Противоязвенные эффекты селанка и его фрагментов
на правах рукописи
ПАВЛОВ Тенгис Саналович ПРОТИВОЯЗВЕННЫЕ ЭФФЕКТЫ СЕЛАНКА И ЕГО ФРАГМЕНТОВ
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
03.00.13 – физиология, 02.00.10 – биоорганическая химия Москва – 2006
Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, заведующий – доктор биологических наук, профессор А.А. Каменский Научные руководители:
доктор биологических наук, профессор Г.Е. Самонина доктор химических наук Ю.А. Золотарев
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук, профессор Н.А. Тушмалова Доктор медицинских наук, профессор Р.У. Островская
Ведущая организация: НИИ нормальной физиологии РАМН
Защита состоится 25 декабря 2006 г. в 15 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д501.001.93 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу 119992 Москва, Ленинские Горы, Биологический факультет, ауд. М-1.
С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Биологического факультета МГУ.
Автореферат разослан
Ученый секретарь совета, доктор биологических наук Б.А. Умарова Актуальность проблемы.
Во всем мире активно исследуется уникальная роль регуляторных пептидов в жизнедеятельности организмов. Открываются новые семейства пептидов, изучаются их свойства. Одним из таких семейств являются глипролины – короткие пептиды, содержащие пролин и глицин. Широкий диапазон физиологических свойств глипролинов обратил на себя пристальное внимание отечественных и зарубежных ученых. Эти пептиды влияют на свертывающую систему крови, обладают противоязвенными свойствами, модулируют работу иммунной системы, оказывают влияние на деятельность центральной нервной системы (ЦНС) (Ашмарин И.П. и др., 2002). Глипролины также входят в состав регуляторных пептидов других семейств. Пептид Pro-Gly-Pro обладает рядом протекторных и лечебных свойств, повышая устойчивость организма к действию различных патогенных факторов – гипоксии и стрессу (Граф А.В. и др., 2006;
Бадмаева С.Е. и др., 2005;
Бадмаева К.Е., 2005;
Ашмарин И.П. и др., 1999;
Samonina G. et al., 2002). При присоединении Pro-Gly-Pro к другим олигопептидам с С-конца, он способен повышать устойчивость конечной молекулы к действию протеаз, дополнять, усиливать и/или изменять физиологические эффекты исходного пептида (Ashmarin I. et al., 2005). Это свойство трипептида используется для создания лекарственных средств на пептидной основе, например, семакса.
Таким же способом был получен гептапептид селанк, объединяющий структуры тафцина Thr-Lys-Pro-Arg и Pro-Gly-Pro. Тафцин – тетрапептид, выщепляемый in vivo из СН2-домена иммуноглобулина G – является иммуномодулятором, обладающим некоторым действием на ЦНС (Siemion I. et al., 1999). Глипролин Pro-Gly-Pro, фрагмент коллагена, известен как пептид, обладающий противоязвенной и антитромботической активностью (Ашмарин И.П. и др., 1997;
Lyapina L. et al., 2000). Селанк (Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro) оказался выраженным селективным анксиолитиком, лишенным ряда отрицательных побочных эффектов, присущих традиционным представителям этой группы лекарств.
В данный момент препарат прошел третью стадию клинических испытаний как анксиолитик. Разработка селанка как лекарственного средства стимулирует изучение влияния пептида на различные физиологические системы организма – кровесвертывание, сердечно сосудистую систему, поведение и обучение, а также поддержание гомеостаза слизистой оболочки желудка (СОЖ). Учитывая свойства тафцина и Pro-Gly-Pro можно было предположить, что селанк обладает и противоязвенными свойствами. Однако до настоящего времени влияние селанка на гомеостаз СОЖ не изучалось.
Язвенная болезнь желудка – полиэтиологическое заболевание, связанное с нарушением целостности его стенок и, прежде всего, – с нарушениями гомеостаза СОЖ (Рысс Е.С. и др., 1998). Несмотря на многообразие средств, предназначенных для фармакотерапии язвенной болезни, существуют определенные перспективные направления поиска противоязвенных препаратов. Наиболее важным является создание средств, действующих комплексно, на несколько механизмов патогенеза.
Механизмы развития нарушений гомеостаза слизистой оболочки желудка и, соответственно, язвенной болезни желудка условно можно разделить на два компонента - центральный и периферический. И хотя в целом организме эти механизмы тесно взаимосвязаны, вклад каждого из них в патогенез язвообразования может сильно варьировать в зависимости от конкретного случая заболевания.
Целью настоящей работы было выяснение роли селанка в поддержании гомеостаза слизистой оболочки желудка, выявлении его метаболитов и определение их роли в осуществлении эффектов самого гептапептида.
Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:
1. Определить, обладает ли селанк противоязвенной активностью на различных моделях язвообразования.
2. Выяснить возможное влияние селанка на кровоток в стенке желудка как один из механизмов поддержания гомеостаза СОЖ.
3. Изучить противоязвенные свойства тафцина и трех фрагментов селанка, полученных последовательным отщеплением аминокислотных остатков с N-конца молекулы, при нарушениях гомеостаза СОЖ, обусловленных разными механизмами патогенеза.
4. Исследовать пути биодеградации in vivo селанка у крыс при внутрибрюшинном и интраназальном ведении и определить вклад метаболитов селанка в действие самого гептапептида, исследуя их протекторные и лечебные противоязвенные свойства.
5. Установить характер распределения введенного селанка по органам белых крыс.
Научная новизна работы. Впервые показаны противоязвенные свойства селективного анксиолитика селанка, его метаболитов, эндогенного иммуностимулирующего пептида тафцина и других фрагментов гептапептида. Выявлено, что биодеградация селанка in vivo преимущественно обусловлена действием дипептидилкарбоксипептидаз и направлена на образование олигопептидов Thr-Lys-Pro, Arg-Pro и Gly-Pro.
Впервые изучены особенности распределения селанка и его пептидных метаболитов по органам крыс при внутрибрюшинном и интраназальном введениях. Установлена их наибольшая концентрация в тканях желудка.
Впервые было продемонстрировано нормализующее действие селанка на локальный тканевой кровоток в стенке желудка, что может быть одним из механизмов его противоязвенного действия.
Научное и практическое значение. Присоединение Pro-Gly-Pro к тафцину не только придает гептапептиду новые анксиолитические свойства, но и повышает устойчивость гомеостаза СОЖ к действию большего ряда ульцерогенных факторов по сравнению с тафцином.
Показанное в работе гастропротекторное и терапевтическое действие селанка и его фрагментов дает основание для дальнейшего изучения некоторых из них в качестве противоязвенных препаратов. Наибольшие противоязвенные эффекты при действии ульцерогенных факторов различной природы были отмечены для самого селанка и его метаболитов Thr-Lys-Pro и Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro. Особый интерес представляет Thr Lys-Pro. Его отличают небольшие размеры, простота синтеза и вероятная возможность проникать в кровь из желудочно-кишечного тракта, что позволяет в будущем исследовать трипептид как противоязвенный агент при пероральном применении.
Положительное влияние селанка на разные механизмы ульцерогенеза, его способность нормализовать работу и других систем организма, прежде всего – ЦНС, делает его применение целесообразным вне зависимости от этиологии язвенной болезни и сопутствующих расстройств.
Апробация диссертации. Материалы исследования обсуждались на IX Международной научной конференции «Ломоносов», Москва, 2002;
Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов, Москва, 2003;
III Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», С-Петербург 2003;
II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов, С-Петербург, 2005;
на заседаниях кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ, 2003-2006 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.
Структура диссертации. Диссертация общим объемом страниц состоит из введения, обзора литературы описания методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, заключения, выводов, приложения и списка цитируемой литературы (155 публикаций).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Действие селанка и его фрагментов исследовали на трех экспериментальных моделях язвообразования: этаноловой, водоиммерсионной стрессорной и ацетатной. В качестве подопытных животных в первом и третьем случаях использовали самцов беспородных белых крыс, во втором – самцов крыс линии Вистар массой 180-350 г.
За сутки до опыта животных лишали пищи, а при этаноловой модели и воды, и помещали в клетку с решетчатым дном для предотвращения копрофагии. В каждом опыте животные были разделены на две группы: опытную, которой за 1 час до введения этанола или погружения в воду вводили внутрибрюшинно исследуемый препарат, и контрольную, которой вводили физиологический раствор в таком же объеме.
Язвообразование, вызванное интрагастральным введением этанола. Спустя час после инъекции препарата крысам с помощью зонда интрагастрально вводили 96% этанол в объеме 1мл/200г массы тела.
Водоиммерсионная стрессорная модель язвообразования. Через час после введения препарата или физиологического раствора крыс помещали в емкости с водой (температура воды - 160 С), где они плавали в течение получаса. Далее животных обтирали и помещали в клетки.
Через час крыс умерщвляли эфиром. Этаноловую и стрессорную экспериментальные модели использовали для изучения протекторных противоязвенных свойств пептидов.
Ацетатная модель язвообразования. Ацетатные язвы вызывали по модифицированному методу Okabe S. et. al (1971). Беспородным крысам, разделенным на контрольную и опытную группы, под эфирным наркозом вскрывали брюшную полость, обнажали желудок и на серозную поверхность пилорического отдела желудка с помощью круглого ватного тампона диаметрам 0,5 мм на 15 секунд апплицировали ледяную уксусную кислоту. После этого поверхность желудка в области аппликации промокали фильтровальной бумагой, а брюшную полость зашивали.
Сразу же после аппликации на СОЖ начинают образовываться язвы, которые постепенно развиваются, достигая максимальной величины к 4-му дню, а затем постепенно регенерируют (Бакаева З.В. и др., 2005).
Проводили две серии экспериментов, в одной из которых исследуемые препараты вводили в течение первых 3-х дней после аппликации, а во второй серии - в течение 3-х дней, начиная с четвертого дня после операции на фоне уже развившейся язвы. Введение исследуемого препарата в первом случае влияет на формирование язвы, тогда как во втором случае можно говорить о его влиянии на скорость ее заживления.
Контрольным животным по той же схеме вводили физиологический раствор.
Повреждения, вызванные действием ульцерогенных факторов.
Через один час после введения этанола на СОЖ выявляются большие повреждения, выражающиеся в значительных геморрагиях и эрозиях большой протяженности. При стрессорном методе вызова язв на слизистой оболочке образуются точечные эрозивные повреждения размером от 0,1*0,1 мм до 1*1 мм, которые в литературе называются стрессорными язвами (Filaretova L. et al., 1998.). Возникающие этаноловые и стрессорные повреждения затрагивают только слизистый, реже мышечный слои и быстро регенерируют (в течение нескольких часов). При ацетатной модели язвообразования возникают язвы, которые по своим гистоморфологическим и временным характеристикам аналогичны пептическим язвам у человека, затрагивают все слои стенки желудка и нередко бывают прободными.
В развитии язвенных повреждений участвуют как периферические, так и центральные механизмы, которые могут иметь различный вклад в развитие пептической язвы желудка. Развитие этаноловых повреждений СОЖ в основном связано с периферическими механизмами ульцерогенеза, стрессорное действие холодового плавания – с центральными механизмами;
ацетатная модель используется для изучения развития и заживления хронических язв. Таким образом, моделируются различные механизмы, обусловливающие образование, развитие и заживление язв.
Определение тяжести повреждения СОЖ. При определении тяжести повреждения слизистой оболочки с помощью бинокуляра с окулярмикрометром оценивали площадь каждого язвенного поражения в мм2. Далее вычисляли суммарную площадь повреждений в каждом желудке, которую нормировали, т.е. представляли в процентах к среднему контрольному значению в каждом эксперименте. Для каждой группы вычисляли средний размер язвенных поражений, т.е. величину повреждений в процентах к контролю. Противоязвенное действие препаратов выражали как обратную величину, т.е. на сколько процентов действие пептидов уменьшает среднюю площадь опытных язв по сравнением с контролем. Для оценки статистической достоверности различий групп использовалась компьютерная программа Statistica 5.0, LSD – тест.
Изучение биодеградации селанка in vivo. С помощью реакции высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена (ВТКИО) при 180оС в Институте Молекулярной Генетики РАН Ю.А. Золотаревым и коллегами был получен равномерно меченный тритием селанк с молярной радиоактивностью 40 Ки/моль.
Работа с животными проводилась в Центре психического здоровья РАМН. Для изучения фармакокинетики селанка меченый пептид общей радиоактивностью 500 мкКи (12,5 пмоль) в физиологическом растворе внутрибрюшинно (0,5 мл) и интраназально (20 мкл) вводили крысам. Забор органов проводили на 1, 3, 5 и 7-й минутах, в случае интраназального введения – еще и на 10-й и 15-й минутах. В течение 1-1,5 минут у декапитированных крыс извлекали и замораживали в жидком азоте кровь, печень, сердце, почки, желудок, головной мозг.
Фракции, содержащие меченые пептиды, выделяли с помощью экстракции 90% ацетонитрилом, содержащим 1% трифторуксусной кислоты, при дроблении в клеточном измельчителе и последующей реэкстракции метанолом.
Измеряли общую радиоактивность экстрактов тканей органов в сцинтилляционном счетчике, а также определяли содержание конкретных пептидов во фракциях, полученных хроматографическим разделением экстрактов.
Определение содержания меченого пептида и его метаболитов основано на определении радиоактивности хроматографических пиков соответствующих немеченых фрагментов, предварительно введенных в исследуемый образец перед разделением и выделенных по данным УФ детекции. Разделение смеси пептидных фрагментов проводили методом ВЭЖХ на колонке Kromasil C18 – 5 µm (4 х 150 мм) при 20оС. В качестве детектора использовали спектрофотометр Beckman модели 165 (Altex) при одновременной детекции на длинах волн 254 и 280 нм.
Полученные образцы пептидных экстрактов из тканей (объем мкл) смешивали с 30 мкл раствора исследуемого немеченого пептида и его метаболитов (по 5 мкг каждого пептида), подвергали градиентному элюированию и определяли радиоактивность продукта каждого из пиков.
Содержание [3Н]селанка и его метаболитов в ткани определяли из данных по содержанию радиоактивности в пептидной фракции и молярной радиоактивности соответствующего фрагмента, рассчитанной из распределения метки в пептиде.
Изучение влияния селанка на желудочный кровоток.
Измерение локального кровотока в стенке желудка наркотизированных уретаном (2,4 г/кг) крыс осуществляли методом водородного клиренса, основанном на регистрации кривой очищения биологической ткани от водорода (Демченко Н.Т., 1976). В качестве регистрирующих электродов использовали «плавающие» платиновые микроэлектроды, которые вводили в стенку желудка и закрепляли на его поверхности. Замеры уровня кровотока проводили каждые 10 минут на протяжении 2 часов;
средняя величина первых трех замеров принималась за 100 %. На протяжении всего эксперимента поддерживалась постоянная температура тела крысы (измеряемая ректально).
Было исследовано влияние селанка в дозе 0,6 мкмоль/кг (1мл/200г) на базальный кровоток желудка крыс и кровоток, уменьшенный индометацином. В первом случае контролем служили животные, которым после определения исходного кровотока, внутрибрюшинно вводили физиологический раствор (1мл/200г);
во втором случае его вводили на фоне действия индометацина (25 мг/кг), введенного за 10 минут до этого.
В опытных группах вместо физиологического раствора вводился селанк.
Используемые пептиды были синтезированы в Институте Молекулярной Генетики РАН. Пептиды разводили непосредственно перед опытом в физиологическом растворе и вводили крысам в дозах 0.6, 0.037, 0.37 и 3.7 мкмоль/кг (1мл/200г).
РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование влияния селанка и его фрагментов KPRPGP, PRPGP, RPGP и TKPR на гомеостаз СОЖ при действии различных ульцерогенных факторов На начальной стадии исследования влияние селанка на гомеостаз СОЖ оценивали по антиульцерогенным эффектам на принятых экспериментальных моделях язвообразования. Нами было исследованы также три фрагмента селанка, полученные последовательным отщеплением аминокислотных остатков с N-конца и тафцин.
Используемая дозировка селанка – 500 мкг/кг (внутрибрюшинно) – соответствовала середине диапазона действующих дозировок препарата при изучении его центральных эффектов (Середенин С.Б. и др., 1998).
Дериваты вводили в эквимолярных количествах - 0,6 мкмоль/кг.
Селанк и его фрагменты в различной мере снижали язвенные повреждения на использованных моделях язвообразования (см. рис.1).
% к контролю ***** ***** *** * ** Этаноловая Стрессорная Ацетатная Ацетатная 4-й день 7-й день Контроль TKPRPGP KPRPGP PRPGP RPGP TKPR Рис.1. Влияние пептидов на величину язвенных повреждений в желудке крыс при внутрибрюшинном введении (0,6 мкмоль/кг) исследуемых пептидов. *p0.05 к контролю Предварительное введение селанка достоверно снижало площадь этаноловых и стрессорных повреждений до 48% и 8,6% соответственно по сравнению с контрольными значениями. Его хроническое введение в той же дозе (0,6 мкмоль/кг) почти вдвое снижает развитие (4-й день) и ускоряет заживление (7-й день) ацетатных язв. Сходным эффектом обладал его фрагмент Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro (KPRPGP), проявляющий даже большее противоязвенное действие на этаноловой и ацетатной моделях.
Впервые был выявлен противоязвенный эффект эндогенного иммуностимулятора тафцина. На всех моделях, кроме стрессорной, он достоверно снижал размеры язвенных повреждений СОЖ. Пентапептид Pro-Arg-Pro-Gly-Pro (PRPGP) был достоверно эффективен на тех же моделях язвообразования. Тетрапептид Arg-Pro-Gly-Pro (RPGP) также проявлял тенденцию к снижению ульцерогенеза, однако статистически достоверные различия с контрольными значениями отмечены лишь для этанолового язвообразования и развития ацетатных язв.
Наличие у селанка противоязвенных свойств было предсказуемым, особенно при стрессорном характере язвообразования – анксиолитические эффекты пептида позволяют снизить уровень стресса у животного. Это согласуется с противоязвенным свойствами других ноотропных препаратов, например, семакса (Жуйкова С.Е и др., 2000). Тем не менее, селанк оказывал влияние не только на центральные механизмы патогенеза, но показал достоверное снижение и этанолового язвообразования, вызванного в основном периферическими механизмами ульцерогенеза, и терапевтическое влияние на ацетатные язвы. Подобное действие характерно для пептидных препаратов (семакса, PGP), а также непептидных средств, традиционно использующихся в качестве антидепрессантов и психостимуляторов. Так, представитель фенилалкилсиднониминового ряда сиднофен обладает хорошо выраженным противоязвенным действием, показанным на этаноловой, водоиммерсионной стрессорной, индометациновой и ацетатной моделях язвообразования (Нацвлиашвили Н.А. и др., 1991;
Юзюк Т.Н. и др., 1993).
Повреждения СОЖ, вызываемые интрагастральным введением этанола, обусловливаются сложным комплексом взаимосвязанных механизмов. Основным является непосредственное влияние этанола на сосуды слизистой, вызывающее их спазм. Другим компонентом его непосредственного действия может быть уменьшение количества слизи:
гистологические исследования показали, что на поверхности и внутри эпителиальных клеток после введения этанола слизь исчезает полностью (Wong et al., 1986).
Исследование влияния селанка на локальный кровоток в стенке желудка наркотизированных крыс Локальные нарушения в микроциркуляторном русле играют особо важную роль в этиологии язвенных поражений СОЖ и других патологий желудочно-кишечного тракта. Ишемия лежит в основе развития язвенных повреждений, вызванных стрессом, интрагастральным введением этанола, нестероидными противовоспалительными средствами. Заживление язв сопровождается ангиогенезом и увеличением кровотока в крае язвы и окружающих язву тканях. В связи с этим при разработке противоязвенных препаратов особое внимание уделяется изучению их влияния на микроциркуляторное русло.
Исследование локального кровотока в стенке желудка, измеренного методом водородного клиренса, у наркотизированных крыс показало, что в норме у разных крыс его уровень составлял 40-90 мл/мин/100 г ткани. В течение двух часов эксперимента уровень базального кровотока в желудке поддерживался на относительно стабильном уровне – его колебания не превышали 10% от исходного. Введение 0,6 мкмоль/кг селанка не изменяло скорость базального кровотока.
Подкожное введение индометацина контрольным животным в течение 30 минут снижает кровоток до ~ 60% от исходного уровня и поддерживает его на этом уровне до конца эксперимента. Введение селанка через десять минут после инъекции индометацина на фоне начала его действия предотвращало такое падение (см. рис.2).
Таким образом, селанк, не влияя на базальный кровоток в желудке, предотвращает снижение кровотока, вызванное индометацином. Подобное поддержание кровотока на адекватном уровне может быть одним из важных механизмов противоязвенного действия пептида.
Рис.2. Селанк в кровоток, % к исходному дозе 0, мкмоль/кг предотвращает вызванное индометацином (25 мг/кг) падение локального кровотока -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 время, мин - физиологический раствор на фоне индометацина;
- селанк на фоне индометацина.
- время введения индометацина;
- время введения селанка или физиологического раствора Изучение путей биодеградации селанка in vivo Регуляторные пептиды, метаболизируясь в крови и тканях организма под воздействием пептидаз, расщепляются до более мелких фрагментов, которые также могут обладать физиологической активностью.
В связи с этим при исследовании регуляторных пептидов, особенно предназначенных для применения в клинике, всегда важно изучить пути их деградации, распределение по системам органов. Как правило, такие работы по выявлению распределения препаратов в тканях, путей их биодеградации и определению специфического связывания с белками мишенями выполняются с препаратами, меченными радиоактивными изотопами. Наиболее универсальными, удобными в работе и безопасными являются препараты, меченные тритием.
Участие селанка в поддержании гомеостаза СОЖ и его противоязвенные эффекты могут быть обусловлены как оригинальным действием целой молекулы гептапептида, так и влиянием фрагментов, образующихся при ее биодеградации. В связи с этим было необходимо изучить пути расщепления селанка пептидазными системами организма in vivo.
Общее содержание радиоактивно меченых соединений в органах представлено в нКи/г и в процентах от введенной радиоактивности на грамм ткани. Концентрацию меченых селанка и его метаболитов в органах представляли в пмоль/г.
Распределение радиоактивности в органах крыс при внутрибрюшинном и интраназальном введениях. Выбор способов введения пептида диктовался тем, что представленные в данной работе результаты о противоязвенных свойствах селанка были получены при внутрибрюшинном введении. В клинической практике предполагается интраназальное введение препарата пациентам. В связи с этим при изучении распределения меченого пептида по органам и характера его деградации было интересно сопоставить эти два способа введения.
Результаты измерения удельной радиоактивности в органах суммированы в табл. 1и 2.
В ходе проделанной работы выяснилось, что при внутрибрюшинном введении радиоактивная метка начинает определяться в кровотоке животного уже с первой минуты после введения. Содержание меченых продуктов в крови быстро снижается более чем на треть к седьмой минуте, что связано с их распределением по системам органов.
Таблица 1.
Распределение радиоактивности в крови и органах крысы при внутрибрюшинном введении 500 µКи селанка, меченного тритием Радиоактивность, нКи/г Время, мин Кровь Печень Сердце Почки Желудок Мозг 1 1190 210 880 740 4300 3 1170 680 800 1460 5300 5 910 660 1140 1300 3500 7 750 580 630 560 3200 В сердце метка попадает также быстро и продолжает оставаться на высоком уровне, сравнимом с кровью, на протяжении времени наблюдения. В органах брюшной полости максимальное содержание метки достигается на третьей-пятой минутах, после чего снижается.
Наибольшее содержание метки отмечено в желудке, превосходя концентрацию в крови почти в 4 раза.
При интраназальном введении меченый селанк попадает в кровь в меньших количествах, чем при внутрибрюшинной инъекции (см. табл. 2).
Соответственно, и содержание метки во внутренних органах существенно меньше, что особенно заметно в случае печени. Очевидно, при внутрибрюшинном введении благодаря особенностям брюшного кровотока в печень попадает гораздо больше всасывающегося из брюшной полости меченого пептида и его метаболитов. В сердце и почках, как и при внутрибрюшинном введении, их содержание сравнимо с кровью.
Содержание в желудке также было очень высоко, и превосходит таковое при внутрибрюшинном введении.
Таблица Распределение радиоактивности в крови и органах крысы при интраназальном введении 500 µКи селанка, меченного тритием.
Радиоактивность, нКи/кг Время, мин Кровь Печень Сердце Почки Желудок Мозг 1 410 21 66 140 2500 3 150 58 150 210 5600 5 210 53 160 210 4500 7 210 41 200 190 3300 10 270 41 200 150 3100 15 160 35 150 100 1300 Приведенное содержание метки в органах представлено как величина радиоактивности, наблюдаемая на определенную массу органа (г). Мы представили эту величину также как долю от введенной в организм с селанком радиоактивности (500 µКи). Это позволяет более удобно наблюдать за распределением метки по органам во времени (см. табл. 3).
Таблица Распределение радиоактивности в органах крысы при внутрибрюшинном введении 500 µКи меченного тритием селанка, в % от введенного % введенного пептида на 1г ткани Время, мин Кровь Желудок Печень Сердце Почки Мозг 1 0,24 0,86 0,04 0,18 0,15 0, 3 0,23 1,06 0,14 0,16 0,3 0, 5 0,18 0,7 0,13 0,23 0,26 0, 7 0,15 0,67 0,12 0,13 0,11 0, Таким образом, при обоих способах введения меченый пептид поступает в кровоток. Для различных органов наблюдается разный уровень включения метки в их ткани. Самое высокое содержание радиоактивных продуктов выявлено в желудке.
Концентрация селанка и продуктов его пептидазной биодеградации в органах крысы in vivo.
Заборе крови через 1 минуту после внутрибрюшинного введения [ Н]селанка показал, что деградация гептапептида направлена на пептидазное расщепление молекулы до более коротких олигопептидов. В таблице 4 показано соотношение меченых пептидных фрагментов в экстракте крови.
Как видно из таблицы, состав продуктов биодеградации селанка в крови iv vivo определяется, в основном, действием дипептидилкарбоксипептидаз и направлен на отщепление от молекулы селанка дипептида Gly-Pro, затем образующийся пентапептид Thr-Lys-Pro Arg-Pro под действием дипептидилкарбоксипептидаз гидролизуется до пептидов Thr-Lys-Pro и Arg-Pro. В меньших количествах наблюдаются продукты активности карбоксипептидаз (Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly), дипептидиламинопептидаз (Pro-Arg-Pro-Gly-Pro) и аминопептидаз (Lys Pro-Arg-Pro-Gly-Pro). Для последнего гексапептида выше была показана противоязвенная активность. Тафцин при деградации in vivo в определяемых количествах не образуется.
Таблица Концентрация селанка и продуктов его пептидазной биодеградации в крови крысы in vivo через 1 минуту после внутрибрюшинного введения 500 µКи меченного тритием селанка N Пептид Концентрация, пмоль/г 1 Gly-Pro 12, 2 Thr-Lys-Pro 7, 3 Arg-Pro 6, 4 Pro-Arg-Pro-Gly-Pro 0, 5 Thr-Lys-Pro-Arg 6 Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly 3, 7 Thr-Lys-Pro-Arg-Pro 9, 8 Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro 22, 9 Arg-Pro-Gly-Pro 0, 10 Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro 2, Нумерация пептидов в таблицах 4,5 определяется порядком появления соответствующих пиков при хроматографии.
Подобный характер деградации селанка в крови показан и при интраназальном введении (см. таблицу 5).
Таблица Концентрация селанка и продуктов его пептидазной биодеградации в крови крысы in vivo через 1 минуту после интраназального введения 500 µКи [3Н]селанка N Пептид Концентрация, пмоль/г 1 Gly-Pro 2, 2 Thr-Lys-Pro 1, 3 Arg-Pro 1, 4 Pro-Arg-Pro-Gly-Pro 0, 5 Thr-Lys-Pro-Arg 6 Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly 1, 7 Thr-Lys-Pro-Arg-Pro 2, 8 Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro 5, 9 Arg-Pro-Gly-Pro 0, 10 Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro 0, Таким образом, деградация селанка обусловливается ферментативным расщеплением рядом протеолитических ферментов, причем наибольший вклад принадлежит дипептидилкарбоксипептидазам.
Интенсивность метаболизма может быть тканеспецифичной и зависеть от локального соотношения ферментов.
Анализ биодеградации селанка in vitro под действием ангиотензин-превращающего фермента (АПФ). Нами был исследован процесс деградации селанка in vitro под воздействием одного фермента, который может играть активную роль в условиях целого организма ангиотензин-превращающего. Он хорошо известен как фермент, регулирующий кровяное давление, является дипептидилкарбоксипептидазой и широко представлен во всем организме.
Фермент располагается на внешней поверхности плазматической мембраны разных клеток - эндотелиальных, специализированных эпителиальных, находящихся в местах интенсивного всасывания или выделения жидкости и солей, нейроэпителиальных, на нервных окончаниях, на клетках мононуклеарного ряда, а также в репродуктивных органах. Растворимая форма фермента присутствует практически во всех биологических жидкостях (Елисеева Ю., 2001).
Добавление АПФ в концентрации 5·10-9 М к раствору селанка ( мкМ) вызывает расщепление гептапептида и спустя 4 часа содержание последнего снижается до 12 мкМ. Параллельно происходит накопление отщепляемого с С-конца молекулы дипептида Gly-Pro, а также пептидов Thr-Lys-Pro и Arg-Pro, до которых гидролизуется под воздействием АПФ пентапептид Thr-Lys-Pro-Arg-Pro (см таблицу 6).
Таблица 6.
Анализ биодеградации in vitro гептапептида селанка (TKPRPGP) под действием ангиотензин-превращающего фермента* Пептид Концентрация пептидов, мкМ 0,5 1 час 2 час 4 час час 1 Gly-Pro 68 107 177 2 Arg-Pro 24 54 110 3 Thr-Lys-Pro 22 54 108 4 Thr-Lys-Pro-Arg-Pro 50 65 69 5 Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro 143 99 38 *Концентрация АПФ 5х10-9 М, исходная концентрация TKPRPGP 210 мкМ, фосфатный буфер рН 7.5, ZnCl2 10-6 М, 37 оС.
Таким образом, данные, полученные in vitro, подтверждают наблюдаемые в условиях целого организма результаты. Основными метаболитами селанка, образующимися под воздействием дипептидилкарбоксипептидаз, являются пептиды Thr-Lys-Pro, Arg-Pro и Gly-Pro. Выявлено также образование гексапептида Lys-Pro-Arg-Pro-Gly Pro, выраженная противоязвенная активность которого была выявлена нами. Отмечен высокий уровень включения меченых пептидов в тканях желудка, мозга и сердца. Наблюдаемое высокое содержание метки в некоторых органах может быть обусловлено взаимодействием со специфическими структурами связывания, например, рецепторами.
Исследование влияния селанка и его метаболитов Thr-Lys-Pro и Arg Pro на поддержание гомеостаза СОЖ Приведенные выше данные о путях биодеградации селанка заставили обратиться к непосредственным метаболитам гептапептида, образующимся при его распаде. Необходимо было узнать, участвуют ли они в поддержании гомеостаза СОЖ, и опосредованы ли противоязвенные эффекты селанка только действием всей молекулы в целом или же и его метаболиты также могут вносить в них свой вклад.
Противоязвенные свойства дипептида Gly-Pro были известны достаточно давно. В нашей лаборатории было изучено влияние дипептида на различных моделях язвообразования. Дипептид обладает ярко выраженным терапевтическим эффектом на ацетатной модели язвообразования при внутрибрюшинном введении в дозе 3,7 мкмоль/кг.
Gly-Pro защищает СОЖ от язвообразования, вызванного стрессом, но на этаноловой модели он оказывал даже потенцирующее действие на ульцерогенез (Жуйкова С.Е. и др., 2003, 2004;
Бакаева З.В., Самонина Г.Е., 2004, 2005).
Действие пептидов Thr-Lys-Pro и Arg-Pro на гомеостаз СОЖ до последнего времени изучено не было. Нами была проведена серия экспериментов, в которой эти пептиды тестировались на трех моделях язвообразования (этаноловой, стрессорной водоиммерсионной и ацетатной) в дозировке 0,037 мкмоль/кг, 0,37 мкмоль/кг, 0,6 мкмоль/кг, 3, мкмоль/кг при внутрибрюшинном введении. Выбор этих дозировок объясняется фактом, что доза 3,7 мкмоль/кг для Gly-Pro хорошо изучена, а 0,6 мкмоль/кг соответствует 500 мкг/кг селанка и применялась нами ранее.
Доза 0,37 мкмоль/кг (310 мкг/кг селанка) близка к принятой дозе при изучении центральных эффектов селанка;
также проверялось действие пептидов в дозе на порядок меньшей - 0,037 мкмоль/кг.
Предварительное введение селанка во всех используемых дозировках статистически достоверно снижало среднюю площадь этаноловых повреждений на ~52-67% по сравнению с контрольными значениями. Следует подчеркнуть независимость противоязвенного действия селанка от применяемой дозы при изменении дозы на два порядка. Сходным образом действовал трипептид Thr-Lys-Pro, достоверно снижавший этаноловое язвообразование в тех же дозах.
Рис.31. Дозозависимые протекторные противоязвенные эффекты селанка и его метаболитов на этаноловой модели язвообразования. *p0. Здесь и далее: Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro (TKPRPGP), Thr-Lys-Pro (TKP), Arg-Pro (RP), Gly-Pro (GP) Дипептид Arg-Pro в зависимости от дозировки показал различные результаты. Так, при дозах 3,7 мкмоль/кг и 0,6 мкмоль/кг пептид не оказывал статистически достоверного влияния на этаноловое язвообразование. Однако, при более низких дозах 0,37 и 0,037 мкмоль/кг Arg-Pro достоверно снижал площадь повреждений на 41% и 22% по сравнению с контролем соответственно (рис.3).
Рис.4. Дозозависимые протекторные противоязвенные эффекты селанка и его метаболитов на стрессорной модели язвообразования. *p0. В тех же дозах эти пептиды были протестированы и на стрессорной модели. В самой малой из исследуемых доз селанк проявлял тенденцию к уменьшению площади язвенных повреждений, а в больших дозах достоверно снижал поражения СОЖ на 82-92% в опытных группах по сравнению с контролем (рис.4).
Thr-Lys-Pro также в трех высших дозах положительно влиял на устойчивость СОЖ к стрессорному воздействию, достоверно снижая язвообразование по сравнению с контрольными группами. Дипептид Arg Pro в отличие от селанка и Thr-Lys-Pro не показал статистически достоверное влияние на стрессорное язвообразование ни в одной из использованных доз.
Обобщая вышесказанное, можно утверждать, что селанк и его непосредственные метаболиты Thr-Lys-Pro и Arg-Pro в разной мере способны оказывать протекторное действие по отношению к СОЖ, увеличивая ее устойчивость к действию ульцерогенных факторов периферической или центральной природы. Действие это дозозависимо и специфично для каждого пептида. Так, например, эффекты Thr-Lys-Pro во многом сходны с таковыми для селанка, иногда превосходя их. Arg-Pro демонстрирует противоязвенные свойства только в случае этанолового язвообразования при минимальных дозах, а при стрессорном таковые совсем отсутствуют.
Терапевтическое влияние селанка в дозе 0,6 мкмоль/кг на развитие и заживление ацетатных язв продемонстрировано выше. На этаноловой и стрессорной моделях показано, что минимальной действующей дозой для селанка и Thr-Lys-Pro является 0,37 мкмоль/кг. Поэтому в следующей серии экспериментов мы сопоставили действие селанка и трех его метаболитов в этой дозе на ускорение заживления ацетатных язв при ежедневном однократном введении в течение 4-6-го дней после операции.
В контрольных группах среднее значение площади язв на седьмой день после операции составило 35,88±6,4 мм2. Хроническое введение селанка, Thr-Lys-Pro и Gly-Pro в дозе 0,37 мкмоль/кг статистически достоверно снижало размеры ацетатных язв на седьмой день после операции по сравнению с контрольными значениями, что свидетельствует об их терапевтическом действии. Дипептид Arg-Pro достоверно не влиял на процесс заживления на этой модели язвообразования (см. рис.5).
Рис. 4. Величины лечебных эффектов противоязвенный эффект, % TKPRPGP, TKP, RP и * * * GP в дозе 0, мкмоль/кг при заживлении ацетатных язв.
*p0, TKPRPGP TKP RP GP Таким образом, как селанк, так и его непосредственные метаболиты обладают противоязвенной активностью. Из литературных данных известно, что дипептид Gly-Pro обладает протекторным действием при действии стресса в дозах 0,2-53 мкмоль/кг и ускоряет заживление ацетатных язв в дозе 3,7 мкмоль/кг (Жуйкова С.Е. и др., 2003;
Бакаева З.В.
и др., 2005). Нами было выявлено, что на ацетатной модели эффективной является и доза 0,37 мкмоль/кг. Активность Thr-Lys-Pro и Arg-Prо на экспериментальных моделях язвообразования была показана впервые.
Наиболее сходным с селанком действием обладал Thr-Lys-Pro;
дипептид Arg-Pro был эффективен лишь на этаноловой модели.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Представленная работа – первое исследование, посвященное изучению влияние селанка на гомеостаз слизистой оболочки желудка.
Как и в случае создания семакса, который приобрел новые свойства по сравнению с АКТГ 4-7, присоединение Pro-Gly-Pro к тафцину привело к возникновению селанка, обладающего новыми свойствами по сравнению с тафцином. Селанк, который в настоящее время прошел третью стадию клинических испытаний как селективный анксиолитический препарат, принимает участие в поддержании гомеостаза СОЖ, увеличивая устойчивость последнего к большему числу ульцерогенных факторов по сравнению с тафцином. Отмечена более низкая эффективная дозировка селанка по сравнению с Pro-Gly-Pro на этаноловой модели язвообразования – 0,037 мкмоль/кг.
Впервые определены продукты биодеградации селанка, которая осуществляется в основном дипептидилкарбоксипептидазами и приводит к отщеплению Gly-Pro;
затем образующийся пентапептид распадается до Thr-Lys-Pro и Arg-Pro. В меньшей степени задействованы другие пептидазы, которые, например, приводят к образованию гексапептида Lys Pro-Arg-Pro-Gly-Pro, для которого также свойственна противоязвенная активность. Наблюдение за распределением меченого селанка и его пептидных метаболитов по разным системам и органам выявило наибольшую концентрацию в тканях желудка, превосходящую при внутрибрюшинном введении почти в 4 раза таковую в крови, а при интраназальном – более чем в 20 раз. Можно предположить, что высокая тропность исследуемых пептидов к тканям желудка способствует поддержанию гомеостаза СОЖ.
Изучение противоязвенных свойств селанка и его фрагментов Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro, Pro-Arg-Pro-Gly-Pro, Arg-Pro-Gly-Pro, Thr-Lys Pro-Arg, Thr-Lys-Pro, Arg-Pro, Gly-Pro показало, что все они в большей или меньшей степени проявляют как протекторные противоязвенные эффекты, так и ускоряют заживление язвы. Так, гексапептид Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro и трипептид Thr-Lys-Pro показали положительное действие на устойчивость СОЖ, сравнимое с активностью селанка, а иногда ее превосходящее. Данные литературы и наши результаты демонстрируют, что дипептид Gly-Pro в широком диапазоне доз защищает СОЖ от воздействия ульцерогенных факторов центральной природы и ускоряет заживление ацетатных язв. Наименьшее противоязвенное действие проявил дипептид Arg-Pro, действуя лишь в минимальных дозах на одной модели язвообразования.
Деградация селанка in vivo происходит достаточно быстро, в течение нескольких минут, а эффекты на СОЖ проявляются гораздо позже. Следует полагать, что поддержание гомеостаза СОЖ и протекторные и терапевтические противоязвенные эффекты селанка могут быть обусловлены не только действием самого пептида, но и его фрагментов, образующихся при ферментативном расщеплении в тканях организма, и их высокой тропностью к тканям желудка.
Механизмы защиты слизистой оболочки желудка со стороны селанка пока изучены недостаточно. В работе продемонстрировано, что гептапептид предотвращает снижение уровня локального кровотока в стенке желудка, вызванное индометацином. Подобное предохранение тканей от ишемии может играть важную роль в устойчивости СОЖ, так как снижение кровотока является причиной ульцерогенеза в эксперименте и клинике. При этом есть данные о том, что Gly-Pro не влияет на сниженный индометацином кровоток, однако обладает эндотелий независимым сосудорасширяющим эффектом на препаратах изолированного кольцевого сегмента аорты крыс (Бакаева З.В. и др., 2003).
Возможно, с этим свойством дипептида связана его (и селанка как предшественника) высокая эффективность на стрессорной модели язвообразования. Медиаторы симпатической системы могут уменьшать кровоток в стенке желудка, вызывая сокращение артериол. Не исключено, что параллельно с центральными действиями селанка дипептид Gly-Pro способен влиять на непосредственно на гладкую мускулатуру сосудов, уменьшая сократительные эффекты, вызванные стрессом.
Принимая во внимание, что одним из основных метаболитов селанка является дипептид Gly-Pro, освобождающийся в большом количестве почти с первой минуты пептидазной деградации, противоязвенное свойство селанка может быть связано также с некоторыми другими его эффектами на компоненты, влияющие на гомеостаз: уменьшением базальной и стимулированной бикарбонатной секрецией желудка (Бакаева З.В. и др., 2004), уменьшением стимулированной кислой секреции желудка, противовоспалительной активностью (Жуйкова С.Е. и др., 2003), увеличением лимфотока (Ашмарин И.П. и др., 1999) и микроциркуляции в брыжейке (Копылова Г.Н. и др., 2003), уменьшением стрессогенных нарушений поведения (Умарова Б.А. и др., 2006), стабилизацией тучных клеток, подавлением их дегрануляции (Копылова Г.Н. и др., 2003) и уменьшением болевой чувствительности (Абрамова М.А. и др., 1997).
Для выяснения влияния метаболитов селанка Lys-Pro-Arg-Pro-Gly Pro, Thr-Lys-Pro-Arg-Pro, Thr-Lys-Pro, Arg-Pro на механизмы, определяющие гомеостаз СОЖ необходимы дальнейшие исследования.
ВЫВОДЫ 1. Селанк (Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro), известный как синтетический анксиолитик, проявляет протекторные противоязвенные свойства, повышая устойчивость слизистой оболочки желудка к действию различных ульцерогенных факторов. Помимо протекторного эффекта, селанк обладает терапевтическим действием, ускоряя заживление ацетатных язв.
2. Противоязвенными свойствами в разной мере обладают и фрагменты селанка, полученные последовательным отщеплением аминокислотных остатков с N-конца молекулы. Впервые выявлены противоязвенные свойства эндогенного иммуностимулятора тафцина, входящего в структуру селанка.
3. Одним из механизмов противоязвенного действия селанка может быть предотвращение снижения уровня локального кровотока, вызванного действием ульцерогенного фактора (индометацина), в стенке желудка.
4. Биодеградация селанка in vivo в организме белых крыс преимущественно направлена на его ферментативное расщепление до более коротких долгоживущих пептидов - Thr-Lys-Pro, Arg-Pro и Gly-Pro. В меньших количествах образуются Lys-Pro-Arg-Pro-Gly Pro, Pro-Arg-Pro-Gly-Pro и Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly. Все исследуемые метаболиты селанка обладают противоязвенными свойствами. В наибольшей степени эти свойства выражены у Thr-Lys-Pro, в наименьшей – у Arg-Pro.
5. Изучение распределения внутрибрюшинно и интраназально введенного меченого селанка и его образовавшихся метаболитов по органам крыс показало, что наибольшая концентрация пептидов на 1г ткани, превышающая в несколько раз содержание в крови, сердце и мозге, характерна для желудка.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Павлов Т.С., Самонина Г.Е. Новое свойство эндогенного иммуностимулятора тафцина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2004. т.138. №8. с.185- 2. Павлов Т.С. Самонина Г.Е. Адреева Л.А., Мясоедов Н.Ф., Ашмарин И.П. Новое свойство синтетического анксиолитика селанка и его дериватов. // Доклады Академии Наук. 2004. т.397. №4. с.1- 3. Павлов Т.С., Санжиева Л.Ц., Самонина Г.Е., Сергеев В.И., Лелекова Т.В. Влияние синтетического анксиолитика селанка на кровоток в стенке желудка и сократительную активность лимфатических сосудов брыжейки наркотизированных крыс. // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2005. т.91. №2. с. 178 183.
4. Золотарев Ю. А., Дадаян А. К., Долотов О. В., Козик В. С., Кост Н.
В., Соколов О. Ю., Дорохова Е. М., Мешавкин В. К., Иноземцева Л.
С., Габаева М. В., Андреева Л. А., Алфеева Л. Ю., Павлов Т. С., Бадмаева К. Е., Бадмаева С. Е., Бакаева З. В., Копылова Г. Н., Самонина Г. Е., Васьковский Б. В., Гривенников И. А., Зозуля А. А., Мясоедов Н. Ф. Равномерно меченные тритием пептиды в исследованиях по их деградации in vivo и in vitro // Биоорганическая химия. 2006. т.32. №2. с.80-88.
5. Павлов Т.С., Самонина Г.Е., Бакаева З.В., Золотарев Ю.А. Гусева А.А. Селанк и его метаболиты поддерживают гомеостаз слизистой оболочки желудка // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. В печати.
6. Павлов Т.С. Влияние селанка и его деривата на устойчивость слизистой оболочки желудка.// В сб. IX Международной научной конференции «Ломоносов». Москва. 2002.
7. Павлов Т.С. Новый эффект эндогенного иммуностимулятора тафцина. // В сб. III Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем». С Петербург. 2003.
8. Павлов Т.С., Самонина Г.Е. Противоязвенные эффекты селанка и его дериватов. // В сб. тезисов Российского симпозиума по химии и биологии пептидов. Москва. 2003.
9. Золотарев Ю.А., Соколов О.Ю., Козик В.С., Кост Н.В., Дорхова Е.М., Мешавкин В.К., Дадаян А.К., Габаева М.В., Павлов Т.С., Самонина Г.Е., Зозуля А.А., Мясоедов Н.Ф. Распределение и пептидазная деградация пептидного анксиолитика селанка в тканях крысы in vivo и in vitro // В сб. тезисов 2-го Российского симпозиума по химии и биологии пептидов. С-Петербург. 2005.