Метод газовой хроматографии – масс-спектрометрии при анализе золпидема и его метаболитов в биологических жидкостях для экспертных целей
На правах рукописи
КРЫЛОВА ЕЛЕНА АНАТОЛЬЕВНА
МЕТОД ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ – МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
ПРИ АНАЛИЗЕ ЗОЛПИДЕМА И ЕГО МЕТАБОЛИТОВ
В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ ДЛЯ ЭКСПЕРТНЫХ ЦЕЛЕЙ
14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
Пермь – 2013 2
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, Хомов Юрий Александрович профессор ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, Белоногова Валентина Дмитриевна профессор ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации Гейн Людмила Федоровна доктор фармацевтических наук, доцент ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Защита состоится «12» ноября 2013 г в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01 при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО ПГФА МЗ РФ по адресу: г. Пермь, ул. Крупской, 46.
Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки Российской Федерации http://www.mon.gov.ru «» октября 2013 г. и на сайте ГБОУ ВПО ПГФА МЗ РФ http://www.pfa.ru «» октября 2013 г.
Автореферат разослан «» октября 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фармацевтических наук Н. В. Слепова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Объектом исследований настоящей работы является снотворный препарат, золпидем (производное имидазопиридина), обладающий короткой продолжительностью действия и быстрым наступлением фармакологических эффектов. Золпидем облегчает засыпание перед сном, а также среди ночи у больных с интрасомническими расстройствами.
Токсикологическое значение золпидем имеет, во-первых, в связи с широким применением, во-вторых, из-за доказанной способности вызывать явления привыкания и лекарственной зависимости (психической и физической) при длительном приеме (более 4 недель). При этом формируются благоприятные условия для немедицинского применения золпидема. Данный препарат не является наркотическим средством, но нередки случаи парентерального введения золпидема с целью получения эйфории (Benyamina A., 2007). В третьих, способность золпидема снижать скорость психической и мышечной реакции делает несовместимым прием этого лекарства с управлением всех видов транспортных средств и работой с приборами и автоматами, требующих точности движений. Препарат не раз применялся для осуществления преступных действий против личности, при этом использовались такие его свойства как потенцированное фармакологическое действие при совместном приеме с алкоголем, а также быстрое наступление седации (Levine B., 1999;
Maravelias C., 2009;
Chze M., 2010). В РФ золпидем является контролируемым лекарственным средством в целях уголовного законодательства: он внесен в Список сильнодействующих веществ, согласно Постановлению Правительства №964 от 29 декабря 2007 года.
Вследствие способности золпидема интенсивно метаболизироваться в организме человека, его обнаружение в моче может быть затруднительно, т.к.
лишь 0,2-1,3 % нативного вещества выводится с мочой в неизменном виде (Hempel G., 1996). Поэтому идентификация его метаболитов в моче может стать необходимым условием для получения корректных результатов ХТА.
Для изучения метаболитов золпидема в настоящей работе применялся метод газовой хроматографии – масс-спектрометрии (ГХ/МС). Он обладает высокой чувствительностью по отношению к описываемым соединениям, обеспечивает их селективное детектирование и снабжает структурной информацией. На сегодняшний день газовыми хроматографами с масс селективным детектированием оснащены многие судебно-химические и токсико-химические лаборатории на территории РФ, и они широко применяются для рутинных исследований. Поэтому получение новых масс спектральных данных о метаболитах золпидема, разработка и внедрение новых методик анализа с применением метода ГХ/МС является весьма актуальной задачей.
Целью настоящей работы явилось изучение биотрансформации золпидема в организме человека, разработка методики совместного изолирования золпидема и его метаболитов из биологических жидкостей при оптимальных условиях и последующее количественное определение золпидема в цельной крови и моче.
Реализация цели осуществлялась путем решения следующих задач:
1) Исследовать особенности метаболических превращений золпидема в организме человека путем идентификации его метаболитов с получением их различных производных, изучением масс-фрагментации, обобщением и описанием полученных газохроматографических и масс спектральных характеристик.
2) Определить оптимальные условия экстракции золпидема и его метаболитов из мочи при совместном присутствии.
3) Разработать методики количественного определения золпидема в цельной крови и моче методом ГХ/МС.
4) Составить по совокупности данных схему ХТА золпидема, адаптированную к практической деятельности судебно-химических и химико-токсикологических лабораторий как для скрининговых исследований на лекарственные и наркотические вещества, так и в случаях направленного анализа на золпидем.
Научная новизна работы:
- с помощью метода ГХ/МС идентифицированы метаболиты золпидема, получены и описаны газохроматографические и масс-спектральные характеристики различных их дериватов;
- с помощью метода математического планирования эксперимента (МПЭ) определены оптимальные условия для совместной экстракции золпидема и его метаболитов из мочи методом ТФЭ;
- доказана необходимость проведения ферментативного гидролиза мочи для последующего обнаружения метаболитов золпидема;
- разработаны ГХ/МС методики количественного определения золпидема в крови и моче, дана оценка возможности использования методик анализа в лабораторной практике путем их валидации.
Практическая значимость и внедрение результатов исследования.
Разработанные методики пробоподготовки крови и мочи для качественного и количественного определения золпидема и его метаболитов внедрены и используются в практике судебно-химического отделения ГКУЗОТ «Пермское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы» (акты внедрения от декабря 2008 г.;
от 27 января 2011 г.;
от 24 февраля 2011 г.);
в химико токсикологической лаборатории ГБУЗ «Пермский краевой наркологический диспансер» (акт внедрения от 27 января 2011 г.;
от 07.05.2013 г.);
в судебно химическом отделении ГУ «Республиканское бюро судебно-медицинской экспертизы МЗ Республика Марий Эл» (акт внедрения от 10 ноября 2011 г.).
Отдельные фрагменты диссертационной работы внедрены в учебный процесс кафедры токсикологической химии ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия МЗ РФ» (акт внедрения от 27 января 2009 г.) и кафедры фармацевтической химии ФДПО и ФЗО ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия МЗ РФ» (акт внедрения от апреля 2012 г.). По материалам исследования подготовлено информационное письмо «Применение методов ТФЭ и ГХ/МС для химико-токсикологического определения золпидема, его метаболитов и продукта гидролиза в биологических жидкостях». (19 с.).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Пермской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации 01.9.50 007417).
Личное участие автора. Для получения результатов, изложенных в диссертации, автор лично провел комплекс лабораторных исследований крови и мочи, включающий пробоподготовку образцов методом ТФЭ, проведение реакций дериватизации и выполнение ГХ/МС анализа с применением необходимого оборудования. Автором проведена разработка и валидация методик количественного определения золпидема в крови и моче, а также интерпретация всех полученных результатов исследований. Автором лично выполнено написание публикаций по данной теме и написание всех глав диссертации.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности.
Научные положения диссертации соответствуют формуле диссертации 14.04.02.
– фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2 и 3 паспорта фармацевтическая химия, фармакогнозия.
Апробация работы. Основные положения работы доложены на Российской научно-практической конференции, посвященной 70-летию Пермской государственной фармацевтической академии «Достижения и перспективы в области создания новых лекарственных средств» (Пермь, 2007);
на Российской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа» (Пермь, 2009);
Российской научно-практической конференции «Создание лекарственных средств на основе продуктов животного происхождения» (Пермь, 2010);
межрегиональной научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию судебно-медицинской службы в Кировской области «Актуальные вопросы судебно-медицинской науки и практики» (Киров, 2010);
XII международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке.
Инновационные технологии, качество и безопасность лекарственных средств»
(Москва, 2011);
III Международной научно-практической конференции «Аналитическая токсикология, перспективы и современные тенденции развития» (Москва, 2012);
Российской научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Современные проблемы фармацевтической науки», посвященной 75-летию Пермской государственной фармацевтической академии (Пермь, 2012);
I Международной научно-практической конференции «Инновационные процессы в исследовательской и образовательной деятельности» (Пермь, 2012);
отчетной научно-практической конференции студентов и молодых ученых (Пермь, 2013);
II Международной научно практической конференции «Инновационные процессы в исследовательской и образовательной деятельности» (Пермь, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, из них 15 статей, из которых 8 – в изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (4 глав), общих выводов, списка использованной литературы, приложения. Работа изложена на 156 страницах компьютерного текста, включает 32 таблицы и 39 рисунков и имеет приложение в объеме 52 страниц. Список использованной литературы содержит 174 наименования, из них 51 отечественных и 123 – зарубежных авторов. В приложении представлены материалы, подтверждающие практическую значимость проведенных исследований: акты внедрения, информационное письмо, таблица, содержащая обзор методов и методик исследования биологических объектов на предмет обнаружения и/или количественного определения золпидема и его метаболитов, а также таблицы, включающие блок информации по полученным методом ГХ/МС количественным данным, которые применялись на этапе математического планирования эксперимента (МПЭ).
На защиту диссертации выносятся следующие положения:
1) Результаты теоретических и экспериментальных исследований по установлению оптимальных условий экстракции золпидема совместно с его метаболитами из биологических жидкостей.
2) Данные о способах дериватизации метаболитов золпидема для их идентификации методом ГХ/МС.
3) Полученные и систематизированные данные о газохроматографических и масс-спектральных характеристиках метаболитов золпидема.
4) Схемы метаболизма золпидема и масс-фрагментации его метаболитов.
5) Методики ГХ/МС количественного определения золпидема в крови и моче.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. Обзор литературы В обзоре представлена информация о физико-химических свойствах золпидема, его фармакодинамике и фармакокинетике, подробно описано его немедицинское применение. Обобщены данные о метаболитах золпидема и их фармакинетических параметрах. Описаны применяемые в ХТА способы изолирования и физико-химические методы для идентификации и количественного определения золпидема и его метаболитов в биологических объектах.
Глава 2. Объекты и методы исследования В эксперименте были использованы объекты исследований:
Золпидема тартрат (порошок-субстанция, Испания, НД 42-13447-05).
Модельные смеси биологических жидкостей – моча и цельная кровь с различной концентрацией золпидема. Для приготовления модельных образцов использовались кровь и моча здоровых доноров, не употреблявших в течение месяца лекарственных и наркотических средств.
Биологические объекты – а) моча, полученная от добровольцев после перорального приема разовой терапевтической дозы золпидема тартрата;
б) образец реальной крови, который был направлен на исследование в ХТЛ ГБУЗ «Пермский краевой наркологический диспансер» от лица после приема токсической дозы золпидема тартрата.
Оборудование. Для ГХ/МС использовали: а) газовый хроматограф Agilent 6850, оснащенный капиллярной кварцевой колонкой НР-5MS длиной м с внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0, мкм. Масс-селективный детектор Agilent 5973N (Agilent, США);
б) газовый хроматограф Agilent 7820, оснащенный капиллярной кварцевой колонкой НР 5MS длиной 30 м с внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм. Масс-селективный детектор Agilent 5975 (Agilent, США). Для ТФЭ применяли: систему с вакуумной камерой (манифолд) на позиций (Supelico), насос низкого вакуума (AIR CADET, США);
картриджи: а) SPEC MP3 – 30 мг (Varian, Inc);
б) AccuBond II EVIDEX – 200 мг-3 мл (Agilent, США);
в) Sampli Q Evidex – 200 мг-3 мл (Agilent, США). Для выполнения реакции гидролиза и процедур дериватизации использовали термоблок ПЭ 4030 (ОАО «Экрос», Россия) и микроволновую печь Rolsen MS 1770 SA (Россия). При выполнении работы также применялись: микровстряхиватель ПЭ-2 (ОАО «Экрос», Россия), полуавтоматические пипетки-дозаторы, позволяющие отбирать объемы жидкостей 4-40, 40-200, 200-1000 мкл и 1-5 мл.
Глава 3. Изучение метаболизма золпидема Золпидем подвергается в организме человека активному метаболизму с образованием гидрокси- и карбоксиметаболитов, обладающих полярными функциональными группами (–ОН, –СOОН), придающими им свойства гидрофильных труднолетучих соединений, что затрудняет их выделение из мочи жидкость-жидкостной экстракцией и дальнейшее обнаружение методом газовой хроматографии. Поэтому для извлечения золпидема совместно с метаболитами использовался метод ТФЭ (Таблица 1), а для их успешной идентификации применялась дериватизация, которая позволила получить летучие, термостабильные производные со специфической масс-фрагментацией.
Таблица 1 – Протокол ТФЭ золпидема и его метаболитов из образцов мочи Этап Процедуры Подготовка образца К 2 мл мочи прибавляли 0,5 мл 1/15 М буфера фосфатного (pH 6,0), 0,1 мл -глюкуронидазы (10 140 ЕД), перемешивали, герметично (ферментативный укупоривали и экспонировали в течение 2 часов при 45 оС.
гидролиз) Полученный гидролизат центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 минут. Центрифугат отделяли от осадка, прибавляли 2, мл 0,1 М буфера ацетатного (pH 4,6) и подвергали ТФЭ Кондиционирование 2 мл этанола;
2 мл 0,1М буфера ацетатного рН 4, сорбента Загрузка образца со скоростью 1 мл/мин Промывка 1 мл 0,1М буфера ацетатного рН 4,6;
1 мл 0,1М кислоты уксусной;
1 мл 10% раствора этанола в воде Элюирование 2 х 2 мл элюента гексан–этилацетат (3:1) (элюат I);
2 х 2 мл дихлорметан–изопропанол–25% р-р аммиака (4:1:0,1) (элюат II) Для определения гидроксипроизводных золпидема использовали ацилирование, карбоксипроизводные алкилировали, либо этерифицировали.
Для обоих типов групп получали триметилсилильные эфиры.
Изучение структуры метаболитов золпидема было выполнено с помощью метода ГХ/МС, ионизация под действием электронного удара 70 эВ.
Газохроматографические данные получены и описаны при следующих условиях разделения: температура инжектора и интерфейса 250 и 280оС, температура колонки: начальная 70оС в течение 2 мин и прогрев до 280оС со скоростью программирования 20 град/мин;
выдержка при температуре 280оС в течение 12 минут, затем прогрев до 300оС со скоростью программирования град/мин;
выдержка при конечной температуре 5 мин. Ввод без деления потока газа-носителя. Регистрация масс-спектров в режиме полного сканирования масс 35-700 а.е. В результате проведенных исследований были идентифицированы гидрокси- и карбоксиметаболиты золпидема в виде их различных производных (Таблица 2). На рисунке 1 представлен масс-спектр нативного золпидема.
Relative Intensity (%) 16 87 8 116 126 166 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 m/z Рисунок 1 – Масс-спектр золпидема В результате проведенных исследований составлена обобщенная схема идентифицированных нами метаболитов золпидема с дополнениями, полученными из литературных источников (Klupsch F., 2006;
Rohrig, T.P., 2010;
Martnez-Ramrez, J.A.;
2012). Схема представлена на рисунке 2.
N N CH3 CH N N H3C H 3C O OH III OH N O N H3C II CH HO N H 3C O X H N ок з ли /O CH ис H3C H+ ОН ро O ле гид ни N е + N окисление CH N CH H3C N H3C O ок ис е O ни ле с ле ни N оки IX е CH H3C N VIII CH H3C N CH N H3C O ие ок н ис ле ле ис N ни ок CH H3C е I N N CH N N OH H3C O O OH IV V N N CH3 CH H3C H3C окисление окисление N O N CH HO N N OH H3C O O O N CH H3C N CH H3C VI VII Рисунок 2 – Биотрансформация золпидема в организме человека (I – золпидем;
II – продукт деструкции;
III – N-(гидроксиметил)-золпидем;
IV – 4’-(гидроксиметил)-золпидем;
V – 6 (гидроксиметил)-золпидем;
VI – 4’-(карбокси)-золпидем;
VII – 6-(карбокси)-золпидем;
VIII – (гидрокси)-золпдием;
IX – золпидем-N-оксид);
X – 3’-(гидрокси)-золпидем Таблица 2 – Газохроматографические и масс-спектральные характеристики производных гидрокси- и карбоксиметаболитов золпидема R N R N R O N CH H3C Характеристические Метаболит t R, Х Масс-спектр ионы, m/z мин (интенсивность, %) ) R la e In n ity (% 293 (100);
233 (53);
e tiv te s 294 (19,7);
365 (17,8);
СН3С(О)– 20,60 271 (19,7);
234 (13,1);
40 219 (12,2);
92 (10) 32 141 24 93 IV:
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 R1= –CH3 m/z R2= –CH2OX R3 = – 323 (100);
324 (27,3);
73 (19,3);
233 (17,6);
sity ) R la e Inten (% 395 (15,5);
234 (8,3);
(СН3)3Si– 19,46 249 (8);
154 (6,1);
e tiv (5,7);
396 (5,7);
(4,9);
92 (4,7);
207 (3,8) 16 73 165 50 100 150 200 250 300 m /z 293 (100);
294 (15,9);
) R la eIn n ity(% 365 (9,4);
234 (7,5);
e tiv te s СН3С(О)– 19,41 72 (5,5);
233 (5,4);
251 (5,1);
249 (4,5);
219 (3,9) 71 97 8 155 V: 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 R1= –CH2OX m /z R2= –CH3 R3 = – 323 (100);
324 (27,1);
73 (10,8);
395 (9,4);
) R la eIn n ity(% e tiv te s 325 (7);
234 (5,9);
(СН3)3Si– 18,39 (5,2);
233 (4,9);
(3,1);
218 (3,1);
(2,8) 233 73 91 8 50 100 150 200 250 300 350 m/z 251 (100);
293 (19,2);
e tiv te sity ) R la eIn n (% VIII: 252 (16,8);
365 (12);
R1= –CH3 235 (11,2);
72 (10,4);
СН3С(О)– 19,87 R2= –CH3 250 (5,6);
249 (4,8);
R3 = –OH 236 (4);
313 (2);
(3) 16 44 127 167 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 m /z VIII: R1= –CH3 323 (100);
324 (25,6);
R2= –CH3 73 (11,2);
395 (8,8);
R3 = –OH 325 (7,2);
307 (4);
) R la eIn n ity(% e tiv te s (4);
251 (3,2);
321 (3);
(СН3)3Si– 18,93 396 (3);
45 (2);
(2);
233 (1);
308 (2);
248 (1);
249 (1);
(1);
380 (1) 85 128 154 206 50 100 150 200 250 300 m/z 279 (100);
351 (26,4);
) R la eIn n ity(% e tiv te s 251 (25,6);
280 (16);
СН3СН2– 19,04 301 (11,2);
235 (8);
72;
92 159 125 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 m/z VI: 279 (100);
219 (29,1);
) R la eIn n ity(% e tiv te s R1= –CH3 280 (21,5);
220 (15);
СН3– 20,00 R2= –CОOX 351 (13,1);
92 (4,7);
R3 = – 72 (4,1);
65 (4,1) 8 143 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 m /z 397 (100);
219 (23,3);
) R la eIn n ity(% e tiv te s 398 (22);
220 (12,5);
СF3CF2СН2– 17,28 469 (9,4);
72 (3,8);
(3,3) 16 72 92 8 205 165 VI:
50 100 150 200 250 300 350 400 R1= –CH3 m/z R2= –CОOX R3 = – 337 (100);
338 (26,7);
73 (24);
219 (17);
) R la eIn n ity(% e tiv te s (14,3);
409 (13);
(СН3)3Si– 22,08 (11,6);
221 (8,4);
(7,8);
394 (7,8);
(7,7);
124 (7,4) 124 8 50 100 150 200 250 300 350 m/z VII: 279 (100);
280 (20,3);
) R la eIn n ity (% R1= –CООX 351 (11,1);
219 (6,4);
e tiv te s СН3– R2= –CH3 18,97 263 (4,5);
264 (3,9);
R3 = – 72 (3,5);
277 (3,2);
220 (2,9) 57 72 127 8 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 m /z VII: R1= –CООX R2= –CH3 R3 = – ) Relative Intensity (% 397 (100);
398 (21,2);
469 (9,6);
219 (6,3);
СF3CF2СН2– 16,52 72 (5,4);
381 (4,6);
220 (4,5);
205 (2,7) 16 72 205 8 103 128 50 100 150 200 250 300 350 400 m/z 337 (100);
338 (26,5);
409 (8,7);
339 (7,1);
Relative Intensity (%) 219 (6,4);
220 (6,1);
(СН3)3Si– 19,96 72 (5,6);
73 (5,5);
(3,2);
394 (3,1);
(2,8);
322 (2,8);
(2,5) 73 265 8 50 100 150 200 250 300 350 m/z Глава 4. Моделирование оптимальных условий ТФЭ для совместного изолирования золпидема и его метаболитов из мочи Для определения оптимальных условий совместного извлечения золпидема и его метаболитов, различающихся между собой физико химическими свойствами, применялись методы планирования многофакторных экспериментов, статистической обработки полученных данных и поисковой оптимизации. Исследование проводилось в два этапа, при этом оценивалось влияние основных существенных факторов при проведении ТФЭ на эффективность совместного изолирования золпидема и его метаболитов из мочи: значение pH фосфатного буфера, используемого на многих этапах ТФЭ;
концентрация уксусной кислоты, применяемой для промывки сорбента после загрузки образца – СУК;
объем элюента – Vэ и соотношение компонентов в его составе – El;
концентрация метанола – СMeOH и его объем VMeOH.
Оптимизировали методику проведения ТФЭ, представленную в Таблице 2 (она применялась на первоначальном этапе идентификации метаболитов золпидема в образцах реальной мочи).
Для исследования применяли 3-факторный 3-уровневый план Бокса Бенкена, позволяющий минимизировать число экспериментов, что привело к сокращению времени, потраченного на исследования, и уменьшению материальных затрат. Параметры искомой оптимизации находили путем построения поверхностей отклика, находящихся в пределах заданного нами факторного пространства, после математической обработки полученных результатов с помощью пакета прикладных программ STATISTICA 6.1. При этом выявлялись статистически значимые факторы, влияющие на величину аналитического сигнала (АС). Было установлено, что варьирование факторов проведения ТФЭ статистически значимо влияет на АС только золпидема и его кислотных метаболитов и индифферентно для его гидроксиметаболитов.
Полученные поверхности отклика позволили наглядно оценить наилучшее сочетание параметров проведения ТФЭ для исследуемых веществ, которое соответствует области поверхности, принимающей максимальное значение.
Наглядно полученные значимые результаты представлены на рис. 3-8. Данные графические трехмерные изображения позволяют оценить взаимодействие двух различных факторов, которые влияют на АС, при фиксированной величине третьего фактора. В результате анализа построенных поверхностей отклика были сформулированы параметры искомой оптимизации:
Кондиционирование сорбента патрона: 1/15М фосфатный буфер в диапазоне pH от 4,8 до 6,0;
Промывка сорбента после загрузки образца:
• 1/15М фосфатный буфер в диапазоне pH от 4,8 до 6,0;
• 0,01-0,1 М уксусной кислоты;
• 3 мл 50% раствора метанола (данная манипуляция заменяет два этапа в исходной методике – Таблица 1).
Элюирование смесью дихлорметан–2-пропанол–25% аммиак (2:1:0,1) по 2 мл (вместо элюирования этой смесью с соотношением (4:1:0,1) по 3 мл, таким образом, увеличение силы элюента позволило сократить его объем).
Рисунок 3 – Поверхность отклика для факторов pH и Рисунок 4 – Поверхность отклика для факторов объема элюента (метаболит VI) объема и концентрации метанола (золпидем) Рисунок 5 – Поверхность отклика для факторов Рисунок 6 – Поверхность отклика для объема концентрации метанола и состава элюента (золпидем) метанола и состава элюента (метаболит VI) Рисунок 7 – Поверхность отклика для объема и Рисунок 8 – Поверхность отклика для концентрации метанола (метаболит VII) концентрации метанола и состава элюента (метаболит VII) По результатам нахождения оптимальных значений варьировавшихся в исследовании факторов (pH, СУК, Vэ, El, СMeOH, VMeOH) была сформулирована следующая методика ТФЭ золпидема и его метаболитов из мочи: к 2 мочи прибавляли 0,5 мл 1/15 М фосфатного буфера рН 6,0, 0,1 мл -глюкуронидазы (10140 ЕД), перемешивали, герметично укупоривали и экспонировали в течение 2 часов при 45 оС. Полученный гидролизат центрифугировали при об/мин в течение 5 минут. Центрифугат отделяли от осадка, прибавляли 2,5 мл 1/15 М фосфатного буфера (pH 5,4) и подвергали ТФЭ по схеме:
кондиционирование сорбента осуществляли последовательным промыванием мл 95 % этанола и 2 мл 1/15 М фосфатного буфера рН 5,4. Загрузку анализируемого образца мочи осуществляли со скоростью 1,0 мл/мин, после чего промывали сорбент последовательным пропусканием через него растворов объемами по 1 мл: 1/15 М фосфатного буфера рН 5,4;
0,1 М раствора уксусной кислоты и 3 мл 50% раствора метанола в воде. Элюирование осуществляли в отдельный флакон со скоростью 1,0 мл/мин смесью дихлорметан–2-пропанол– 25% раствор аммиака (2:1:0,1) дважды порциями по 2 мл. Элюат испаряли досуха в токе азота при 60 оС.
Глава 5. Количественное определение золпидема в цельной крови и моче Количественное определение золпидема проводили методом внутреннего стандарта (ВС), в качестве которого использовали имипрамина гидрохлорид (рисунок 9). Калибровочные стандарты были получены добавлением:
а) к 2 мл «холостой» пробы мочи этанольных растворов, содержащих по 50;
100;
200;
500 и 1000 нг золпидема;
б) к 0,5 мл «холостой» пробы цельной крови этанольных растворов, содержащих по 20;
75;
125;
250 и 750 нг золпидема.
Во все пробы добавляли имипрамина гидрохлорида в количестве 500 нг.
Исследовались по две пробы для каждой концентрации. Все пробы мочи подвергались ТФЭ на патронах Sampli Q Evidex по оптимизированной нами методике. Пробоподготовку крови проводили по следующей методике: к калибровочным стандартам крови прибавляли по 3 мл 1/15 М фосфатного буфера рН 5,4 и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут. Далее проводили ТФЭ по схеме: кондиционирование сорбента осуществляли последовательным промыванием по 2 мл 95 % этанола и по 2 мл 1/15 М фосфатного буфера рН 5,4. Загрузку анализируемых образцов крови осуществляли со скоростью 1,0 мл/мин, после чего промывали сорбент последовательным пропусканием через него растворов объемами по 1 мл: 1/ М фосфатного буфера рН 5,4;
0,1 М раствора уксусной кислоты и 10% этанола.
Элюирование первоначально осуществляли смесью этилацетат–н-гексан (1:3) дважды порциями по 2 мл (элюат I – отбрасываем) и далее промывали патроны по 2 мл метанола. Последующее элюирование проводили в отдельные флаконы со скоростью 1,0 мл/мин смесью дихлорметан–2-пропанол–25% раствор аммиака (4:1:0,1) дважды порциями по 2 мл (элюат II). Элюат II испаряли досуха в токе азота при 60 оС. Условия хроматографического разделения:
температура испарителя хроматографа и интерфейса детектора – 300 и 280оС.
Температура колонки: начальная 70оС в течение 1 мин и прогрев до 230оС со скоростью программирования 40 град/мин;
затем прогрев до 300оС со скоростью программирования 20 град/мин;
выдержка при конечной температуре 2,5 мин. Регистрация масс-спектров проводилась в режиме селективного ионного мониторинга (SIM) по ионам с величинами m/z для золпидема – 235, 307, 219;
для имипрамина (ВС) – 234, 235, 280. Для количественного определения были использованы величины площадей пиков ионных фрагментов со 100% интенсивностью в спектре (234 – для имипрамина и 235 – для золпидема). Ионные фрагменты m/z 307, 219 (золпидем) и 235, (ВС) были использованы для подтверждения идентификации. Калибровочные графики представлены на рисунке 10.
9. 1. 7. 0. 0. Relative Intensity 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11. Retention Time (min) Рисунок 9 – Хроматограмма модельной смеси мочи, содержащей золпидем (9,736 мин – время удерживания) и внутренний стандарт имипрамин (7,394 мин) Эффективность экстракции золпидема из модельной крови и мочи определяли на трех уровнях концентраций для каждого объекта, при этом выход исследуемого вещества наблюдался в пределах 96-98,8% для крови и 98,6-108,4% для мочи.
Zolpidem Zolpidem Response Ratio Response Ratio 0 0 0.5 1 1.5 0 0.2 0. Concentration Ratio Concentration Ratio нг/мл нг/мл Рисунок 10 – Калибровочные графики для количественного определения золпидема в крови r2 – 0,999 (слева) и в моче r2 – 0,998 (справа) Методики были валидированы, при этом была доказана их специфичность, проведено определение пределов обнаружения (ПО) и пределов количественного определения (ПКО) расчетным путем с использованием величин стандартного отклонении аналитического сигнала (S) и тангенса угла наклона (b) калибровочных прямых, построенных путем добавления калибровочных уровней к основным графикам вблизи предполагаемых ПО и ПКО (Рисунок 11). Расчеты проводили по формулам:
S S ;
ПКО = ПО = 3, b b Var2 vs. Var Var2 = -,0978 +,00803 * Var Корреляция : r =, АС - -200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Концентрация золпидема в крови, нг/мл 95% доверит.
Var1 vs. Var Var1 = -,1326 +,01740 * Var Корреляция : r =, АС 95% доверит.
- -100 0 100 200 300 400 500 Концентрация золпидема в моче, нг/мл Рисунок 11 – Калибровочные графики для крови и мочи (определение ПО и ПКО) ПО в крови составил 24,0 нг/мл;
в моче – 13,2 нг/мл;
ПКО в крови – 72, нг/мл;
в моче – 40 нг/мл. Аналитическая область методики определения золпидема в моче – 40-500 нг/мл, в крови – 70-1500 нг/мл, при этом нижние уровни концентраций золпидема ограничиваются найденными для него ПКО, определенных для разных биожидкостей. Правильность и прецизионность (повторяемость и промежуточную прецизионность) методик определяли на трех уровнях концентраций золпидема в биожидкостях (150-1500 нг/мл для крови и 50-400 нг/мл для мочи). При статистической обработке определено, что результаты, полученные по описанным методикам, являются правильными, т.к найденные значения концентраций, принимаемые за истинные, лежали внутри доверительного интервала соответствующего среднего результата анализа, и находятся в пределах приемлемости, т.к. при оценке прецизионности коэффициент вариации был менее 15%.
На основе проведенных экспериментальных исследований по разработке условий изолирования, идентификации и количественного определения нами составлена схема для ХТА золпидема и его метаболитов с применением методов ТФЭ и ГХ/МС (рисунок – 12).
Кровь Моча (0,5 мл) (2 мл) +3 мл 1/15 М фосфатного Ферментативный гидролиз (для качественного обнаружения метаболитов Без гидролиза (для количественного буферного раствора pH 5, золпидема) + 0,5 мл 1/15 М фосфатного буферного раствора с pH 5,4 + 0, центрифугирование 10 мин при определения) мл -глюкуронидазы 2 ч при 45оС центрифугирование 5 мин при 3000 об/мин +1 мл 1/15 М фосфатного буферного раствора об/мин +2,5 мл 1/15 М фосфатного буферного раствора pH 5,4 pH 5, ТФЭ ТФЭ Кондиционирование (2 мл 95%-ного этанола и 2 мл 1/15 М фосфатного буферного Кондиционирование (2 мл 95%-ного этанола и 2 мл 1/15 М фосфатного буферного раствора pH 5,4 загрузка образца 1,0 мл/мин промывка сорбента (1 мл 1/15М раствора pH 5,4 загрузка образца 1,0 мл/мин промывка сорбента (1 мл 1/ фосфатного буферного раствора pH 5,4;
1 мл 0,1 М уксусной кислоты и 1 мл 10%-ного М фосфатного буферного раствора pH 5,4;
1 мл 0,1 М уксусной кислоты и 3 мл этанола) элюирование I смесью н-гексан–этилацетат (3:1) 2 раза по 2 мл (элюат I – 50%-ного метанола) элюирование (1,0 мл/мин) смесью дихлорметан–2 отбрасываем) элюирование II (1,0 мл/мин) смесью дихлорметан–2-пропанол–25%- пропанол–25%-ный раствор аммиака (2:1:0,1) 2 раза по 2 мл ный раствор аммиака (4:1:0,1) 2 раза по 2 мл Качественное и количественное определения Качественное определение Количественное определение Получение производных метаболитов золпидема и продукта его деструкции Ацетилирование Метилирование (алкилирование йодистым метилом) сухой остаток + 40 мкл безводного пиридина и 60 мкл уксусного ангидрида сухой остаток + 20-25 мг К2СО3, 500 мкл безводного ацетона, 40 мкл йодистого метила 45 мин при 60оС 5 мин при облучении СВЧ 560 Вт Силилирование Алкилирование пентафторпропанолом сухой остаток + 100 мкл БСТФА, содержащего 1% об. триметилхлорсилана сухой остаток + 25 мкл 2,2,3,3,3-пентафторпропанола и 75 мкл 2,2,3,3,3 мин при 80 оС пентафторпропионового ангидрида 5 мин при облучении СВЧ (560 Вт) Рисунок 12 – Схема ХТА золпидема и его метаболитов с применением методов ТФЭ и ГХ/МС ОБЩИЕ ВЫВОДЫ 1. Для извлечения золпидема и его метаболитов из биологических жидкостей применен метод ТФЭ, который позволил эффективно изолировать аналиты, значительно различающиеся по физико-химическим характеристикам.
2. На основе изучения характера масс-фрагментации полученных различных дериватов основных метаболитов золпидема (метильных, этильных, ацетильных, пентафторпропионильных и триметилсилильных) под действием электронного удара (70 эВ), обработаны и описаны их масс-спектральные характеристики, дополненные газохроматографическими данными.
Полученные сведения суммированы и приведены в единую систему, что ранее не встречалось в отечественной и доступной зарубежной литературе.
3. Составлена схема метаболизма золпидема в организме человека.
4. Проведена в два этапа оптимизация процедур ТФЭ методом математического планирования эксперимента с применением 3-х факторного 3 х уровневого плана. Компьютерное моделирование Бокса-Бенкена позволило определить оптимальные значения варьировавшихся в исследовании факторов, а также оценить эффекты их взаимодействий при минимальной затрате времени и лабораторных ресурсов.
5. На основе полученных оптимизационных данных предложена методика для количественного определения золпидема в крови и моче методом ГХ/МС с применением в качестве внутреннего стандарта имипрамина гидрохлорида.
6. Установлены валидационные характеристики предложенных методик по показателям специфичность, предел обнаружения, предел количественного определения, линейность, аналитическая область методики, правильность, прецизионность (повторяемость и внутрилабораторная прецизионность), показано их соответствие требованиям валидации.
7. Доказано, что применение предложенных методик количественного определения золпидема в образцах цельной крови и мочи, позволяет с высокой степенью эффективности (близкой к 100%) проводить экстракцию данного вещества из биологических жидкостей.
8. Составлена схема определения золпидема, его метаболитов и продукта гидролиза в образцах цельной крови и мочи с применением ТФЭ и ГХ/МС. Она может быть применена в практике клинико-диагностических и судебно-химических лабораторий, имеющих соответствующее приборное оснащение.
По теме диссертации опубликованы следующие работы:
Исследование экстракции золпидема из водных растворов / Е.А. Шилова, 1.
С.С. Катаев, Н.Б. Зеленина, Ю.А. Хомов, Е.И. Егорова, Н.В. Кокшарова // Достижения и перспективы в области создания новых лекарственных средств.
Рос. науч.-практ. конф., посвящ. 70-летию ПГФА: материалы… – Пермь, 2007. – С. 236-241.
Шилова, Е.А. Изучение условий совместной экстракции золпидема и его 2.
главного метаболита // Вестник ПГФА. – Пермь. – 2008. – №4. – С. 200-201.
Изолирование золпидема и его основного метаболита методом 3.
твердофазной экстракции / Е.А. Шилова, С.С. Катаев, Н.Б. Зеленина, Ю.А.
Хомов, Е.И. Егорова, Н.В. Кокшарова // Проблемы экспертизы в медицине. – 2008. – Т. 8. – №1. – С. 37-40.
Шилова, Е.А. Количественное определение золпидема в моче методом 4.
газовой хроматографии масс-спектрометрии / Е.А. Шилова, Е.И. Егорова // Вестник ПГФА. – Пермь. – 2009. – №5. – С. 165-167.
Химико-токсикологический анализ золпидема / Ю.А. Хомов, Е.И.
5.
Егорова, Н.В. Кокшарова, Е.А. Шилова // Вестник РУДН, серия Медицина. – 2009. – №4. – С. 469-473.
Крылова, Е.А. Исследование золпидема в образцах реальной мочи на 6.
уровне терапевтических доз / Е.А. Крылова, Ю.А. Хомов, С.С. Катаев // Вестник РУДН, серия Медицина. – 2010. – №6. – С. 269-272.
Крылова, Е.А. ГХ/МС определение золпидема в крови / Е.А. Крылова, 7.
Ю.А. Хомов, С.С. Катаев // Вестник РУДН, серия Медицина. – 2010. – №6. – С. 264-268.
Определение золпидема в моче пациентов с использованием методов 8.
ВЭТСХ, ВЭЖХ, УФ-, ГХ/МС спектрометрии / Ю.А. Хомов, Е.И. Егорова, Ю.Н.
Карпенко, Е.А. Крылова // Вестник ПГФА. – Пермь. – 2010. – №7. – С. 272-275.
Идентификация золпидема и его основных метаболитов в моче методом 9.
газовой хроматографии масс-спектрометрии / Е.А. Крылова, С.С. Катаев, Ю.А.
Хомов, Н.В. Кокшарова // «Актуальные вопросы судебно-медицинской науки и практики» Материалы науч.-практ. конф. с международным участием:
материалы… – Киров, 2010. – С. 288-392.
10. Крылова, Е.А. Способы доказательства метаболитов золпидема в моче // «Здоровье и образование в XXI веке». XII Международный конгресс:
материалы… – М., 2011. – С. 102.
11. Крылова, Е.А. Определение золпидема в образцах мочи при различных сроках хранения / Крылова Е.А., Харири В., Хомов Ю.А. // «Современные проблемы фармацевтической науки». Российская науч.-практ. конф. студентов и молодых ученых, посвящ. 75-летию ПГФА: Материалы… – Пермь, Вестник ПГФА. – 2012. – №9. – С. 141-142.
12. Hariri, B. L’influence du processus de putrifaction sur l’identification du zolpidem dans les bio-liquids / B. Hariri, E.A. Krylova, Y.A. Khomov // «Инновационные процессы в исследовательской и образовательной детельности». I Международн. науч. конф.: тез. докл. – Пермь, 2012. – С. 106 107.
13. Крылова, Е.А. Золпидем и его метаболиты как объекты химико токсикологического анализа и исследований для экспертных целей / Е.А.
Крылова, С.С. Катаев, Ю.А. Хомов // Наркология. – 2012. – №4. – С. 43-47.
14. Хомов, Ю.А. Изолирование, обнаружение и количественное определение золпидема в биологических жидкостях / Ю.А. Хомов, Е.А. Крылова, Е.И.
Егорова // Современные проблемы науки и образования. – 2012. – № (Электронный журнал) – URL: www.science-education.ru/102- 15. Крылова, Е.А. Изучение влияния процессов биодеградации на определение золпидема в моче / Е.А. Крылова, Ю.А. Хомов // Современные проблемы науки и образования. – 2012. – №3 (Электронный журнал) – URL:
www.science-education.ru/103- 16. Крылова, Е.А. Фармакокинетика и биотрансформация золпидема: анализ главных метаболитов (научный обзор) / Е.А. Крылова, Ю.А. Хомов // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – №2 (Электронный журнал) – URL: www.science-education.ru/108- 17. Крылова, Е.А. К метаболизму золпидема / Е.А. Крылова, Н. Деркауи, Ю.А. Хомов // Вестник ПГФА. – 2013. – С. 82-84.
18. Krylova, E.A. Gas chromatography mass-spectrometry for the identification of zolpidem hydroxylic and carboxylic metabolites in urine / E.A. Krylova, N. Derkaui // «Инновационные процессы в исследовательской и образовательной деятельности». II Международн. науч. конф.: тез. докл. – Пермь, 2013. – С. 75 76.
19. Krylova, Е.А. Determination of zolpidem and its metabolites by Chromatography Mass-Spectrometry / E.A. Krylova, S.S. Kataev, Y.A. Khomov // Journal of Analytical Chemistry. – 2013. – Vol. 68, №8. – P. 724-731.
Автор выражает признательность и глубокую благодарность заведующему судебно-химического отделения Пермского краевого бюро судебно-медицинской экспертизы к.х.н. Катаеву С.С. за оказанную помощь на всех этапах работы над диссертацией, а также сотруднику ГКУЗОТ «ПКБ СМЭ» Зелениной Н.Б. за помощь при выполнении экспериментальной части работы.
Крылова Елена Анатольевна (Россия) Метод газовой хроматографии – масс-спектрометрии при анализе золпидема и его метаболитов в биологических жидкостях для экспертных целей В результате проведенных исследований изолированы и идентифицированы основные метаболиты золпидема в виде их производных с помощью методов ТФЭ и ГХ/МС. Подробно описаны их газохроматографические и масс-спектральные характеристики. Составлена схема метаболизма золпидема. Определены оптимальные условия ТФЭ золпидема совместно с его метаболитами из мочи с применением 3-х факторных 3-х уровневых планов Бокса-Бенкена. Разработаны методики количественного определения золпидема в цельной крови и моче. Данные методики были валидированы по показателям специфичности, предела обнаружения, предела количественного определения, линейности, аналитической области методики, правильности, прецизионности. Предложена схема химико-токсикологического анализа золпидема и его метаболитов в биологических жидкостях.
Krylova Elena (Russia) The gas chromatography – mass spectrometry for analysis of zolpidem and its metabolites in biological fluids for expert perposes As a result of conducted research the basic metabolites of zolpidem were extracted and identified in the form of their derivates with the help of SPE and GC/MS. The gas chromatographic and mass spectral characteristics are detailed described. The scheme of the metabolism of zolpidem is drawn up. The optimal conditions of SPE of zolpidem combined with its metabolites from urine are determined by the application of three-factors and three-levels Box-Behnken design.
The methods of quantitative determination of zolpidem in whole blood and urine are developed. These methods were validated on specificity, limits of determination and quantification, linearity, analytical range, accuracy, precision. The scheme of chemical and toxicological analysis of zolpidem and its metabolites in biological fluids is also suggested.
Подписано в печать 30.09.2013. Формат 6090/16.
Усл. печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ № 2047/2013.
Отпечатано c готового оригинал-макета в типографии издательства Пермского национального исследовательского политехнического университета.
Адрес: 614990, г. Пермь, Комсомольский пр., 29, к. 113.
Тел. (342) 219-80-33.