Разработка оптических методов исследования объектов с дифракционным и субдифракционным пространственным разрешением

На правах рукописи

ПАРФЕНОВ Петр Сергеевич РАЗРАБОТКА ОПТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ОБЪЕКТОВ С ДИФРАКЦИОННЫМ И СУБДИФРАКЦИОННЫМ ПРОСТРАНСТВЕННЫМ РАЗРЕШЕНИЕМ 01.04.05 – Оптика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Санкт-Петербург 2008

Работа выполнена в ФГУП "Научно-производственная корпорация "Государственный оптический институт им. С. И. Вавилова" доктор физико-математических наук Научные руководители:

Баранов Александр Васильевич доктор технических наук Шилов Валерий Борисович доктор технических наук

Официальные оппоненты:

Горбунов Георгий Георгиевич доктор физико-математических наук Полищук Владимир Анатольевич Институт аналитического приборостроения

Ведущая организация:

РАН

Защита диссертации состоится «03» декабря 2008 г. в _ часов на заседании диссертационного совета Д 407.001.01 ФГУП "НПК "Государственный оптический институт им. С.И. Вавилова", расположенного по адресу: 199034, г. Санкт-Петербург, Биржевая линия, д. 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан «_» _ 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор физ.-мат. наук, профессор Данилов В. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Одной из важнейших задач современной оптики является разработка но вых научно-технических подходов к созданию спектральных оптических при боров и методов исследования объектов с дифракционным и субдифракционным пространственным разрешением. Диссертационная работа посвящена развитию перспективных направлений современной оптической микроскопии: характеризации параметров различных материалов с субдифрак ционным пространственным разрешением с помощью ближнепольной микро скопии и экспресс-диагностики объектов с использованием «биочиповых» структур. В первом случае используется анализ спектров люминесценции и/или комбинационного (рамановского) рассеяния света [1], а во втором – параллель ный анализ люминесцентных свойств массива характеризуемых объектов [2, 3].

Эти методы являются одними из наиболее перспективных при физических, хи мических и биологических исследованиях, а также в медицинских приложени ях, что обусловлено их высокой чувствительностью и информативностью.

Оптическая диагностика со сверхвысоким пространственным разрешением крайне важна для наноиндустрии, поскольку позволяет контролировать такие параметры наноструктур как размер, форма и взаимное расположение, а также химический состав и наличие локальных механических напряжений. Аналогич ным пространственным разрешением должны обладать и методы контроля эле ментной структуры современных интегральных схем и интегральных схем ближайшего будущего.

Пространственное разрешение обычных люминесцентных и рамановских микроскопов ограничено дифракционным пределом. В связи с этим они не по зволяют проводить измерения с разрешением лучше 250 нм и дают лишь про странственно усредненную спектральную информацию. Поэтому исследования различных структур с более высоким пространственным разрешением обычно выполняются методами электронной микроскопии, зачастую требующей при менения разрушающих методов пробоподготовки или приводящей в процессе измерения к повреждению или разрушению образцов. Пространственный рель еф планарных структур может быть исследован с использованием туннельных и атомно-силовых микроскопов, которые позволяют получить субнанометровое разрешение (вплоть до отдельных молекул), однако с их помощью не удается провести химическую идентификацию структурных элементов. Кроме того, как анализируемые биомолекулы, так и наноструктуры часто внедрены в различ ные матрицы (мембраны, диэлектрические и полупроводниковые слои и т.п.), и характеризовать их геометрические параметры с помощью атомно-силовой микроскопии становится невозможно.

Одновременно решить проблемы повышения пространственного разре шения вплоть до 20-50 нм и химической идентификации структурных элемен тов в оптическом диапазоне длин волн возможно путем объединения методов ближнепольной микроскопии, люминесцентного и рамановского анализа [4].

Ближнепольный рамановский и люминесцентный микроскопы позволяют ви зуализировать отдельные белковые молекулы в клеточной мембране, опреде лить форму, химический состав и внутренние напряжения в наноструктурах, включая полупроводниковые наноструктуры. Поэтому разработка методов и аппаратуры для проведения люминесцентных и рамановских исследований на наномасштабном уровне является одной из актуальных задач современной на ноиндустрии.

Ближнепольная оптическая микроскопия с использованием волоконно оптических зондов имеет существенные недостатки. Для достижения наномет рового пространственного разрешения необходимо использовать зонды с малой апертурой, что приводит к резкому падению интенсивности возбуждающего света, передаваемого по волоконному волноводу. Кроме того, с увеличением пространственного разрешения интенсивности оптических сигналов уменьша ются, т.к. они собираются со всё меньших объемов исследуемого образца. Дан ные потери не могут быть компенсированы простым увеличением интенсивности возбуждающего излучения, поскольку при этом происходит ра зогрев и разрушение зонда. Эти проблемы особенно важны для регистрации рамановских спектров наноструктур, так как интенсивность рассеянного света много меньше интенсивности люминесценции. Одним из способов их решения является с использование металлических заостренных зондов (с радиусом кри визны острия 10-50 нм). Наличие металлического зонда приводит к резкому усилению оптического поля вблизи его острия при освещении зонда оптиче ским излучением, резонансно возбуждающим локальные плазмоны острия [5].

Характерный размер области локализации усиленного поля примерно равен ра диусу кривизны острия, что определяет пространственное разрешение метода.

Важной задачей, связанной с повышением чувствительности измерений с по мощью ближнепольных рамановских и люминесцентных спектрометров, явля ется также выбор оптимальных схем освещения и детектирования. При создании таких приборов необходимо также решить задачи стабилизации рас стояния «зонд-образец», изготовления и оптимизации механических, геометри ческих и оптических параметров зондов, а также разработки аналитических методов обработки получаемой спектроскопический информации.

Микролюминесцентный анализ «биочиповых» структур с большим мас сивом одновременно анализируемых ячеек является перспективным методом оптического экспресс-контроля [2, 3]. Необходимость дальнейшего увеличения скорости определений, требующее увеличения числа одновременно анализи руемых ячеек, поставило актуальную задачу разработки адекватной оптической техники анализа «биочиповых» структур нового поколения.

Целью работы является разработка методов люминесцентной и раманов ской микроскопии исследования объектов с дифракционным и субдифракцион ным пространственным разрешением и их техническая реализация:

безапертурная ближнепольная микроскопия и экспресс-диагностика «биочипо вых» структур.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие зада чи:

1. Проанализировать возможности технической реализации и разработать принципиальную схему безапертурного рамановского и люминесцентного спектрометра ближнего поля, использующего эффект локального усиления оптических полей вблизи острия металлических зондов.

2. Разработать методы изготовления металлических зондов и определения их резонансных оптических характеристик.

3. Исследовать особенности реализации и разработать аппаратурные принципы построения системы регулирования расстояния «зонд-образец» для ближне польных зондовых микроскопов.

4. Разработать метод сопряжения систем позиционирования спектрометра ближнего поля, позволяющий совместить плоскость образца, вершину зонда и центр сфокусированного лазерного луча.

5. Разработать методику регистрации оптического сигнала спектрометра ближнего поля при работе в одноканальном режиме счета фотонов, а также разработать алгоритм управления работы в указанном режиме.

6. Разработать метод микролюминесцентного анализа «биочиповых» структур с большим массивом одновременно анализируемых ячеек (15х20).

Научная новизна работы заключается в том, что в ней впервые:

– исследованы особенности конкуренции гравитационных и капиллярных сил в процессе электрохимического травления, используемого при изготовлении металлических зондов с радиусом кривизны острия менее 15 нм;

– предложен метод определения резонансных оптических характеристик се ребряных и золотых зондов для ближнепольного микроскопа, основанный на регистрации спектра рассеяния зонда и определении спектрального положе ния максимума рассеяния;

– предложен оригинальный метод возбуждения и детектирования люминес ценции, позволяющий получать изображения и проводить параллельный анализ большого массива ячеек биочипа.

Практическая ценность работы заключается в разработке:

– принципиальной схемы безапертурного рамановского и люминесцентного спектрометра ближнего поля для исследования и характеризации как про зрачных, так и непрозрачных образцов с пространственным разрешением до 50 нм;

– метода изготовления металлических зондов с радиусом острия до 15 нм трав лением на постоянном токе в капле электролита и определения их резонанс ных оптических характеристик;

– системы регулирования расстояния «зонд-образец», позволяющей поддержи вать расстояние в диапазоне 5-20 нм;

– системы сопряжения элементов взаимного позиционирования металлическо го острия и образца в поле лазерного излучения;

– алгоритма управления, программного обеспечения и методики регистрации оптического сигнала спектрометра ближнего поля при работе в одноканаль ном режиме счета фотонов;

– принципиальной схемы и изготовлении опытного образца видеоанализатора изображений для микролюминесцентного анализа «биочиповых» структур с большим массивом одновременно анализируемых ячеек.

На защиту выносятся 1. Принципиальная схема безапертурного рамановского и люминесцентного спектрометра ближнего поля для исследования и характеризации как прозрач ных, так и непрозрачных образцов с пространственным разрешением до 50 нм.

2. Метод изготовления металлических зондов для сканирующих ближнеполь ных микроскопов, позволяющий получать зонды с радиусом острия менее нм.

3. Метод определения резонансных оптических характеристик серебряных и золотых зондов для ближнепольного микроскопа, основанный на регистрации спектра рассеяния зонда и определении спектрального положения максимума рассеяния.

4. Система регулирования расстояния «зонд-образец», позволяющая поддержи вать расстояние в диапазоне 5-20 нм.

5. Система сопряжения элементов взаимного позиционирования металлическо го острия и образца в поле лазерного излучения.

6. Алгоритм управления спектрометром и программное обеспечение для реги страции оптических сигналов в одноканальном режиме счета фотонов.

7. Метод возбуждения и детектирования люминесценции биочипов, позволяю щий получать изображения и проводить параллельный анализ большого масси ва ячеек, и принципиальная схема видеоанализатора изображений.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертации докладывались на 15 российских и международных научных конференциях:

Optical micro- and nanotechnologies (Санкт-Петербург, 2002), FLAMN-07 (Санкт Петербург, 2007), ICSI-5 (2007, Марсель, Франция), Нейробиотелеком- (Санкт-Петербург, 2004), ежегодных НТК СПбГУТ (Санкт-Петербург, 2002 2006), НУМК СПбГУ ИТМО (Санкт-Петербург, 2003, 2005) и межвузовских КМУ (Санкт-Петербург, 2007, 2008).

Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в 14 пе чатных работах, список которых приведен в конце автореферата, в том числе работы опубликованы в изданиях, рекомендованных ВАК. По результатам ра боты получен 1 патент.

Результаты работы использовались во ФГУП "ГОИ им. С.И. Вавилова" в НИР "Создание экспериментального макета ближнепольного микроскопа для использования в прецизионном машиностроении" за 2002–2003 гг. и "Скани рующий люминесцентный микроскоп ближнего поля" за 2004 г., выполнявших ся по государственным контрактам №40.600.14.0011 и №40.600.11.0019 в рамках ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" на 2002–2006 гг., и в ОКР "Разработка и изготовле ние люминесцентных видеоанализаторов биочипов для диагностики генетиче ских и инфекционных заболеваний" за 2003–2004 гг., выполнявшейся по госу дарственному контракту №36.6656.11.0270 от 28.04.2003 в рамках ФЦП "Реформирование и развитие оборонно-промышленного комплекса (2002- гг.)", направление 3.

В СПбГУ ИТМО результаты работы использовались при выполнении Проекта аналитической ведомственной целевой программы "Развитие научного потенциала высшей школы (2006-2008)" РНП.2.1.1.1075 "Физические основы создания новых сверхвысокочувствительных люминесцентных сенсоров для экологчиеских и биомедицинских применений: эффекты переноса энергии фо товозбуждения в системах квантовая точка – молекула".

Соответствующие акты внедрения приложены к диссертации.

Личный вклад автора. Содержание диссертации и основные положе ния, выносимые на защиту, отражают персональный вклад автора в опублико ванные работы. Все представленные в диссертации результаты получены лично автором. Подготовка к публикациям полученных результатов проводилась со вместно с соавторами, причем вклад диссертанта был определяющим.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, заключения, списка литературы, включающего 113 наиме нований, и приложения. Основная часть работы изложена на 129 станицах ма шинописного текста. Работа содержит 70 рисунков и 2 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность научных исследований, прово димых в диссертационной работе, сформулированы цели и задачи работы, а также представлены выносимые на защиту основные научные результаты.

В первой главе проведен обзор основных микроскопических методов исследования объектов с дифракционным и субдифракционным пространст венным разрешением, таких как люминесцентная, атомно-силовая и ближне польная микроскопия. Показано, что для решения задач структурно химической характеризации объектов, а также определения механических на пряжений в них с пространственным разрешением до 10 нм необходимо ис пользование безапертурного сканирующего оптического микроскопа ближнего поля. Такой микроскоп, анализирующий как люминесцентный, так и раманов ский отклики, позволит решить эту задачу, как в физике полупроводников, так и в биологии. Делается вывод, что разработка методик и аппаратуры для прове дения люминесцентных и рамановских исследований на субдифракционном уровне является одной из актуальных задач современной оптической микро скопии.

Во второй главе, посвященной оптической микроскопии с субдифракци онным оптическим разрешением, рассматриваются технические вопросы реа лизации ближнепольной оптической спектроскопии, объединяющей возможности атомно-силовой микроскопии и оптической спектроскопии суб дифракционного пространственного разрешения.

Одним из вариантов реализации ближнепольной сканирующей микро скопии является туннельный сканирующий оптический микроскоп (ТСОМ). С точки зрения целей настоящей работы важно, что эта схема может быть приме нена для возбуждения люминесценции образца и ее спектрального анализа с пространственным разрешением нанометрового масштаба, определяемым ра диусом закругления вершины световода. Для проведения люминесцентных из мерений в рамках данной работы изготовлен макет ТСОМ, в конструкции которого использованы механические и электронные элементы растрового тун нельного профилографа, где металлическое острие заменено острием стеклово локонного световода, а также исследованы особенности его работы. Этот макет ТСОМ использовался в дальнейшем для регистрации резонансных оптических характеристик металлических зондов (серебряных и золотых).

Известно, что значительное повышение чувствительности рамановских и люминесцентных измерений достигается при использовании т.н. гигантского комбинационного рассеяния света (Surface-Enhanced Raman Scattering, SERS) и гигантской люминесценции. Ограниченное дифракционным пределом про странственное разрешение SERS преодолевается в случае использования тех ники безапертурной ближнепольной микроскопии, в которой эффект SERS реализован с помощью металлического заостренного зонда. Такая техника по лучила название усиленного острием рамановского рассеяния (Tip-Enhanced Raman Scattering, TERS). На основе техники TERS, эффекта гигантского усиле ния рассеяния и люминесценции реализована схема безапертурного ближне польного микроскопа-спектрометра. В этой схеме усиление оптического поля возникает вблизи острия металлического зонда атомно-силового или ближне польного сканирующего микроскопа.

В результате выполнения работы разработаны несколько вариантов прин ципиальной схемы построения рамановского спектрометра ближнего поля, предназначенных для проведения исследований образцов разного типа с ис пользованием оптических и металлических зондов, и проведено их сопоставле ние. На основе проведенного сравнения сделан вывод, что оптимальным вариантом является реализация схемы перенастраиваемого универсального ближнепольного спектрометра. В этом случае оказывается возможным на од ном приборе, обеспеченном пассивной виброзащитой, проводить исследования как прозрачных, так и непрозрачных объектов с использованием как апертур ных, так и безапертурных зондов. Такая схема позволяет использовать ближне польный спектрометр во всех режимах (на просвет и на отражение с возбуждением с помощью апертурного зонда, с совмещенными и раздельными каналами возбуждения и сбора излучения с помощью безапертурного зонда при работе с прозрачными и непрозрачными образцами) путем применения различ ных блоков возбуждения и сбора излучения, а также смены предметных столов и источников излучения.

Одним из ответственных элементов безапертурных ближнепольных микроскопов является металлический зонд с радиусом кривизны острия от еди ниц до нескольких десятков нанометров. Проанализированы существующие методы изготовления острий способом электрохимического травления, как наиболее распространенным, и на основе проведенного анализа предложено два метода изготовления металлических зондов из вольфрамовой проволоки.

Первый способ заключается в травлении вольфрамовой проволоки в капле рас твора щелочи в металлическом кольце на стабилизированном постоянном токе 6-12 мА – он обеспечивает получение острий с типичным радиусом 10-15 нм и конусностью около 35° (рис. 1). Такие острия по геометрическим параметрам подходят для работы в режиме электростатического усиления электромагнит ного поля. Новизна предлагаемого метода заключается в подборе режима и формы капли, при которой капиллярные силы компенсируют большую часть веса отрывающейся части, что позволяет получать острия с радиусом менее расчетного, равного 50 нм. Второй способ, заключающийся в травлении в объ еме жидкости при переменном напряжении 3-6 В, обеспечивает получение ост рий с вершиной радиусом около 60 нм и конусностью 15-20°. Острия, полученные этим способом, подходят для работы с SERS частицей, прикреп ленной к вершине. В обоих случаях используется прокаленная вольфрамовая проволока диаметром 0,15 мм и раствор 1M NaOH.

а) б) Рис. 1. Электронно-микроскопические изображения острий, полученных травлением в капле щелочи в кольце. а – радиус 14 нм, конусность 35°, длина 630 нм;

б – радиус 11 нм, конус ность 37°, длина 960 нм Также рассмотрены вспомогательные способы улучшения параметров острий – травление в два этапа с промежуточным переворачиванием на 180°, исследовано влияние на травление капиллярных сил и рассмотрен вопрос уда ления окислов с острия. Для достижения эффекта локального усиления оптиче ских полей при резонансном возбуждении поверхностных плазмонов сформированные острия покрывались пленкой золота или серебра толщиной в несколько нанометров путем вакуумного испарения или электролитического осаждения. При этом геометрические параметры острий практически не изме нялись.

Разработан способ регистрации оптической резонансной характеристики Ag и Au зондов, основанный на регистрации спектра рассеяния зонда и опреде лении спектрального положения максимума рассеяния при погружении верши ны острия в эванесцентное поле при полном внутреннем отражении (рис. 2).

Это позволяет контролировать спектральные характеристики рассеяния зонда, т.к. положение максимума соответствует наиболее эффективной резонансной генерации плазмонов, локализованных на вершине зонда, и определить длину волны, на которой реализуется точный резонанс оптического возбуждения ло кальных плазмонов, а интенсивность рассеяния и люминесценции в пробном объекте, помещенном вблизи вершины зонда, достигает максимального значе ния. Использование нерадиационного эванесцентного поля для возбуждения локальных плазмонов позволяет уменьшить фоновые засветки и делает воз можным получения спектров рассеивания.

Для воспроизводимого закрепления иглы под углом, нужным для реали зации максимального усиления [5], предложено как формировать острия, так и наносить на них покрытия уже после прикрепления к ножке кварцевого резона тора. Также это уменьшает риск повреждения острия иглы или её металличе ского покрытия в процессе закрепления иглы.

Задача стабилизации расстояния между исследуемым образцом и зондом с острием на конце решена наиболее распространенным способом – измерени ем тангенциальной составляющей силы физического взаимодействия острия с образцом. Для измерения величины атомно-силового взаимодействия выбран электромеханический способ возбуждения и регистрации колебаний с помо щью камертонного кварцевого резонатора, и исследовали режимы его работы, а также особенности реализации. Разработана схема синхронного детектора на основе устройства выборки-хранения, работающая на частоте 32 кГц, и на её основе – система регулирования расстояния «зонд-образец», позволяющая под держивать расстояние в диапазоне 5-20 нм.

Рис. 2. Схема устройства для регистрации спектра излучения, рассеянного зондом при помещении его в эванесцентное поле. 1 – ксеноновая лампа, 2 – призма, 3 – эванесцентное поле, 4 –исследуемый зонд, 5 – трехкоординатный пьезосканатор, 6 – система обратной связи, 7 – микрообъектив, 8 – спектрограф, 9 – ПЗС-приемник, 10 –компьютер При разработке рамановского спектрометра ближнего поля решена за дача сопряжения двух систем позиционирования, изначально предназначенных для автономной работы – сканирующего пьезостолика Flatscanner (Nanonics) и атомно-силовой головки Smena (NT-MDT). Благодаря использованию ряда до полнительных возможностей, нам удалось через высоковольтный делитель по дать управляющее напряжение атомно-силовой головки, являющееся усиленным топографическим сигналом, на аналоговый вход пьезостолика (рис.

3), позволив разделить часть функций между этими системами. В таком режиме атомно-силовая головка Smena обеспечивает горизонтальное перемещение зон да при юстировке, постоянно работающая система вертикального перемещения головки Smena обеспечивает постоянство расстояния зонд-образец (посредст вом механизма «shear-force»), а пьезостолик Flatscanner обеспечивает верти кальное перемещение образца при юстировке и горизонтальное перемещение во время сканирования. Общее управление сканированием образца, а также за пись и обработка полученных данных в этом режиме производится системой управления пьезостоликом без необходимости разработки дополнительного программного обеспечения. Проведенное сопряжение позволило совместить плоскость образца, вершину зонда и центр сфокусированного лазерного луча, поддерживая вершину зонда в центре светового пятна при сканировании.

Рис. 3. Схема сопряжения блоков атомно-силового микроскопа Solver-Bio и пьезостолика Nanonics через высоковольтный делитель Разрабатываемый ближнепольный спектрометр предназначен для полу чения рамановского изображения исследуемой наноструктуры с субдифракци онным пространственным разрешением и создания на его основе карт химического состава. В его состав входит спектрометр Acton SpectraPro 2558 с многоканальной системой регистрации (ПЗС-линейка), которая позволяет сразу регистрировать достаточно большой участок спектра, но мало подходит для по строения карт химического состава. Для получения пространственного распре деления отдельных линий рамановского спектра разработан одноканальный режим работы, в котором спектрометр Acton SpectraPro 2558 работает как мо нохроматор, а регистрация осуществляется охлаждаемым ФЭУ в режиме счета одиночных фотонов. Для реализации этого подхода предложены алгоритм управления и специализированное программное обеспечение, позволяющие со гласовать работу монохроматора и счетчика фотонов в одноканальном режиме для регистрации спектров.

В качестве детектора нами выбран фотоэлектронный умножитель ФЭУ 106, как обладающий малым уровнем собственных шумов, хорошей одноэлек тронной характеристикой, и большим динамическим диапазоном (до 107). Для усиления и счета одноэлектронных импульсов ФЭУ использованы широкопо лосный усилитель SR445A и счетчик фотонов SR400 (Stanford Research Со., США). Альтернативный вариант – однофотонные лавинные фотодиоды (SPCM AQR, EG&G;, Inc., Канада), отвергнут главным образом из-за большого уровня собственных шумов. Для счетчика SR400 критична не столько амплитуда им пульса, сколько временное разрешение и скорость нарастания фронта импульса (менее 2 нс), поэтому особое внимание уделено согласованию нагрузок и ста билизации напряжения на последних каскадах ФЭУ. Разработанная система приема сигнала позволяет регистрировать сигнал начиная с уровня отдельных фотонов при уровне шума единицы фотонов/с (при охлаждении до –40°С).

Для согласования работы монохроматора и счетчика фотонов разработан алгоритм управления и специализированное программное обеспечение (на ос нове Microsoft Visual C++ 6.0 с использованием библиотеки MFC), позволяю щие в одноканальном режиме регистрировать спектры рамановского рассеяния в диапазоне 150-3000 см-1 со спектральным разрешением ~5 см-1 при работе с лазерами 532 и 633 нм (рис. 4), и люминесценции в диапазоне 400-900 нм, а также перестраивать монохроматор для регистрации разных характерных полос в спектрах образцов с нанометровым пространственным разрешением. Реали зован вариант пошагового поворота дифракционной решетки со счетом сигнала в каждой точке, с выводом результатов на экран и возможностью сохранения данных. Возможно дальнейшее наращивание программных модулей, например, для реализации функций записи двухмерного распределения сигнала по иссле дуемому участку.

Рис. 4. Внешний вид окна программы управления. Приведен рамановский спектр крем ния с характерной полосой на 520 см-1 с полушириной 6 см- Результаты исследования усиленного острием рамановского рассеяния (TERS) от Ge/Si куполообразных точек, проведенного на разработанном спек трометре ближнего поля, показывают возможность химического анализа от дельных точек размером менее нм что подтверждает 50 (рис. 5), работоспособность выбранных решений.

Рис. 5. Исследование рамановского рассеяния Ge/Si точек. а – атомно-силовое изображе ние образца, линия показывает направление перемещение острия;

б – типичный набор ра мановских спектров, полученных при разных положениях острия: (1) – начальная точка сканирования, (2) – область Ge/Si точек (x=100 и 800 нм), (3) – TERS спектр Ge0.5Si0.5 точ ки x=100 со спектральным разрешением 4 см- Третья глава посвящена оптической микроскопии с дифракционным разрешением, а именно разработке аппаратуры для люминесцентного экспресс контроля «биочиповых» структур – видеоанализаторов. Обычно биочип пред ставляет собой нелюминесцирующую подложку, на которую нанесена матрица, содержащая от десятков до сотен ячеек диаметром порядка 100 мкм, располо женных на расстоянии нескольких сотен мкм друг от друга и содержащих им мобилизованные зонды. Люминесцентные видеоанализаторы должны обеспечивать регистрацию весьма слабого свечения отдельных ячеек, возни кающего из-за связывания окрашенных образцов с зондами, на достаточно большом поле с их строгой координатной привязкой для диагностики с помо щью ЭВМ.

Ранее в ГОИ им. С.И. Вавилова были разработаны портативные видео анализаторы биочипов, но развитие и совершенствование биочиповой техноло гии и требование увеличения скорости анализа привело к изменению ряда параметров биочипов. В связи с увеличением числа одновременно анализируе мых ячеек, приведшему к увеличению размеров матрицы с 3,5х4 мм2 до 5х мм2, а также переходом на новый краситель (Cy5 вместо Texas Red), изменени ем предельных концентраций (10 амоль красителя на ячейку вместо 30 амоль) и изменением способа нанесения матрицы (что повысило требования к центри ровке чипа), потребовалась разработка принципиальной схемы и создание опытного образца видеоанализатора изображений для микролюминесцентного анализа «биочиповых» структур с большим массивом одновременно анализи руемых ячеек.

Для разработки модели, соответствующей современным требованиям, сформулированы технические требования и разработана принципиальная схема прибора (рис. 6). Предложенная система освещения предусматривает освеще ние матрицы биочипа двумя полупроводниковыми лазерами с длиной волны 655 нм и мощностью 25 мВт через волоконно-оптические жгуты с осветитель ными наконечниками в форме лопатки и со случайным расположением волокон на торцах жгута, что позволяет достаточно равномерно осветить сравнительно большое поле матрицы биочипа и возбудить люминесценцию окрашенных яче ек. В результате тщательной настройки освещения удалось добиться равномер ности люминесценции по полю матрицы в допустимых пределах ±15%.

Рис. 6. Принципиальная оптическая схема люминесцентного видеоанализатора. 1 – кластер биочипа, 2 – лазеры, 3 – блоки питания, 4 – проекционный объектив, 5 – светофильтр, ПЗС-камера, 6 – 7 – компьютер, волоконно-оптические 8 – жгуты Особое внимание уделено важнейшему элементу проекционной системы – объективу. В результате сопоставления нескольких вариантов по сложности и технологичности выбран специально разработанный широкопольный высоко апертурный зеркально-линзово-призменный объектив 1х0,35, поле зрения ко торого (6х8 мм) соответствует размеру матрицы биочипа. Разрешающая способность объектива составляет 80-300 лин/мм и достаточна для работы с ячейками диаметром 100 мкм, а рабочее расстояние 15 мм упрощает настройку осветительной системы. Запирающий светофильтр выбран с учетом большой апертуры светового пучка (0,35), и, благодаря высокой скрещенности, позволя ет регистрировать весьма слабые сигналы, обеспечивая соотношение сиг нал/фон не менее 10. Разработанная система загрузки чипа обеспечивает точность позиционирования не хуже 4,5 мкм. Пороговая чувствительность при бора определена на уровне примерно 10 амоль красителя Cy5 на ячейку объе мом 0,2 нл, что вполне удовлетворяет требованиям к прибору подобного класса.

Проведены успешные лабораторные и эксплуатационные испытания, в т.ч. с диагностическими туберкулезными чипами, определяющими лекарствен но-устойчивые формы, что подтверждает работоспособность выбранного вари анта построения анализатора.

В заключении сформулированы основные результаты выполненной ра боты:

1. Разработана принципиальная схемы безапертурного рамановского и люми несцентного спектрометра ближнего поля, использующего эффект локаль ного усиления оптических полей вблизи острия металлических зондов для исследования и характеризации как прозрачных, так и непрозрачных образ цов с пространственным разрешением в 50 нм.

2. Разработан метод изготовления металлических зондов с радиусом острия менее 15 нм травлением на постоянном токе в капле электролита и исследо ваны особенности конкуренции гравитационных и капиллярных сил в про цессе электрохимического травления.

3. Предложен метод определения резонансных оптических характеристик се ребряных и золотых зондов для ближнепольного микроскопа, основанный на регистрации спектра рассеяния зонда и определении спектрального по ложения максимума рассеяния.

4. Разработана система регулирования расстояния «зонд-образец», позволяю щая поддерживать расстояние в диапазоне 5-20 нм.

5. Разработана система сопряжения элементов взаимного позиционирования металлического острия и образца в поле лазерного излучения, позволяющая совместить плоскость образца, вершину зонда и центр сфокусированного ла зерного луча.

6. Разработаны алгоритм управления, программное обеспечение и методика регистрации оптического сигнала спектрометра ближнего поля при работе в одноканальном режиме счета фотонов.

7. Предложен оригинальный метод возбуждения и детектирования люминес ценции, позволяющий получать изображения и проводить параллельный микролюминесцентный анализ большого массива ячеек биочипа (15х20), разработана принципиальная схема видеоанализатора, изготовлен опытный образец и проведены его испытания.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Voronin Yu.M., Ivanov M.M., Parfenov P.S., Toporcov S.A., Chentzov Yu.V.

Near-field scanning tunneling optical microscope // Proceedings of The First sci entific workshop-presentation «Optical micro- and nanotechnologies» / СПбГИТМО (ТУ), 2002. – С. 7-15.

2. Парфенов П.С., Баштанов А.В., Воронин Ю.М. Регистрация сил бокового сдвига в ближнепольной микроскопии // Труды учебных заведений связи. – 2004, № 170. – С. 113-116.

3. Воронин Ю.М., Иванов М.М., Парфенов П.С., Топорков С.А., Ченцов Ю.В.

Ближнепольный сканирующий туннельный оптический микроскоп // Извес тия вузов. Приборостроение. – 2004, том 47, №12. – С. 45-49.

4. Агроскин Л.С., Парфенов П.С., Барский И.Я., Воронин Ю.М., Барский В.Е.

Люминесцентный видеоанализатор биологических микрочипов // Оптиче ский журнал. – 2006, Т.73, №12. – С.47-50.

5. Баранов А.В., Виноградова Г.Н., Воронин Ю.М., Германова Н.М., Диденко И.А., Маслов В.Г., Орлова А.О., Парфенов П.С., Перлин Е.Ю., Петров В.И., Топорков С.А., Федоров А.В. Способ регистрации резонансной характери стики металлического зонда ближнего поля для рамановского наноспектро метра // Патент РФ на изобретение № 2319118 от 24.05.2006.

6. Баранов А.В., Виноградова Г.Н., Воронин Ю.М., Германова Н.М., Диденко И.А., Маслов В.Г., Орлова А.О., Парфенов П.С., Перлин Е.Ю., Петров В.И., Топорков С.А., Федоров А.В. Способ изготовления зонда для рамановского наноспектрометра // Заявка на изобретение № 2006134079 от 25.09.2006.

7. A.V. Baranov, A.V. Fedorov, Yu.M. Voronin, G.N. Vinogradova, P.S. Parfenov, A.A. Kim, T.S. Perova. TERS-based characterization of Si-Ge nanostructures //

Abstract

book of 5th International Conference on Silicon Epitaxy and Heterostruc tures, ICSI-5, May 20-24, 2007, Marseille, France. – 22Р 2-02.

8. I.D. Rukhlenko, A.V. Fedorov, A.V. Baranov, Yu.M. Voronin, G.N. Vinogra dova, P.S. Parfenov. Tip-enhanced secondary emission of semiconductor quan tum dots // Book of abstracts of Int. Conf. “Fundamentals of Laser Assisted Mi cro– & Nanotechnologies (FLAMN-07)”, St. Petersburg, Russia, June 25-28, 2007. – P. 92.

9. Парфенов П.С. Использование атомно-силового взаимодействия в люми несцентной нанооптике // 55-я научно-техническая конференция профессор ско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов:

материалы / СПб ГУТ. СПб, 2003. – С. 101.

10.Парфенов П.С. Применение синхронного детектирования для измерения величины силы бокового сдвига в ближнепольной оптической микроскопии // 56-я научно-техническая конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов: материалы / СПбГУТ. СПб, 2004. – С. 92.

11.Парфенов П.С. Высокоразрешающее исследование люминесцентно мече ных хромосом // 57-я юбилейная научно-техническая конференция профес сорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов:

материалы / СПбГУТ. СПб, 2005. – С. 118.

12.Парфенов П.С. Основные факторы, влияющие на процесс люминесценции молекул в ближнем поле // 58-я научно-техническая конференции профес сорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов: ма териалы / СПбГУТ. СПб, 2006. – С. 97.

13.Парфенов П.С. Организация сопряжения электронных блоков рамановского наноспектрометра // Сборник тезисов IV межвузовской конференции моло дых ученых. – СПб: СПбГУ ИТМО, 2007. – С. 52.

14.Парфенов П.С. Реализация одноканального счета фотонов для рамановско го наноспектрометра // Сборник тезисов V межвузовской конференции мо лодых ученых. – СПб: СПбГУ ИТМО, 2008. – С. 240.

Список цитируемой литературы 1. Raman Microscopy. Developments and Applications / Edited by: George Turrell and Jacques Corset. – США, Elsever, 1996. – P. 453.

2. Мирзабеков А.Д., Прокопенко Д.В., Чечеткин В.Р. Применение матричных биочипов с иммобилизованной ДНК в биологии и медицине. // В кн.: Ин формационные медико-биологические технологии / под ред. В.А. Княжева и К.В. Судакова. – ГЭОТАР-МЕД, Москва, 2002. – C. 166-198.

3. Барский В.Е., Колчинский А.М., Лысов Ю.П., Мирзабеков А.Д. Биологиче ские микрочипы, содержащие иммобилизованные в гидрогеле нуклеиновые кислоты, белки и другие соединения: свойства и приложения в геномике // Молекулярная биология. – 2002, Т.36, №4. – C. 563-584.

4. Progress in Nano-Electro-Optics I: Basics and Theory of Near-Field Optics / Ed.

Ohtsu M. // Springer Series in Optical Sciences. – 2003, Vol. 86. – P. 159.

5. Pettinger B., Picardi G., Schuster R., Ertl G. Surface-enhanced and STM tip enhanced Raman spectroscopy of CN ions at gold surfaces // Journal of Electro analytical Chemistry. – 2003, vol. 554. – P. 293-299.