020 0,0039 0,0005 0,2814 0, 6 0,0135 0,0027 0,0015 0,0002 0,0319 0, Как следует из полученных результатов, в анализируемом сырье можно идентифицировать все исследуемые кумарины, но одни из них являются доми нирующими, а другие присутствуют в следовых количествах. Хроматограммы других образцов сырья существенно отличаются между собой, что затрудняет выбор маркерного вещества. Поэтому этот метод не позволяет оценить качест во сырья и предложить какое-либо соединение для стандартизации плодов мор кови дикой. В связи с этим, было признано целесообразным, использовать для определения кумаринов в плодах моркови дикой, метод спектрофотометрии.

Анализ спектров поглощения извлечений, полученных спиртом этиловым 90 %, содержащим 1 % концентрированной кислоты хлористоводородной, по казал, что все они имеют плато в области 300-320 нм, которое соответствует максимуму поглощения кумарина при 315 нм (рис. 10).

С использованием данной методики были проанализированы изучаемые образцы сырья, что позволило в пересчете на кумарин установить нижний пре дел содержания суммы кумаринов в плодах моркови дикой 0,2 %.

A 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 350 нм 280 290 300 310 320 330 Рисунок 10 – Спектры поглощения раствора СО кумарина и извлечения из сырья моркови дикой (образец № 3):

1 – CO кумарина, 2 – извлечение Для методики установлены валидационные характеристики (по парамет рам специфичность, линейность, предел количественного определения, точ ность, прецизионность, уровень систематической погрешности). Методика об ладает достаточной чувствительностью и, варьируя навеской можно анализиро вать сырь с любым содержанием кумаринов.

Метод количественного определения суммы гидроксикоричных кислот в листьях артишока колючего В результате исследования фенольных соединений методом ВЭЖХ было установлено, что основным компонентом в листьях артишока колючего являет ся кофейная кислота (табл. 7), поэтому она использована в качестве стандарт ного вещества при расчете количественного содержания суммы коричных ки слот. Присутствие кофейной кислоты устанавливали в извлечениях полученных спиртом этиловым 70 %, спектр поглощения измеряли в интервале длин волн 200-400 нм. Было обнаружено совпадение спектров поглощения у растворов полученных извлечений и раствора CO кофейной кислоты по максимумам око ло 327±2 нм и 299±2 нм и минимуму при 264±2 нм.

Методом добавок установлено, что внесение определенного количества кофейной кислоты в водно-спиртовое извлечение из листьев артишока колюче го вызывает увеличение интенсивности поглощения при сохранении характера полосы поглощения. При этом наблюдается полоса поглощения с максимумом при 329±2 нм, минимумом при 265±2 нм и перегибом в области 290-310 нм.

В связи с этим количественное определение коричных кислот проводили методом прямой спектрофотометрии, установлено, что в листьях артишока ко лючего содержание гидроксикоричных кислот в перечете на кофейную кислоту составило 1,2-4,1 %, и данная методика может быть использована как для стан дартизации сырья – листьев артишока колючего, так и лекарственных препара тов на его основе.

Метод количественного определения суммы фенольных соединений в семенах клоповника посевного Аналогично разрабатывали методику количественного определения сум мы фенольных соединений в семенах клоповника посевного.

Спектр поглощения спиртового извлечения имеет характерную полосу поглощения с максимумами около 330±2 нм, минимум при 264±2 нм и переги бы в области 230-240 и 300-320 нм, что соответствует спектру CO хлорогено вой кислоты. Содержание суммы фенольных соединений, в пересчете на хлоро геновую кислоту в семенах клоповника посевного составляло 0,75-1,03 %.

Метод количественного определения суммы фенольных соединений в корневищах имбиря аптечного Согласно полученным данным максимум поглощения водно-спиртового раствора находится при длине волны 280±2 нм и совпадает с максимум погло щения спиртового раствора 6-гингерола. Поэтому в дальнейших исследованиях мы использовали длину волны 280 нм.

Содержание суммы фенольных соединений, в пересчете на 6-гингерол в корневищах имбиря аптечного составило 1,8-2,6 %.

Метод количественного определения диосгенина и суммы фурастаноловых гликозидов в семенах пажитника сенного Определение стероидных сапонинов проводили методом, предложенным в ФС «Трава якорцев стелющихся». Метод основан на способности фурастано ловых гликозидов образовывать с пара-диметиламинобензальдегоидом соеди нения, окрашенные в розовый цвет. Измерив оптическую плотность окрашен ных растворов при длине волны 518 нм, концентрацию фурастаноловых глико зидов находили по графику, построенному по кобальта хлориду, который ис пользовался в качестве заменителя раствора сравнения.

Количественное определение диосгенина проводили методом спектро метрии в видимой области, предложенным в ФС «Корневища с корнями дио скореи». Метод основан на способности диосгенина, образовывать с реактивом Марки соединения, окрашенные в розовый цвет. Измеряя оптическую плот ность окрашенных растворов при длине волны 490 нм, концентрацию диосге нина находили по градуированному графику, построенному по СО диосгенина.

В результате проведенного анализа установлено, что содержание фуро станоловых гликозидов в семенах пажитника сенного составляет 2,62-6,01 %, диосгенина – 0,99-1,75 % в пересчете на абсолютно-сухое сырье.

*** Изучен макро- и микроэлементный состав 12 исследуемых образцов сы рья. В изучаемых видах определено количественное содержание от 16 до элементов, из которых 13 являются эссенциальными и 5 условно эссенциальными.

Установлено, что все исследуемые образцы сырья соответствуют по пока зателю содержания тяжелых металлов требованиям ГФ XII.

C точки зрения радиологической безопасности исследуемые образцы рас тительного сырья не представляют опасности, так как накапливают до 1 % Cs 137 и 0,15-0,30 % Sr-90 от допустимого нормативной документацией уровня.

*** По итогам проведенных фитохимических исследований определили при оритетные группы биологически активных комплексов перспективных в отно шении создания на их основе фитосубстанций обладающих различной фарма кологической активностью.

Настои готовили в соответствии с требованиями ГФ XI издания.

Жидкий экстракт из плодов артишока колючего – методом модифициро ванной реперколяции (с включением стадии термической экстракции) по ана логии с жидким экстрактом из плодов расторопши пятнистой [Авдеева Е.В., 2007].

Сухие экстракты получали методом бисмацерации из предварительно обезжиренного сырья, в количестве 100,0 г. Количество экстрагента и продол жительность экстракции на первой стадии мацерации составило 800,0 мл в те чение 6-12 часов, на второй – 500,0 мл в течение 3-4 часов при периодическом перемешивании. Полученные извлечения упаривали под вакуумом при темпе ратуре 50-600 С в сушильном шкафу до влажности не более 5 %. Конечные продукты представляли собой гигроскопичные порошки коричневого цвета со специфическим запахом и горьким вкусом. Опытные образцы сухих экстрактов были получены в условиях заводской лаборатории ЗАО «Вифитех».

Характеристика полученных экстрактов представлена в таблице 9.

Изучение фармакологической активности Изучение «острой» токсичности всех исследуемых объектов показало, что они практически безопасны для человека. Практическая нетоксичность ис следуемых фитосубстанций делает целесообразным проведение фармакологи ческого скрининга в опытах in vivo.

Установлено, что сухие экстракты, полученные из семян пажитника сен ного и плодов момордики харантия, обладают выраженным гипогликемиче ским действием и снижают уровень глюкозы в сыворотке крови животных при экспериментальном аллоксановом диабете на 38,48 % и 65,89 % соответствен но.

Таблица 9 – Показатели качества сухих экстрактов полученных на основе растительного сырья исследуемых видов Группа Выход Влаж- Метод действующих Экстрагент сухого Сырье ность, стандар- веществ и их экстракта, %** тизации количество, %* %** экстрагент – спирт этиловый спектро- фурастаноловые фотомет- гликозиды, Семена рия 18,32±0, пажитника сумма фенольных соеди 70 % 19,07±1,21 3,41±0, сенного нений в пересчете на ВЭЖХ кофейную кислоту, 1,08±0, сумма фенольных соеди Семена спектро нений в пересчете на клоповника фотомет 70 % 22,08±1,26 2,16±0, хлорогеновую кислоту, рия посевного 3,85±0, сумма флаволигнанов в ВЭЖХ пересчете на силимарин, Плоды 1,01±0, артишока 80 % 21,36±0,84 2,58±1, спектро- оксикоричные кислоты в колючего фотомет- пересчете на кофейную рия кислоту, 7,61±0, Корневища спектро- сумма фенольных куркумы фотомет- соединений в пересчете на 80 % 22,04±0,95 2,54±1, рия куркумин 8,04±0, длинной экстрагент – вода очищенная Плоды вода титримет- органические кислоты, момордики 12,35±0,46 3,05±0, очищенная рический 3,32±0, харантия Примечание: * – выход экстракта приведен в пересчете на вес абсолютно сухого сырья, ** – указано среднее значение шести определений Содержание общего холестерина в сыворотке крови животных под влия нием сухих экстрактов пажитника сенного достоверно снижается на 31,66 %, артишока колючего – на 45,88 %. Сухой экстракт куркумы длинной снижает общий холестерин крови на 47,86 %, но недостоверно.

Максимальное содержание антиоксидантов имеет место в сухом экстрак те, полученном из плодов момордики харантия спиртом этиловым 70 %, семян клоповника посевного спиртом этиловым 40 %, плодов артишока колючего спиртом этиловым 70 %.

В сравнительном аспекте влияние на функциональное состояние печени исследуемого артишока колючего плодов экстракта жидкого не имело выра женных достоверных различий с действием препарата – аналога расторопши экстракта жидкого. Следовательно, артишока колючего плодов экстракт жид кий можно рекомендовать для более углубленного изучения с целью создания гепатопротекторного средства.

Наибольшую отхаркивающую активность проявил настой, полученный из семян клоповника посевного, который превосходит действие препарата сравне ния «Мукалтин», по-видимому, это объясняется не только высоким содержа нием ВРПС, но и сапонинов (двигательная активность мерцательного эпителия увеличивалась на 43,87 %). Настой из корневищ имбиря аптечного показал от харкивающий эффект сопоставимый с препаратом сравнения (после апплика ции двигательная активность увеличивалась на 30,21 %).

Изучение антибактериального действия выявило преимущественно ак тивность извлечений, полученных 40 % спиртом этиловым из корневищ кур кумы длинной, имбиря лекарственного и семян чернушки посевной. Установ лено выраженное антибактериальное действие спиртового извлечения из кор невищ куркумы длинной по отношению практически ко всем тест-культурам.

Эфирные масла куркумы длинной, имбиря аптечного, кмина тминового и моркови дикой, полученные из исследуемых образцов сырья проявляют широ кий спектр антибактериальной активности, что дает основание для их дальней шего углубленного изучения в качестве потенциальных противомикробных средств.

Исследуемые фитосубстанции: жирное масло пажитника сенного и мас ляный экстракт момордики харантия при наружном нанесении на ожоговую рану ускоряли в ней репаративные процессы, что приводило к более раннему отторжению ожогового струпа и сокращению сроков эпителизации.

*** Результаты проведенных исследований позволили сформулировать мето дологическое обоснование использования сырья пищевых растений, как новых источников лекарственных средств (рис. 11).

Предлагаемые методические подходы базируются на проведении ком плекса теоретических, фитохимических, фармакологических и технологических исследований, объединяемых общей целью – создание фармакоэкономических БЛОК 1 Выявление перспективных объектов БЛОК 2 Расширение сведений о исследования химическом составе • Анализ нормативных документов • Определение качественного состава • Анализ рынка пищевого сырья БАС • Обобщение сведений о применении • Опредлеление количественного растений в научной и народной медицине содержания БАС • Анализ ресурсной базы • Определение ведущих групп БАС • Данные о химическом составе • Изучение аналитической групы БАС • Актуальность фармакотерапевтического действия БЛОК 4 Создание фитосубстанций с различной БЛОК 3 Разработка нормативной фармакологической активностью с учетом комплексной переработки сырья документации на сырье перспективных видов • Выбор технологической схемы получения фитосубстанций с учетом приоритетных групп БАС • Разработка методик качественного и количественного анализа БАС в ЛРС • Изучение возможности комплексной переработки растительного сырья для выделения различных • Определение числовых показателей биологически активных комплексов • Установление анатомо-диагностических • Проведение фармакологического скрининга полученных признаков ЛРС фитосубстанций • Составление нормативной документации • Разработка лекарственных форм, их стандартизация, на ЛРС оценка специфической активности, безопасности, составление НД Рисунок 11 – Схема научно-методического обоснования использования сырья пищевых растений, как источников новых лекарственных средств условий для расширения номенклатуры лекарственных растений и производст ва доступных, безопасных и терапевтически эффективных отечественных ле карственных фитопрепаратов для лечения определенных форм заболеваний.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ 1. Теоретически и экспериментально обоснована возможность использования растительного сырья, культивируемых растений при комплексном изучении в медицинской практике.

2. Проведено всестороннее фитохимическое изучение с целью установления их общего химического состава и выявления, основных наиболее перспектив ных БАС. Данный этап исследования позволил расширить сведения о хими ческом составе, и показал возможность их комплексной переработки:

выделены различные фракции углеводных комплексов из 13 образцов сырья, установлен их качественный и количественный состав, позволив ший в качестве источников полисахаридов предложить новые виды сы рья: околоплодник момордики харантия, корневища имбиря аптечного, корневища куркумы длинной, семена клоповника посевного, семена па житника сенного, листья артишока колючего (выход составил от 21,6 % до 29,8 %);

выделен и изучен компонентный состав 9 образов жирного масла иссле дуемых растительных объектов, который позволил идентифицировать не только жирнокислотный состав, но и сопутствующие фосфо-, гликолипи ды, стерины, ретинолы, токоферолы и др. БАС;

наиболее ценными по со ставу являются жирные масла семян пажитника сенного и момордики ха рантия;

такие объекты как семена чернушки посевной, семена клоповни ка посевного и плоды артишока колючего могут быть отнесены к «мас личному» сырью (содержание жирного масла более 18 %);

разработаны методы выделения биоактивных пептидных экстрактов из видов исследуемых растений, количественно определен и установлен их аминокислотный состав, методом гель-электрофореза определены моле кулярные массы пептидов, низкомолекулярные пептиды от 250 кДа до кДа были зафиксированы в образцах, полученных из семян кунжута вос точного, клоповника посевного, пажитника сенного, чернушки посевной, перца однолетнего и плодах артишока колючего;

разделение пептидов проводили также методом экслюзионной ВЭЖХ, в результате уточнены молекулярные массы пептидов, показана их гомогенность;

из пептидных экстрактов, полученных из семян перца однолетнего, кунжута восточно го, чернушки посевной, плодов кмина тминового и моркови дикой с по мощь ионообменной хроматографии и гель-электрофореза выделили и охарактеризовали биоактивные пептиды;

доказана их противофунгицид ная и цитотоксическая активность;

определены содержание в сырье, физико-химические показатели эфирно го масла, полученного из 6 видов растительного сырья, методом ГХ-МС определен химический состав изучаемых образцов эфирного масса: в эфирном масле корневищ имбиря лекарственного идентифицированы веществ;

в эфирном масле корневищ куркумы длинной идентифицирова ны 25 веществ;

в эфирном масле моркови дикой идентифицировали химических компонентов;

в эфирном масле чернушки посевной иденти фицировано 7 компонентов;

в эфирном масле кмина тминового из Узбе кистана – 15, а из Марокко – 16 компонентов;

в 9 исследуемых объектах методами хроматографии (БХ, ТСХ, ВЭЖХ) идентифицировали 30 соединений фенольной природы, из них 6 – ко ричных кислот, 13 – флавоноидов, 1 – фенологликозид, 6 – кумаринов, 2 – дубильных вещества;

идентифицировано 5 органических кислот и определено их количествен ное содержание в околоплоднике момордики харантия: щавелевая кисло та (64,84 % содержания в выделенной смеси), лимонная кислота (2,87 %), винная кислота (3,85 %), аскорбиновая кислота (27,02 %), янтарная ки слота (1,43 %);

изучен макро- и микроэлементный состав 12 исследуемых образцов сы рья, в изучаемых видах определено количественное содержание от 16 до 30 элементов, из которых 13 являются эссенциальными и 5 условно эссенциальными.

3. На этапе установления норм качества сырья предложены методики качест венного и количественного анализа БАС, установлены числовые показатели сырья.

4. По результатам макро- и микроскопического исследования определены диаг ностические признаки цельного, измельченного и в виде порошка ЛРС: кор невищ куркумы длинной, корневищ имбиря аптечного, плодов моркови ди кой, плодов кмина тминового, семян пажитника сенного, семян клоповника посевного, плодов момордики харантия, плодов артишока колючего.

5. Обосновано проведение стандартизации сырья куркумы длинной и моркови дикой по содержанию куркуминоидов и кумаринов соответственно и разра ботаны новые методики их количественного определения с валидационной характеристикой.

6. Результаты скрининговых фармакологических исследований некоторых фи тосубстанций, стандартизированных по ведущей группе биологически ак тивных соединений, показали наличие отхаркивающего, гепатопротекторно го, гипохолестеринемического, антиоксидантного, антибактериального, ги погликемического действия.

7. На основании проведенных исследований разработана нормативная докумен тация на лекарственное сырье: ФС «Куркумы длинной корневища» и ФС «Моркови дикой плоды» (находятся на экспертизе в ФГУ «НЦ ЭСМП»);

ФСП «Моркови дикой плодов экстракт жидкий» (Регистрационное удостове рение ЛРС – 005939/09-210709);

Проекты ФС «Имбиря аптечного корневи ща», ФСП «Артишока колючего листья», ФСП «Пажитника сенного семена».

8. Сформулированы научно-методические подходы к обоснованию использова ния сырья пищевых растений, как новых источников лекарственных средств.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Орловская, Т.В. Пажитник сенной – перспективное целебное растение / Т.В.

Орловская, З.С. Магомедова // Российские аптеки. – 2004. – № 7-8. – С. 78 80.

2. Орловская, Т.В. Изучение жирнокислотного состава липидов семян клопов ника посевного / Т.В. Орловская // Вестник Воронежского госуниверситета (ВГУ). Сер.: химия, биология, фармация. – 2006. – № 2. – С. 334-335.

3. Орловская, Т.В. Изучение аминокислотного состава семян клоповника по севного / Т.В. Орловская // Дальневосточный мед. журн. – 2006. – № 2. – С.

73-74.

4. Орловская, Т.В. Изучение углеводов Trigonella foenum-graecum / Т.В. Ор ловская, В.А. Челомбитько // Химия природ. соединений. – 2006. – № 2. – С.

181.

5. Орловская, Т.В. Изучение углеводов Curcuma longa / Т.В. Орловская, В.А.

Челомбитько // Химия природ. соединений. – 2006. – № 4. – С. 389-390.

6. Орловская, Т.В. Изучение углеводов Cynara scolymus / Т.В. Орловская, И.Л.

Лунева, В.А. Челомбитько // Химия природ. соединений. – 2007. – № 1. – С.

89-90.

7. Орловская, Т.В. Аминокислотный состав семян и околоплодника Momordica charantia / Т.В. Орловская, В.А. Челомбитько // Химия природ. соединений.

– 2007. – № 2. – С. 195.

8. Орловская, Т.В. Химический состав листьев Cynara scolymus / Т.В. Орлов ская, И.Л. Лунева, В.А. Челомбитько // Химия природ. соединений. – 2007. – № 2. – С. 196-197.

9. Орловская, Т.В. Изучение углеводов Lepidium sativum / Т.В. Орловская, В.А.

Челомбитько // Химия природ. соединений. – 2007. – № 3. – С. 255-256.

10. Орловская, Т.В. Изучение фенольного комплекса Lepidium sativum / Т.В.

Орловская, В.А. Челомбитько // Химия природ. соединений. – 2007. – № 3. – С. 269.

11. Орловская, Т.В. Изучение жирнокислотного, аминокислотного и минераль ного состава корневищ имбиря аптечного / Т.В. Орловская // Известия высш. уч. зав. Сев.-Кавк. регион. – 2007. – Спецвыпуск: Проблемы фарма ции, фармакологии и рациональной терапии. – С. 100-102.

12. Орловская, Т.В. Аминокислотный и минеральный состав корневищ куркумы длинной / Т.В. Орловская, Ибрагим Самер Али, В.А. Челомбитько // Извес тия высш. уч. зав. Сев.-Кавк. регион. – 2007. – Спецвыпуск: Проблемы фар мации, фармакологии и рациональной терапии. – С. 102-104.

13. Орловская, Т.В. Изучение углеводов и липидов Momordica charantia / Т.В.

Орловская // Химия природ. соединений. – 2008. – № 2. – С. 179-180.

14. Орловская, Т.В. Изучение полисахаридов Zingiber officinale / Т.В. Орловская // Химия природ. соединений. – 2008. – № 2. – С. 181-182.

15. Орловская, Т.В. ВЭЖХ-анализ плодов момордики харантия / Т.В. Орлов ская // Фармация. – 2010. – № 1. – 8-11.

16. Гаврилин, М.В. Содержание куркуминоидов в корневищах куркумы длин ной / М.В. Гаврилин, Т.В. Орловская, С.П. Сенченко // Фармация. – 2010. – № 3. – С. 30-32.

17. Гаврилин, М.В. Валидация методики определения куркуминоидов в корне вищах куркумы длинной / М.В. Гаврилин, Т.В. Орловская, С.П. Сенченко // Фармация. – 2010. – № 6. – С. 18-22.

18. Исследование биоактивных пептидов из некоторых видов растений / Т.В.

Орловская [и др.] // Химия природ. соединений. – 2010. – № 2. – С. 276-277.

19. Патент 2403566 Российская Федерация, МПК G01N 33/15. Способ количе ственного определения восстанавливающих сахаров // Н.Ш. Кайшева, А.Ш.

Кайшев, Т.В. Орловская. – № 2008149186/21;

заявл. 12.12.2008 г.;

опубл.

10.11.2010. – Бюл. № 31. – 14 с.

20. Выделение и изучение фермента липазы из семян чернушки посевной / Т.В.

Орловская [и др.] // Регион. конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (57;

2002;

Пятигорск): материалы… – Пятигорск: Пятигорск. ГФА, 2002. – С. 18-19.

21. Орловская, Т.В. Изучение полисахаридного комплекса семян клоповника посевного / Т.В. Орловская // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / Пятигорск. ГФА. – Вып. 59. – Пятигорск, 2004. – С. 42.

22. Орловская, Т.В. Определение диосгенина в пажитнике сенном (Trigonella foenum-graecum), культивируемом на Кавказских Минеральных Водах (КМВ) / Т.В. Орловская, З.С. Магомедова, В.А. Челомбитько // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр.

/ Пятигорск. ГФА. – Вып. 60. – Пятигорск, 2005. – С. 36-37.

23. Экспериментальное изучение противоожоговой активности жирного масла семян пажитника сенного / Т.В. Орловская [и др.] // Человек и лекарство:

тез. докл. 12 Рос. нац. конгр. 18-22 апр. 2005 г. – М., 2005. – С. 451-452.

24. Орловская, Т.В. Разработка характеристик подлинности и доброкачествен ности клоповника посевного семян / Т.В. Орловская // Разработка, исследо вание и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / Пяти горск. ГФА, СПб. ГХФА. – Вып. 62. – Пятигорск, 2007. С. 98-99.

25. Орловская, Т.В. Морфолого-анатомическое изучение семян и листьев кло повника посевного / Т.В. Орловская, В.А. Челомбитько // Разработка, иссле дование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / Пя тигорск. ГФА, СПб. ГХФА. – Вып. 62. –Пятигорск, 2007. С. 99-101.

26. Орловская, Т.В. Определение антибактериальной активности различных из влечений из некоторых видов лекарственного растительного сырья и оценка его микробиологической чистоты / Т.В. Орловская, М.В. Мазурина // Разра ботка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб.

науч. тр. / Пятигорск. ГФА, СПб. ГХФА. – Вып. 62. – Пятигорск, 2007.

С. 501-502.

27. Орловская, Т.В. Состав и содержание липидного и полисахаридного ком плексов плодов моркови дикой / Т.В. Орловская // Фармация из века в век:

тр. науч.-практ. конф. – СПб., 2008. – Ч. 3. Анализ и стандартизация лекар ственных средств. С. 108-111.

28. Орловская, Т.В. Морфолого-анатомическое изучение корневищ имбиря ле карственного / Т.В. Орловская // Разработка исследование и маркетинг но вой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / Пятигорск. ГФА. – Вып.

63. – Пятигорск, 2008. – С. 70-73.

29. Орловская, Т.В. Морфолого-анатомическое изучение корневищ куркумы длинной / Т.В. Орловская, В.А. Челомбитько // Разработка исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / Пяти горск. ГФА. – Вып. 63. – Пятигорск, 2008. – С. 74-76.

30. Орловская, Т.В. Новый подход к стандартизации пищевого растительного сырья / Т.В. Орловская // Инновационные технологии в пищевой промыш ленности: материалы междунар. науч.-практ. конф. (1;

1-2 июля 2008;

Пяти горск). – Пятигорск, 2008. – С. 128-133.

31. Орловская, Т.В. Показатели норм качества корневищ куркумы длинной / Т.В. Орловская, В.А. Челомбитько // Фармация из века в век: тр. науч. практ. конф. – СПб., 2008. – Ч. 3. Анализ и стандартизация лекарственных средств. С. 104-108.

32. Орловская, Т.В. Морфолого-анатомическое изучение плодов моркови дикой / Т.В. Орловская // Разработка исследование и маркетинг новой фармацев тической продукции: сб. науч. тр. / Пятигорск. ГФА. – Вып. 64. – Пятигорск, 2009. – С. 89-91.

33. Определение фенольных соединений в противодиабетическом сборе № 1 / Т.В. Орловская [и др.] // Разработка исследование и маркетинг новой фар мацевтической продукции: сб. науч. тр. / Пятигорск. ГФА. – Вып. 64. – Пя тигорск, 2009. – С. 120-122.

34. Орловская, Т.В. Исследование фенольного комплекса корневищ куркумы длинной / Т.В. Орловская, В.А. Челомбитько // Разработка исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / Пяти горск. ГФА. – Вып. 65. – Пятигорск, 2010. – С. 96-98.

35. Орловская, Т.В. Изучение гипогликемической и гипохолестеринемической активности некоторых сухих экстрактов / Т.В. Орловская, С.А. Кулешова, В.А. Челомбитько // Разработка исследование и маркетинг новой фарма цевтической продукции: сб. науч. тр. / Пятигорск. ГФА. – Вып. 66. – Пяти горск, 2011. – С. 553-554.

36. Орловская, Т.В. Сравнительная оценка гепатопротекторной активности экс трактов артишока колючего и расторопши пятнистой / Т.В. Орловская, С.А.

Кулешова // Разработка исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / Пятигорск. ГФА. – Вып. 66. – Пятигорск, 2011. – С. 551-553.

37. Орловская, Т.В. Определение антибактериальной активности некоторых эфирных масел / Т.В. Орловская, М.В. Мазурина // Разработка исследова ние и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / Пяти горск. ГФА. – Вып. 66. – Пятигорск, 2011. – С. 555-556.

38. Орловская, Т.В. Количественное определение антиоксидантов в некоторых сухих экстрактах / Т.В. Орловская, М.И. Кодониди // Разработка исследо вание и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / Пяти горск. ГФА. – Вып. 66. – Пятигорск, 2011. – С. 156-157.

39. Орловская, Т.В. Изучение «острой» токсичности активности некоторых ви дов растительного сырья и фитосубстанций на его основе / Т.В. Орловская, С.А. Кулешова // Разработка исследование и маркетинг новой фармацевтиче ской продукции: сб. науч. тр. / Пятигорск. ГФА. – Вып. 66. – Пятигорск, 2011.

– С. 550-551.

40. Orlovskaya, T.V. Chemical study of Curcuma longa rhizomes / T.V. Orlovskaya, Ibragim Samer Ali, V.A. Chelombit'ko // International Symposium on the Chemi stry of Natural Compounds: abstracts (7;

October 16-18 2007;

Tashkent, Uzbekis Tashkent: AS RUz., 2007. – P. 343.

tan).

*** Автор выражает искреннюю благодарность за консультативную по мощь и предоставленное рабочее место в соответствующих лабораториях:

кандидатам химических наук, старшим научным сотрудникам лаборато рии химии высокомолекулярных растительных веществ Института химии растительных веществ им. С.Ю. Юнусова АН РУз (Республика Узбеки стан, г. Ташкент) Л.Г. Межлумян, Н.Р. Юлдашевой, М.Х. Маликовой, уче ному секретарю института В.И. Виноградовой;

доктору химических наук, зав. лабораторией химии белков и пептидов Ин ститута биоорганической химии им. А.С. Садыкова АН РУз (Республика Узбекистан, г. Ташкент) О.Н. Вешкуровой;

доктору биологических наук, ведущему научному сотруднику научного цен тра сердечнососудистой хирургии РАМН им. А.Н. Бакулева (г. Москва), профессору Г.А. Осипову;

докторам фармацевтических наук кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии Самарского государственного медицинского уни верситета, профессору В.А. Куркину и профессору Е.В. Авдеевой;

доценту кафедры фармакологии Пятигорской ГФА, кандидату фармацев тических наук С.А. Кулешовой;

доктору фармацевтических наук, начальнику лаборатории ООК ЗАО «Ви фитех» И.Н. Зилфикарову (Московская обл., пос. Оболенск).

Автор выражает особую глубокую признательность и благодарность доктору фармацевтических наук, профессору Михаилу Витальевичу Гаврилину за постоянную, неоценимую помощь при выполнении аналитических ис следований, обсуждении полученных результатов и оформлении диссертации.

ОРЛОВСКАЯ ТАТЬЯНА ВЛАДИСЛАВНА ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ РАСТЕНИЙ С ЦЕЛЬЮ РАСШИРЕНИЯ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ФАРМАЦИИ 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук Подписано к печати « » _ 2011 г. Формат 60х84/ Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная. Усл. печ. л. 2, Тираж 100 экз. Заказ № _ Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

357532, г. Пятигорск, пр. Калинина,